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DNA的复制（摘自华中农业大学 生物化学系 丰明乾 教授 的 生物化学笔记）
生物体的遗传信息储存在DNA中，并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自DNA转录给RNA，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。
1958年，F.Crick提出中心法则：
（1）以原DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程。
（2）以某一段DNA分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分子的过程。
（3）以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。
中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。
DNA生物合成有两种方式：DNA复制和反转录
DNA体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状）
DNA的体外复制：分子克隆。
第一节 DNA的复制
一、 DNA半保留复制
1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。
P321 图191 Watson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型
在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补的子代链，结果新形成的两个子代DNA与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样，而且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA，另一条是新合成的。
1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli. DNA，证明了DNA的复制是半保留复制。
P322 图19-2 DNA的半保留复制。
1963年，Cairns用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E. coli. 染色体DNA。
P323 图 19-3
3H-脱氧胸苷标记E.coli. DNA ，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将E.coli. DNA转至膜上，干燥，压感光胶片，3H放出β粒子，还原银，在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子，并以半保留的形式进行复制。
DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。
二、 复制起点、单位和方向
DNA的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。
1、 复制起点
复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如D环复制）。
在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。
多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含A.T。
★环状DNA复制起点的确定方法
P325 图19-6
★复制起点的克隆和功能分析——重组质粒转化法
大肠杆菌的复制起点oriC区1Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有1-2个拷贝，用核酸外切酶缩短oriC克隆片段的大小，最后得到245bp的基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到20以上，这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。
鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段296bp的DNA片段上，与大肠杆菌的复制起始区有86%同源性，而且有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。
起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。
2、 复制单位
复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。
原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。
环状DNA的复制眼象θ，称θ形复制。
真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。
病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。
3、 复制方向
定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。
★用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度
低放射性3H-脱氧胸苷
高放射性3H-脱氧胸苷
a. 单向
b. 双向等速 三种结果图形
c. 双向异速
E.coli.的一个温度敏感株，在42℃时，能使DNA在完成复制后，不再开始新的复制过程，而在25℃时复制功又能能恢复。
4、 DNA的几种复制方式
（1）、 直线双向复制
单点，双向，T7
多点，双向，真核染色体DNA
（2）、 θ型复制：环状双链DNA，单向或双向（E .coli.）
（3）、 滚环复制：环状单链DNA，Φx174
（4）、 D环复制：线粒体、叶绿体DNA
（5）、 多复制叉复制：
第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。
在E.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA的复制最快可达50Kb/min，完全复制需40min，富营养时，20min分裂。而真核染色体要6-8小时。
三、 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子
目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制
（一） DNA的聚合反应和聚合酶
DNA生物合成5，→3，，化学合成3，→5，
1、 DNA聚合反应必备的条件
⑴ DNA聚合酶
⑵ DNA模板(反转录时用RNA模板)
⑶引物 (DNA、RNA或蛋白质)
⑷ 4种dNTP
⑸ Mg2+
2、 聚合反应过程及特点
总反应式：
n1dATP DNA pol . dAMP
n2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4）PPi
n3dCTP Mg2+ dCMP
n4dTTP dTMP
P329 图19-10 P330图19-11
在链的延长过程中，链的游离3，-羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击，生成3，.5，-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。
DNA聚合酶的反应特点：
⑴ 以4种dNTP为底物
⑵ 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。
⑶ 反应需有引物3，-羟基存在
⑷ 链生长方向5， → 3，
⑸ 产物DNA的性质与模板相同
3、 由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型
P331图19-12
（1） 发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3"羟基端回折成引物链。
（2） 末端延伸聚合：加入双链DNA作为模板和引物，3"末端突出作为模板。
（3） 分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。
（4） 环形聚合：加入带引物的环形DNA作为模板。
4、 E.coli DNA聚合酶
（1）、 E.coli. DNA pol.I（Kornberg酶，400 copy/cell）
单体酶，分子量109Kd，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNA pol.Ⅰ
催化活性：
5， → 3， 聚合活性
3， → 5， 外切活性
5， → 3， 外切活性
用蛋白水解酶将DNA pol.Ⅰ部分水解可得：
大片段（Klenow），75Kd，活性：5， → 3，聚合活性、3， → 5，外切活性。
小片段，36Kd，活性：5， → 3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。
Klenow片段的用途：
a 补齐DNA 3，隐缩未端
b. 标记DNA片段未端
c．cDNA合成第二链
d．d DNA测序
（2）、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ（100 copy/cell）
单体酶，分子量120Kd
催化活性：5，→ 3，聚合(活性很低)
3，→ 5，外切
可能在DNA的修复中起某中作用。
（3）、 E.coli.DNA pol.Ⅲ（复制酶，10-20 copy/cell）
寡聚酶，全酶由10种共22个亚基组成，α、ε和θ三种亚基组成核心酶。
P334表10-3
DNA pol.Ⅲ是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase)
Pol.Ⅲ的5，→3，外切酶活性只作用于单链DNA。
P334 表19-2 E.coli三种DNA聚合酶的性质比较
★DNA聚合酶有6个结合位点
⑴ 模板DNA结合位点
⑵ 引物结合位点
⑶ 引物3，-OH位点、反应位点
⑷ 底物dNTP结合位点
⑸ 5， → 3， 外切位点(pol.Ⅱ没有)
⑹ 3， → 5， 外切位点(校正)
5、 真核生物DNA聚合酶
P334 表19-4 真核生物DNA聚合酶
真核DNA聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。
⑴ DNA聚合酶α，多亚基，功能与E.coli. pol.Ⅲ类似，是真核DNA复制酶。
⑵ DNA聚合酶β，主要在DNA损伤的修复中起作用。
⑶ DNA聚合酶γ，从线粒体得到，可能与线粒体DNA的复制有关。
⑷ DNA聚合酶δ，特点：有3， → 5，外切活力。
（二） 引物酶或RNA聚合酶（引发酶）
细胞内，DNA的复制需要引物（DNA或RNA），引物酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基的RNA引物。
★DNA复制为什么要用RNA引物？（为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？）
P338
⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配
⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，→3，校对功能难发挥作用。
（三） 解螺旋酶
大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开。
解螺旋酶I、II、III沿着模板链的5"→3"方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3"→5"方向移动。
（四） DNA旋转酶
属DNA拓扑异构酶Ⅱ，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。
拓扑异构酶分两类：I和II，广泛存在于原核生物和真核生物。
拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。
拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。
（五） 单链DNA结合蛋白（SSB）
复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。
（六） DNA连接酶（ligase）
连接双链DNA上的切口。
大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。T4DNA ligase即可连接粘性末端的DNA，又可连接平齐末端的双链DNA。
E.coli.和其它细菌的DNA ligase以NAD为能源，动物细胞和噬菌体DNA ligase以ATP为能源。
（七） DNA复制的拓扑结构
P338-339
四、 DNA的半不连续复制
P336 图19-15 DNA的半不连续复制
DNA聚合酶催化的方向是5，→3，。
前导链：
滞后链：
1968年，发现冈崎片段。长度：
细菌：1Kb-2Kb，相当于一个顺反子的大小。
真核：100-200bp，约等于一个核小体DNA的长度。
五、 DNA复制过程（E.coli.）
P342 图19-17 大肠杆菌的复制体结构示意图
1、 复制的起始
引发：当DNA的双螺旋解开后，合成RNA引物的过程。
引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC、n、n"n""I）构成的复合体，负责RNA引物的合成。
引发体沿着模板链5"→3"方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。
E.coli.DNA复制原点ori C，由245bp组成，三组13bp重复序列（近5，端处），四组9 bp重复序列（另一端处）。
图
大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质：
DNaA 在原点处打开双螺旋
DNaB 使DNA解旋
DNaC DNaB结合在原点所需
Hu 刺激起始
引物酶（DNaG） 合成RNA引物
SSB 结合单链DNA
RNA聚合酶 促进DNaA活性
旋转酶 松驰DNA扭曲应力
20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。
三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。
DnaB（在DnaC协助下）与开放复合物结合，进一步解链。
2、 DNA链的延长反应
前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNA pol.Ⅲ催化。
复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。
复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。
3、 RNA引物的切除及缺口补齐
DNA polⅠ的5， → 3，外切活力，切除RNA引物。
DNApolⅠ的5， → 3，合成活性补齐缺口。
4、 DNA切口的连接
DNA ligase，动物、真核由ATP供能，原核由NAD供能。
5、 DNA合成的终止
环状DNA、线性DNA，复制叉相遇即终止。
uf075 小结：
⑴ DNA解螺旋酶解开双链DNA。
⑵ SSB结合于DNA单链。
⑶ DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。
⑷ DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。
⑸ DNA pol.Ⅲ在两条新生链上合成DNA。
⑹ DNA polⅠ切除RNA引物，并补上DNA。
⑺ DNA ligase连接一个冈崎片段。
DNA复制过程中，聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP掺入DNA链中，此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNA polⅠ、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。
六、 真核生物DNA的复制 P343
1、 复制起点和单位
真核生物染色体DNA是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分段进行复制。每个复制子大多在100-200bp之间，比细菌染色体DNA（单复制子）小得多。
★试验证据：5-氟脱氧胞苷标记
真核生物DNA复制叉移动的速度此原核的慢，如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟1-3Kb，细菌每分钟5Kb。
真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。真核生物在快速生长时，可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇，早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为7.9kb，而在培养的成体细胞中，平均距离为40kb，成体细胞只利用一部分复制起点。
2、 复制过程中组蛋白的装配
核小体的结构（200bp左右）
在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，DNA的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。
★试验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观察
3、 真核生物DNA复制的终止
端粒：一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体，是真核细胞染色体末端所特有的结构。
功能：
⑴保证线性DNA的完整复制
⑵保护染色体末端
⑶决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。
端粒（telomeres）分布于线性真核染色体未端。酵母端粒约100bp的重复序列，形式为：5，（TxGy）n3，(AxCy) n，x和y一般为1—4。
端粒末端的重复序列，通过端粒酶（telomerase）将其加到染色体末端。
端粒酶含有RNA和蛋白质（起DNA聚合酶的作用）两种组分，RNA分子约159b，含有多个CyAx重复序列，RNA分子用作端粒TxGy链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶，它只合成与酶自身的RNA模板互补的DNA片段。
人类体细胞的端粒长度，随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，短至1-4Kbp时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。
⑴杂交
图
⑵聚合
图
⑶转位再杂交
图
⑷进一步聚合
图
⑸非标准GG配对
图
七、 DNA复制的调控
八、 DNA复制的真实性
《杨岐生》P144
生物体DNA复制具有高度真实性，复制107-1011碱基对,只有一个错误碱基。
碱基对的自由能通常在4-13KJ/mol，这样的自由能相当于平均参入100个核苷酸就可能出现一次错配，仅靠Watson-Crick双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达10-2 。
1、 DNA聚合酶对碱基的选择作用
酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的dNTP能长时间停留，而参与聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸，选择正确的dNTP掺入引物末端。
酶积极参与理论：DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。
动力学校正阅读：在新的磷酸二酯键未形成时，dNTP结合在酶与模板—引物复合物的聚合位点上，DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP。
DNA聚合酶对底物的识别作用，DNA聚合酶有两种底物，一种是DNA模板—引物，另一种是dNTP。
DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的3，未端，再识别底物dNTP，是一种有序的识别过程。
2、 3，→5，外切活性的校正阅读
E. coli. DNA pol.Ⅰ和pol.Ⅲ有3，→5，外切活性，可删除错误插入的核苷酸。
缺失3， →5，外切活性的E. coli. DNA pol.Ⅰ，催化DNA合成时，出现错误的几率增高5-50倍。因此，3，→5，外切活性可以使DNA复制的真实性，提高1-2个数量级。
图
3、 影响DNA合成真实性的因素
⑴高浓度NMP(如3，-AMP, 5，-GMP)
NMP竞争酶的dNTP结合位点，抑制3，→5，外切活性。
⑵某一种dNTP浓度银高,可使引物3，末端离开外切活性中心。
⑶dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式，Mg2+为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子（如Mn2+）代替Mg2+时，会改变酶的主体结构，影响聚合活性和3，→3，外切活性。
4、 为什么用RNA引物
⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配
⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，→3，校对功能难发挥作用。
北营 -
就是说原来有两条链，1和2，复制以后呢不就是4条了么，对吧
但是1和2都会保留下来就会形成 1和1" 2和2",也就是说一条DNA 链中的两条DNA单链其中一条是从上一次复制的DNA中保留下来的呵呵
说的够简单了吧给点分啊