以RNA为遗传物质的生物体,如何进行基因的翻译和表达?

抗体及免疫细胞受体是典型得生物文库. 在免疫系统中, 文库设计, 合成以及优化的整个过程都由生物体自己控制. 只有抗原结构和形成胚胎因子的遗传信息是外部的条件, 其余均是由内在因素自发控制. 因为免疫系统使用蛋白质结构文库, 它们将氨基酸作为文库的基本因素.因为肽或以含氨基酸形成的蛋白质都是通过翻译遗传信息而合成的初产品, 需要序列的蛋白质能容易地藉由向微生物如细菌或病毒体内插入修改后的遗传信息来获得. 微生物文库合成有几大优点. 可以克隆微生物使每种微生物只制造一种蛋白质, 而且即使只有一个细胞也可以利用细胞增殖简单克隆出足够数量. 使用生物的最大好处是他们能自我繁殖, 只需给予充足的补给. 这是对使用微生物的蛋白质合成过程的简短描述. 在合成用于制造目的蛋白质序列的DNA链之后, 合成其互补链, 如果需要的话使用酶. 为使合成的DNA在微生物中恰当的复制并翻译, 需要用病媒动物(vector)压缩它然后进入微生物之内. 蛋白质在微生物的表面上被表达, 下一步是寻找目的蛋白质.制造文库需要多种遗传信息. 随机DNA合成或切片cDNA或某种生物全基因组DNA都可使用. 制造特定蛋白质的 DNA序列片断能被修改以制造突变蛋白质文库. 考虑到体积限制和微生物繁殖的表达速率, 可以制得109(十亿)种文库. 与106到107种合成文库相比, 这可是个大数. 5单元肽的数量是205(320万)种, 6单元的是6400万, 7单元肽的数量超过10亿. 因此, 如果改变了超过7氨基酸的肽, 就仅能制出没有包含全部可能组合的不完全文库. 但这并不意谓着我们不能制造超过7氨基酸的蛋白质. 对于长链蛋白质, 7个不同的氨基酸能被单独选择而且替换. 当DNA随机合成的时候, 可以重复DNA密码而指定相同的氨基酸, 并且改变产生的频率. 因此, 为得到所有可能的组合, 需要更多的克隆体.::::抗菌素文库:::: 抗菌素文库是最著名的蛋白质文库法之一. 抗菌素寄居宿主体内, 是一种含有衣壳和遗传物质的病毒. 这种方法在80年代中期发明, 在90年代开始用于多种领域. M13和Lambda病毒是最著名的. M13和lambda病毒<http://www.cvm.msu.edu/courses/mic569/docs/parasite/><http://www.hal.rcast.u-tokyo.ac.jp/genome/Present.htm> M13 是一种薄长的病毒, 由于它的基因组体积小, 可以容易地制出多种文库. 不同于其他病毒, 它能到宿主细胞的外面而不损坏它们或抑制它们的生长. 已知M13在宿主细胞中增殖其遗传信息并且以包着衣壳的形式出现, 它能制造10种类型的蛋白质, 而且通常在pVIII, pIII衣壳中合成文库. pVIII蛋白质包围其整个身体, 含有约50个氨基酸. 通常每一病毒表达2700个. 因为它的氨基端伸出衣壳, 可以修饰它以在其上表达一个不同的肽. 通常一个长肽不能够表达, 但是6单位的肽是可能的. 由于同时表达大量相同的文库分子, 尽管相对较短, 用它于多种配体反应是可以的. pIII 蛋白质在病毒末端表达, 而且通常是含有406个氨基酸的3到5种蛋白质. 它能表达相当大的蛋白质因而可以将它用在全蛋白质或抗体文库种. 正常的抗体使用Fab, 即抗原识别区域, 或者说Fvs链. 抗菌素文库和杂种细胞是制造抗体的最著名的方法. M13是制造随机肽文库的理想材料, 而且病毒能够足够稳定的被沉淀和浓缩, 因而在1-10mL体积中筛选109种文库成为可能.不同于M13, Lambda病毒在细胞质中包裹着衣壳, 当有足够数量后穿出衣壳而不是总是戴着衣壳出现. 换句话说, 如果表达不同的蛋白质, 它将会折叠的形状出现并具有恰当的功能. pV和D蛋白质普遍用于文库合成.如同能在抗菌素表面表达蛋白质一样, 还有随机肽, 天然蛋白质碎片, 特异性突变蛋白质文库和部份抗体碎片, 他们可用于色谱材料, 蛋白质-蛋白质反应, 受体结合位搜索和药物发现. ::::细菌及酵母文库:::: 不仅带有衣壳的病毒, 还有带有细胞壁和细胞膜的细菌也能用于文库表达. 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都能用来在细胞表面表达蛋白质, 还有大肠杆菌(E. coli), 一种革兰氏阴性菌, 也普遍使用. 大肠杆菌是如此有名, 以致于外行如我者也知道两种细菌: 一是大肠杆菌, 另一种是其余的. 细菌文库可以找出一种能够与抗体紧密结合的抗原, 然后将其用作疫苗. 细菌文库也可用于表达诊断抗体或受体文库, 以用于特定材料的分析. 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 <www.meddean.luc.edu/.../DeptWebs/ microbio/med/gram/tech.htm> <http://www.hhmi.org> 高等动物的蛋白质被蛋白质合成后的磷化作用或糖加成修饰的功能称为翻译修饰翻译修饰. 但是细菌作为一种原核生物 没有这种功能, 因而合成了一个蛋白质后要么它由于溶解度低而沉淀, 要么失活. 因此, 酿酒酵母, 一种真核细胞就被利用. 尽管酿酒酵母如细菌一般是单细胞, 它有翻译修饰功能并且能够使合成的蛋白质与原始的极为相似. 酵母<news.bbc.co.uk/hi/english/health/ newsid_761000/761884.stm> 与病毒不同, 由于它有微米大小的细胞所以可以使用FACS(萤光活性细胞分类)技术. 文库中的蛋白质在细胞表面表达, 然后经过FACS机的细管, 这样萤光标记的目标分子就被加到其上. FACS根据萤光颜色和活性强度分类每个细胞. 分类不同颜色的目标分子并分类不同活性和选择性的细胞是可能的. 另外的优点是液相筛选, 它不必分离紧密附着的分子. 分类后的细胞再一次繁殖, 然后再筛选. ::::淘洗(Biopanning):::: 下面是一个合成的微生物文库的实例. 它的目的是寻找一种能够跟特定分子紧密连接的酶.<http://www.hort.purdue.edu/CFPESP/Hasegawa/ha00002.htm> 首先，目标分子平均地被置于检光板上. 制备了的微生物文库被加到板上. 只有与目标分子紧密结合的微生物能够存留, 其余的都到了溶液中. 一段时间后, 除去没有结合的微生物, 然后以恰当的溶液洗涤弱结合或偶然结合的微生物. 目标分子结合的紧密程度决定了洗涤过程. 仍然存留的微生物可通过加入低pH或高浓度的目标分子而分离, 通过繁殖增加数量. 有时结合程度太强时分离它们而不致死细菌是困难的. 如果它是噬菌体, 而不是分离, 那就可以直接感染宿主细胞. 由于存在偶然未考虑的微生物种类, 第一次增殖的微生物直接进行重复筛选－增殖的过程以增加含有活性蛋白质的克隆体数量. 最后在低浓度下培养后, 每个克隆体得以分离. 通常选出几十个克隆体用于DNA序列分析. 如果从DNA信息得到的肽结构是可识别的而且大多数克隆体表现出相同的肽序列, 那就意味着成功了. 然而, 因为蛋白质可能对多种克隆体表现出毒性而且 DNA表达率能改变, 总是有一种可能性存在, 即克隆体增殖速度和表达效果均好于期望的筛选结果. 因此, 通过测量肽合成及键强度的证实步骤是必需的.即使在被获得的DNA或肽中有重要的药物候选者, 它们也将在蛋白质激酶的作用下在体内迅速水解. 因此, 用具有相似肽结构的人造分子取代它们是必需的, 尽管这个步骤非常困难. 几年以前麻州理工学院的Peter Kim小组报道了一个有趣的实验, 他们用D-氨基酸取代其光学异构体天然L-氨基酸以降低水解率. 他们使用人造D-氨基酸作为靶分子, 用天然L-氨基酸筛选发现了高亲合的肽. 因为真正的受体是由L-氨基酸构成, 也即其镜像, 于是他们合成了已发现的L-肽的镜像, 即D-肽. 当D-肽被用于天然受体的时候, 它仍然表现了高活性. Perter Kim, 过去一直作HIV感染途径和治疗方面的工作, 现在正在Merk工作, 他是在Sung-ho Kim博士那一代之后最强有力的韩国诺贝尔奖候选人.::::DNA, RNA 文库:::: 微生物蛋白质文库技术基本基于活体生物的自我再生能力. 那就是, 通过放大(饲养)少量已获得的候选分子来提高纯度和数量. 蛋白质是活体生物利用遗传信息的产物这一点也非常重要. 如果用DNA或RNA而不是蛋白质可以吗? PCR(DNA扩增技术)的发展, 使得自90年代早期以来使用核酸做文库成为可能.因为DNA和RNA是由4种单位构成, 10长度的低聚体有410(约106=一百万)种, 20长度的低聚体文库有约1012种. 通过使用自动固相DNA合成机, 序列中的5"端和3"端被修饰, A, T, C和G随机放置, 每个约占序列的25%. 当有了一条链后, 就通过使用酶或PCR扩增复制它. 通常约1014-15个分子被合成和使用, 但是时常存在大约40个随机引入位(1024种), 有时他们以不完全文库系列开始. 对于DNA文库, 基本使用DNA本身, 而对于RNA文库, 需要T7 RNA 聚合酶转录.制备的文库按照与靶分子结合程度筛选;用PCR扩增DNA, 用RT-PCR扩增RNA. 蛋白质, 不同的核酸, 糖类和小分子都可用作靶分子. 放大了的文库的筛选和扩增过程被重复直到1014-15 的起始数量降至几百, 然后分析获得的候选分子的序列, 并且测量每个的亲合强度. SELEX<http://web.uvic.ca/sciweb/Courses/B300/B300.Outline.html> 这些已获得的DNA和RNA叫做智能配体(aptamers), 它们表现出对蛋白质靶分子的强亲合性, 高1nM Kd. 智能配体抑制靶分子在体内的功能, 但是它很快地被体内的核酸酶破坏. 为了解决这个问题, 文库的一些部份用人造核酸取代以增强对核酸酶的抵抗性. 在他们之中, 核酶(ribozymes), 一种可以催化其它化学反应的催化剂, 也被发现而且可以确认RNA界假说.

关于10X 公司3‘和5"基因表达文库的差异，官方给出的解释如下： 这两者很相似，但在最终的文库中，捕获的是不同的多聚腺苷酸化转录本末端。两种方案都使用了polydT引物用于反转录，但在3‘方案中polydT序列位于凝胶珠oligo上，而在5‘方案中polydT则作为反转录的引物。在这两种方案中，都用到了一种模板转换引物（template switching oligo,TSO）,目的是为了反转录全长转录本。 经过cDNA扩增后，分子在偏好300-400bp长度片段的条件下被随机片段化。片段化后，只有同时包含10X Barcode和Illumina Read 2的接头（它们在片段化后被连接于cDNAs上）的那些转录本，才会在Sample Index PCR过程中被扩增。因此，在最终的文库中，或者体现为3‘末端的转录本（因10X Barcode邻近转录本3‘末端的polyA尾）,或者体现为5‘末端的转录本（因10X Barcode邻近转录本5"末端和TSO）。 下列示意图比较了两种方案的文库构建。请注意不同的单细胞3‘试剂盒版本（V2和V3）其文库构建是类似的，但V3的UMI更长。所需的测序循环数亦有不同。单细胞3‘V3 基因表达文库：单细胞3‘ V2基因表达文库：单细胞5‘ 基因表达文库：

1 直接筛选： 1 利用抗性基因标记 2 营养标记 3 阿拉法半乳糖苷酶标记（插入突变）2 菌落原位杂交杂交（质粒文库）/噬菌斑原位杂交（噬菌体文库），然后用southern杂交检测阳性的位点3 对于表达文库的鉴定，可以通过1表形分析，2利用免疫学探针，3 产物生物功能来判断

基因文库技术分离目的基因 所谓文库(1ibrary)是指一种全体的集合。基因文库(gene library)则是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落(或噬菌斑)(或成活细胞)即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。 构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库。此外基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。基因文库构建包括以下基本程序： ① DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。 ② 载体的选择及制备。 ③ DNA片段或cDNA与载体连接。 ④ 重组体转化宿主细胞。 ⑤ 转化细胞的筛选。当获得了含重组体的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。基因的克隆只是分离基因的基础，基因克隆后还要对克隆的基因进行分离，即利用各种手段把目的基因从文库中分离出来。分离出目的基因还必须对其进行必要的检测与分析：如进行序列测定，体外转录及翻译、功能互补实验等。通过这些实验确定出基因的结构及功能。到这时才能算分离到了目的基因。所以，基因的克隆、克隆基因的分离、分离基因的鉴定是利用基因文库技术分离目的基因的主要内容。一、基因文库的类别 1． 基因组文库与cDNA文库 根据基因类型，基因文库可分为基因组文库及cDNA文库。基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。 cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 基因组文库根据DNA来源又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。 基因组文库与cDNA文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。文库构建时的信息供体是某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织(或器官)在某种环境条件下的基因表达情况，并不能包括该生物有机体的全部基因。在某种意义上讲它可以表现基因组的功能信息。再者，cDNA文库只反映mRNA的分子结构。cDNA中不含有真核基因的间隔序列及调控区，确切说cDNA并不是真正意义上的基因。基因组文库构建时遗传信息供体是基因组DNA，因而无发育时期及组织器官特异性，在一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。目前这两类基因文库在基因工程中都得到有效应用。选择哪一种，主要是根据实验目的。在分离RNA病毒基因，研究功能蛋白序列，分离特定发育阶段或特定组织特异表达的基因时应构建cDNA文库。在研究mRNA分子中不存在的序列及基因组作图时必须构建核基因组文库。 2． 克隆文库及表达文库从基因文库的功能上看可分为克隆文库及表达文库。克隆文库由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片断大量增殖。表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元件外，还具有控制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。表达载体又有融合蛋白表达载体及天然蛋白表达载体之分。 从克隆文库中分离目的克隆时主要利用核酸探针，可以是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可以是同种或同属生物的同源序列探针。从表达文库中分离目的克隆时，因克隆片段的表达产物蛋白质具有抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以利用免疫学探针及生物功能进行筛选。表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因的分离。 3．不同载体的基因文库 目前用于构建基因文库的载体主要有质粒、噬菌体、黏粒及人工染色体四大类。每类中又有许多不同的载体。不同的载体适于构建不同的基因文库。（1）． 质粒文库 质粒是最早用于基因克隆的载体。现已有各种适用于不同工作的如克隆、表达、测序等专用商品质粒。但在构建基因文库上，由于质粒相对较小并只能容纳比自身更小的片段，因此它不能用于构建核基因组文库，通常只用来构建短序列的克隆文库。例如叶绿体DNA分子较小，可以用质粒构建叶绿体DNA文库。质粒载体可用于生物cDNA文库构建。但只适合于高丰度的mRNA。（2）． 噬菌体文库 目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体很多，如单链的M13噬菌体载体、λ噬菌体载体、P1噬菌体载体、噬菌粒(phagemid或phasmid)等。其中使用最多的是入噬菌体。 λ-DNA为双链结构，长49kb。线性分子两端各有一条12个核苷酸的黏性末端称cos位点。分子中有约15kb可去掉的非必要基因区，又称“填充区”， “填充区”两侧的序列含有其增殖所必需的全部基因，称为左、右臂。“填充区”可被外源DNA取代，构成重组体，这是它成为克隆载体的结构基础。由于噬菌体头部包装容量的限制，重组λ-DNA分子大小只能在39—52kb之间。（3）． 黏粒文库 黏粒(cosmid)也称柯斯质粒，是人工构建的由λ噬菌体的COS序列、质粒的复制子序列及抗生素抗性基因序列组合而成的一类特殊的质粒载体。COS序列是DNA包装进噬菌体颗粒所必须的。复制子通常是使用ColEl或pMBl的复制起始位点。黏粒具有λ噬菌体的某些性质，在克隆了大小合适的外源DNA片段并且在体外被包装成噬菌体颗粒后，能高效转导对入噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞。在宿主细胞内按λ噬菌体方式环化，但不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒(因分子中不具入噬菌体全部必要基因)。它也具有质粒载体的主要性质，在宿主细胞内可以像其他质粒一样复制，并与松弛型质粒相同，适量的氯霉素可促进扩增。因具抗生素基因，可以通过抗生素抗性筛选重组子。黏粒载体在构建时也加上了设在插入失活基因内的多克隆位点。黏粒载体的分子较小(2．8—24kb)，但克隆容量很高，对外源DNA长度的要求是30～45 kb，上限几乎是入噬菌体载体容量(23 kb)的2倍，所以黏粒载体在核基因组文库构建上具有相当的优势，可克隆包括3，和5"调控区在内的完整的植物基因。（4）．人工染色体文库 人工染色体载体是利用真核生物染色体或原核生物基因组的功能元件构建的能克隆大于50kbDNA片段的人工载体。其中有的载体既可用于克隆，又能直接转化，是进行基因功能研究的良好载体。近年来陆续发展起来的人工染色体文库有YAC库、BAC库、BIBAC库、PAC库及TAC库。二、核基因组文库构建核基因组文库构建主要使用λ噬菌体置换型载体或黏粒载体。 1． 随机文库克隆数目随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等。对于随机文库: N = ln(1-P) ； ln（1-x/y） N：克隆数目 P：设定的概率值(如：0．99，表示在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0．99) x：插入片段平均大小(15～20kb) y：基因组的大小(以kb计) 如果插入片段平均大小为20kb，某基因组大小为4X108bp，P = 0．99时，根据上式N = 1X105。含1XlO5个克隆的基因文库相当覆盖了5倍的基因组，在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0．99。随机片段可通过机械切割或限制酶消化产生。机械切割法可获得较均一的随机片段，但片段不能直接用于克隆，需经末端修饰、甲基化，连上接头后再用限制性内切酶消化产生黏性末端。用限制酶消化的方法虽然可直接产生黏性末端，但片段的随机性较差，所以采用后种方法时，文库的克隆数目应大于计算值。三、利用PCR技术构建c DNA文库 cDNA文库构建的起始信息物质是mRNA。因此构建cDNA文库首先要考虑的问题是mRNA的含量及质量。生物细胞中mRNA含量较低。通常cDNA文库构建需要ug级的mRNA。对于低丰度的mRNA(<0．5％)，要通过富集或增大克隆数目来保证构建的文库中能够含有它们的克隆

先对蛋白质测序，只要测头尾七八个氨基酸，然后翻译出其基因并据此合成引物，然后从基因文库中PCR即可

酵母单杂交技术是一种研究蛋白质和特定DNA序列相互作用的技术方法，主要包括四个流程即：一、筛选含有报告基因的酵母单细胞株；二、构建表达文库；三、重组质粒转化至酵母细胞；四、阳性克隆菌株的筛选。

克隆基因分离，是指尚没有严格定义，可以理解为基因研究中常规分离过程的俗称。主要有应用核酸探针（核酸杂交筛选）法分离基因文库中目的基因、差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因、mRNA差别显示技术、表达文库筛选和酵母双杂交系统等。应用核酸探针法分离目的基因：把cDNA文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆。应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因：差别杂交亦称差别筛选，适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。克隆基因分离，是指尚没有严格定义，可以理解为基因研究中常规分离过程的俗称。主要有应用核酸探针（核酸杂交筛选）法分离基因文库中目的基因、差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因、mRNA差别显示技术、表达文库筛选和酵母双杂交系统等。应用核酸探针法分离目的基因：把cDNA文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆。应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因：差别杂交亦称差别筛选，适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。

通过构建cDNA表达文库不但可以保护濒危珍稀生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针：cDNA文库的构建将在鱼类分子生物学方面起到更多的作用。

分离目的基因 生物芯片是高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子的微列阵。列阵中每个分子的序列及位置都是已知的，并按预先设定好的顺序点阵。基因芯片是生物芯片的一种，其上固定的是核算类物质，主要用于DNA、RNA分析。分为DNA芯片和微点阵两种。 分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）基因。目前是通过①比较不同物种之间，或同一物种不同个体之间；或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异表达（基因表达平行分析）来实现的。采用基因芯片技术进行基因差异表达研究可以通过杂交直接检测到细胞中mRNA的种类及丰度，与传统的差异显示相比具有样品用量小，自动化程度高，被检测目标DNA密度大及并行种类多等优点。②利用同源探针从cDNA或EST微列阵中筛选分离目的基因。目前有DNA 芯片、cDNA芯片两种。其基本步骤包括：基因芯片的制备、靶样品制备、杂交与检测、目的基因得分离并获得全长。2 基因文库技术分离目的基因 基因文库指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体的形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑，或成活细胞）即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。其类型很多，如可分为基因组文库与cDNA文库、克隆文库与表达文库，按载体分有智力文库、噬菌体文库、黏粒载体文库、人工染色体文库等。基因文库构建后，从文库中筛选基因的方法主要有以下几种：核算杂交法、免疫学检测法、DNA同胞选择法、PCR筛选法等。基因文库的构建是目前基因工程的核心工作，也是分离目的进的常用方法之一。3 功能蛋白组分离目的基因 蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过高效液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如：应用PCR进行分离目的基因：通过对蛋白质的序列分析，可以通过密码子的简并性设计简并引物，可利用RT-PCR 得到目的基因的全长；应用核算杂交筛选法分离目的基因：即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库；免疫雪筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。4 PCR技术在基因克隆中的应用 PCR技术已经渗透到生物学的各个领域，在分子克隆和获得cDNA全长方面起着重要的作用。利用 PCR技术对特定条件下基因的表达进行检测即通过mRNA差别显示（DDRT-PCR）可鉴定和分离出所需的目的基因；通过RT-PCR克隆到目的基因的 cDNA区域进行cDNA文库的构建，通过锚定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因调控区等。现在可用于基因分离和克隆的 PCR方法主要有：RT-PCR，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小节），用于DNA序列克隆的Panhankle- PCR、Cassette-PCR以及减法cDNA文库的PCR法构建等。Panhankle-PCR、Cassette-PCR为基因组已知DNA相临未知序列的克隆奠定了良好的基础。5 mRNA差别显示技术分离差别表达基因 mRNA差异显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速行之有效的方法之一。它是将mRNA反转录与PCR技术结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。它利用5"锚定引物oligo（dT）12MN和3"端随机引物对总mRNA进行PCR扩增，以期得到差异表达的条带。并对其差异显示的条带进行回收、克隆。6 插入突变分离克隆目的基因 获得突变体进行未知基因的克隆是常用的方法之一。这里举T-DNA标签法和转座子诱变分离克隆目的基因的例子。T-DNA标签法是将T-DNA在任何感兴趣的基因处产生插入性突变，获得分析该基因功能的对照突变体。它将T-DNA左右边界之间携带的外源报告基因片段作为一个选择性的遗传标记，因为插入的序列是已知的，因而对获得的转基因重组突变体就可以通过各种克隆和PCR策略加以研究。倘若将35S强启动子在T-DNA整合到宿主基因组后，整合到内原基因的上游，则可以产生异常增加或表达的时空特异性改变而破坏基因的表达的效果。有获得性突变和功能丧失性突变等。转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的植物与遗传上有差异的同种植物杂交，因转座因子插入到某一特定的基因序列而破坏了该基因编码的蛋白，进而导致可见的表性的破坏或改变，这样就可以在产生后代中筛选出新型的突变体。

从基因文库中筛选某一克隆的常用办法是分子杂交。首先把属于一个文库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养皿上以取得相当分散的菌落或噬菌斑，然后用硝酸纤维滤膜吸印，使培养皿和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆。同时另行制备供分子杂交用的探针。为了筛选真核生物的某种基因，常从它的转录产物mRNA经反向转录（见中心法则）合成相应的互补 DNA(cDNA)，再加入用32P标记的核苷三磷酸，用DNA多聚酶I切口移位方法制成有同位素标记的探针。把探针 DNA和硝酸纤维滤膜上的菌落或噬菌体分别进行变性处理，然后进行分子杂交。再将 X光底片覆盖在经过处理的滤膜上以进行放射自显影。在培养皿上找出和 X光底片上的黑点相对应的菌落或噬菌斑，这些菌落或噬菌体中便包含着所需要的基因。经过扩增便能得到大量的细菌或噬菌体，从中可以分离出所需基因的DNA片段。不需要模板，但需要知道其序列，以构建探针去捕获目的基因。补充回答：为了更形象地解答你的问题，我又去搜索了些参考资料。看到了一个不错的比喻，我现在试着借用来解答你的疑惑。如果把基因文库看作一座图书馆，那么目的基因就是一本你感兴趣的书。上面回答的是借书的流程，而你现在的补充问题则属于借书前的工作。如果你只是说要借一本书，却不知道书名、作者、出版社、里面的人物和情节等所有内容，那么纵使有通天的本领，也不可能把这本书从图书馆里帮你调取出来。回到基因文库和目的基因上来。既然是目的基因，那么，对这个基因其实是有一定程度了解的，只是我们手里没有实物。我们要做的不仅是把它调取出来，而是在调取后拿它去做后续工作，这才是重要的。就像借了书要读一样。核苷酸序列信息就相当于书名。如果不知道，你需要能通过其他途径去查询获取。就像通过小说主人公的名字去查得书名最后借到书一样。不知解释清楚没有？欢迎勘误。

蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体，主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过高效液相色谱、质谱对蛋白质序列进行分析，再借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如应用PCR进行分离目的基因；通过对蛋白质的序列分析，可以通过密码子的简并性设计简并引物，可利用RT-PCR得到目的基因的全长；应用核酸杂交筛选法分离目的基因，即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库；免疫学筛选法分离目的基因是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。

酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。发现新的蛋白质和蛋白质的新功能酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。建立基因组蛋白连锁图众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。

生物芯片技术是随着"人类基因组计划"（human genome project, HGP）的进展而发展起来的，它是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，它融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片（1）。本文主要讨论基因芯片技术，它为"后基因组计划"时期基因功能的研究提供了强有力的工具，将会使基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破，该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。 1 基本概念 基因芯片（gene chip）也叫DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situ synthesis）或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。 2 技术基本过程 2．1 DNA方阵的构建 选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物，并作相应处理，然后采用光导化学合成和照相平板印刷技术可在硅片等表面合成寡核苷酸探针;（2）或者通过液相化学合成寡核苷酸链探针，或PCR技术扩增基因序列，再纯化、定量分析，由阵列复制器（arraying and replicating device ARD），或阵列机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片（3）。 2．2 样品DNA或mRNA的准备。 从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须进行扩增提高阅读灵敏度。Mosaic Technologies公司发展了一种固相PCR系统，好于传统PCR技术，他们在靶DNA上设计一对双向引物，将其排列在丙烯酰胺薄膜上，这种方法无交叉污染且省去液相处理的繁锁；Lynx Therapeutics公司提出另一个革新的方法，即大规模平行固相克隆（massively parallel solid-phase cloning）这个方法可以对一个样品中数以万计的DNA片段同时进行克隆，且不必分离和单独处理每个克隆，使样品扩增更为有效快速（4）。 在PCR扩增过程中，必须同时进行样品标记，标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。 2．3 分子杂交 样品DNA与探针DNA互补杂交要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。如用于基因表达监测，杂交的严格性较低、低温、时间长、盐浓度高；若用于突变检测，则杂交条件相反（5）。芯片分子杂交的特点是探针固化，样品荧光标记，一次可以对大量生物样品进行检测分析，杂交过程只要30min。美国Nangon公司采用控制电场的方式，使分子杂交速度缩到1min，甚至几秒钟（6）。德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等认为以肽核酸（PNA）为探针效果更好。 2．4 杂交图谱的检测和分析 用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得到有关基因图谱。目前，如质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏`、快速，有取代荧光法的趋势。 3 应用 3．1 测序 基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列，准确率达99%（7）。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异，结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间，提示了二者在进化上的高度相似性（8）。 3．2 基因表达水平的检测。 用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列（其中14个为完全序列，31个为EST），检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。（9）Schena等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列，来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异，发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达，11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实（10）。在HGP完成之后，用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了（11）。 3．3 基因诊断 从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如，Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。又如，Heller等构建了96个基因的cDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎（RA）相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用（12）。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。 3．4 药物筛选 如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍，基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段，它能够大规模地筛选、通用性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再用m RNA 构建c DNA表达文库,然后用得到的肽库制作肽芯片,则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。或者,利用RNA、单链DNA有很大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利与靶分子相结合，可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上，然后与靶蛋白孵育，形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物，可以筛选特异的药物蛋白或核酸，因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中，Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸，并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物，实验表明，这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。（13）生物芯片技术使得药物筛选，靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高，成本大大降低。基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步，美国很多制药公司已开始前期工作，即正在建立表达谱数据库，从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有很大的潜在应用价值。 3．5 给药个性化 临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异，如药物应答基因，导致对药物产生不同的反应。例如细胞色素P450酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关，如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用，大约5%~10%的高加索人缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异，这些变异除对药物产生不同反应外，还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。另一方面，在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型，HBV基因的多个位点如S,P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。又如，现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3-12月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变。Rt基因四个常见突变位点是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加（14）。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片，则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后有很大的意义。 此外，基因芯片在新基因发现、药物基因组图、中药物种鉴定、DNA计算机研究等方面都有巨大应用价值。 4 基因芯片国内外现状和前景 自从1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片，并制作出芯片系统（15），此后世界各国在芯片研究方面快速前进，不断有新的突破。美国的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、欧洲各国都积极开展DNA芯片研究工作；摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资开展芯片研究。98年12月Affymefrix公司和Molecular Dynamics公司宣布成立基因分析协会（Genetic Analysis Technology Consortium）以制定一个统一的技术平台生产更有效而价谦的设备，与此相呼应，英国的Amershcem Pharmacia Biotechnology公司也在同一天宣布将提供部分掌握的技术以推动这项技术的应用（16）。美国关于芯片技术召开了两次会议，克林顿总统在会上高度赞赏和肯定该技术，将基因芯片看作是保证一生健康的指南针（17）。预计在今后五年内生物芯片销售可达200-300亿美元；据《财富》杂志预测（97.3），在21世纪，生物芯片对人类的影响将可能超过微电子芯片。

摘要： HAP转录因子(HAP2/HAP3/HAP4/HAP5) 是存在于酿酒酵母中的一种异源多聚蛋白，它能与酵母中许多启动子上游的CCAAT盒（顺式作用元件）专一性结合， 以增强基因的转录。在酵母hap5突变株的细胞中，用酵母单杂交系统从水稻cDNA-GAL4表达文库中筛选出的阳性克隆是编码谷胱甘肽氧还蛋白的cDNA，提示细胞内的氧化还原系统可能作用于HAP蛋白，从而对CCAAT盒的结合活力起调节作用。 对HAP3亚基分子中半胱氨酸残基的突变实验结果支持上述推测。关键词： CCAAT，HAP复合物， 转录因子，氧化还原系统DNA-Binding Activity of the Transcription Factor HAP Is Regulated by Cellular RedoxYAO Quan-Hong, XING Yan-Yan, WANG Zong-Yang, ZHANG Jing-Liu and HONG Meng-MinShanghai Institute of Plant Physiology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032Abstract：The CCAAT binding factor of brewer"s yeast Saccharomyces cerevisiae has been shown previously to be a heteromeric complex containing HAP2, HAP3, HAP4 and HAP5 subunits. This factor can bind specifically to CCAAT-containing upstream sites within the promoters of numerous yeast genes, and then activate the transcription. By using a yeast one-hybrid system, we tried to isolate the counterpart of the yeast HAP5 gene from rice cDNA-Gal4 fusion library constructed in a E.coli-yeast shuttle vector pPC86. However, we identified a cDNA encoding glutaredoxin (Fig．1). The results indicte that the cellular redox environment of yeast cell may be a factor regulating the CCAAT-box-binding activity of the HAP3 subunit (Table 1). The results of the HAP3 mutants in which the highly conserved cysteine residues at positions 68 and 72 had been converted to serine support the above suggestion (Table 2).Key words: CCAAT, HAP complex, transcription factor, redox system 真核基因转录起始时，有一些被称为转录因子的核蛋白会结合在真核基因启动子上游的顺式作用元件上，以增强或阻遏真核基因的转录(Wolberger 1993)。 有些转录因子要经过磷酸化或二聚化，引起蛋白分子的构型发生一些改变后，才具有与DNA结合的能力（Hunter和 Karin 1992）。最近Zheng 等（1998）报告，有些转录因子与DNA 的结合活力受细胞中的氧化还原状态的调节。例如，用凝胶滞后试验在体外研究Jun和Fos转录因子与含Ap-1结合位点的DNA的结合作用时，观察到硫氧还蛋白(thioredoxin)、还原辅酶Ⅱ(NADPH)与硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase)可明显提高它们的异源二聚体与DNA的结合能力(Abate等1990)。 在一些真核基因转录起始点上游存在核心序列为CCAAT的顺式元件，该元件可呈正、反两种方向(Van Huijsduijnen等 1987)。 已知酿酒酵母中至少有16种基因的5"端上游都含CCAAT元件。与这些基因上游的CCAAT结合以调节基因转录的反式作用因子是HAP复合物(Pinkham和Keng 1992)， 它是由HAP2、HAP3、HAP4和HAP5 四个蛋白亚基组成的异源多聚体，其中HAP2和HAP3都含有DNA结合域，但单独的HAP2和HAP3蛋白都不具DNA结合活性，只有当HAP2与HAP3 通过它们的亚基结合域形成二聚体蛋白时才构成一个完整的CCAAT盒结合功能域(Xing 等1993) 。而且体内与体外的研究都证实，这种复合功能域的形成还需要HAP5亚基的参与（McNabb等1995）。HAP4亚基含有活化结构域(activation domain)，起活化基因转录的作用(Foraburg和Guarente 1989)。近年来，已从粟酒裂殖酵母、小鼠、大鼠、人等生物中克隆了编码CCAAT盒结合蛋白的基因， 这些CCAAT结合蛋白与酵母HAP转录因子类似蛋白间存在高度同源的结构域(Van Huijsduijnen等1990)；在高等植物中， 也已从油菜中克隆了与HAP2亚基中DNA结构域高度同源的基因(Albani和Robert 1995)。 我们曾报告，用酿酒酵母CYC1基因启动子上游含CCAAT盒的DNA片段为“鱼铒”，在HAP2基因突变的酵母细胞中，用酵母单杂交方法从水稻cDNA-GAL4 表达文库中筛选出了编码HAP2类似蛋白的cDNA克隆(姚泉洪等待发表)。本研究用相似的方法，在HAP5突变的酵母细胞中，用酵母单杂交方法， 试图从水稻cDNA-GAL4 表达文库中筛选出编码水稻HAP5类似蛋白的cDNA。但HAP5类似cDNA没有筛到，却几次筛选到水稻中编码谷胱甘肽氧还蛋白(glutaredoxin)的cDNA。这一意外的结果提示我们HAP转录因子与DNA结合受氧化还原（redox）调节的可能性。 本文报告上述实验结果以及对HAP3亚基中半胱氨酸残基进行的突变实验，并就HAP转录因子的DNA结合活力是否受氧化还原调节的问题进行了讨论。1 材料与方法1.1 工具酶与化学试剂 限制性内切酶和其它基因工程工具酶为德国Boeringer公司产品，X-gal购自Sigma公司，其它化学试剂为美国Sigma公司或国产AR级试剂。1.2 菌种和质粒 MC8为氨基酸缺陷型大肠杆菌菌株(thi－,trp－,ura－,leu－,his－)。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）hap5缺陷型菌株为Δhap5-10 (MATα,leu 2-3,112,ura3-52,his4-519,adel-100,trp1 Δhap5)。大肠杆菌-酵母穿梭载体pLG Δ-265 UP1带有lacZ报告基因、URA选择标记、2μ复制序列和酵母CCAAT盒。lacZ报告基因由CYC1的基本启动子控制，而含CCAAT盒的DNA片段位于CYC1的基本启动子上游，此元件被转录因子结合后，即可调节lacZ基因的表达。酿酒酵母-大肠杆菌穿梭载体pPC86带有色氨酸合成酶基因，系朱群博士赠送。pDB20(HAP5)质粒带LEU选择标记，该载体由ADH1启动子控制酵母HAP5基因的表达用作鉴定水稻类似HAP5 cDNA时的阳性对照。pYP2质粒由本实验室构建，它带有PGK启动子及色氨酸合成酶基因，PGK启动子后的BamHⅠ和KpnⅠ切点间插入用于表达的cDNA。1.3 PCR引物 酵母pPC86载体cDNA插入5"端Gal4激活功能域侧的引物为：GAL4(5"-GGATGTTTAATACCACT-3"）,3"端ADH终止子侧的引物为：TAD4(5"-TTGATTGGAGACTTGACC-3")。水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA(Minakichi等1994)两侧的引物分别为：5"端翻译启始密码子ATG附近的引物Gluta1(5"AAGGATCCATGGCGCTCGCCAAGGCCAAG 3"), 3"端翻译终止密码子TAG附近的引物Gluta2(5"TTGTGGTACCTATGCGGTGATTGTCGTCTTTG 3")。酿酒酵母HAP3基因(Hahn等1988)两侧的引物分别为：5"端翻译起始密码子ATG附近的引物HAP3Z1(5"AAGGATCCATGAATACCAACGAGTCC 3")，3"端翻译终止密码子TGA附近的引物HAP3F1(5"TTGTGGTACCTCAAGGCACCTCTTCG 3")。用于酿酒酵母HAP3基因第68位Cys突变为Ser的内侧突变引物分别为：含突变碱基的5"端引物HAP3Z2(5" CGAAAGAGTCCATGCAGGAG 3")，含突变碱基的3"端引物HAP3F2(5"CTCCTGCATGGACTCTTTCG 3")。用于酿酒酵母HAP3基因第72位Cys突变为Ser的内侧突变引物分别为：含突变碱基的5"端引物HAP3Z3( 5"CATGCAGGAGTCTGTCAGTG 3") ，含突变碱基的3"端引物HAP3F3(5"CACTGACAGACTCCTGCATG 3")。1.4 酵母表达型水稻cDNA库 构于酵母载体pPC86的水稻IR36幼苗的表达型cDNA库由美国Salk研究所的朱群博士提供。1.5 培养基 大肠杆菌MC8生长于添加亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸、维生素B1的M9基本培养基， 用于选择带有水稻cDNA的pPC86质粒。含2％葡萄糖或2％乳酸的酿酒酵母丰富培养基YPD、基本培养基SC及酵母X-gal培养基的制备参照Sherman（1991）的方法。1.6 酵母感受态细胞的制备及质粒转化 酿酒酵母的质粒转化选用Gietz等(1992)的醋酸锂法。于30℃过夜培养5 ml酿酒酵母至OD600为0.5左右，扩大培养至50ml,再生长4h后，5000×g离心8min收集细胞。以20ml无菌水洗，然而把离心收集的酵母以10ml新配的LiAc溶液100mmol/L(用pH 8.0的Tris 10mmol/L、 EDTA 0.1mmol/L 缓冲液配制)洗1次。7000×g离心8min后，最终将酵母细胞悬于0.5ml的LiAc溶液中。50μl的酵母悬液中加入 1μg的质粒DNA、50μg的鲑鱼精DNA及300μl含40% PEG3350的LiAc溶液，充分混匀后于30℃保温30min。接着于42℃热激15min。把离心收集的酵母细胞重悬于TE溶液中，并涂于酵母选择培养基。1.7 DNA操作 酵母DNA的快速抽提按Robzyk和Kassir（1992）的方法。DNA操作按标准的分子克隆步骤（Sambrook等1989）。大肠杆菌的电击转化按Dower等(1988)的方法。抽提含水稻cDNA阳性质粒的双链DNA，在ABI 377型DNA自动化测序仪上进行序列测定。 引物GAL4与TAD4间的PCR扩增反应条件为：94℃ 40s, 42℃ 50s, 72℃ 3min，共扩增30个循环。水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA两侧引物Gluta1和Gluta2间的PCR扩增反应条件为：94℃ 30s, 66℃ 45s， 72℃ 30s，共扩增30个循环。酵母HAP3基因的定点突变采用重叠延伸法(Ho等1989)。HAP3外侧引物间及外侧引物与内侧引物突变间的PCR扩增反应条件为：94℃ 30s, 48℃ 40s，72℃ 30s，共扩增30个循环。2 结果2.1 酵母单杂交法筛选水稻中类似酵母HAP5基因的cDNA 酵母单杂交体系最初是由Wang和Reed (1993)所设计,它含两个质粒：其一为酵母表达质粒，用于表达cDNA与GAL4激活功能域的融合蛋白;另一质粒将一个顺式作用元件与带有基本启动子的细菌lacZ报告基因连接，该载体称作鱼饵质粒。本实验酵母单杂交体系中所用的鱼饵质粒为pLGΔ-265 UP1，该载体是把含CCAAT的顺式作用元件插入到178载体中CYC1基本启动子上游构建而成。我们先将鱼饵质粒pLGΔ-265 UP1转化入酵母菌株Δhap5-10，在不含尿嘧啶的平皿上得到转化子Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)。然后将30μg含水稻cDNA的pPC86载体转化到感受态酵母中，于不含尿嘧啶和色氨酸的培养基上培养。得到3×106左右的转化子，用硝酸纤维膜将这些转化子复印至X-gal平板上进行显色反应。作为阳性对照，含HAP5基因表达载体pDB20(HAP5）及鱼饵质粒pLGΔ-265 UP1的Δhap5-10酵母菌株经培养6 h后已显蓝色。而含水稻cDNA库的质粒pPC86的Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)酵母菌株2 d后才出现蓝色菌落。此实验重复进行了4次，一共获45个蓝色酵母菌落。2.2 酵母阳性菌落的重复筛选 为了验证初筛得到的酵母阳性菌落中是否含有相似于HAP5功能的cDNA克隆，从上述45个酵母阳性菌落中抽提DNA，用电击法将DNA转化到大肠杆菌MC8中，培养于2YT+Ap平板，然后复印至不含色氨酸的M9培养基平板上培养。因为pPC86质粒上带有编码TRP合成酶的标记基因，因此能生长出的菌落表明它带有pPC86质粒。然后再从能在不含色氨酸M9培养基上生长的大肠杆菌中抽提质粒DNA，将这些质粒DNA分别转化到酵母Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)菌株中，于X-gal平板上进行显色，从中鉴定出能使酵母菌落重复变蓝的cDNA克隆17个。2.3 阳性克隆的鉴定和测序 由于hap5缺陷型酵母不能在含非发酵性碳源的培养基上生长，我们将4次酵母单杂交筛选并经复筛后留下的17个阳性质粒转化入Δhap5-10缺陷型酵母进行功能互补法鉴定。结果表明，这些含水稻cDNA的阳性质粒都不能使hap5缺陷型酵母在非发酵性碳源的培养基上生长。它们都没有补偿缺陷型酵母中所缺失的HAP5的功能，因此不是编码类似HAP5的cDNA克隆。为了弄清它们的结构，我们以GAL4和TAD4为引物进行PCR扩增。并对扩增出的cDNA顺序分别进行Sau3AⅠ酶切，根据酶切带型对各批筛出的cDNA进行归类。结果表明，17个中有6个筛出的阳性cDNA具类似酶切带型；4次筛库中有3次获得该类cDNA克隆。我们以GAL4和TAD4两引物直接对具相似酶切带型、编号为C3的cDNA进行DNA序列分析，图1的结果显示其核苷酸与已报道的水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA序列完全相同(Minakichi等1994)。我们又按照所测出的水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA的核苷酸顺序，合成了cDNA两端的寡核苷酸引物gluta1和gluta2，并对所获的6个具相同酶切带型的cDNA克隆进行PCR扩增，结果也确证它们都是编码水稻谷胱甘肽氧还蛋白的cDNA。图1 水稻C3 cDNA克隆的核苷酸顺序及推导的氨基酸序列Fig.1 Sequence of the C3 cDNA clone and predicted amino acid sequence2.4 C3所编码的谷胱甘肽氧还酶对HAP复合物DNA结合活性的影响 以C3的DNA为模板，用两端分别存在BamHⅠ和KpnⅠ酶切点的gluta1和gluta2为引物进行PCR扩增。将此含glutaredoxin基因完整编码区的PCR扩增片段经BamHⅠ和KpnⅠ酶切后克隆到酵母表达载体pYP2中PGK启动子后的相应酶切点间，构成酵母重组质粒pYP3。接着将pYP2、pDB20、pDB20(HAP5)与pYP3等4种质粒分别转化到已经带有质粒p178或pLGΔ-265 UP1的两酵母菌株Δhap5-10(p178)和Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)中。将上述4种质粒分别转化两株酵母菌株。这两株酵母菌株为hap5突变株，但含有具激活功能的HAP4蛋白，有结合功能的HAP2、HAP3蛋白。在不含尿嘧啶和色氨酸的培养基上得到转化子，并将这8种酵母转化子用硝酸纤维素膜分别复印至X-gal平板上进行显色反应，2 d后转化子Δhap5-10( pYP3+pLGΔ-265 UP1)显蓝色，阳性对照菌株Δhap5-10(pDB20(HAP5)+pLGΔ-265 UP1)菌落呈深蓝色，而阴性对照菌株Δhap5-10(pYP2+pLGΔ-265UP1)和Δhap5-10(pDB20+pLGΔ-265 UP1)以及4种质粒在酵母菌株Δhap5-10(178)中的转化子都没有蓝色显现(表1)。说明glutaredoxin能使HAP2、HAP3与HAP4在没有HAP5的情况下使lacZ基因得到表达。表1 C3所编码的glutaredoxin对鱼饵质粒上lacZ基因表达的影响Table 1 Effects of glutaredoxin encoded by C3 on the lacZ gene expression in bait plasmidPlasmid Expression of lacZ gene p178 pLGΔ-265 UP1 pYP2 － － pDB20 － － pDB20(HAP5) － +++ pYP3 － + 2.5 HAP3蛋白Cys位点突变对HAP复合物DNA结合活性的影响 在hap5缺失型酵母细胞中，glutaredoxin能使HAP2、HAP3与HAP4一起使lacZ表达。由于已知glutaredoxin是参与调节细胞氧化还原状态（redox）的主要成分，因此我们推测它对HAP蛋白的作用可能是调节HAP蛋白中－SH与－S－S的可逆反应。为弄清它是否起这种作用，我们将HAP3基因第68位及第72位Cys突变为Ser，来验证此种推测是否正确。方法是以Δhap5-10菌株DNA为模板，分别以HAP3Z1、HAP3F2及HAP3Z2、HAP3F1这两对引物进行PCR扩增。再以回收的两个PCR产物为模板，通过HAP3Z1和HAP3F1引物扩增出第68位Cys突变为Ser的HAP3基因。并以同样的方法获得第72位Cys突变为Ser的HAP3基因。分别将HAP3基因及两突变基因的BamHⅠ和KpnⅠ酶切产物克隆入pYP2酵母表达载体，构成带有HAP3基因的质粒pYP4、带有第68位Cys突变为Ser的HAP3基因的质粒pYP5及第72位Cys突变为Ser的HAP3基因的质粒pYP6。接着把pYP4、pYP5和pYP6质粒分别转化入含质粒p178和pLGΔ-265 UP1的酵母Δhap5-10菌株中，在不含尿嘧啶和色氨酸的培养基上选择酵母转化子。转化子用硝酸纤维膜复印至X-gal平板上进行显色反应，2 d后两种带有HAP3发生突变基因的质粒的转化子在没有glutaredoxin存在的情况下都显示出蓝色。而带有正常HAP3基因质粒的转化子没有显示蓝色，且转化到Δhap5-10(178)菌株中的4种转化子也没有显示蓝色(表2)。该结果说明在hap5基因突变酵母细胞中，－SH被突变后的HAP3亚基与细胞中的HAP2、HAP4，即能在单杂交系统中使lacZ基因组成性地表达，而无需glutaredoxin的氧还调节。表2 HAP3蛋白Cys位点突变对鱼饵质粒上lacZ基因表达的影响Table 2 Effects of mutant HAP3 at cysteine residues on the lacZ gene expression in bait plasmidPlasmid Expression of lacZ gene p178 pLGΔ-265 UP1pYP2 － － pYP4 － － pYP5 － + pYP6 － + 3 讨论 细胞中存在多个调节细胞氧化还原(redox)状态的系统，其中之一为谷胱甘肽氧还蛋白系统，此系统包含谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶与谷胱甘肽氧还蛋白(Holmgren 1989)。该系统通过谷胱甘肽氧还蛋白中半胱氨酸残基上的－SH氧化成－S－S－键或可逆地还原成－SH来调节细胞中的redox状态。这种redox状态也促使某些功能性蛋白分子上的－SH或－S－S－随即发生可逆的氧化或还原，并引起蛋白分子的构型改变，从而影响蛋白分子的活性、稳定性与正确的折叠等重要功能(Holmgren 1989)。 我们在HAP2酵母突变株细胞中，用酵母单杂交方法从水稻cDNA-GAL4 表达文库中成功地筛选到水稻中与HAP2类似的基因RAPB，且RAPB基因可互补酵母的hap2缺陷。这表明用此套单杂交系统来筛选转录因子基因是有效的。按推理，用相同的酵母单杂交系统，在酵母hap5突变株细胞中也应能筛选到水稻的HAP5类似基因，但是所得到的阳性cDNA克隆都不能互补酵母HAP5的缺陷性状。对所得到的阳性cDNA克隆进行核苷酸顺序分析的结果表明，从水稻cDNA文库中得到的这些cDNA所编码的是谷胱甘肽氧还蛋白，而不是期望的水稻编码类似酵母HAP5蛋白。Minakichi等(1994)曾报告水稻glutaredoxin基因的表达主要集中于种子中，而在叶片中的表达很低。而4次筛水稻叶片表达型库过程中有3次筛到glutaredoxin基因，这说明这一实验结果并非偶然。至于为何未筛到HAP5类似基因，是由于我们所用的水稻cDNA-GAL4表达文库中没有HAP5-cDNA，还是由于水稻中没有类似此功能的基因，这还有待进一步研究。 酵母功能互补试验显示水稻glutaredoxin基因没有明显的互补HAP5基因的活性；酵母单杂交试验的结果也说明水稻glutaredoxin基因增强lacZ基因表达的活性远低于HAP5基因。有人推测酵母HAP5蛋白的功能可能是与HAP2和HAP3两亚基间发生疏水相互作用，从而促使形成一种稳定的能结合CCAAT盒的复合结构(McNabb等1995)。如果这种推测是正确的话，那么glutaredoxin的作用也可能是使HAP3亚基保持－SH基状态，从而使HAP2和HAP3之间形成一种不稳定的与CCAAT盒结合较弱的复合结构。glutaredoxin对HAP复合物DNA结合活性的促进及HAP3亚基中半胱氨酸残基突变成丝氨酸残基实验的结果与上述推测较相符。即第68和72位Cys突变为Ser的HAP3蛋白和HAP2蛋白相互作用即具有CCAAT盒结合活性。 到目前为止，已经报告过许多转录因子，如c-fos和c-jun(Abate等1990)，NFκB/Rel(Matthews等 1992)，c-Myb(Guehmann等1992)，BPV-1(McBride等1992)，USF(Pognonec等1992)和NF-Y(Nakshatri等1996)等的DNA 结合活力均受redox调节。其中NF-Y是从人与小鼠细胞中克隆出的能与CCAAT盒结合的转录因子， 它也是异源多聚体蛋白。NF-YA、NF-YB分别为酿酒酵母的HAP2、HAP3的类似基因，两者中有高度同源的结构域，且功能上可互换(Maity等1992, Kim等1996，Coustry等1995)。另外至今所发表的HAP3类似蛋白中3个半胱氨酸残基的位置是保守的(Xing等1993)。 Nakshatri等(1996)报告小鼠的NF-Y转录因子与CCAAT盒在体外的结合活力受redox 状态的调节。硫氧还蛋白可以增强NF-Y异源多聚蛋白与CCAAT盒结合的活力，当－SH基被烷化后NF-Y与CCAAT的结合活性受到破坏。通过将蛋白分子的半胱氨酸残基逐个突变去除，证明受调节的是NF-YB亚基中的第85位与89位上的两个半胱氨酸，已知硫氧还蛋白与谷胱甘肽氧还蛋白一样，也是细胞中一种氧化还原调节系统， 因此我们报告的glutaredoxin在没有HAP5的情况下能使HAP2 与HAP3 结合在CCAAT盒上的发现，与他们的结果特别是硫氧还蛋白对NF-Y蛋白与CCAAT盒结合活性的调节作用可以互为佐证，并对进一步了解HAP5(NF-YC)亚基的功能有重要的意义。国家自然科学基金(39893320)资助项目。作者单位：中国科学院上海植物生理研究所，上海 200032

最大用途在于疾病检测基因表达水平的检测　用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。谢纳(M.Schena) 等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列，来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异，发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达，11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在HGP完成之后，用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。基因诊断　从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如Affymetrix公司，把p53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成p53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。又如，Heller等构建了96个基因的cDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎（RA）相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。药物筛选　利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再cDNA表达文库得到的肽库制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。还有，利用RNA、单链DNA有很大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利与靶分子相结合，可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上，然后与靶蛋白孵育，形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物，可以筛选特异的药物蛋白或核酸，因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中，Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸，并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物，实验表明，这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。生物芯片技术使得药物筛选，靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高，成本大大降低。个体化医疗　临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异（单核苷酸多态性，SNP），导致对药物产生不同的反应。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。另一方面，在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型，HBV基因的多个位点如S、P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。测序　基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。研究人员用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列，准确率达99%。用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异，结果发现在外显子约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间，提示了二者在进化上的高度相似性。生物信息学研究　人类基因组计划是人类为了认识自己而进行的一项伟大而影响深远的研究计划。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能，只有知道其功能才能真正体现HGP计划的价值--破译人类基因这部天书。后基因组计划、蛋白组计划、疾病基因组计划等概念就是为实现这一目标而提出的。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。生物芯片技术就是为实现这一环节而建立的，使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能，必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台，成为基因组信息学研究的主要技术支撑。生物芯片作为生物信息学的主要技术支撑和操作平台，其广阔的发展空间就不言而喻。在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物基因组图谱、药物筛选、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台，这从中国99年3月国家科学技术部刚起草的《医药生物技术“十五”及2015年规划》中便可见一斑：规划所列十五个关键技术项目中，就有八个项目（基因组学技术、重大疾病相关基因的分离和功能研究、基因药物工程、基因治疗技术、生物信息学技术、组合生物合成技术、新型诊断技术、蛋白质组学和生物芯片技术）要使用生物芯片。生物芯片技术被单列作为一个专门项目进行规划。总之，生物芯片技术在医学、生命科学、药业、农业、环境科学等凡与生命活动有关的领域中均具有重大的应用前景。

1 核酸杂交是最常用,最可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子.1)同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.2)部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.3)总cDNA探针:通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.cDNA扣除探针:从第一种mRNA制备cDNA探 针, 连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交;回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的第一种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.* 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆.5)合成寡核苷酸探针2 特异性免疫学检测在cDNA表达文库中,目的基因的表达产 物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测3 cDNA克隆的同胞检测将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆.4 cDNA克隆的确证cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.第四节 目的基因的分离外源基因:插入到载体内的那个特定的片段基因.目的基因:那些已被或者准备要分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA片段.

【答案】：基因文库是指包含某一生物基因组DNA片段的全部克隆。即将整个基因组DNA切成片段，并用合适的载体将全部DNA片段进行克隆。文库中每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。cDNA文库是指包含某一生物mRNA的全部cDNA克隆。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。cDNA文库的优点：①文库中只含表达基因的cDNA，种类数比基因数少得多，较易筛选到目的基因克隆。②真核生物基因由于含有内含子，在原核生物细胞中不能直接表达。cDNA文库中筛选到cDNA克隆，只要附上原核生物的调节和控制序列，就能在原核细胞内表达。③由于cDNA不含真核生物基因的启动子和内含子，因而其DNA序列比基因短，可选用质粒或噬菌体载体作为克隆载体。微生物的单个基因只占基因组DNA的很小部分，要从中分离某一目的基因，就好比大海捞针，是一项十分艰巨的工作。建库后，利用标记的基因探针进行：DNA杂交，或者用抗体与表达蛋白进行免疫反应，或检测表达蛋白活性，从文库中较易筛选出含目的基因的克隆。

《给孩子们的故事》读后感童喜喜在讲座中强调，“不老泉文库”是近期出版的儿童文学经典系列，那么这套书的魅力到底何在？记者采访了“不老泉文库”策划人、二十一世纪出版社副总编辑魏钢强。魏钢强在介绍“不老泉文库”时，提炼了三个关键词，即“20世纪”、“佳作”和“模样”，以表达文库与其他儿童文学系列的气质差异。20世纪，指文库给出了极为明确的时间断限：往前不收公版书，往后排除了本世纪的作品。佳作，则概括了文库对收录好书评价标准：时间的评判比任何大奖，任何排行榜都更具有权威性。如果一本书受到好评，虽然过去了十多年，在高度商业化的美国、英国这样的国家，它仍能一版再版，还能够输出版权，对这样的书有理由高看一眼。模样，则指文库不限定篇幅和体裁，类型上更加开放。在设计和装帧上尽量保留原版书的感觉，优先考虑阅读和收藏，而不是宣传和销售。　　目前，“不老泉文库”已出版了《不老泉》、《银顶针的夏天》、《时代广场的蟋蟀》等6部，已畅销100多万册，其中《不老泉》还被新闻出版广电总局列为2014年向全国青少年推荐的百种优秀图书。麦克米伦世纪为加快“不老泉文库”品牌的打造，将于今年6月底集中推出《妮尔的天空》、《真正的贼》、《沉船的眼睛》、《苏菲的航海日志》、《给孩子们的故事》等作品。截止到今年年底，“不老泉文库”将扩充至20余部。　　在本次讲座结束后，麦克米伦世纪还将在江西、浙江、福建、广东等多地启动“不老泉文库”进校园的活动，并设万元奖金奖励优秀书评，让孩子们一起来领会经典阅读的魅力。

1. 《给孩子们的故事》好句 《给孩子们的故事》读后感 童喜喜在讲座中强调，“不老泉文库”是近期出版的儿童文学经典系列，那么这套书的魅力到底何在？记者采访了“不老泉文库”策划人、二十一世纪出版社副总编辑魏钢强。魏钢强在介绍“不老泉文库”时，提炼了三个关键词，即“20世纪”、“佳作”和“模样”，以表达文库与其他儿童文学系列的气质差异。20世纪，指文库给出了极为明确的时间断限：往前不收公版书，往后排除了本世纪的作品。佳作，则概括了文库对收录好书评价标准：时间的评判比任何大奖，任何排行榜都更具有权威性。如果一本书受到好评，虽然过去了十多年，在高度商业化的美国、英国这样的国家，它仍能一版再版，还能够输出版权，对这样的书有理由高看一眼。模样，则指文库不限定篇幅和体裁，类型上更加开放。在设计和装帧上尽量保留原版书的感觉，优先考虑阅读和收藏，而不是宣传和销售。 目前，“不老泉文库”已出版了《不老泉》、《银顶针的夏天》、《时代广场的蟋蟀》等6部，已畅销100多万册，其中《不老泉》还被新闻出版广电总局列为2014年向全国青少年推荐的百种优秀图书。麦克米伦世纪为加快“不老泉文库”品牌的打造，将于今年6月底集中推出《妮尔的天空》、《真正的贼》、《沉船的眼睛》、《苏菲的航海日志》、《给孩子们的故事》等作品。截止到今年年底，“不老泉文库”将扩充至20余部。 在本次讲座结束后，麦克米伦世纪还将在江西、浙江、福建、广东等多地启动“不老泉文库”进校园的活动，并设万元奖金奖励优秀书评，让孩子们一起来领会经典阅读的魅力 2. 高尔基的《童年》好句赏析 1、‘外祖父家里，弥漫着人与人之间的强烈的仇恨之雾；大人都中了仇恨的毒，连小孩也热衷于参加一份。 赏析；此句写出了外祖父家这种残暴的行径给孩子们幼小的心灵带来了严重的伤害，使孩子们也像大人们一样恶毒或郁郁寡欢。 2、有天晚上，在已经喝过茶，还没有吃晚饭之前，舅舅们和格里戈利师傅正在把染好了的成幅料子缝成一匹一匹的，然后在上面缀个厚纸签儿。米哈伊尔舅舅想跟那个快瞎的格里戈利开个玩笑，叫九岁的侄儿在蜡烛上烧师傅的顶针。萨沙用烛花镊子夹着顶针烧起来，把它烧得滚烫的，偷偷地放到格里戈利的手底下后，就躲到炉子后面去了。 赏析；此段通过描写萨沙的动作，写出了恃强凌弱是这个小市民家庭的癖好 。 3、用一天傍晚，他来了，打扮得像过节似的，穿着金黄的绸衬衫、绒布裤子、像手风琴般轧轧作响的皮靴。他的头发发亮，浓眉下一对愉快的斗鸡眼，还有年轻的小胡子底下雪白的牙齿，都闪闪发光，他那绸衬衫，和谐地映着长明灯的红光，像是在燃烧。 赏析：此段通过描写‘小茨冈"的外貌，写出了‘小茨冈"为了来看望我，特意穿得很隆重 。 4、‘小茨冈"像一团火在燃烧，他张开双手，像一只鹞鹰展翅翱翔，脚步快得令人难以想象；他尖叫了一声，往地上一蹲，像一只金色的雨燕上下窜动，绸衬衫颤抖着，晃动着，仿佛在燃烧，在融化，发出耀眼的光辉，把周围都照亮了。 赏析：此段通过描写‘小茨冈"的动作，写出了‘小茨冈"的舞蹈优美 。 5、母亲下葬后几天，外祖父对我说："喂，列克谢，你不是奖章，不能老是挂在我的脖子上，这不是你呆的地方，你到人间混饭吃去吧。" 于是，我去了人间。 赏析：祖父淡淡的话语，预示着高尔基童年的结束，，他要开始另一种生活了，去人间，开始新的生活。 6、伏尔加河蓝色的水面上，桔红色的轮船在逆流而上，而一张张金色的叶片则缓缓顺流漂下。 赏析：运用对比的修辞手法，并运用多种色彩，描绘了秋季伏尔加河上轮渡的景色，淡淡的，却也宁和。 7、那曲子激昂中含着忧伤，仿佛是从高山奔流而下的河水，激荡在房间中。 赏析：这句话运用比喻的修辞手法，把曲子比作河水，生动形象地表现了曲子的感染力。 8、歌唱中，外祖母时而前进，时而后退，时而飞旋，青春瞬间回到了她的身上，令她呈现出一种鲜花绽放般的美丽。每个人都被她吸引住了。 赏析：运用比喻的修辞手法，把外祖母比作鲜花，又运用动作描写、烘托、夸张等手法，表现了外祖母跳舞时的美好，表达作者对外祖母的爱。 9 、“醒一醒吧，人都有一死，这算得了什么，小鸟不是也要死吗？” 赏析：醒一醒吧，简洁的话语，让人感到悲痛又无奈，孩子都要学着长大。即使是安慰，也要让他认清现实。 10、灯影不再摇曳，月光清楚地印在地板上，显得那么凄凉而又安详。 赏析：这句话选取灯影、月光等有特征的景物，。运用环境烘托出一片凄凉安详的气氛。 3. 童年好句摘抄及赏析 1.在外祖父家打架时场面的描写： 两个舅舅忽地一声站起来，把身子伸过桌子，冲着外祖父大叫大吼，像狗似的冤屈地龇着牙，哆嗦着。 外祖父用羹匙敲着桌子，满脸通红，叫声像公鸡打鸣似的响： “叫你们全给我要饭去！” 外祖母痛苦得面孔都变样儿了，说： “全都分给他们吧，你也好落得耳根子清静，分吧！” “住嘴，都是你惯的！”外祖父叫喊着，两眼直发光。真怪，别看他个子小，叫起来却震天动地。 赏析：加 这段文字虽然不长，却把一具乱七八糟的打架场面写得很有层次，把每一个人的动作、表情、心情都鲜明地描写出来，读后给人一种身临其境的感觉。2. 抄写：在幽暗的小屋里，我父亲躺在窗下地板上，他穿着白衣裳，身子伸得老长老长的，他的光脚板的脚指头，奇怪地张开着，一双可亲的手安静地放在胸脯上，手指也是弯曲的；他那一对快乐的眼睛紧紧地闭住，像两枚圆圆的黑铜钱，他的和善的面孔发黑，难看地龇着牙吓唬我。 赏析：《童年》在艺术上运用儿童视角和成人视角交替使用的方法去描写。作品主要从儿童的视角观察描写生活，使“童年”更加生动，充满童趣， 以上一段话的描写十分真实地表现了一个3岁男孩的心态。 因为他年纪小，还不懂死亡意味着什么，所以他注意的是那些他认为有趣、奇怪的事情，例如父亲的脚趾奇怪地张开着，难看地龇着牙等等。另一方面，作家又偶尔以成人的视角评点生活，使作家笔下所写的文字含义更清晰更深刻，更富有思想性和哲理性。 3.抄写： 她今天样子很凶，但当我问起她的头发为什么这样长的时候，她还是用昨天那样温暖而柔和的腔调说： “看来这世上递给我的惩罚，上帝说：给你梳这些该死的头发去吧！年轻的时候，我夸耀过着一把马鬃，到老来，我可诅咒它了。你睡吧！还早着呢，——太阳睡了一夜刚起来……” “我不想睡！” “不想睡就不睡好了，”她马上表示同意，一面编辫子，一面往沙发那边瞧，母亲就在沙发上躺着，脸朝上，身子直的像一根弦。 “你昨天怎么把牛奶瓶子打破了？你笑声说！” 外祖母说话好似在用心地唱歌，字字句句都想鲜花那样温柔、鲜艳和丰润，一下子就牢牢地打进我的记忆里。她微笑的时候，那黑得像黑樱桃的眼珠儿睁得圆圆的，闪出一种难以形容的愉快光芒，在笑容里，快活地露出坚固雪白的牙齿。 虽然黑黑的，两颊有许多皱纹，但整个面孔仍然显得年轻，明朗。但这面孔却被松软的鼻子、胀大了的鼻孔和红鼻尖而给弄坏了。 她从一个镶银的黑色鼻烟壶里嗅烟草。她的衣服全是黑色的，但通过她的眼睛，从他内心却射出一种永不熄灭的、快乐的、温暖的光芒。 她的腰弯得几乎成为驼背，肥肥胖胖，可是举动却像一只大猫似的轻快而敏捷，并且柔软得也像这可爱的动物。 赏析：文章以极其细腻而又饱含神情的笔触描绘了“外祖母”这充满人性光辉的人物形象。 在外祖母没有听的我的声音时，她的样子很凶，“嘴唇歪扭着，黑眼珠儿闪着气愤的光芒”。当我问到头发为什么这么长的时候，外祖母即刻改换了模样，“还是用昨天那样的温暖而柔和的腔调说”。 外祖母总是用这样温暖柔和的腔调对我说话。 把自己的头发长说成是上帝给自己的惩罚，自嘲中满含着幽默，一个多么开朗的人啊。 “你睡吧，还早着，——太阳睡了一夜刚起来……”多像在一个童话般的世界中，一个慈祥老人所说的话呀，可以想象出她脸上洋溢的微笑，可以感受到她轻松和谐的语调。 “我不想睡！”感叹号昭示着我态度的坚决，显现出我在外祖母面前的无拘无束乃至略微的放肆。 对于我这样的言语，外祖母马上表示同意“不想睡就不睡好了。”外祖母就是这样尊重我——一个儿童的意愿！她的这样的平常的话，如同那窗外的阳光温暖着我幼小的心灵。 她微笑时，“闪出一种难以形容的愉快光芒”，“快活地露出雪白的牙齿”有皱纹的面孔“年轻、明朗”，我的外祖母是乐观的、充满朝气的；全黑的衣服遮不住她眼睛里射出发自内心的“永不熄灭、快乐的、温暖的光芒。”外祖母又是顽强刚毅的；她“腰弯得几乎成为驼背”，“肥肥胖胖”，“却又像一只大猫似的轻快而敏捷”，我的外祖母是又是可爱的。 在那天醒来的早晨，我就这样静静地注视着我的慈爱的、乐观的、坚毅的外祖母，让她的唱歌似的话语，如鲜花般在我的心底温柔地开放…… 这便是透过高尔基文字的河流，我们所能感知到的温馨的画面。外祖父家里，弥漫着人与人之间的强烈的仇恨之雾；大人都中了仇恨的毒，连小孩也热衷于参加一份。 " 赏析；此句写出了外祖父家这种残暴的行径给孩子们幼小的心灵带来了严重的伤害，使孩子们也像大人们一样恶毒或郁郁寡欢。2."有天晚上，在已经喝过茶，还没有吃晚饭之前，舅舅们和格里戈利师傅正在把染好了的成幅料子缝成一匹一匹的，然后在上面缀个厚纸签儿。 米哈伊尔舅舅想跟那个快瞎的格里戈利开个玩笑，叫九岁的侄儿在蜡烛上烧师傅的顶针。萨沙用烛花镊子夹着顶针烧起来，把它烧得滚烫的，偷偷地放到格里戈利的手底下后，就躲到炉子后面去了。 " 赏析；此段通过描写萨沙的动作，写出了恃强凌弱是这个小市民家庭的癖好。3."用一天傍晚，他来了，打。 4. 求10句高尔基《童年》的佳句赏析 1“从那时起，她的上帝对于我更亲近更可理解了。” 赏析：外祖母的上帝意味善良，宽恕和仁慈，"我"从外祖母的上帝那里明白了许多做人的道理，更贴近我的心灵，所以显得更亲切更可理解了。 2“在她没来之前，我仿佛是躲在黑暗中睡觉，但她一出现，就把我叫醒了，把我领到光明的地方。" 赏析：我童年时期生活在一个充满黑暗，丑陋，冷酷，污浊的环境中，正是慈祥善忍，宽厚善良的外祖母，才让“我”不被环境压垮，保持着生活的信心和勇气，成长为一个坚强，善良，勇敢的人。 3“黑得像黑樱桃似的眼珠儿睁得圆圆的，闪出一种难以形容的愉快光芒 。” 赏析：运用比喻的修辞手法描写外祖母的肖像，形象地表现了外祖母丰富的情感世界和乐观坚毅的个性。 4“走开！”她大吼一声，“踩死你，走开……” 赏析：这句话是对外祖母的动作和语言描写，生动传神的写出了外祖母的另一种性情，丰富了外祖母的性格特点，与前文的遇事冷静沉着形成对比，体现了外祖母有很多种性格，但是却不让人讨厌，恰恰相反，让人觉得外祖母很可爱，体现了作者对外祖母的喜爱与赞美。 5那曲子激昂中含着忧伤，仿佛是从高山奔流而下的河水，激荡在房间中。 赏析：作者把取自带给人的感受比作高山奔流而下的河水，生动形象的写出了这首曲子的激昂和汹涌的气势，也借河水的柔弱，突出了曲子中隐藏的忧伤。 6我非常害怕外祖父，总觉得他的绿眼珠无时无刻不在盯着我看。 赏析：生动形象地写出了我内心的恐惧与紧张，突出了外祖父的凶神恶煞。 7."外祖父家里，弥漫着人与人之间的强烈的仇恨之雾；大人都中了仇恨的毒，连小孩也热衷于参加一份。" 赏析；此句写出了外祖父家这种残暴的行径给孩子们幼小的心灵带来了严重的伤害，使孩子们也像大人们一样恶毒或郁郁寡欢。 8."用一天傍晚，他来了，打扮得像过节似的，穿着金黄的绸衬衫、绒布裤子、像手风琴般轧轧作响的皮靴。他的头发发亮，浓眉下一对愉快的斗鸡眼，还有年轻的小胡子底下雪白的牙齿，都闪闪发光，他那绸衬衫，和谐地映着长明灯的红光，像是在燃烧。" 赏析；此段通过描写‘小茨冈"的外貌，写出了‘小茨冈"为了来看望我，特意穿得很隆重。 9."有天晚上，在已经喝过茶，还没有吃晚饭之前，舅舅们和格里戈利师傅正在把染好了的成幅料子缝成一匹一匹的，然后在上面缀个厚纸签儿。米哈伊尔舅舅想跟那个快瞎的格里戈利开个玩笑，叫九岁的侄儿在蜡烛上烧师傅的顶针。萨沙用烛花镊子夹着顶针烧起来，把它烧得滚烫的，偷偷地放到格里戈利的手底下后，就躲到炉子后面去了。" 赏析；此段通过描写萨沙的动作，写出了恃强凌弱是这个小市民家庭的癖好。 10.""小茨冈"像一团火在燃烧，他张开双手，像一只鹞鹰展翅翱翔，脚步快得令人难以想象；他尖叫了一声，往地上一蹲，像一只金色的雨燕上下窜动，绸衬衫颤抖着，晃动着，仿佛在燃烧，在融化，发出耀眼的光辉，把周围都照亮了。" 赏析；此段通过描写‘小茨冈"的动作，写出了‘小茨冈"的舞蹈优美。 望采纳~ 5. 《童年》的佳句赏析 阿廖沙因把桌布放进染缸遭外公毒打，卧床养伤。后来，外公来看他，向他讲起自己年轻时在伏尔加河上做纤夫时的情形，节选片段即为外公讲述内容。 片段主要描述了两个场景：一是纤夫拉纤时的场景，一是纤夫们休息时的场景。两幅场景形象而逼真地展示了19世纪上半叶俄国纤夫生活的全貌。一方面纤夫的工作是沉重、痛苦、令人无法忍受的。赤脚逆水行船，上有能将脑壳晒的直冒油的太阳，下有又尖又利的碎石子。腰弯的头点地，浑身的骨头格格作响，汗浸得眼看不见路，连跌交也是值得高兴的事，因为可以趁机喘口气。这种场景让人不由得想到俄国著名画家列宾油画《伏尔加河上的纤夫》中所展示的纤夫形象。纤夫的日子是沉重而艰辛的，这里作者坚持了他现实主义写作原则，不夸张，不想象，全部用白描手法将烈日下纤夫拼命拉纤的步履维艰刻画得入木三分，读后让人动容。但另一方面纤夫们对待沉重生活的态度又是开朗乐观的。休息歇脚时，他们一边煮饭，一边唱起心爱的歌谣，喊声震耳，连稀饭溢出来都不知道。面对生活的苦难，他们没有叹息，没有沉默，而是工作时拼命努力，休息时尽情宣泄。为了显示纤夫们歌声的豪迈，作者用伏尔加河水来衬托。“这时，伏尔加河的流水就仿佛流的更快了，河水像一匹脱缰的野马奔腾起来，直冲云霄。”白天劳作场景与傍晚休息场景对照来看，俄国纤夫生活的悲惨与对生活乐观开朗的态度就很鲜明的体现出来了。 这个片段是《童年》全书中对外公为数不多的正面描写中着墨最多的一处。阿廖沙听着外公的讲述，觉的外公成了外婆童话中的人物，由一个干瘦的小老头变成童话中的大力士，一个人用纤绳拉着一条巨大的灰色货船沿着伏尔加河逆流而上。这也从另一方面说明外公残暴自私、冷酷、吝啬之外还有一些好的品质，如果不是当时社会的逼迫，也许他不会变成后来那样一个令阿廖沙讨厌、憎恶的恶人，这是对黑暗社会的控诉。 6. 童年佳句积累并赏析 "外祖父家里，弥漫着人与人之间的强烈的仇恨之雾；大人都中了仇恨的毒，连小孩也热衷于参加一份。 赏析；此句写出了外祖父家这种残暴的行径给孩子们幼小的心灵带来了严重的伤害，使孩子们也像大人们一样恶毒或郁郁寡欢。 "有天晚上，在已经喝过茶，还没有吃晚饭之前，舅舅们和格里戈利师傅正在把染好了的成幅料子缝成一匹一匹的，然后在上面缀个厚纸签儿。米哈伊尔舅舅想跟那个快瞎的格里戈利开个玩笑，叫九岁的侄儿在蜡烛上烧师傅的顶针。萨沙用烛花镊子夹着顶针烧起来，把它烧得滚烫的，偷偷地放到格里戈利的手底下后，就躲到炉子后面去了 赏析；此段通过描写萨沙的动作，写出了恃强凌弱是这个小市民家庭的癖好 3."用一天傍晚，他来了，打扮得像过节似的，穿着金黄的绸衬衫、绒布裤子、像手风琴般轧轧作响的皮靴。他的头发发亮，浓眉下一对愉快的斗鸡眼，还有年轻的小胡子底下雪白的牙齿，都闪闪发光，他那绸衬衫，和谐地映着长明灯的红光，像是在燃烧。" 赏析；此段通过描写‘小茨冈"的外貌，写出了‘小茨冈"为了来看望我，特意穿得很隆重 小茨冈"像一团火在燃烧，他张开双手，像一只鹞鹰展翅翱翔，脚步快得令人难以想象；他尖叫了一声，往地上一蹲，像一只金色的雨燕上下窜动，绸衬衫颤抖着，晃动着，仿佛在燃烧，在融化，发出耀眼的光辉，把周围都照亮了。" 赏析；此段通过描写‘小茨冈"的动作，写出了‘小茨冈"的舞蹈优美 母亲下葬后几天，外祖父对我说： "喂，列克谢，你不是奖章，不能老是挂在我的脖子上，这不是你呆的地方，你到人间混饭吃去吧。" 于是，我去了人间. 赏析：祖父淡淡的话语，预示着高尔基童年的结束，他要开始另一种生活了，去人间，开始新的生活。 7. 童年佳句赏析 《童年》 高尔基 作者介绍： 马克西姆u2022高尔基（1868-1936）生于俄国中部的尼日尼u2022诺夫戈罗德城，幼年时期父亲就去世了，勤劳善良的母亲因无法养活他，只好把他送到外祖父家度过童年。 他只上过三年学，十一岁就走向社会，开始了自食其力的生活。他当过学徒工、搬运工、守夜人、面包工等。 十六岁时，他只身来到喀山，进入了“社会大学”，在与命运的争斗中它深入俄国社会得罪底层，和各个阶层、各种人物接触，饱尝了生活的艰辛，从而不断的丰富了它的社会知识和生活经验。 1905至1907年，高尔基积极投身誉为大的无产阶级革命，1906年写成了长篇小说《母亲》。 《母亲》真实地反映了20世纪初俄国风起云涌的工人运动，表现了俄国工人阶级从自发走向自觉的斗争过程，被列宁称赞为一本“非常及时的书”。十月革命后，高尔基写出了他最著名的自传体三部曲《童年》、《在人间》、《我的大学》。 内容介绍： 高尔基的自传体三部曲最初发表1913年，它既是作者童年至青年时期生平的自述，也是举世公认的艺术珍品，是作者根据自己亲身的生活经历，对俄罗斯19世纪末期社会政治生活所描绘的一幅生动的历史画卷。作品中主人公阿廖沙的原型就是高尔基本人，这一形象即是作者早年生活的写照，也是俄国人民，特别是处于社会下层的劳动人民经过磨练后走向新生活的典型。 好词摘录： 忽如其来、飘忽、兴趣盎然、熠熠生辉 好句摘录： 伏尔加河蓝色的水面上，桔红色的轮船在逆流而上，而一张张金色的叶片则缓缓顺流漂下。 我非常害怕外祖父，总觉得他的绿眼珠无时无刻不在盯着我看。 那曲子激昂中含着忧伤，仿佛是从高山奔流而下的河水，激荡在房间中。 经常有人听见了他们的歌声从窗户底下停下来看着他们，那一张张仰起的面孔让我想起没洗的脏盘子。 好段摘录： “唉，你们这些人啊……！”他常常这样忽如其来地叹气，也不知在感叹什么。“人啊……”的尾音总是被他拉得长长的。 茨冈脸色红红地走到厨房中间，像一团火焰般地跳动起来：两手高高扬起，脚步快得让人难以分辨，衬衫抖动着，像燃烧一般发出灿烂地光辉。他放纵地舞着，仿佛打开门让他出去他就能跳遍全城！大家都被他感染，跟着他颤动起来。 歌唱中，外祖母时而前进，时而后退，时而飞旋，青春瞬间回到了她的身上，令她呈现出一种鲜花绽放般的美丽。每个人都被她吸引住了。 我的感想： 作者将主人公当时所处的肮脏的环境写得很到位，在语言描写上很有功夫。使文章生动，令人身临其境，对美与丑及人复杂的感情有了更深层次的了解。 读书笔记 《童年》 高尔基 作者介绍： 马克西姆u2022高尔基（1868-1936）生于俄国中部的尼日尼u2022诺夫戈罗德城，幼年时期父亲就去世了，勤劳善良的母亲因无法养活他，只好把他送到外祖父家度过童年。他只上过三年学，十一岁就走向社会，开始了自食其力的生活。 他当过学徒工、搬运工、守夜人、面包工等。十六岁时，他只身来到喀山，进入了“社会大学”，在与命运的争斗中它深入俄国社会得罪底层，和各个阶层、各种人物接触，饱尝了生活的艰辛，从而不断的丰富了它的社会知识和生活经验。 1905至1907年，高尔基积极投身誉为大的无产阶级革命，1906年写成了长篇小说《母亲》。《母亲》真实地反映了20世纪初俄国风起云涌的工人运动，表现了俄国工人阶级从自发走向自觉的斗争过程，被列宁称赞为一本“非常及时的书”。 十月革命后，高尔基写出了他最著名的自传体三部曲《童年》、《在人间》、《我的大学》。 内容介绍： 高尔基的自传体三部曲最初发表1913年，它既是作者童年至青年时期生平的自述，也是举世公认的艺术珍品，是作者根据自己亲身的生活经历，对俄罗斯19世纪末期社会政治生活所描绘的一幅生动的历史画卷。 作品中主人公阿廖沙的原型就是高尔基本人，这一形象即是作者早年生活的写照，也是俄国人民，特别是处于社会下层的劳动人民经过磨练后走向新生活的典型。 好词摘录： 忽如其来、飘忽、兴趣盎然、熠熠生辉 好句摘录： 伏尔加河蓝色的水面上，桔红色的轮船在逆流而上，而一张张金色的叶片则缓缓顺流漂下。 我非常害怕外祖父，总觉得他的绿眼珠无时无刻不在盯着我看。 那曲子激昂中含着忧伤，仿佛是从高山奔流而下的河水，激荡在房间中。 经常有人听见了他们的歌声从窗户底下停下来看着他们，那一张张仰起的面孔让我想起没洗的脏盘子。 好段摘录： “唉，你们这些人啊……！”他常常这样忽如其来地叹气，也不知在感叹什么。 “人啊……”的尾音总是被他拉得长长的。 茨冈脸色红红地走到厨房中间，像一团火焰般地跳动起来：两手高高扬起，脚步快得让人难以分辨，衬衫抖动着，像燃烧一般发出灿烂地光辉。 他放纵地舞着，仿佛打开门让他出去他就能跳遍全城！大家都被他感染，跟着他颤动起来。 歌唱中，外祖母时而前进，时而后退，时而飞旋，青春瞬间回到了她的身上，令她呈现出一种鲜花绽放般的美丽。 每个人都被她吸引住了。 我的感想： 作者将主人公当时所处的肮脏的环境写得很到位，在语言描写上很有功夫。 使文章生动，令人身临其境，对美与丑及人复。

提取基因工程的目的基因。基因保存。

酵母单杂交技术主要包括以下哪些流程？（） A.筛选含有目的基因和报告基因的酵母单细胞报告株B.构建文库蛋白片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA表达文库C.重组质粒转化至酵母细胞D.当GAL4与DNA结合蛋白结合到DNA相应的顺式元件，就能启动报告基因表达，也就完成阳性克隆菌株的筛选正确答案：筛选含有目的基因和报告基因的酵母单细胞报告株；构建文库蛋白片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA表达文库；重组质粒转化至酵母细胞；当GAL4与DNA结合蛋白结合到DNA相应的顺式元件，就能启动报告基因表达，也就完成阳性克隆菌株的筛选

语言表达能力需要借助于对语言的认识与理解，就像王阳明小时候格竹子。目前中国的语言比较复杂，中国原来的语言与西方的语言混杂，语义含混不清，造成了语言的荒漠化。表达能力如果建立在这种语言荒漠上，表达出来的结果是可想而知的。所以，建议区分文字的本意与释意，国学与西学的不同用法，这样就会有表达能力了。不过，这很困难，不要讲一个小学生，即使是大学生也没有多少是具备这种能力的。原因是我们的教育没有严格区分这两种语言，教育体系不健康是主要原因。

必须要酶切，切割的是质粒！夜深了，手机打字也慢，明天中午，我再给你补充详细解释吧。 ——————让您久等了。。。。。。。是的，基因组文库需要酶切，cDNA文库不需要酶切，但这指的是目的基因。不管哪一种，目的基因要想与质粒连接，都是需要酶切的，因为必须把质粒切开，才能连接目的基因。基因组文库，是直接从染色体DNA分子上获取目的基因，肯定需要限制酶进行特异性切割。cDNA文库构建，是用细胞内总的mRNA进行反转录，每个mRNA上只有一个基因，并且不含有内含子（这也是cDNA文库的优点所在）。反转录获得的cDNA不需要酶切（因为只含有一个基因），两端适当处理，即可与切开的质粒DNA连接，再进行转化即可。cDNA不能切，切了就没用了。一般，一个细胞内有上千种mRNA，所以反转录得到的cDNA也是上千种，都不一样，但每个只含有一个基因，cDNA是比较短的。一个cDNA就可以转化一个受体菌，形成一个菌落，这个菌落就只含有这种cDNA了。具体，可以百度一下“cDNA文库”，百科里介绍的有。大学王镜岩《生物化学》教材里介绍的也有。

刚开始我也不知道，在百科里查了一下差不多懂了： 真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难. 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多.

不可以。抑制表达了的话，则终止tetR表达，消除了对HIS3的抑制，导致其表达，使细菌在选择培养基上得以生长。

1 cDNA 文库的构建 1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。在获得高质量的 mRNA 后，用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。 1.2 cDNA 全长文库 经典 cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的 cDNA。为了克隆到真正的 cDNA 全长，建立富含全长的 cDNA 文库具有重要意义。为此，必须克服仅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长 cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的 mRNA 分子经反转录而得到的 DNA 分子群体，是 mRNA 分子群的一个完整的拷贝。全长 cDNA 文库不仅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通过基因序列比对得到 mRNA 剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen，USA) 使用说明进行。判断一个 cDNA 文库中的 cDNA 序列是否是全长基因的 cDNA，主要方法有以下几种。 1.2.1 直接从序列上评价 5"端：如果有同源全长基因的比较，可以通过与其它生物已知的对应基因5"末端进行比较来判断。如果无同源基因的新基因，则首先判断编码框架是否完整，即在开放阅读框的第1个 ATG 上游有无同框架的终止密码子；其次，判断是否有转录起始点，一般加在5"帽结构后有一段富含嘧啶的区域，或者是 cDNA 5"序列与基因组序列中经过酶切保护的部分相同，则可以确定得到的 cDNA 的5"端是完整的。3"端：同样可以用其它生物已知的对应基因3"末端进行比较来判断，或编码框架的下游有终止密码子，或有1个以上的 PolyA 加尾信号，或无明显加尾信号的则也有 PolyA 尾。 1.2.2 用实验方法证实 可以通过引物延伸法确定5"端和3"端的长度，如：5"端 RACE，3"端 RACE，或者通过 Northern Blot 证实大小是否一致。 1.3 对 cDNA 文库的分析 对 cDNA 文库质量的评价主要有两个方面。第一方面为文库的代表性，cDNA 文库的代表性是指文库中包含的重组 cDNA 分子反映来源细胞中表达信息(即 mRNA 种类)的完整性，它是体现文库质量的最重要指标。文库的代表性好坏可用文库的库容量来衡量，它是指构建的原始 cDNA 文库中所包含的独立的重组子克隆数。库容量取决于来源细胞中表达出的 mRNA 种类和每种 mRNA 序列的拷贝数，1个正常细胞含10000～30000种不同的 mRNA，按丰度可分为低丰度、中丰度和高丰度三种，其中低丰度 mRNA 是指某一种在细胞总计数群中所占比例少于0.5％时。满足最低要求的 cDNA 文库的库容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 计算( P 为文库中任何一种 mRNA 序列信息的概率，通常设为99％；N 为文库中以 P 概率出现细胞中任何一种 mRNA 序列理论上应具有的最少重组子克隆数；n 为细胞中最稀少的 mRNA 序列的拷贝数；T 为细胞中表达出的所有 mRNA 的总拷贝数)。第二方面是重组 cDNA 片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种 mRNA 片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种 mRNA 尽管具体序列不同，但基本上都是由3部分组成，即5"端非翻译区，中间的编码区和3"端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。因此，要从文库中分离获得目的基因完整的序列和功能信息，要求文库中的重组 cDNA 片段足够长以便尽可能地反应出天然基因的结构。 2 cDNA 文库构建的其它类型 2.1 均一化 cDNA 文库 它是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在 cDNA 文库中表达基因对应的 cDNA 的拷贝数相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通过基因组 DNA 饱和杂交的原理将 cDNA 文库进行均一化的理论。但该理论一直以来都被认为不能应用于实际。其主要限制因素是难以提供足量的极低表达丰度的 cDNA 用于饱和杂交，从而可能会造成部分基因的 cDNA 的丢失。20年前，基于 DNA-RNA 杂交的研究就已经将基因的转录水平分为高中低3类。随后研究进一步表明，绝大多数基因是处于中等或低等表达丰度的，在单个细胞中含有近1～15个拷贝，而高丰度表达基因的转录产物在单个细胞中最高可达5000个左右拷贝，约占总表达量的25％。这种基因表达能力上的巨大差异成了获得一个具有完整代表性的 cDNA 文库的障碍，其表达量上的巨大差异更为大规模研究增添了困难。对单一组织的 cDNA 文库而言，高拷贝基因序列的大量存在给基因的筛选和鉴定带来不必要的浪费，尤其是在大规模的 EST 测序中。 均一化 cDNA 文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。现在，在构建均一化的 cDNA 文库中至少有2种主要的观点：一种是基于复性动力学的原理，高丰度的 cDNA 在退火条件下复性的速度快，而低丰度的 cDNA 复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组 DNA 在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过 cDNA 与基因组 DNA 饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的 cDNA 的丰度。第一种方法的掌握对技术的要求比较高，对多数人而言需要多次摸索才能找到最适条件；而后一种方法易于掌握，但有研究者根据复性动力学的原理也提出了其不利因素，即采用基因组 DNA 饱和杂交的方法会因为低拷贝的表达基因拷贝数少而无法被杂交上。目前已报到的均一化 cDNA 文库多是根据第二种原理构建的，常用策略有基于 PCR 技术利用 cDNA 多次复性 mRNA-cDNA 杂交等。有研究报道，针对各自选择的高表达靶序列进行分析后，均一化处理后文库的高丰度表达 cDNA 是处理前的0.3％～2.5％，基本满足节约筛选的要求。 均一化 cDNA 文库具有以下4方面的优点：第一，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验成本。第二，增加克隆低丰度 mRNA 的机会，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。第三，与原始丰度的 mRNA 拷贝数相对应的 cDNA 探针与均一化的 cDNA 文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。而以往的文库构建，忽略了 mRNA 丰度的影响。第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序或芯片制作等研究。 2.2 差减 cDNA 文库 (Subtractive cDNA library) 差减文库也称扣除文库，使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料(如不同基因处理细胞系或植物的近等基因系等)提取 mRNA (或反转录后合成 cDNA)，在一定条件下用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子( Driver )与含有目的基因的试验方( Tester )进行杂交，选择性的祛除两部分共同基因杂交形成的复合物，往往进行多次的杂交—祛除过程，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。消减杂交是构建差减 cDNA 文库的核心，差减文库是否构建成功很大程度上决定于差减杂交的效率。差减杂交的方法主要有(1)羟基磷灰石柱层析法 (HAP)；(2)生物素标记、链亲和蛋白结合排除法；(3)限制性内切酶技术相结合的差减方法；(4)差减抑制杂交法 (SSH)；(5)磁珠介导的差减法 (MAST)，其中 SSH 法最为常用。 抑制性消减杂交技术 (Suppression Subtractive Hybridization，SSH) 是 DIATCHENKO 等人于1996年依据消减杂交和抑制 PCR 发展出来的一种分离差异表达基因的新方法，主要用于分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。它主要是利用抑制 PCR 对差减杂交后丰度一致的目的材料中两端连有不同接头的差异表达片段进行指数扩增，而两端连接上同一接头的同源双链片段仅呈线形扩增，从而达到富集差异表达基因的目的。因此应用该技术能够对两个有差异表达的材料(细胞或组织)高、中、低丰度目的基因都进行有效、快速、简便克隆。近年来已成功应用于植物发育、肿瘤与疾病、以及外界因子诱导组织细胞中相关的应答基因的分析和克隆。 2.3 固相 cDNA 文库构建 cDNA 的固相合成是人们早为熟知的技术，但局限之处 oligo(dT) 与纤维素胶粒或磁珠的结合比较牢固，将 cDNA 洗脱下来时得率不是很高，而且以后的反应步骤也不能都在介质上进行，这可能是该技术应用并不十分广泛的原因。 最近 THOMAS ROEDE 提出了一种新的 cDNA 文库固相合成方法( THOMAS ROEDE，1998)，克服了以前文库构建中存在的缺点，所用的酶和试剂与传统方法完全相同，不同的是 cDNA 的合成和修饰均在固相支持物—磁珠上完成。cDNA 通过一个生物素固定在链霉素偶联的磁珠上，这样在反应过程中就可以简便而迅速的实现酶和缓冲液的更换，因此它将快速与高质量的文库构建结合在一起(构建文库只需1 d)，并且构建的文库适合大多数的研究目的。 固相 cDNA 合成法的主要优点是可以简便 cDNA 合成的操作。在进行缓冲液更换时既没有 cDNA 的丢失之忧，也无其它物质污染之忧。另外，用此方法可以得到真实的代表性文库，它包含有短小的 cDNA，这是因为在克隆之前省去了分级分离的步骤。总之，固相法结合了传统的 cDNA 合成的优点并弥补了其不足。这种方法简便易行，可靠低廉，所建文库高质量，因此它可能会替代目前应用的 cDNA 文库操作方法。 另外，最近发展起来的微量 RNA 的 cDNA 构建，是使用 PCR 技术，在实验室条件下扩增的 mRNA 的 cDNA 量，其 PCR 检测的灵敏度远远大于反转录 PCR(RT-PCR) 法。微量 RNA 的 cDNA PCR 文库的构建可为有关微量活性物质遗传基因的研究提供方便。 3 cDNA 文库应用于分离新基因的方法 发现并分离克隆新基因始终是分子生物学研究的主要任务和目的，虽然 cDNA 文库的用途很多，但是，应用于分离新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪种类型的 cDNA 文库，都可以用于分离新基因，只是使用的方法有差异。分离方法主要有两种：第一，对于非全长 cDNA 文库，即不管是经典的 cDNA 文库方法或差减法构建的 cDNA 文库，需要利用已经获得的新 cDNA 序列片段，通过 RACE 方法获得新基因的全长序列。第二，利用全长 cDNA 文库与目的基因片段作为探针的杂交筛选。 3.1 从非全长 cDNA 文库中筛选新基因 3.1.1 RACE 法 RACE 文库即快速扩增 cDNA 末端法( Rapid Amplification of cDNA End，RACE )只需知道 mRNA 内很短的一段序列即可扩增出其 cDNA 的5"(5" RACE )和3"端(3" RACE )。该法的主要特是利用一条根据已知序列设计的特异性引物和一条与 mRNA 的 PolyA (3" RACE )或加至第一链 cDNA 3"端的同聚尾(5" RACE )互补的通用引物，由于同聚体并非良好的 PCR 引物，同时为了便于 RACE 产物的克隆，可向同聚体引物的5"端内加入一内切酶位点。所用的 cDNA 模板可以使用多聚 dT 引物延伸合成(3"，5"-RACE 均可)。当 RACE PCR 产物为复杂的混合物时，可取部分产物作模板，用另一条位于原引物内侧的序列作为引物与通用引物配对进行另一轮 PCR (巢式 PCR )。早在1988年，FROHMAN 等即用此方法成功地获得了4种 mRNA 的5"合3"末端序列。 迄今已有几种改良的 RACE 方法，通过修饰与优化，与最初的 FROHMAN 报道有所不同：(1) BARSON 等采用锁定寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸引物“锁定”基因特异性序列的3"末端与其 Poly (A) 尾的连接处，进行第1条 cDNA 链的合成，消除了在合成第1条 cDNA 链时寡聚 (dT) RNA 模板 Poly (A) 尾任何部位结合而带来的影响。(2) EDWARDS 和 TROUTT 小组利用 T4 RNA 连接酶把寡核苷酸连接到单链 cDNA 的5"末端，然后用一个3"末端特异性引物和一个锚定引物就可以直接对锚定连接的 cDNA 进行体外 PCR 扩增和克隆。随后，BERTLING 等又用 DNA 连接酶代替 RNA 连接酶。这些方法都避免了在第2条 cDNA 链内同聚序列区互补而导致截断 cDNA 的产生。(3) MARUYAMA 等提出 cRACE 法，采用的引物为基因特异性的，所以非特异性 PCR 产物基本上不会产生。Clontech 等公司也根据 RACE 法的更新，相继推出了 RACE 的相应试剂盒，为克隆 cDNA 提供了方便的工具。最近 HUANG 等人即用 RACE 试剂盒克隆了一种含有类植物血凝素免疫受体 ITIM。 3.1.2 用 PCR 法从 cDNA 文库中快速克隆基因 通过对文库的筛选或适用简并引物进行 PCR 反应，常常只能获得不完整的 cDNA 片段。为了得到 cDNA 全长，常常要重新筛选文库。重新筛选文库工作量大，RACE 虽然为此提供可方便，但应用该方法需重新提取 mRNA 和反转录。而用 PCR 法从 cDNA 文库中快速克隆基因的方法，只需提取 λ 噬菌体 DNA，按保守序列设计 PCR 引物便可将未知片段进行克隆。特别是在基因的两端变异较大而中间某区域保守的情况下，用 PCR 法很容易获取 cDNA 的全长。同一转录产物，又是存在着不同的拼接方式，通过筛库的办法同时将不同拼接方式的克隆筛选出来可能性较小，而使用 PCR 扩增后，有利于观察到不同的拼接方式。另外，为研究基因在不同组织中表达情况，常根据差异显示法找出特异的 mRNA。 3.2 从全长 cDNA 文库中进行杂交筛选 3.2.1 标记探针 cDNA 文库筛选法 cDNA 文库通常涂抹到母盘培养基上，然后再把这些菌落的样品吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上；这时加入标记的探针，如果出现杂交信号，那么从母盘上就可以把包含杂交信号的菌落分离、培养出来。以此筛选出阳性克隆，进行序列分析，以获得 cDNA 全长。该方法能避免 PCR 扩增的非特异性扩增或错配，是一种比较准确可靠的 cDNA 克隆方法。主要缺点是克隆过程需要一系列的酶促反应、产率低、费时长、工作量大。该方法适合于表达丰度高的基因的筛选分离。用于做标记探针的 DNA 片段可以是其它生物的基因片段，在这种情况下筛选出来的基因往往是已分离基因的同源基因；如果用于做标记探针的 DNA 片段是通过新分离蛋白质的氨基酸反推设计的 DNA 序列，或者是特异分子标记子 DNA 序列，那么可以筛选得到新功能基因。 3.2.2 反式 PCR 反式 PCR 克隆 cDNA 全长的基因原理是：双链 cDNA 合成后进行尾—尾连接，环化的 cDNA 用位于已知序列内的限制性内切酶酶切位点造成缺口或用 NaOH 处理使之变性，然后用2条基因特异性引物对重新线性化或变性的 cDNA 进行扩增。反式 PCR 的优势在于，它采用了2条基因特异性引物，因此不易产生非特异性扩增。该方法可以快速、高效地扩增 cDNA 或基因组中已知序列两侧位置的片段。 4 小结 随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。在过去寻找新基因的方法中，以消减杂交、mRNA 差异显示，cDNA 的代表性差异显示分析法、差异消减展示等方法应用最广。这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。目前，比较可行而且应用较多的方法主要还是 cDNA 文库的筛选。一方面 cDNA 文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因此 cDNA 克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多；另一方面由于每个 cDNA 克隆只代表一种 mRNA 序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低，所以 cDNA 文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。本文涉及到的有关 cDNA 文库构建方法，是目前比较常用的，这些方法各有优缺点，研究者应根据自己的实际情况，选择合适的技术，已达到自己预期的目的。

含义不同，作用不同。1、含义不同。酵母初级文库是由高拷贝数的质粒构成；而次级文库则是一种更复杂的系统。2、作用不同。酵母初级文库可以快速、高效地扩增目标DNA序列；而次级文库则是可以更稳定、更可靠地表达目标蛋白，并且避免了初级文库中可能存在的问题。

常用办法是分子杂交

cDNA文库 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA基因组文库 用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。

建库的话随便找个T载体就可以了，只要方便测序就好，至于要实现原核表达的话我个人建议您还是在完成测序后将表达框分离（PCR也好、酶切也好），连接到原核表达载体，我个人推荐使用IPTG诱导、含有组氨酸标签的表达载体，这样也方便后期的纯化工作等。当然如果想直接在普通的大肠杆菌中表达也是可以的，比如前一段时间我搞土壤DNA文库时就是直接将文库在含有筛选剂的极限培养基上筛，获得的克隆直接测序，得到了一个基因，当然其表达框前面不远处就是一个35BP的原核启动子，之后就将这个启动子加上个AGGAGG以及GFP基因的上游18bp序列做引物（上游刚好59bp再多一个都不是1.2元每个碱基了），下游直接是GFP下游引物验证了一下功能。肯定能用的。你也可以试着这样原核表达。不过很冒风险。

构建cDNA文库时，需要将双链cDNA与表达载体连接起来，以便将目标基因表达出来。为了保证双链cDNA与表达载体以正确的方向连接，可以采取以下措施：选择合适的限制性内切酶：在连接双链cDNA和表达载体时，需要使用限制性内切酶进行切割。选择合适的限制性内切酶可以保证连接的方向正确。选择合适的连接方式：连接双链cDNA和表达载体时，可以采用两种不同的连接方式，即末端连接和内部连接。末端连接可以保证连接的方向正确，而内部连接则需要在连接前进行反向转录，以保证连接的方向正确。进行PCR扩增：在连接双链cDNA和表达载体之前，可以进行PCR扩增，以检查连接的方向是否正确。PCR扩增可以通过引物的设计来检查连接的方向是否正确。进行测序验证：在连接双链cDNA和表达载体之后，可以进行测序验证，以确保连接的方向正确。测序验证可以通过测序连接产物来检查连接的方向是否正确。综上所述，为了保证双链cDNA与表达载体以正确的方向连接，需要选择合适的限制性内切酶和连接方式，并进行PCR扩增和测序验证。

酵母菌（yeast）广泛分布于自然界中，种类繁多，已知的就有几百种。实际上酵母菌不是一个分类学名词，而是一类单细胞真菌的统称。由于酵母菌的种类复杂、形态多样、代谢特点存在很大差异，系统进化地位也不尽相同，因此很难对其下一个确切的定义。但一般认为酵母菌具有以下几个基本特征：个体一般以单细胞状态存在；多数以出芽方式繁殖，也有的进行裂殖或产生子囊孢子；能发酵多种糖类；细胞壁常含有甘露聚糖；喜在含糖较高、酸性的环境中生长。

cDNA文库 以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库.基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达,而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同,所以cDNA文库具有组织细胞特异性.cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因.但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同,基因组.DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA 基因组文库 用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA,可以得到大量的基因组DNA片段,然后将这些DNA片段与载体连接,再转化到细菌中去,让宿主菌长成克隆.这样,一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段,整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库. 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆.这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合,即基因组文库,它包含了该生物的所有基因.

cDNA以mRNA为模板，基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

基因文库是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落(或噬菌斑)(或成活细胞)即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。 构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库。此外基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。基因文库构建包括以下基本程序： ① DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。 ② 载体的选择及制备。 ③ DNA片段或cDNA与载体连接。 ④ 重组体转化宿主细胞。 ⑤ 转化细胞的筛选。当获得了含重组体的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。基因的克隆只是分离基因的基础，基因克隆后还要对克隆的基因进行分离，即利用各种手段把目的基因从文库中分离出来。分离出目的基因还必须对其进行必要的检测与分析：如进行序列测定，体外转录及翻译、功能互补实验等。通过这些实验确定出基因的结构及功能。到这时才能算分离到了目的基因。所以，基因的克隆、克隆基因的分离、分离基因的鉴定是利用基因文库技术分离目的基因的主要内容。一、基因文库的类别 1． 基因组文库与cDNA文库 根据基因类型，基因文库可分为基因组文库及cDNA文库。基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。 cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 基因组文库根据DNA来源又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。 基因组文库与cDNA文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。文库构建时的信息供体是某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织(或器官)在某种环境条件下的基因表达情况，并不能包括该生物有机体的全部基因。在某种意义上讲它可以表现基因组的功能信息。再者，cDNA文库只反映mRNA的分子结构。cDNA中不含有真核基因的间隔序列及调控区，确切说cDNA并不是真正意义上的基因。基因组文库构建时遗传信息供体是基因组DNA，因而无发育时期及组织器官特异性，在一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。目前这两类基因文库在基因工程中都得到有效应用。选择哪一种，主要是根据实验目的。在分离RNA病毒基因，研究功能蛋白序列，分离特定发育阶段或特定组织特异表达的基因时应构建cDNA文库。在研究mRNA分子中不存在的序列及基因组作图时必须构建核基因组文库。 2． 克隆文库及表达文库从基因文库的功能上看可分为克隆文库及表达文库。克隆文库由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片断大量增殖。表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元件外，还具有控制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。表达载体又有融合蛋白表达载体及天然蛋白表达载体之分。 从克隆文库中分离目的克隆时主要利用核酸探针，可以是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可以是同种或同属生物的同源序列探针。从表达文库中分离目的克隆时，因克隆片段的表达产物蛋白质具有抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以利用免疫学探针及生物功能进行筛选。表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因的分离。 3．不同载体的基因文库 目前用于构建基因文库的载体主要有质粒、噬菌体、黏粒及人工染色体四大类。每类中又有许多不同的载体。不同的载体适于构建不同的基因文库。（1）． 质粒文库 质粒是最早用于基因克隆的载体。现已有各种适用于不同工作的如克隆、表达、测序等专用商品质粒。但在构建基因文库上，由于质粒相对较小并只能容纳比自身更小的片段，因此它不能用于构建核基因组文库，通常只用来构建短序列的克隆文库。例如叶绿体DNA分子较小，可以用质粒构建叶绿体DNA文库。质粒载体可用于生物cDNA文库构建。但只适合于高丰度的mRNA。（2）． 噬菌体文库 目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体很多，如单链的M13噬菌体载体、λ噬菌体载体、P1噬菌体载体、噬菌粒(phagemid或phasmid)等。其中使用最多的是入噬菌体。 λ-DNA为双链结构，长49kb。线性分子两端各有一条12个核苷酸的黏性末端称cos位点。分子中有约15kb可去掉的非必要基因区，又称“填充区”， “填充区”两侧的序列含有其增殖所必需的全部基因，称为左、右臂。“填充区”可被外源DNA取代，构成重组体，这是它成为克隆载体的结构基础。由于噬菌体头部包装容量的限制，重组λ-DNA分子大小只能在39—52kb之间。（3）． 黏粒文库 黏粒(cosmid)也称柯斯质粒，是人工构建的由λ噬菌体的COS序列、质粒的复制子序列及抗生素抗性基因序列组合而成的一类特殊的质粒载体。COS序列是DNA包装进噬菌体颗粒所必须的。复制子通常是使用ColEl或pMBl的复制起始位点。黏粒具有λ噬菌体的某些性质，在克隆了大小合适的外源DNA片段并且在体外被包装成噬菌体颗粒后，能高效转导对入噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞。在宿主细胞内按λ噬菌体方式环化，但不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒(因分子中不具入噬菌体全部必要基因)。它也具有质粒载体的主要性质，在宿主细胞内可以像其他质粒一样复制，并与松弛型质粒相同，适量的氯霉素可促进扩增。因具抗生素基因，可以通过抗生素抗性筛选重组子。黏粒载体在构建时也加上了设在插入失活基因内的多克隆位点。黏粒载体的分子较小(2．8—24kb)，但克隆容量很高，对外源DNA长度的要求是30～45 kb，上限几乎是入噬菌体载体容量(23 kb)的2倍，所以黏粒载体在核基因组文库构建上具有相当的优势，可克隆包括3，和5"调控区在内的完整的植物基因。（4）．人工染色体文库 人工染色体载体是利用真核生物染色体或原核生物基因组的功能元件构建的能克隆大于50kbDNA片段的人工载体。其中有的载体既可用于克隆，又能直接转化，是进行基因功能研究的良好载体。近年来陆续发展起来的人工染色体文库有YAC库、BAC库、BIBAC库、PAC库及TAC库。二、核基因组文库构建核基因组文库构建主要使用λ噬菌体置换型载体或黏粒载体。 1． 随机文库克隆数目随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等。对于随机文库: N = ln(1-P) ； ln（1-x/y） N：克隆数目 P：设定的概率值(如：0．99，表示在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0．99) x：插入片段平均大小(15～20kb) y：基因组的大小(以kb计) 如果插入片段平均大小为20kb，某基因组大小为4X108bp，P = 0．99时，根据上式N = 1X105。含1XlO5个克隆的基因文库相当覆盖了5倍的基因组，在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0．99。随机片段可通过机械切割或限制酶消化产生。机械切割法可获得较均一的随机片段，但片段不能直接用于克隆，需经末端修饰、甲基化，连上接头后再用限制性内切酶消化产生黏性末端。用限制酶消化的方法虽然可直接产生黏性末端，但片段的随机性较差，所以采用后种方法时，文库的克隆数目应大于计算值。三、利用PCR技术构建c DNA文库 cDNA文库构建的起始信息物质是mRNA。因此构建cDNA文库首先要考虑的问题是mRNA的含量及质量。生物细胞中mRNA含量较低。通常cDNA文库构建需要ug级的mRNA。对于低丰度的mRNA(<0．5％)，要通过富集或增大克隆数目来保证构建的文库中能够含有它们的克隆

cDNA文库（cDNA library）：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般具有10^5种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都仅有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

cDNA文库（cDNA library）：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般具有10^5种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都仅有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

从古希腊文学到文艺复兴;从古典主义到现代主义;从浪漫主义到现实主义;从荒诞派到黑色幽默;从表现主义到意识流;从垮掉的一代到愤怒的青年，全书囊括了各个时代各个流派的经典之作、代表之作，反应了世界文学发展的全历程。《世界文学名著》包括了世界名书文库、世界禁书文库、世界奇书文库、世界趣书文库，收入了近二百部不同国家、不同时代、不同流派的世界文学名著，是迄今为止收录书目最多、影响最大、规模空前的文学巨著，涵盖了世界文学的方方面面，反映了世界文学的全貌，堪称一部世界文学的"四库全书”。《红与黑》(法)司汤达作为禁书，叙述了一个青年的毁灭。是一所解剖恶德败行的手术观察间。《巴黎圣母院》(法)雨果19世纪浪漫主义文学的奠基之作，将世间美与丑的强烈对照，融入了一个颠颠倒倒、是是非 非的故事里。《爱的教育》意大利作家亚米契斯的作品《简·爱》(英)夏洛蒂·勃朗特面对争论纷起的舆论界，作者微笑着写道：“感谢读者，用宽容的耳朵倾听了一个朴实无华 的故事。”《钢铁是怎样炼成的》(俄)奥斯特洛夫斯基在苏联解体前，此书以161种文字印发了600多次，流传于世界各国，是一本举世公认的教育 青年的“生活教科书”。《安徒生童话》(丹麦)安徒生大多数人的生命历程中接触的第一本世界名著，歌颂了人世间永恒的真、善、美。 《母亲》(法)小仲马本书问世不久，便立即以多种文字图外发行，列宁盛赞它是“一本非常及时的书”。 麦哲《鲁滨逊漂流记》(英)笛福一部描述人类返朴归真情结的冒险故事，其发行量几乎超出了欧洲其它读物，不同语言的译 本几乎覆盖全世界各个角落。 理智与情感《一千零一夜》一座东方文学辉煌壮丽的丰碑，一颗古老文明神秘绚丽的瑰宝。《希腊神话故事》“这是一个不可企及的典范。”——马克思《十日谈》(意)薄伽丘作品揭露禁欲主义，宣扬个性解放，详尽描述人对世间欢乐的不倦追求，被奉为“人曲”而 流传于世。《牛虻》(英)艾·丽·伏尼契“不论我活着，或是我死掉，我都是一只快乐的飞虻。”《小妇人》(美)路易沙·梅·奥尔科特该书被美国国会图书馆评为全世界最畅销的一部优秀作品。《老人与海》(美)海明威“我试图创造一个真实的老人，一个真实的男孩，一个真实的海洋，一条真实的鲨鱼。”——海明威《基督山伯爵》是法国著名通俗历史小说大仲马（1802-1870）的代表作。法老大副堂泰斯船长委托，为拿破仑党人送了一封信，遭到两个卑鄙小人和法官的陷害，被打死牢。狱友法里亚神甫向他传授各种知识，并在临终前把埋于基督山岛上的一批宝藏秘密告诉了他。堂泰斯越狱后找到了宝藏，成为巨富。从此名基督山伯爵，经过精心策划，报答了恩人，惩罚了仇人。本充满浪漫的传奇色彩，章章奇特新颖，引人入胜。《三个火枪手》，又译《三剑客》、《侠隐记》，是法国19世纪浪漫主义作家大仲马的代表作之一。该书曾五次被翻拍成电影作品。南斯拉夫球员萨维切维奇、潘采夫、普罗辛内斯基，被合称“三个火枪手”。另外还有一部日本动画片和一部迪士尼动画片也叫“三个火枪手”，但都同大仲马的原著无关。《福尔摩斯探案集》(英)柯南道尔一桩桩扑朔迷离的案件迎刃而解，一个个狠毒残忍的凶手终落法网。世界文坛的巨作，刑侦 学的教科书。《呼啸山庄》是英国女作家勃朗特姐妹之一艾米莉·勃朗特的作品。小说描写吉卜赛弃儿希斯克利夫被山庄老主人收养后，因受辱和恋爱不遂，外出致富，回来后对与其女友凯瑟琳结婚的地主林顿及其子女进行报复的故事。《飘》，字义解释为：随风飞动、摇摆，浮动的意思。小说《飘》是美国著名女作家玛格丽特·米歇尔创作的一部具有浪漫主义色彩、反映南北战争题材的小说。主人公斯佳丽身上表现出来的叛逆精神和艰苦创业、自强不息的精神，一直令读者为之倾心。这部经久不息的小说感动了无数的读者。多次被翻拍成电影。电影又名《乱世佳人》。《战争与和平》俄罗斯伟大作家列夫·托尔斯泰的《战争与和平》是世界文学史上一部不朽名著。小说最突出的艺术成就是那气势磅礴、宏大复杂的结构与严整有序的布局。托尔斯泰以一天才之笔，游刃于战争与和平、心理与社会、历史与哲学、婚姻与宗教之间，主次分明，匠心独具。小说《战争与和平》以库拉金、罗斯托夫、鲍尔康斯基和别朱霍夫四大贵族家庭的生活为情节线索，气势磅礴地反映了十九世纪初到二十年代俄国社会的重大历史事件。《悲惨世界》是由法国大作家维克多·雨果于1862年所发表的一部长篇小说，涵盖了拿破仑战争和之后的十几年的时间，是十九世纪最著名的小说之一。该作品被译成多国文字，拍成了多部电影。《傲慢与偏见》是简·奥斯汀的代表作。这部作品以日常生活为素材，一反当时社会上流行的感伤小说的内容和矫揉造作的写作方法，生动地反映了18世纪末到19世纪初处于保守和闭塞状态下的英国乡镇生活和世态人情。《汤姆叔叔的小屋》，又译为《黑奴吁天录》、《汤姆大伯的小屋》，是美国著名作家斯陀夫人的一部现实主义作品。斯陀夫人（1811—1896）出生于北美一个牧师家庭，曾做过哈特福德女子学院的教师。她目睹黑奴在奴隶主残酷压迫下的悲惨命运，心生怜悯之情。在此启发下，她亲自到南方了解真实情况，决定以自己的方式参与解放黑奴的战斗中。斯陀夫人因对黑奴命运的关注成为支持废奴作家中最杰出的一位。《查泰莱夫人的情人》英国作家劳伦斯的小说，是劳伦斯的最后一部长篇小说，西方十大情爱经典小说之一。因大量情爱描写，在英美及我国被长期禁止发行。后被多次改编为电影。《格林童话》产生于十九世纪初，是由德国著名语言学家，雅格·格林和威廉·格林兄弟收集、整理、加工完成的德国民间文学。它是世界童话的经典之作，自问世以来，在世界各地影响十分广泛。格林兄弟以其丰富的想象、优美的语言给孩子们讲述了一个个神奇而又浪漫的童话故事。在国内，日本，台湾也有根据《格林童话》创作的故事集。《孤星血泪》故事讲述一个小孤儿皮普，从小依靠姐姐与姐夫过活，却在无意中帮助了一位含冤被陷的逃犯，后来受到一位不愿透露身份的人士资助，使他能在上流社会求学生活，成为一名绅士。《汤姆·索亚历险记》是美国著名小说家马克·吐温的代表作，发表于1876年。小说主人公汤姆·索亚天真活泼，富于幻想和冒险，不堪忍受束缚个性，枯燥乏味的生活，幻想干一番英雄事业。《堂吉诃德》是文艺复兴时期的现实主义杰作，作者塞万提斯。主要描写和讽刺了当时西班牙社会上十分流行的骑士小说，并揭示出教会的专横，社会的黑暗和人民的困苦。《堂吉诃德》问世以来，经受住了时间的考验，堂吉诃德的名字在不同历史年代，不同国家都流传着。《亚马逊漂流记》讲述了正直的乔恩一家如何战胜邪恶的故事。该书至今被译成世界上多种文字。书中所展现的神奇故事伴随了一代又一代人的美丽童年、少年直至成年。无论作为语言学习的课本，还是作为通俗的文学和科学读本，本书对当代中国的青少年都将产生积极的影响。《茶花女》是法国亚历山大·小仲马的代表作，讲述在19世纪40年代，一个叫阿尔丰西娜·普莱西的贫苦乡下姑娘来到巴黎，走进了名利场，成了上流社会的一个社交明星，开始了卖笑生涯；并改名为玛丽·杜普莱西。结实了小仲马，于是两人开始了一段交往的爱情故事。《羊脂球》是有“短篇小说大师”之称的法国作家莫泊桑先生创作的小说，《羊脂球》是他的成名作，也是他的代表作之一。故事以羊脂球的悲惨遭遇反衬了资本主义下的丑恶肮脏的灵魂。他们虚伪的面具下藏的都是腐朽的内脏和污秽的思想。《苔丝》是英国著名小说家和诗人托马斯.哈代的代表作之一，一百多年过去了，女主人公苔丝也早已树立在世界文学画廊之中，这不仅仅因为人们对传统美德有所超越，更因为作品主人公所拥有的人性与灵魂深处的巨大魄力使之成为最动人的女性形象之一。《格列佛游记》是乔纳森·斯威夫特的一部杰出的游记体讽刺小说，以较为完美的艺术形式表达了作者的思想观念，作者用丰富的讽刺手法和虚构幻想的离奇情节，深刻的剖析了当时的英国社会现实。另外，同名电影和动漫，也是根据该小说改编的。《美国的悲剧》是西奥多·德莱塞最为重要的作品。这部小说共分三卷。故事以一个普通美国青年克莱德·格里菲斯短促的一生为线索，将美国现代社会生活的众多画面交织进去。《从地球到月球》是法国著名科幻小说作家儒勒·凡尔纳的科幻小说。其中的科幻构思至今令人称道。《安妮日记》是作者安妮·弗兰克遇难前两年藏身密室时的生活和情感的记载。作为一名成长中的少女，她在日记中吐露了与母亲不断发生冲突的困惑以及对性的好奇。同时，对于藏匿且充满恐怖的25个月的密室生活的记录，也使这本《安妮日记》成为德军占领下的人民苦难生活的目击报道。安妮日记的最后一则，所标的日期是1944年8月1日。战争结束，安妮的父亲奥托·弗兰克决定完成女儿的宿愿，将日记出版问世。《白雪公主》最初使用白雪公主这个词的地方是德国著名童话集《格林童话》之中的《白雪公主》。原文讲述了一个可爱美丽的公主因为后母嫉妒其美貌而被迫逃到森林，偶遇善良的七个小矮人。最后在他们帮助下，克服了后母的诅咒，找到真爱的王子的故事。《海的女儿》是安徒生的著名童话，是最脍炙人口的名篇。该童话被多次改编为电影、木偶剧、儿童剧。《爱丽丝梦游仙境》（又名爱丽丝漫游奇境；英语：Alice"s Adventures in Wonderland）是英国作家查尔斯·路德维希·道奇森以笔名路易斯·卡罗尔于1865年出版的儿童文学作品。故事叙述一个名叫爱丽丝的女孩从兔子洞进入一处神奇国度，遇到许多会讲话的生物以及像人一般活动的纸牌，最后发现原来是一场梦。《浮士德》是一部长达一万二千一百一十一行的诗剧，第一部二十五场，不分幕。第二部分五幕，二十七场。全剧没有首尾连贯的情节，而是以浮士德思想的发展变化为线索。这部不朽的诗剧。《昆虫记》也叫做《昆虫物语》、《昆虫学札记》和《昆虫世界》，英文名称是《The Records about Insects》，是法国杰出昆虫学家法布尔的传世佳作，亦是一部不朽的著作。它不仅是一部文学巨著，也是一部科学百科。《变形记》（德语Die Verwandlung，英语The Metamorphosis）卡夫卡短篇代表作，是卡氏艺术上的最高成就，被认为是20世纪最伟大的小说作品之一。创作于1912年，发表于1915年。《格兰特船长的儿女》是法国著名科幻作家，儒勒·凡尔纳的代表作品。故事发生在1864年。苏格兰贵族格雷那万爵士是邓肯号游船的船主,他从海上的漂流物里获得了一份文件,从中得知两年前在海上遇难失踪的苏格兰航海家格兰特船长尚在人间,于是毅然带着船长的女儿玛丽和儿子罗伯特等人,驾驶着自己的游船去寻找和营救。小说围绕着营救这个主题展开。《伊索寓言》原书名为《埃索波斯故事集成》，是古希腊民间流传的讽喻故事，经后人加工，成为现在流传的《伊索寓言》。《伊索寓言》是一部世界上最早的寓言故事集。《天路历程》为英国人班扬所著，该书借用了寓言和梦境的形式，书中的叙述者在梦中看到一个叫做“基督徒”的人正在读一本书，知道了自己居住的城市将遭天火焚毁，惊恐不已。《马可·波罗游记》（The Travels of Marco Polo），是1298年威尼斯著名商人和冒险家马可·波罗撰写的其东游的沿途见闻。该书是世界历史上第一个将地大物博的中国向欧洲人作出报道的著作，它记录了中亚，西亚，东南亚等地区的许多国家的情况，而其重点部分则是关于中国的叙述，以大量的篇章，热情洋溢的语言，记述了中国无穷无尽的财富，巨大的商业城市，极好的交通设施，以及华丽的宫殿建筑。这些叙述在中古时代的地理学史，亚洲历史，中西交通史和中意关系史诸方面，都有着重要的历史价值。《我的大学》本书是高尔基引著名的自传体第三部曲，也是高尔基《人生三部曲》之一。其余两部为《童年》、《在人间》。作者描写了他青年时代的生活经历。从这个被真实记述下来的教程中，我们可以看出青少年时代的高尔基对小市民习气的深恶痛绝，对自由的热烈追求，对美好生活的强烈向往，在生活底层与劳苦大众的直接接触，深入社会，接受革命者思想影响和如饥似渴地从书籍中汲取知识养料是他得以成长，从生活底层攀上文化高峰的重要条件。《野性的呼唤引》(The Call of the Wild)以一只狗的经历表现文明世界的狗在主人的逼迫下回到野蛮，写的是狗，也反映人的世界。 热望本已在，蓬勃脱尘埃：沉沉长眠后，野性重归来。《雾都孤儿》（英语：Oliver Twist），是英国作家狄更斯于1838年出版的写实小说。以雾都伦敦为背景，讲述了一个孤儿悲惨的身世及遭遇，主人公奥立弗在孤儿院长大，经历学徒生涯，艰苦逃难，误入贼窝，又被迫与狠毒的凶徒为伍，历尽无数辛酸，最后在善良人的帮助下，查明身世并获得了幸福。《绿野仙踪》又名《OZ国经典童话》，是美国作家弗兰克·鲍姆创作的奇幻冒险童话故事集，共十四本，有“美国的《西游记》”之称。《尤利西斯》（上、下）是爱尔兰意识流文学作家詹姆斯·乔伊斯于1922年出版的长篇小说。小说以时间为顺序，描述了主人公，苦闷彷徨的都柏林小市民，广告推销员利奥波德·布卢姆（Leopold Bloom）于1904年6月16日一昼夜之内在都柏林的种种日常经历。小说大量运用细节描写和意识流手法构建了一个交错凌乱的时空，语言上形成了一种独特的风格。《尤利西斯》是意识流小说的代表作，并被誉为20世纪一百部最佳英文小说之首，每年的6月16日已经被纪念为“布卢姆日”。《尤利西斯》是英国现代小说中最有实验性、最有争议的作品。《安娜卡列尼娜》 （上、下）是托尔斯泰第二部里程碑式的长篇小说，创作于 1873—1877年。作品由两条既平行又相互联系的线索构成：一条是安娜与卡列宁、渥伦斯基之间的家庭、婚姻和爱情纠葛；一条是列文和吉娣的爱情生活及列文进行的庄园改革。安娜是一个上流社会的贵妇人，年轻漂亮，追求个性解放和爱情自由，而她的丈夫却是一个性情冷漠的“官僚机器 ”。一次在车站上，安娜和年轻军官渥伦斯基邂逅，后者为她的美貌所吸引，拼命追求。最终安娜堕入情网，毅然抛夫别子和渥伦斯基同居。但对儿子的思念和周围环境的压力使她陷入痛苦和不安中，而且她逐渐发现渥伦斯基并非一个专情的理想人物。在相继失去儿子和精神上最后一根支柱 ——渥伦斯基后，经过一次和渥伦斯基的口角，安娜发现自己再也无法在这个虚伪的社会中生活下去，绝望之余，她选择了卧轨自杀。小说揭露了 19世纪六七十年代俄罗斯上流社会的丑恶与虚伪，同时也表达了作者处在社会转型期时所进行的复杂的道德探索和思想探索。《复活》作者是列夫·托尔斯泰（1828-1910），十九世纪俄国对世界文学最有影响的作家。《复活》是他的代表作之一。本书取材于一件真实事件，主要描写男主人公涅赫柳多夫引诱姑妈家女仆玛斯洛娃，使她怀孕并被赶出家门。后来，她沦为妓女，因被指控谋财害命而受审判。男主人公以陪审员的身份出庭，见到从前被他引诱的女人，深受良心谴责。他为她奔走伸冤，并请求同她结婚，以赎回自己的罪过。上诉失败后，他陪她流放西伯利亚。他的行为感动了她，使她重新爱他。但为了不损害他的名誉和地位，她最终没有和他结婚而同一个革命者结为伉俪。小王子《红字》：讲述了17世纪清教殖民统治下，在波士顿发生的一个恋爱悲剧。女主人公海丝特·白兰嫁给了医生奇灵渥斯，奇灵渥斯遭遇海难，白兰以为他在海难中已经遭遇不幸。在孤独中白兰与牧师丁梅斯代尔相恋并生下女儿珠儿。白兰被当众惩罚，戴上标志“通奸”的红色A字示众。然而白兰坚贞不屈，拒不说出孩子的父亲。后来丈夫齐灵渥斯却平安地回到了新英格兰，并隐瞒了自己的身份。当他查出白兰的情人是丁梅斯代尔，齐灵渥斯便开始折磨这位愧疚不已的年轻牧师。最终，齐灵渥斯因偏狂报复而身败名裂；丁梅斯代尔不堪愧疚，身心俱毁，临终前在公开承认了通奸事实；只有海丝特勇敢地面对未来，准备带着女儿去欧洲开始新的生活。嘉莉妹妹恋爱中的女人名利场（上、下）远离尘嚣莎士比亚戏剧集 （上、下）

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DNA文库严格来讲应称作cDNA文库，中文名称是基因文库，是指某生物基因组中所有可表达的基因片段，经mRNA反转录后获得相应的cDNA的集合，将这些cDNA的集合经转入和克隆后贮存于受体细胞群落中，这个受体细胞群落即构成该生物的cDNA文库。

不是，基因文库里只有目的基因，构建表达载体是从基因文库里提取目的基因后构建

一般是提取目的基因，连接到克隆载体，导入受体细胞进行扩增，提取携带目的基因的克隆载体，再将目的基因转接到表达载体，导入受体细胞进行基因表达，这么个大致过程。如果直接连接的表达载体，导入受体细胞再分离目的基因也是如通过测序为了验证目的基因序列的正确性等一些操作。

一、DNA文库和cDNA文库的概念将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。二、DNA文库和cDNA文库的构建原理DNA文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。三、DNA文库和cDNA文库的用途基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA

一、DNA文库和cDNA文库的概念将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。二、DNA文库和cDNA文库的构建原理DNA文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。三、DNA文库和cDNA文库的用途基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA

是cDNA文库的基因,大肠杆菌本身是原核生物,真核生物基因组基因往往含有内含子,在真核生物中转录后会被修饰,剪切下来的,而在大肠杆菌中,不能被剪切,所以转基因的时候最好转的是cDNA文库的基因,已切除内含子.另外,不是所有外源基因都适合用大肠做表达菌的,还要具体问题具体分析哦~

基因表达谱（gene expression profile），指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库，大规模cDNA测序，收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成，从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息，这样编制成的数据表就称为基因表达谱

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滚滚长江东逝水，浪花淘尽英雄。是非成败转头空，青山依旧在，几度夕阳红。在哪英雄辈出，战乱动荡的年代，有谁会分清楚是是非非呢。战乱一般没有评人的标准，唯一的就是是否符合历史。他表达的思想就是以史为鉴，构建和谐社会。

基因组文库的构建的定义：某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中，这个群体就称为该生物基因组的文库。 目的：a）分离有用的目的 基因b）保存某种生物的全部基因所以是为了储存

细胞内的基因是选择性表达的，所以不是每个基因都会复制表达。