分子生物学实验要构建含有两个基因的真核表达载体，怎么进行设计载体？

噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒，同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。噬菌粒具有以下令人瞩目的特征：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。

噬菌粒(phagemid)实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体,是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体,具有 ColE1 复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒,以及丝状体噬菌体的间隔区。 噬菌体颗粒就是噬菌体

没有与宿主细胞的染色体整合。噬菌粒（phagemid）是带有丝状噬菌体复制起始点的质粒。展示筛出来的质粒表达不出来是没有与宿主细胞的染色体整合还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。

【答案】：M13噬菌体载体是基于大肠杆菌M13丝状噬菌体基因组构建的载体，在M13噬菌体基因组基因间隔区中插入β-半乳糖苷酶N端一小段编码序列(内插入若干限制性内切酶的单一切点)及其调控序列。M13载体一般只能克隆300～400bp的外源DNA片段，常用于制备单链DNA探针、定位诱变模板，也可用于噬菌体展示。噬菌质粒是噬菌体M13的基因间隔区(内含有M13的复制起点)插入到细菌质粒载体中构建而成的质粒。噬菌粒在大肠杆菌细胞内以质粒的复制起点进行复制，产生双链DNA。当含噬菌粒的大肠杆菌被辅助噬菌体感染后，在辅助噬菌体基因产物作用下，噬菌粒基因间隔区特定位点被切开，然后以M13的复制起点进行复制，产生单链DNA，并利用辅助噬菌体提供的装配蛋白和外壳蛋白装配成重组噬菌体颗粒，释放至胞外。噬菌质粒载体本身分子小，约为3kb，便于分离和操作；可克隆10kb的外源DNA片段，克隆能力强于M13噬菌体载体。

虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区，能够合成单链DNA，但是它没有M13的功能基因，没有M13基因2的产物存在，所以不能合成单链DNA。而辅助噬菌体具有M13的所有功能基因，但是IG区是缺陷的，辅助噬菌体本身的DNA不能进行单链复制，于是就可以为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白。辅助噬菌体必需具备如下条件：(1)助噬菌体的DNA IG区必需失去功能，其本身的DNA不会被包装到成熟的噬菌体颗粒中；（2）由于辅助噬菌体的IG区失活，其本身的基因不能表达，要使辅助噬菌体的所有功能基因都能进行表达，必须在辅助噬菌体的基因组中导人新的复制起点；(3)辅助噬菌体的基因组中具有选择标记，便于识别和收集一定数量的辅助噬菌体。

在基因工程中最常用的载体是质粒，此外还有噬菌体、动植物病毒等。

载体连接体系是指将不同载体上的基因进行组合，以实现功能的编程。它是合成生物学和纳米技术领域的重要研究方向之一。在设计载体连接体系时，载体与片段的最佳比例应根据具体的应用需求来确定。这是因为不同的应用场景需要不同的载体和片段，不同的载体和片段也会对连接的比例产生不同的影响。举例来说，如果要构建一种病毒治疗系统，可以选择载体为病毒，将治疗相关的片段连接在其基因组中。在这种情况下，病毒的DNA/RNA构成了大部分载体体积，而治疗相关的片段则只需要占载体基因组的一小部分，因此载体与片段的比例应该是载体占多数，片段占少数。另一方面，如果要实现一种基因编辑系统，可以选择载体为质粒，将编码CRISPR-Cas9系统的片段连接在其上。在这种情况下，CRISPR-Cas9相关片段是实现基因编辑的关键，占据了载体基因组的大部分，因此载体与片段的比例应该是片段占多数，载体占少数。

有用。虱螨一喷净特性：本品为菊科植物除虫菊干燥花絮的有效成分提炼而成的天然产品，本品品质温和，可有效杀灭体外成虫、幼虫及虫卵，所以有用。虱螨目是最初的虱螨目和噬菌粒目，通常被称为虱螨或虱子。

载体:1、科学技术上指某些能传递能量或运载其他物质的物质。如工业上用来传递热能的介质，为增加催化剂有效表面，使催化剂附着的浮石、硅胶等都是载体。2、泛指能够承载其他事物的事物。如语言文字是信息的载体。BOY,对于你单指化学中的载体,我想应该是单纯地指待存在催化剂的反应条件以及反应场所吧(主要还是指反应场所吧).虽然化学催化剂效率远不及生物中的酶,但有异曲同工的性质,酶的活性和温度,湿度,空间等等等各种因素有关. 另外,主要还是生物中的载体比较广泛哈,在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。 　　运载体　　在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。　　作为运载体必须具有四个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③ 含有复制起始位点，能够独立复制；④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。中学阶段的主要要了解和掌握的载体就是质粒载体，噬菌体载体以及病毒,其他的都不需要了解哈~~BOY

材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞及菌株 HAb18为分泌抗人肝癌mAb的鼠杂交瘤细胞株，由陈志南建株〔4〕；正常肝细胞株QZG引自中国科学院上海细胞库。pCANTAB 5E克隆及表达载体，为Pharmacia公司产品。1.1.2 试剂 反转录系统为Promega公司产品；PCR引物： heavy chain primer 1和2(Pharmacia公司产品)，分别为重链5′端和3′端引物；light chain primer mix： 为10种轻链5′端和3′端引物的混合物，用来扩增鼠Ig VL基因；linker primer mix，为带有Linker序列(Gly4Ser)3的重链3′端和轻链5′端的引物，用来将VH，VL拼接成ScFv基因；RS primer mix，为带有SfiI位点的重链5′端引物和带有NotI位点的轻链3′端引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段并引入酶切位点。引物A，D分别为重链5′端引物(含EcoRI酶切位点)及轻链3′端引物(含SalI酶切位点)〔5〕。A，D引物的序列如下:引物A VH-1（正向）:5′ GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG 3′EcoRⅠ引物D VL-2（反向）:5′ CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC 3′SalⅠ1.2 方法1.2.1 总RNA提取、cDNA第1链合成及VH和VL基因的扩增 取对数生长期的HAb18细胞，用异硫氰酸胍变性法，提取细胞总RNA。参照Promega公司反转录系统的产品说明书，反转录合成cDNA第1链。将cDNA第1链合成反应物分为两份，分别加入VH和VL引物各2 μl进行PCR。1.2.2 ScFv基因的组装 回收的VH和VL基因片段与linker primer mix等摩尔混合，加入dNTP至终浓度为2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶5u，进行7次PCR循环(94℃ 1 min，63℃ 4 min)。将VH和VL基因拼接为ScFv基因。在上述反应体系中，加入RS primer mix，再进行30次PCR循环，可在ScFv基因的两端分别加入SfiI和NotI酶切位点。1.2.3 ScFv基因的克隆和筛选 上述加端PCR产物经1.8% 琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收后，用SfiI和NotI消化，并与以此两种酶双酶切的pCANTAB 5E噬菌粒DNA连接，转化E.coli HB2151，在SOBAG（含100 mg/L氨苄青霉素和2%葡萄糖的SOB培养基）琼脂板上筛选转化菌。从转化板上挑取单个菌落，用2×YTAG（含100 mg/L氨苄青霉素和2% 葡萄糖的2×YT培养液）于30℃培养过夜，以碱裂解法小量提取噬菌粒DNA，以引物A，D进行PCR扩增出ScFv基因片段，并克隆入pUC19载体。1.2.4 ScFv核苷酸序列的测定 以美国PE317-A型自动序列分析仪进行序列测定。1.2.5 可溶性ScFv基因的分泌型表达 将含ScFv基因的重组噬菌粒菌种接种于5 ml LB 培养基，过夜培养。加至50 ml SBAG(含100 mg/L氨苄青霉素和2%葡萄糖的SB培养液)中，30℃振荡培养1 h，5 000 r/min离心15 min，弃上清。将沉淀重悬于50 ml SBAI(含100 mg/L氨苄青霉素和1 mmol/L IPTG的SB培养液)中，37℃诱导3 h，离心同上。取沉淀悬于5 ml新配制的溶菌酶（1 g/L），20% (w/v)蔗糖，30 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)及 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液中，冰浴10 min，4℃以12000r/min离心5 min，上清即为外周质部分。将其冷冻干燥后，贮于-20℃。临用时以0.01 mol/L PBS溶解至500 μl。1.2.6 ScFv基因可溶性表达产物的鉴定 采用SDS-PAGE及Western blot(二抗为鼠抗-E-tag抗体)进行鉴定。1.2.8 流式细胞仪分析ScFv的活性 收集培养的肝癌细胞SMMC 7721，正常肝细胞QZG及胃癌细胞SCG 7901，用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度至5×106/L~1×107/L。每管加入40 μl细胞悬液，100 μl ScFv表达产物，再加入50 μl 1∶20灭活正常兔血清（用DPBS稀释），于4℃作用30 min，洗涤2次，以800 r/min离心5 min，弃上清。加入抗E-tag抗体8 μl(2.5 g/L)，4℃作用30 min，洗涤2次，弃上清。加入50 μl FITC标记的羊抗鼠抗体，充分振摇，4℃作用30 min，洗涤2次，加入500 μl固定液，以流式细胞仪进行分析。同时设正常肝细胞、胃癌细胞为阴性对照组，肝癌细胞加亲本抗体Hab18为阳性对照组。2 结 果2.1 VH和VL基因的PCR扩增及ScFv基因的拼接 VH和VL基因测序结果显示，VH为363 bp，VL为342 bp，与预期的VH和VL基因片段大小相符。将VH和VL基因用linker连接成ScFv基因（其中linker为45 bp）。以此为模板加入RS primer mix进行PCR扩增，所获扩增产物的大小约为730 bp，表明VH，VL及linker primer mix的浓度配合准确，并引入了SfiI和NotI酶切位点（图1，见第Ⅳ页）。2.2 ScFv基因的克隆 将ScFv基因克隆入pCANTAB 5E中，连接物转化E.Coli HB2151。在SOBAG固体培养基上筛选转化的菌落。然后随机挑选8个菌落，小量制备噬菌粒DNA，以Sfi I 和NotI双酶切鉴定。若含有外源插段者，应切出约730 bp大小的片段。结果表明，8个克隆均含插段。2.3 ScFv基因的序列测定 如图2所示，ScFv基因全长为726 bp，包括预期的VH，VL基因和linker序列。VH基因序列处于linker的上游，VL基因序列处于linker的下游。2.4 可溶性ScFv蛋白的鉴定 可溶性ScFv-E-tag融合蛋白，预期的Mr为29 000。E-tag可作为蛋白标签，通过鼠抗E-tag抗体来检测ScFv基因的表达。将阳性克隆以1 mmol/L IPTG诱导3 h，对IPTG诱导和未诱导的菌体进行裂解，经SDS-PAGE后，在(Mr为29 000处多出1条明显的新生蛋白带，与预计的ScFv-E-tag融合蛋白的大小Mr为29 000)相符（图3，见第Ⅳ页）。同时做与图3相同的SDS-PAGE并进行Western blot，在Mr为29 000处有显色条带，即为能与抗E-tag抗体特异性结合的可溶性ScFv蛋白（图4，见第Ⅳ页）。2.5 可溶性ScFv蛋白与肝癌细胞的结合活性 以可溶性 ScFv蛋白为一抗，抗E-tag抗体为二抗，FITC-抗鼠IgG为三抗，用流式细胞仪测定荧光标记细胞的阳性率(图5，见第Ⅳ页)。肝癌细胞组： 无关抗体(抗-CD3)为1.6%，亲本抗体为97.5%，ScFv 为30.9%；正常肝细胞+ScFv蛋白为2.6%，胃癌细胞+ScFv蛋白 为4.1%。表明可溶性ScFv蛋白能与肝癌细胞特异地结合，而不与正常肝细胞和胃癌细胞结合。荧光显微镜观察，可溶性ScFv蛋白与肝癌细胞的膜抗原相结合，在细胞膜上可见颗粒状的荧光(结果未显示)。3 讨 论 随着Ig基因结构与功能研究的不断深入，基因工程新技术的不断涌现和成熟，基因工程抗体的研究取得了很大进展。现获得的各种基因工程抗体已基本克服了鼠源性mAb的缺点，及制备人源性抗体的困难，使之在基础医学研究和临床疾病的诊断、治疗和预防等领域，特别是肿瘤的治疗中，得到了极为广泛地应用，有的已进入Ⅲ期临床应用。运用基因工程重组技术，将鼠源性抗体恒定区和可变区的框架区以人源性相应抗体片段取代，可降低抗体的免疫原性，有效地减轻免疫排斥反应〔6〕。利用基因突变技术改变抗体的某些结构，则可提高抗体的亲和力，延长其半衰期〔7〕。另外，还可将抗体基因与其它功能性基因相连接，赋予抗体新的功能。 近年发展起来的抗体库克隆技术，可无需进行细胞融合制备杂交瘤，甚至无需进行免疫，即可直接从基因水平上，获得所需的针对相应抗原的抗体。制备基因工程抗体的关键，是获得抗体可变区基因，拼接成单链抗体基因，并表达出有生物学活性的产物。 本文从分泌抗肝癌mAb的杂交瘤细胞(HAb18)中，用RT-PCR，克隆出抗体可变区基因，其关键是PCR引物的设计。大多数研究者设计合成的引物，通常是针对V区FR1 5′端（或信号肽）的保守序列和J基因3′端序列（或恒定区基因序列）而设计的，特异性不够强，不能有效地扩增某些目的基因。Pharmacia公司噬菌体呈现系统中的混合引物，系针对鼠Ig基因不同家族的序列而设计的。从理论上讲，适用于所有类型的Ig，每种可变区基因都可获得扩增，对全套抗体库的构建非常重要。 本研究所用pCANTAB 5E是Pharmacia公司的产品，含有氨苄青霉素抗性基因，plac启动子和M13噬菌体基因间隔区片段，在多克隆位点与gⅢ编码区之间，有1个c-myc tag序列和琥珀终止码TAG，IPTG可诱导外源基因的表达。在不含有琥珀抑制基因的菌株（如HB2151）中，E-tag后的终止码被识别，多肽链的翻译终止于此，从而可生成具有生物学活性带有13肽E-tag的可溶性ScFv蛋白，释放于细菌周质中。E-tag为源于人c-myc基因的一段序列，对ScFv基因的结构和活性均无影响，可作为可溶性ScFv蛋白的标签，用抗E-tag抗体来检测ScFv基因的表达并纯化其产物。我们用含有ScFv基因的重组噬菌粒载体转化大肠杆菌HB2151，经IPTG诱导获得可溶性表达产物。用抗E-tag抗体做Western blot证实，表达产物为ScFv-E-tag融合蛋白。流式细胞仪分析表明，此ScFv融合蛋白可与肝癌细胞结合，荧光标记细胞的阳性率为30.9%，而不与正常肝细胞及胃癌细胞相结合，表明此ScFv蛋白具有肝癌结合的特异性。参考文献1 顾方舟，陈妙兰，陆如山等. 肝癌研究概况与展望. 北京： 中国协和医科大学，北京医科大学联合出版社，1993: 1-32 Hoston JS，Levinson D，Mudgett HM et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in E.coli. Proc Natl Acad Sci USA，1988；85: 5879-58833 Kroesen BJ，Wellenberg GJ，Bakker A et al. The role of apoptosis in bispecific antibody-mediated T cell cytotoxicity. Br J Cancer，1996 ；73(6): 721-7274 陈志南，刘彦仿，杨继震等. 抗人肝细胞癌单克隆抗体的产生及其相应抗原的免疫组化定位研究. 单克隆抗体通讯，1989；5(2)： 33-365 杨安钢，吉昌华，韩 骅等. 抗人CD8单抗κ轻链可变区基因的克隆和序列测定. 生物化学与生物物理进展，1992；19（4）： 286-2886 Man SC，Jeanne BK，Bednarik EJ. Humanized anti-Lewis Y antibodies: in vitro properties and pharmacokinetics in rhesus monkeys. Cancer Research，1996；56: 1118-11257 Mats O，Henrik O，Michael M et al. Light chain shuffling of a high affinity antibody results in a drift in epitope recognition. Mol Immunol，1996；33(1): 47-56(收稿 1998-03-03 修回 1998-03-26)

构建基因组文库的步骤A 分离基因组DNA；B 用超声波或限制酶等进行基因组DNA部分或完全降解；C 将降解物进行分级得到所需大小DNA片段；D 将DNA片段与载体连接(一般用λ噬菌体载体)；E 将重组体导入宿主细胞；F 最后筛选鉴定重组子克隆。建立基因组文库的方法2—λ噬菌体基因组文库 可插入较大片段，最大可达23kb建立基因组文库的其他方法：cosmid基因组文库 YAC基因组文库 BAC基因组文库基因文库的质量标准：重组克隆的总数不宜过大， 以减轻筛选工作的压力；载体的装载量最好大于基因的长度， 避免基因被分隔克隆；克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域, 以利克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下,重组克隆能稳定保存、扩增、筛选建立cDNA文库的基本步骤 (1)隔离总RNA和净化mRNA (2)合成的双链互补脱氧核糖核酸适合插入一个克隆载体(3)克隆cDNA合适的向量(4)转移到合适的宿主细胞的重组载体(5)筛查阳性克隆cDNA克隆的策略(1)自身引导的第二链合成+同聚物加尾（2）cDNA克隆方法的改进。尾随第一链寡核苷酸（DC）允许使用寡核苷酸引物（ DG）将要开展的第二链（3）cDNA的定向克隆从基因文库中筛选分离目的基因克隆(1)制备核酸探针进行杂交筛选(2) 制备抗体进行免疫杂交筛选(3)根据生物大分子间的相互作用筛选目的基因(4)利用PCR技术筛选目的基因文库(5)利用噬菌体表面展示技术分离目的cDNA克隆：噬菌体展示(phage display)：是在噬菌体表面表达已融合到噬菌体外壳蛋白的重组蛋白或多肽的技术。应用噬菌体展示技术的关键是构建表达性基因文库，这种文库称为噬菌体展示文库(phage display library )。常用的构建噬菌体显示文库的表达载体有两类：丝状噬菌体和以这些噬菌体复制起始序列为基础构建的噬菌粒(phagemid)。mRNA差别显示技术原理：在 mRNA3′端的 poly (A)5"上游的 2个碱基只有 1 2种组合。与此相对应，共可人工合成12种不同的下游引物，用以反转录mRNA 合成cDNA第一条链。这种引物通常称为3"端锚定引物，它由Oligo-d T后面接上两个碱基 (如 5′T1 1 - 1 2 MN3′, M=G、C或 A; N=A、G、C或 T)构成。这样，每一种此类人工合成的寡核苷酸引物，都将能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。由此可知，使用5′T1 1 - 1 2 MN3′引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的但序列结构不同的12份亚群体。DDRT-PCR的主要步骤：Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3"锚定引物作为反转录的引物，合成第一链cDNA；Ⅱ.用5"随机引物和某个3"端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)；Ⅲ.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；Ⅳ.回收特异性差别条带；Ⅴ.用同一引物对扩增已回收的DNA条带；Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；Ⅶ.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。 DNA插入诱变法分离目的基因DNA插入诱变法主要用于植物目的基因的克隆分离研究。其基本原理是，当一段特定的DNA序列插入到植物基因的内部或其邻近位置时，一般会诱导该基因发生突变形成突变体植株，或者在插入位置产生一个新的基因。 如果该DNA插入序列是已知的，便可用它作为DNA分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选得到突变基因片段。然后利用此突变基因片段制备探针，从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。这样，插入的DNA序列相当于在植物基因上贴了一张标签，因此，DNA插入诱变法又叫DNA标签法(DNA tagging)。差别杂交和减法杂交技术分离目的基因差别杂交构建了基因文库后，如没有任何可供选择的探针进行筛选，或没有任何有关目的基因的核苷酸序列信息时，可以考虑用差别杂交法筛选目的基因片段。差别杂交(Differential hybridization)也称为差别筛选(Differential screening)法。特别适用于分离在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调控的基因，亦可有效地用来分离经特殊处理诱导表达的基因。差别杂交的技术原理：有目的基因能正常表达和不能表达的两个不同的细胞群体。在这种情况下，分别制备两种不同细胞群体的mRNA提取物，其中一个群体含有一定比例的目的基因mRNA ，另一个群体不含有目的基因mRNA。差别杂交的技术原理过程：以这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目的基因表达的mRNA群体为探针时，所有包含重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点;而以目的基因不表达的mRNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，变可以挑选出含有目的基因的菌落，供进一步研究用。差别杂交法的局限性：首先，差别杂交的灵敏度比较低，不适合低丰度mRNA的目的基因的分离。其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑，是一项十分耗时耗力的工作；第三，差别杂交重复性差。差别杂交涉及文库的滤膜影印，不同滤膜之间的DNA保有量往往不均一，杂交所得的信号强度也会不一致，需要重新进行点杂交，以做进一步的阳性克隆鉴定工作 。mRNA减法杂交基本原理：从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录成为cDNA，然后与无目的基因表达的组织中提取的mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成程cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍然保持单链状态，这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。基因突变技术分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又分两种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变(oligonucleotide-mediated mutagenesis)；第二类是利用PCR,以双链DNA为模板所进行的基因突变。寡核苷酸介导的定点诱变的原理 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子链的组成部分。因此，所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列。要求所设计的寡核苷酸引物除了所需的突变位点之外，与目的基因编码的区段完全互补。作为诱变剂的寡核苷酸序列，同待诱变的目的基因的互补序列之间，能形成一种稳定的唯一的双链结构。决定双链区段稳定性的主要因素是碱基的组分、核苷酸的错配以及寡核苷酸引物的长度等。寡核苷酸介导的定点诱变的基本步骤(a)将要进行突变的目标基因(或DNA片段)克隆于M13噬菌体载体或噬菌粒载体。(b)从重组的M13或噬菌粒中制备单链DNA。(c)将设计好的寡核苷酸突变引物的5"端用T4多核苷酸激酶进行磷酸化。(d)将上述突变引物与目标基因(单链的DNA模板)进行退火。(e)在存在DNA聚合酶和dNTP的情况下，使退火引物沿单链DNA模板延伸，然后新生链的末端用T4 DNA连接酶连接。(f)转染易感细菌。(g)筛选出带有突变的目标基因的噬菌斑。(h)从突变的重组噬菌体制备单链DNA，通过DNA序列分析确认突变位点的正确性。(i)从重组的M13噬菌体复制型双链DNA中回收突变的目标基因(DNA片段)。(j)将突变了的基因(DNA片段)重组入表达载体进行表达。第五章受体细胞应具备的条件(1)便于重组DNA分子的导入。如易形成感受态，具有较高的转化效率；(2) 能使重组体DNA分子稳定存在于细胞中。如限制性缺陷型； (3) 便于重组体的筛选。如具有与重组体互补的遗传性状； (4) 受体细胞遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长，能进行高密度培养；对动物细胞要可悬浮培养，对培养基适应性要好；(5)安全性高，无治病性，不会对外界环境造成生物污染：感染与寄生缺陷型；(6)蛋白水解酶少,利于外源蛋白在细胞内的积累。尤其是对枯草芽孢杆菌。(7) 受体细胞的密码子偏倚性要小；(8) 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 ▲糖蛋白不能在E.coli中表达；(9) 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值；(10)对于用于基因扩增或基因高效表达的受体要用重组整合缺陷型。第六章克隆基因高表达的相关因素1有效转录开始 关键的一步，并限制外源基因表达的一步！构建表达载体的同时，选择强的和可控制的启动子和相关终止序列。2有效延长和终止转录正确 3 mRNA的稳定性4有效地转录开始5遗传密码子偏向6核糖核酸处理过程7终止密码子8表达载体9重组蛋白Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA）；正调节因子 CAP；负调节因子 lac I Tac 表达系统 tac启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂合启动子。 调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平高于 trp 和 lacUV5启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。包涵体蛋白在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起，形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体(inclusion body, inclusive body)。包涵体主要由蛋白质组成，并且大部分为外源基因的表达产物，它们具有正确的氨基酸序列，但构像却是错误的，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。包涵体形成的原因主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。此外，还有以下原因：(1)表达量过高。(2) 重组蛋白的氨基酸组成(3)重组蛋白所处的环境：温度、pH(4)缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类(5)培养条件不佳酵母基因表达载体的种类 自主复制型质粒载体:含酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和克隆位点等关键元件。较高拷贝数，细胞分裂时不能平均分配到子细胞中。 整合型质粒载体:不含酵母基因组的DNA复制起始区，但含有整合介导区。 着丝粒型质粒载体:在自主复制型质粒载体基础上构建而成，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件，可保证平均分配到子细胞中。1-2拷贝/细胞。 酵母人工染色体:以线性双链DNA形式存在于酵母细胞，每个细胞只有单拷贝。

1、概念不同质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子。载体：某些能传递能量或运载其他物质的物质。2、存在不同质粒广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。载体只作为两个物质之间沟通的桥梁。扩展资料：分类1、根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。2、根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。3、根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。参考资料：百度百科-质粒百度百科-载体

那得看是什么的载体膜上用于主动运输的载体全是蛋白质。但是在基因工程上基因的运载体却可以是质粒（一种环状DNA），病毒也可作基因的运载体所以载体不都是蛋白质；如果你指膜上的载体，那就全是蛋白质。

根据信息载体不同分为：芯片卡，磁条卡。载体（Vector） ，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。在实际生活中，胰岛素就可以通过使用载体将已插入胰岛素基因片段的质粒放入大肠杆菌内。经过插入基因片段的质粒就称作载体。该质粒在细菌内可以进行自我复制，并且不会影响到生物原来的活动。载体按功能可分为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段。主要有质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，如启动子和终止子。为了实现外源基因在不同表达载体中进行复制和表达，基因工程操作中常使用穿梭载体( shuttle vector)。穿梭载体含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的细胞中复制，如既能在原核生物中复制也能在真核生物中复制的载体，不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列( ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。

载体与片段的摩尔比例计算：先算出载体和目的基因的浓度，（可以跟mark的亮度对比估算，也能用软件计算），再根据摩尔质量比和基因的大小算出质量比，再算出体积比就行。载体与插入片段比例一般是1:10，通过测定DNA浓度来调整。单酶切片段插入时，载体一定要去磷酸化，载体易自连；双酶切二者比例要适当，比例不对，载体也会自连，因为微生物有自己的修护系统。载体按功能可分为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段。主要有质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，如启动子和终止子。为了实现外源基因在不同表达载体中进行复制和表达，基因工程操作中常使用穿梭载体( shuttle vector)。

（1）． 质粒文库 质粒是最早用于基因克隆的载体。现已有各种适用于不同工作的如克隆、表达、测序等专用商品质粒。但在构建基因文库上，由于质粒相对较小并只能容纳比自身更小的片段，因此它不能用于构建核基因组文库，通常只用来构建短序列的克隆文库。例如叶绿体DNA分子较小，可以用质粒构建叶绿体DNA文库。质粒载体可用于生物cDNA文库构建。但只适合于高丰度的mRNA。（2）． 噬菌体文库 目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体很多，如单链的M13噬菌体载体、λ噬菌体载体、P1噬菌体载体、噬菌粒(phagemid或phasmid)等。其中使用最多的是入噬菌体。 λ-DNA为双链结构，长49kb。线性分子两端各有一条12个核苷酸的黏性末端称cos位点。分子中有约15kb可去掉的非必要基因区，又称“填充区”， “填充区”两侧的序列含有其增殖所必需的全部基因，称为左、右臂。“填充区”可被外源DNA取代，构成重组体，这是它成为克隆载体的结构基础。由于噬菌体头部包装容量的限制，重组λ-DNA分子大小只能在39—52kb之间。（3）． 黏粒文库 黏粒(cosmid)也称柯斯质粒，是人工构建的由λ噬菌体的COS序列、质粒的复制子序列及抗生素抗性基因序列组合而成的一类特殊的质粒载体。COS序列是DNA包装进噬菌体颗粒所必须的。复制子通常是使用ColEl或pMBl的复制起始位点。黏粒具有λ噬菌体的某些性质，在克隆了大小合适的外源DNA片段并且在体外被包装成噬菌体颗粒后，能高效转导对入噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞。在宿主细胞内按λ噬菌体方式环化，但不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒(因分子中不具入噬菌体全部必要基因)。它也具有质粒载体的主要性质，在宿主细胞内可以像其他质粒一样复制，并与松弛型质粒相同，适量的氯霉素可促进扩增。因具抗生素基因，可以通过抗生素抗性筛选重组子。黏粒载体在构建时也加上了设在插入失活基因内的多克隆位点。黏粒载体的分子较小(2．8—24kb)，但克隆容量很高，对外源DNA长度的要求是30～45 kb，上限几乎是入噬菌体载体容量(23 kb)的2倍，所以黏粒载体在核基因组文库构建上具有相当的优势，可克隆包括3，和5"调控区在内的完整的植物基因。（4）．人工染色体文库 人工染色体载体是利用真核生物染色体或原核生物基因组的功能元件构建的能克隆大于50kbDNA片段的人工载体。其中有的载体既可用于克隆，又能直接转化，是进行基因功能研究的良好载体。近年来陆续发展起来的人工染色体文库有YAC库、BAC库、BIBAC库、PAC库及TAC库。

Aactivation domain 活化结构域adapters 连接物adenine 腺嘌呤adenosine 腺ADP (adenosine diphosphate) 腺二磷酸affinity column 亲和柱AFLP (amplified fragment length polymorphisms) 增值性断片长度多态现象agrobacterium 农杆菌属alanine 丙氨酸allele 等位基因amber mutation 琥珀型突变AMP (adenosine monophosphate) 腺一磷酸ampicillin 氨?青霉素anchor primer 锚状引物annealing 退火annealing temperature 退火温度anticodon 反密码子AP-PCR (arbitrarily primed PCR) 任意引物聚合?链反应arbitrary primer 任意引物ATP (adenosine triphosphate) 腺三磷酸autosome 常染色体Bbaculovirus 杆状病毒base pair 基对base sequence 基顺序beta-galactosidase β-半乳糖?beta-glucuronidase β-葡糖醛酸糖?bioluminescence 生物发光bioremediation 生物降解biotechnology 生物技术blotting 印迹法blue-white selection 蓝白斑筛选blunt end 平(整末)端Ccatalyst 催化剂cDNA library 反向转录DNA库centromere 着丝体centrosome 中心体chemiluminescence 化学发光chiasma 交叉chromomere 染色粒chromoplast 有色体chromosomal aberration 染色体畸变chromosomal duplication 染色体复制chromosomal fibre 染色体牵丝chromosome 染色体chromosome complement 染色体组chromosome map 染色体图chromosome mutation 染色体突变clone 克隆cloning 无性繁殖系化codon 密码子codon degeneracy 密码简并codon usage 密码子选择cohesive end 黏性末端complementary DNA (cDNA) 反向转录DNAcomplementary gene 互补基因consensus sequence 共有序列construct 组成cosmids 黏性质粒crossing over 互换cyclic AMP (cAMP) 环腺酸cytosine 胞嘧啶Ddark band 暗带deamination 脱氨基作用decarboxylation 脱羧基作用degenerate code 简并密码degenerate PCR 退化性聚合?链反应dehydrogenase 脱氢?denaturation 变性deoxyribonucleoside diphospahte 脱氧核糖核一磷酸deoxyribonucleoside monophospahte 脱氧核糖核二磷酸deoxyribonucleoside triphospahte 脱氧核糖核三磷酸deoxyribose 去(脱)氧核糖dicarboxylic acid 二羧酸digoxigenin 洋地黄毒diploid 二倍体DNA (deoxyribonucleic acid) 去(脱)氧核糖核酸DNA binding domain DNA结合性结构域DNA fingerprinting DNA指纹图谱DNA helicase DNA解螺旋?DNA kinase DNA激?DNA ligase DNA连接?DNA polymer DNA聚合物DNA polymerase DNA聚合?double helix 双螺旋double-strand 双链Eelectroporation 电穿孔endonuclease 内切核酸?enhancer 增强子enterokinase 肠激?episome 游离基因ethidium bromide 溴乙锭eukaryotic 真核生物的euploid 整倍体exonuclease 外切核酸?expressed-sequence tags 表达的序列标记片段extron 外含子FF factor F因子FAD (flavine adenine dinucleotide) 黄素腺嘌呤二(双)核酸feedback control 反馈控制feedback inhibition 反馈抑制feedback mechanism 反馈机制first filial (F1) generation 第一子代FISH (fluoresence in situ hybridization) 荧光原位杂交forward mutation 正向突变F-pilus F纤毛functional complementation 功能性互补作用fusion protein 融合蛋白Ggel electrophoresis 凝胶电泳gene 基因gene cloning 基因克隆gene conversion 基因转变gene duplication 基因复制gene flow 基因流动gene gun 基因枪gene interaction 基因相互作用gene locus 基因位点gene mutation 基因突变gene regulation 基因调节gene segregation 基因分离gene therapy 基因治疗geneome 基因组 / 染色体组genetic map 基因图genetic modified foods (GM foods) 基因食物genetics 遗传学genetypic ratio 基因型比 / 基因型比值genome 基因组 / 染色体组genomic library 基因组文库genotype 基因型giant chromosome 巨染色体globulin 球蛋白glucose-6-phosphate dehydrogenase 6-磷酸葡萄糖脱氢?GP (glycerate phosphate) 磷酸甘油酸脂GTP (guanine triphosphate) 鸟三磷酸guanine 鸟嘌呤Hhaploid 单倍体haploid generation 单倍世代heredity 遗传heterochromatin 异染色质Hfr strain 高频重组菌株holoenzyme 全?homologous 同源的housekeeping gene 家务基因hybridization 杂交Iimmunoglobulin 免疫球蛋白in vitro 在体外 / 在试管内in vivio 在体内independent assortment 独立分配induced mutation 诱发性突变induction 诱导initiation codon 起始密码子inosine 次黄insert 插入片段insertional inactivation 插入失活interference 干扰intergenic 基因间的interphase 间期intragenic 基因内的intron 内含子inversion 倒位isocaudarner 同尾酸isoschizomer 同切点?JKkanamycin 卡那毒素klenow fragment 克列诺夫片段Llac operon 乳糖操纵子ligase 连接?ligation 连接作用light band 明带linker 连接体liposome 脂质体locus 位点Mmap distance 图距离map unit 图距单位mature transcript 成熟转录物metaphase 中期methylase 甲基化?methylation 甲基化作用microarray 微列microinjection 微注射missense mutation 错差突变molecular genetics 分子遗传学monoploid 单倍体monosome 单染色体messenger RNA (mRNA) 信使RNAmultiple alleles 复(多)等位基因mutagen 诱变剂mutagenesis 诱变mutant 突变体mutant gene 突变基因mutant strain 突变株mutation 突变mutation rate 突变率muton 突变子NNAD (nicotinamide adenine dinucleotide) 烟醯胺腺嘌呤二核酸NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 烟醯胺腺嘌呤二核酸磷酸nicking activity 切割活性nonsense codon 无意义密码子nonsense mutation 无意义突变Northern blot Northern印迹法nuclear DNA 核DNAnuclear gene 核基因nuclease 核酸?nucleic acid 核酸nucleoside 核nucleoside triphosphate 核三磷酸nucleotidase 核酸?nucleotide 核酸nucleotide sequence 核酸序列Ooligonucleotide 寡核酸one gene one polypeptide hypothesis 一个基因一种?学说operon 操纵子oxidative decarboxylation 氧化脱羧作用oxidative phosphorylation 氧化磷酸化作用PPCR (polymerase chain reaction) 聚合?链反应peptide ?peptide bond ?键phagemids 噬菌粒phosphorylation 磷酸化作用physical map 物理图谱plasmid 质粒point mutation 点突变poly(A) tail poly(A)尾polymerase 聚合?polyploid 多倍体positional cloning 位置性无性繁殖系化primary transcript 初级转录物primer 引物probe 探针prokaryotic 原核的promoter 启动子protease 蛋白?purine 嘌呤pyrimidine 嘧啶QRrandom segregation 随机分离RAPD (rapid amplified polymorphic DNA) 快速扩增多态DNAreading frame 阅读码框recessive gene 隐性基因recombinant 重组体recombinant DNA technology 重组DNA技术recombination 重组regulator (gene) 调控基因replica 复制物 / 印模replica plating 复制平皿(板)培养法replication 复制replication origin 复制起点reporter gene 报道基因repression 阻遏repressor 阻遏物repressor gene 阻遏基因resistance strain 抗药性菌株restriction 限制作用restriction enzyme 限制性内切?restriction mapping 限制性内切?图谱retrovirus 反转录病毒reverse transcription 反转录作用RFLP (restricted fragment length polymorphisms) 限制性断片长度多态现象ribonucleotide 核糖核酸ribose 核糖ribosomal RNA (rRNA) 核糖体RNAribosome 核糖体RNA (ribonucleic acid) 核糖核酸RNA polymerase I RNA聚合?IRNA polymerase II RNA聚合?IIRNA polymerase III RNA聚合?IIIR-plasmid R质粒 / 抗药性质粒Ssecond filial (F2) generation 第二子代self-ligation 自我连接作用shuttle vectors 穿梭载体sigma factor σ因子single nucleotide polymorphism 单核酸多态性single-stranded DNA 单链DNAsister chromatid 姊妹染色单体sister chromosome 姊妹染色体site-directed mutagenesis 定点诱变somatic cell 体细胞Southern blot Southern印迹法splice 拼接star activity 星号活性stationary phase 静止生长期sticky end 黏性末端stop codon 终止密码子structural gene 结构基因supernatant 上层清液supressor 抑制基因Ttelophase 末期template 模板terminator 终止子tetracycline 四环素thymine 胸腺嘧啶tissue culture 组织培养transcription 转录作用transfer RNA (tRNA) 转移RNAtransformation 转化作用transgene 转基因translation 翻译 / 平移transmembrane 跨膜triplet 三联体triplet code 三联体密码triploid 三倍体UVvector 载体WWestern blot Western印迹法

(1)cDNA文库是指细胞全部mRNA通过逆转录得到cDNA后被克隆的总和。cDNA的组成特点是片段中不含基因的内含子和其他调控序列。cDNA文库构建基本步骤：①制备mRNA：全RNA提取与mRNA的分离提纯；②合成cDNA：oligo dT与mRNA3"端poly(A)杂交作为引物合成第一链，第二链合成是以第一链为模板，DNA聚合酶催化。常用RNase H切割mRNA-cDNA杂合链中的mRNA序列产生的小片段为引物合成第二链的片段，再连接成完整链；③制备载体DNA：由于cDNA分子的长度在0. 5～8kb，常用的质粒载体和噬菌体载体都可以，载体选择根据文库用途确定，如噬菌粒载体具有噬菌体的高效性和质粒载体系统可以利用蓝白斑筛选的便利；④cDNA的分子克隆：cDNA连入载体，转化重组体，扩增；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，评价文库质量。文库是否有价值主要从文库含量和插入片段的大小来评价，所构建文库必须有足够多的克隆数以确保基因组cDNA每一个序列至少有1个拷贝在文库内。(2)cDNA文库同基因组文库的差别主要在于基因组文库(尤其是真核生物的基因组文库)可能包含有非编码序列，含有更丰富的遗传信息。

一样。克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

1、性质不同。表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。 2、组成不同。表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

克隆载体（CloningVector）：通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。

克隆载体是能够通过限制性内切酶，将目的DNA片段整合进去，并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA。通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。

①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入。③含有复制起始位点，能够独立复制；通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。⑤载体DNA分子大小应合适，以便操作。基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体。

表达载体和克隆载体有什么不同?高粉答主4778表达载体和克隆载体的区别：1、性质不同表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。克隆载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。2、组成不同表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。克隆载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

克隆载体是能够通过限制性内切酶,将目的DNA片段整合进去,并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA.通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体,在载体上插入合适大小的外源DNA片段,并注意不能破坏载体的自我复制性质.将重组后的载体引入到宿主细胞中,并在宿主细胞中大量繁殖.常见的载体有质粒,噬菌粒,酵母人工染色体.对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖,而且最好要有较高的自主复制能力.②容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好.③容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制.这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点.④容易从宿主细胞中分离纯化出来, 这才便于重组操作.⑤有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来.

http://baike.baidu.com/view/184171.htm我从这个网址搜到的，你可以看看，是4声没问题载体　　　　载体：zài tǐ　　英文单词vector ，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。 　　运载体　　在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。　　作为运载体必须具有四个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③ 含有复制起始位点，能够独立复制；④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。　　　基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体

小蛮和赵灵儿的孙女，小蛮是女娲族的直系后裔，李忆如之女，由“巫月神教”掌门海棠夫人（阿奴）抚养长大。虽然娇蛮，但心地善良。母亲李忆如，在小蛮年幼时去世；父亲不明（在官方短漫《忆相逢》中，小蛮父亲为韩仲晰）。外公李逍遥（一贫）平时忙于蜀山事务等无暇照顾小蛮，于是由巫月神教海棠夫人（阿奴）抚养小蛮长大，并收其为徒，除了教法术和武术，也教其女娲族的一些法术。扩展资料李忆如和小蛮：生下小蛮的六年后，韩仲晰因身体原因终究走到了最后一程。临终前，韩仲晰表示对不起忆如，为了他不能回家，甚至婶婆过世也没能看到她最后一面。忆如为了让他安心，表示她和他与小蛮在一起的日子，是她最珍贵的时光。韩仲晰交代完后事，便离世。忆如抱着小蛮哭得伤心，突然怀中的小蛮没有动作，忆如检查发现她昏迷。忆如带着小蛮前往蜀山，找草谷前辈为小蛮看病。草谷让忆如陪小蛮住下来，同时，请逍遥随她去抓药。忆如隐隐知道草谷是私下与父亲谈话，于是在药房外偷听。草谷诊断出小蛮因父母原因而真元缺损，若是普通孩子则可不用修行；但小蛮是女娲族人，随着成长要从母亲身上吸取女娲灵力，对小蛮而言是增加了负担。负担到小蛮承受不了会昏迷不醒，女娲族本能已开始毁掉小蛮的真元，女娲灵力返回给母亲。而解救方法是忆如将全部的女娲灵力瞬息给小蛮，重新塑造真元。只是忆如没有几日可活。忆如听完草谷的话，毅然将自己的女娲灵力全部传给了小蛮。原是黑发的小蛮，拥有了象征灵力高强的红发，而忆如发色由红变黑。当父亲看到已经恢复活力的小蛮时，就明白忆如知道了办法并已照做。忆如看到阿奴，便嘱咐小蛮要听阿奴师父的话，随后任小蛮跟着阿奴离去。忆如同父亲商量，让小蛮在苗疆生活，并向父亲道歉她的任性，只是她并不后悔她所做的每一个决定。令忆如遗憾的是，她无法看着小蛮长大，于是请父亲及大家费心照顾小蛮。

中国古代一直都有说天机是不可泄露的，但历史上也不乏有泄露的天机的能人，那么历史上泄露的天机的四个人下场是什么样的呢？四个人里面有三个人都是结局相似，只有一个人是结局尚好。首先是许负，生年不详，猜测应该实在始皇二十六年左右，也就是公元前221年。因为这一年，天下统一，高兴的秦始皇命令普天同庆，有什么祥瑞就上奏朝廷。各地官员赶紧献上奇事，河内郡在秋天上奏说温城县令许望家里生了一个女儿，出生时手里拿着一块玉，玉上面还有八卦图，并且此女出生百天就会说话了。秦始皇觉得这是祥瑞，就下令赏赐黄金给许家，让他们好好养着这个小女孩，许望为了表示感谢秦始皇就给女儿取名许莫负。许望为了不辜负秦始皇的期望，对女儿是精心养护，还给她特意请了教书先生。莫负名声大震之后秦始皇也派人来请，但是莫负却选择了装病，父亲的问的时候她只是说天下大乱，并且将自己的名字莫负改成了负。两年后天下果然大乱，就在这时刘邦听说许家女儿的事情就像前来拜访一下。谁知许负一见刘邦、萧何等人就让父亲追随刘邦，因为她看出了刘邦是帝王之相，而萧何等人将来是位极人臣的相貌。神的还不止这一件，还有公元前206年，这个时候秦朝已经灭亡了。许负看见魏豹夫人薄姬就说她的相貌极贵，将来一定能够生下天子。给魏豹高兴的立马就背叛了刘邦，刘邦无奈只在就派韩信攻击。刘邦登基之后许负跟刘邦说有一个女子应该娶，这个人就是薄姬。吕后之乱的时候，只有薄姬的儿子刘恒活了下来并且平定了叛乱。许负的结局是好的，她在五十大寿的时候用一番话劝说了刘邦让自己退出朝廷，因此她活到了八十岁。剩下的几位就没有那么好了，第二和第三就是名满天下的李淳风、袁天罡。李淳风、袁天罡都是唐朝人，李淳风从小就聪明，对于天文、历法之类的更是精通。袁天罡更精通的是橡树，很多人都会找袁天罡看相并且都能看中。到了贞观十一年袁天罡感觉大祸将至，就跟李世民请辞回到家乡。第二年，一个人进宫了，这个人将是未来的皇后也是皇上，这个人是武媚娘。太白星开始经常在白天出现，于是李世民让袁天罡算下是什么原因。太史却算出了帝传三世，武代李兴的预言，这可不是一个好兆头，李世民立马召见了太史令李淳风，密谈之后李世民没有再做任何举动。贞观十七年，李淳风跟袁天罡两个人琢磨之下编写了《推背图》，这幅图是因为李淳风算着算着竟然算出了唐以后中国两千多年的命运，直到袁天罡推了一下他的背所以命名的。《推背图》就成为了中华语言的第一奇书，作者之一的袁天罡在贞观十九年4月去世，这一年他七十二岁。剩下的李淳风活到了咸亨元年（670年），根据唐代史书记载是忽然去世。最后一位就是一统江山刘伯温的刘基，刘基精通象纬之学。聪慧过人，对于书籍有过目不忘的本领。民间传说一向把刘伯温比作神人，说他先知先觉、料事如神，往前知道五百年，往后知道五百年。他在朱元璋建立明朝的时候发挥了很大的作用，但在洪武八年（1375年）正月下旬，刘基感染风寒之后朱元璋让胡惟庸给他带了御医。吃了药的刘基病情更重，跟朱元璋见了一面之后他就明白了是朱元璋放任的，交代后世之后就去世了，时年六十五岁。参考资料：《明史·刘基传》、《明史纪事本末》、《旧唐书》、《新唐书》、《史记》

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本人，在正泰太样能呆了两年。工资嘛还可以，本科生，3000多吧，关键是看去什么部门，若是在生产搞技术的话，挺累，现在太阳能行业发展前景不是很好，好多小一点的企业纷纷倒闭，同时正泰也在经受着考验！前途不是很大，人很多，关系很复杂！

品牌和质量。1、品牌好。浙江正泰品牌深受广大消费者的喜爱，口碑信誉有保证，中国香港正泰口碑不好。2、质量好。浙江正泰质量都是经过专业设计加工而成，每一件产品都有专门的质量合格证书，中国香港正泰质量管理体系不严格。

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提起“985”、“211”，不计其数的大学名字会环绕在我们脑海，但是这其中却很少出现兰州大学的名字。不是因为兰州大学“技不如人”，实属是过于低调，因此被众人低估。小编今天就要揭开兰州大学的面纱，带领大家一睹它的风采！兰州大学创建于1909年，一百年间它不断的扩建、整合、修改，最终建设成教育部直属全国重点大学，中央直管副部级建制的全国重点高校。百年的风雨冲刷，磨砺出底蕴深厚、卓越奋进的兰州大学。新中国成立后，它先后入选了“211”、“985”和“双一流”建设高校（A类）。甚至创造了化学“一门八院士”、地学“师生三代勇闯地球三极”、中科院“兰大军团”、隆基兰大合伙人等享誉国内外的“兰大现象”。仅仅介绍到这里，小编就发现兰州大学果然不可小觑，百年的校史沉淀了低调内敛、谦逊务实的兰大，因此在各个大学争先亮相之际，兰州大学却隐于世俗的浮躁中，执着于教学水平的提升和科研平台的扩展。就其学科领域而言，时至今日的兰州大学已经有8个国家重点学科，化学、大气科学、生态学、草学4个学科还入选了世界一流学科建设名单。13个学科进入ESI全球前1%，其中化学学科进入ESI全球前1‰。数据清晰地展现了兰州大学的强劲实力，也在不知不觉间诉说着兰大自强不息的品格。突出的学科实力需要优质的师资力量加以支撑，因此兰州大学的师资力量也不容小觑。兰州大学拥有两院院士19人，国家自然科学基金优秀青年科学基金获得者26人；省级拔尖领军人才和领军人才百余人，甘肃省“高等学校教学名师奖”获得者26人；甘肃省飞天学者36人。高水平的教师团队是兰州大学培养高精尖人才的有力后盾，因此兰州大学绝对配得上老牌名校这个殊荣。除去学科领域和师资力量，兰州大学的科研实力更是不同凡响。在国家战略和“一带一路”的倡议下，兰州大学成立了一大批创新研究团体，如国家自然科学基金委创新研究群体，教育部创新团队，以及一系列国家级研究机构，如国家重点实验室、国家地方联合工程实验室等。这些科研人才和机构包括但是不仅限于科学、人文、语言、教育、思想政治等方面，可以说是多方面、全方位的培养高素质、高水平的人才。卓尔不群的硬件实力奠定了兰州大学在国家高等教育格局中重要战略的地位，同时它在人才培养上硕果累累。据其就业质量报告显示，兰州大学2019年的就业率超过九成，其中升学率近36.6%。在往届的毕业生中涌现出大量的优秀学术人才、医学人才和财经人才，因此也可以说明兰州大学非凡的办学质量。综上所述，兰州大学绝对是非常不错的国家重点院校，只是它“斯为泰山而不骄”的低调性格掩藏了它的真实水平。

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神将飞蓬与魔尊重楼施斗，由于分心其佩剑被打落凡间。由于飞蓬离开致使神魔之井无人看守触犯天条，被贬为人。飞蓬第一世姜国太子龙阳，妹妹龙葵。姜国与扬国战斗不敌，龙阳要铸魔剑以破敌，但剑未成国先破，龙阳死，龙葵跳入铸剑炉，魔剑因龙葵室女之血天成，顷刻间将方元数百里化为乌有。龙葵的灵魂伏在魔剑之中，并在魔剑中分成两个。仙剑4开始。山顶野人云天河从小在山上长大，不动世事，一日因猎猪误入其父母墓室，遇见盗墓少女韩菱纱。由于天河的剑（望舒）误碰韩菱纱而使剑苏醒，并将墓室毁坏。天河怕死去的父亲责怪，并且被菱纱劝导下山寻找其父亲的过去。途中遇见曾经被天河父亲云天青久过的少女柳梦璃，并一起踏上寻仙之旅。终于成功加入琼华派，并和其“师叔”慕容紫英寻找3寒器解救了被冰封在琼华禁地的玄宵。玄宵要回望舒剑。原来有一妖界19年与琼华派相遇一次，琼华派要用玄宵佩剑羲和与望舒剑网住妖界夺取灵力。而梦璃竟然是妖界的少主，于是众人得知事情真相后帮助妖界对抗琼华，并得知望舒剑需要至阴女体为宿主，菱纱恰恰成为望舒宿主，未修练得宿主只会因望舒剑的使用不断灵力外泄直至死亡。于是众人为解救菱纱，成功阻止琼华飞升。但天河为救山下黎民也付出了双目的代价。期间，菱纱了解了自己族人世代短命的真相，梦璃回到妖界续呈妖界之主，紫英得到魔剑并想办法将其精华。天河得到神龙之息而长命，菱纱曾帮助一个叫景阳的人疑为后来仙剑3主角景天之祖先。百年之后，紫英终修炼成仙，菱纱离开人世，天河因神龙之息并为衰老，梦璃出现不知是与天河重聚还是要为天河送别……（仙剑4结局各人理解不同）后多年女娲族后人紫萱与第一世恋人相识但他已经结婚，两人相恋而不能相守。后紫萱找到那人的第二世林业平，与之幸福的度过一生并生下一女青儿，青儿一直被药物控制生长。第三世紫萱暗暗设局希望她的恋人（长卿）成仙并与她失守。紫萱在长卿看守锁妖塔时放走锁妖塔中一狼妖赤炎并将其分成两个，一个有记忆的人与一直爱着他的蜀山女弟子丝缎逃离蜀山后生下两个儿子周炫（星璇）和周煌（南宫煌）。另一个没有记忆但有强大妖力将长卿打伤，紫萱突然出现相救，并以苗族巫蛊之法为他疗伤，两人必须解衣相对引起了蜀山掌门的误会。仙剑3开始魔尊重楼为寻找当日对手飞蓬来到人间，在锁妖塔中寻找飞蓬佩剑未果却找到飞蓬第一世龙阳佩剑魔剑。将其带出锁妖塔，却也误将锁妖塔损坏。此时飞蓬以转世为蜀山脚下渝州永安当伙计景天，正巧这日唐家堡小姐雪见来到永安当寻找能和被她损坏的紫砂壶盖一样的壶盖遇见景天，并因为重楼破坏锁妖塔引发地震与景天发生误会（毒暗器刺中景天），而雪见又因听到一些机密被赶出唐门。景天得到重楼“送”来的魔剑并与雪见一起闯荡江湖。期间结识正要去蓬莱求助帮忙求情的紫萱和长卿，景天前世的妹妹龙葵也从魔剑中从出。几人为解决邪剑仙的阴谋，来到蜀山，并开始了寻找灵珠重新封印锁妖塔的旅程。后终于打败邪见仙，但紫萱也为封印锁妖塔牺牲。牺牲前吐出自己内丹助长卿成仙。而因此负责够取长卿灵魂的鬼差雷元戈无法完成任务滞留人间。期间龙葵为救景天再次铸剑（根据仙剑3外传问情篇剧情推测，此处铸剑者为龙葵而非雪见），但最后景天在新仙界在招数上战胜重楼，重楼复活龙葵。景天，雪见，龙葵回到新安当，景天成为新安当老板，从此过上了商人的生活。（从仙剑3外传问情篇推测应该是完美结局）期间景天为李家的两个儿子起名三思，三省。后，景天收李三思为徒弟，并传授其飞龙探云手。接前边被紫萱分开的妖物赤炎妖的一半找到人的一半想找回其记忆，但招到人的一半的反抗并误将人的一半杀死，丝缎殉情，燎日（即妖那部分的赤炎）将快要死周炫强行移灵到其父亲周赤炎的尸体上并带回里蜀山。而周煌折被带到蜀山收养改名南宫煌。仙剑3外传开始南宫煌于酒剑仙司徒钟为好友，一日为司徒钟下山买酒，解救了一只五毒兽（王蓬絮）并结识李三思得其传授飞龙探云手，并认识了朝廷逃婚郡主温慧。此时蜀山地脉异常，需要把五灵地脉一一打通回复正常而蜀山弟子又不能进入地脉，于是打通地脉的任务就交给了南宫煌等人身上。在南宫、温慧、王蓬絮等人打通地脉期间结识了南宫煌的哥哥星璇，鬼差雷元戈等人。最终众人成功打通地脉，并得知盘古创世之理，长卿引咎退隐。而南宫等人也卷入了里蜀山妖界的一场风波之中，最后众人终于打败里蜀山之主燎日，但星璇也付出了生命的代价（温慧，王蓬絮结局）。或关键时刻南宫煌五灵轮发挥威力打败燎日从此南宫温慧，星璇王蓬絮过上幸福生活（隐藏结局）期间众人结识景天，重楼，紫萱之女青儿等人，南宫煌得知自己身世。南宫也因自己半妖身份被赶出蜀山。殊明被神界封为镇狱明王。后紫萱之女青儿嫁个南诏巫王生下一女灵儿。青儿因拜月教叛乱被追杀并舍身封印了拜月教主召唤的水魔兽。灵儿被一人（姥姥）带离南诏来到中原隐居仙灵岛。后李三思夫妇苗疆暴毙，留下一子李逍遥。仙剑1开始逍遥因给一醉道士（酒剑仙）酒与其结识。并因其婶婶李大娘病而去仙灵岛求药，结识灵儿，并与灵儿结为夫妻，但因为苗人所给丹药忘却了这段记忆。而仙灵岛也被苗人屠戮。于是逍遥带着灵儿踏上千里寻母之路。途中他们结识了林家堡大小姐林月如。为化解误会李逍遥在比武招亲擂台上战胜林月如被招为女婿，而灵儿因为过早怀有人类孩子并且心情等问题现出原形逃离林家堡，李逍遥与林月如又踏上寻找灵儿之路，后终于找到灵儿，而灵儿为救李逍遥又跟黑苗石长老离开。中途又被剑圣误解打入锁妖塔。逍遥为救灵儿与月如闯入锁妖塔，杀死镇狱明王，并成功摧毁锁妖塔，但月如却死在锁妖塔底，逍遥记忆也在锁妖塔回复。为给灵儿求药李逍遥又踏上了征程，途中又遇到了白苗少女阿奴对其一往情深。后李逍遥因青儿的回魂仙梦回到10年前得知10年的恩怨。灵儿康复生下一女李忆如。月如也被36颗傀儡虫镇住保持不死不活的状态。后灵儿祈雨解除苗疆数年干旱，终于与拜月教主对抗战胜拜月教主，拜月以自身唤醒水魔兽，不得已灵儿舍刚刚想起他的丈夫，刚刚出世的女儿已自身封印了水魔兽。连失两位爱侣的逍遥心灰意冷，告别阿奴离开苗疆，却看到没有“死”的月如抱着李忆如在雪中等候……后逍遥成为蜀山仙剑派掌门。锁妖塔倒众多妖魔逃出，其中包括魔族掌旗使孔璘，孔一心复活被封印的魔尊。仙剑2开始李逍遥少年时的小玩伴王小虎长大，并学的魔刀刀法和穿云掌两项绝技。小虎儿时结识伙伴七七并帮助过前来求师的豫南松。长大后的小虎一日结识神秘少女苏媚，并在回乡后巧遇逍遥之女李忆如，在把李忆如送回仙灵岛后发现李逍遥没有来给李忆如过生日并陪忆如一起寻找李逍遥，途中再遇苏媚和沈欺霜（七七）。后发现李逍遥已经神秘失踪。途中得知苏媚身份竟是一狐狸和蛇的混血妖。后苏媚发现忆如的月如娘亲竟然就是自己苦苦寻找多年的杀亲仇人时，想到忆如无耐离开。忆如因关心李逍遥在圣姑帮助下使用回魂仙梦，看到李逍遥被孔璘用计困在画卷中，后王小虎等人在千叶禅师帮助下救出李逍遥，而孔璘的魔尊复活计划也开始了，李逍遥被迫破解天罡剑阵，小虎等人成功杀死了孔璘但魔尊也成功复活。但刚复活的魔尊被李逍遥全力杀死。魔力从回3魔器。后魔器落入千叶手中，千叶并想用魔器成为新的魔尊。小虎等人后得知了千叶阴谋但苏媚也因为为了破解结界而被打回原形。后众人终于打败千叶，林月如因魔器回魂珠复活与逍遥忆如一起回到仙灵岛，小虎和七七再次踏上寻找苏媚之路…。仙剑ol开始（不认同仙剑ol剧情的就无视这段吧）仙剑2期间天鬼皇为救李逍遥与被孔璘暗算受伤。鬼界势力大乱，后出现一叫鬼帝者想统治人间，而苗疆又有传言魔尊之子将在苗疆现世。李逍遥为他缥缈峰帮助平定鬼帝事件，自己暗中调查魔尊之子之事。此时李忆如已经成长为一个大姑娘，巧实李逍遥交给阿奴抚养的韩仲晰。而李逍遥再次神秘失踪，魔族与战败的拜月教，北武林的败类沈家堡又有着一些不为人知的秘密。后忆如经过一次次和韩仲晰的交往双方都彼此喜欢上了对方，但渐渐的韩仲晰发生了一些变化经常头痛，后来变得狂乱，原来韩仲析竟然就是魔尊之子。原来韩仲晰原名伐天，在很幼小时由于魔族被正派追杀其部下没有办法将其“灵”（忘了叫什么了就叫灵吧）送到小韩仲析体内，就是说伐天进入了韩仲析体内因此正派人士没有找到伐天，而韩仲晰恰被李逍遥所救，送个阿奴抚养。从此伐天的记忆一直在韩仲晰体内沉睡后来伐天记忆觉醒想控制韩仲晰的身体，但是招到韩仲晰顽强抵抗，后来伐天想到和韩仲晰记忆融合就是谁也不把对方压倒同时拥有两个人的记忆，后来成功。于是新韩仲晰同时拥有伐天和韩仲晰得记忆。对忆如依然情深地固，但对李逍遥一样恨之入骨，定要报杀父之仇。最后魔族进入锁妖塔准备夺某样东西，由忆如，月如，盖罗娇进入锁妖塔阻止，最后见到新韩仲晰。忆如希望韩仲晰回心转意，但韩仲晰虽然对忆如情深但也不忘了自己是伐天，希望得到其父亲魔尊在神魔之井的强大力量而天下无敌。此时伐天力量觉醒7层。最后李逍遥和酒剑仙赶到，由于魔族部队在最后被大家（蜀山，仙霞，忆如，月如，盖罗娇，缥缈峰）等人消灭（被消灭者包括魔族左使青凤），韩仲晰提出和李逍遥1对1单独战斗，虽然众人反对认为这样李逍遥过于危险，但李逍遥同意了韩仲晰的要求，并与韩仲晰在锁妖塔1对1单挑，两人中只有一人能活着离开，如果李逍遥死了，伐天离开锁妖塔后一样会被守在外边的正派人士杀死只是完成了他报仇的心愿。众人离开锁妖塔在外边焦急等待。过了很久很久，终于走出了一个人，那个人是李逍遥。忆如扑到李逍遥怀中痛哭不止……全仙剑终

我是位男医药代表，也干了一段时间，对于你的问题，我可以肯定回答你，女孩做医药代表非常好。医药代表主要面对的就是医院采购医药的人员，药店老板，诊所医生等，可以想下，这些人基本是男的，不是吗？我刚入行的时候，有个女同事，她干了有6年了，他和我聊的时候就说，医药代表就是男的和女的聊，女的和男的聊，意思也就很明白了，我们所面对的人基本上是男多女少，所以女生有很大的优势，这一点也不可笑，事实就是如此，前期谁都没经验，但是要是干了有一段时间后，女生的能力就锻炼出来了，加上是女生，优势就很明显了。要是不信，让我们假想下，两个都干了3年的医药代表，一男一女，都去找一家医院的院长，当然一般院长男的多，是位男院长接待，男的先找，女的后找，你想下这个院长对待两个人的态度会怎样。接下来就看个人如何把握了。其实不一定女孩一定比男生强，主要看能力，还有毅力。干了一段时间就无师自通了。

个人觉得女医药代表，勤奋工作，积极提升自己的个人拜访技巧，比如“门诊拜访技巧”，“如何开发新客户，新科室”，“病房拜访”，“邀约”，“夜访注意事项”等等，加上坚持不懈的努力工作三个月，取得中上等的业绩还是不难的，最起码我在第三个月，在10名同期上岗的同事里排名第二，领导还是比较满意的。提升这方面的技巧，可以多听多思考公司的培训课，多跟同事交流，另外闲暇或者等客户的时候可以着重在听听医药代表实录，戴着耳机，因为仅仅100集实战课就有近1000分钟都是音频，还有热点问答解答课，可以在师杏堂收听全部章节，或经常听说的app（那里不全）都有，感觉适合自己实际操作再选择！

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仙剑云之凡李忆如女儿小蛮的父母亲是谁揭秘 关于仙剑历史上最大的谜团是什么，我想大家应该都会说，小蛮她爹到底是谁。小蛮娘是忆如，这是肯定的，但是小蛮父亲到底是谁，一直也没个定论。电视剧版仙剑五《云之凡》里会不会揭晓这个谜底呢? 云之凡小蛮角色介绍： 小蛮，单机游戏《仙剑奇侠传五》的第二女主角。小蛮是女娲后人，拥有强大的灵力(女娲族拥有至高灵力潜能，在灵力爆发时要高于普通天神级别)。 女娲族的直系后裔，李忆如（这个孩子，等于是月如姐姐牺牲性命换来的，我希望月如姐姐在天之灵能继续庇佑这孩子平安长大。"--赵灵儿）之女，由“巫月神教”掌门海棠夫人(阿奴)抚养长大。虽然娇蛮，但心地善良。为了寻回土灵珠和找到情蛊的制作方法而踏上中原;经历种种事件逐渐成长的小蛮，最终担负起女娲后人的责任，以水灵珠为媒运用补天之术帮助魔界祈水，修复夜叉族乃至整个魔界的大地水脉。 李忆如去哪了为什么没有出现死了吗? 女娲的后代如果母亲没死的话，女儿就会一直保持婴儿状态。其他女娲后人都可以正常长大，但是长到一定程度会把母亲灵力吸光，她的母亲就会死。 仙剑云之凡李忆如女儿小蛮的父母亲是谁揭秘 其实关于忆如的故事，大部分是在09年的仙剑ol里面。不过姚仙当初说过，仙剑ol的故事大家可以当同人看，和电视剧一样处理就好了。 小蛮的父亲是谁? 那么小蛮她爹到底是谁?李忆如嫁给了何人，这就成了仙剑史上最大的谜团。先说下小蛮她爹不会是韩仲晰的原因。先推测李忆如年龄。剑OL剧情，李忆如和韩仲晰相遇，李忆如16岁。 仙剑五，李逍遥至少58岁，仙剑五前结局时，李逍遥38岁。仙剑一剧情开始，逍遥19岁，结局时，差不多过了一年，赵灵儿怀胎十月，差不多就是一年，逍遥20岁。那么，逍遥大忆如20岁，因此，五前结局，忆如18岁。 五前结局，雨柔出生，雨柔大小蛮四岁，雨柔出生四年后，小蛮出生，此时忆如22岁。忆如不可能怀胎6年……除非出现类似紫萱那样封印女儿的特殊情况。然后，如果小蛮的父亲是韩仲晰，由于韩仲晰是魔族，所以小蛮应该 也有魔族血统。 仙剑云之凡李忆如女儿小蛮的父母亲是谁揭秘 但是根据仙剑五剧情，主角一行人来到神魔之井大门前面，守门的两位魔将只允许姜云凡和龙幽通过，却不允许小蛮和雨柔通过。可见，小蛮无魔族血统，其父不可能是魔族。 结论 ：小蛮之父，忆如的丈夫不是韩仲晰。 最后，虽然可以得出结论小蛮的父亲不是韩仲晰，但是也不知道小蛮的父亲到底时谁?唯一能得出结论是忆如22岁才生的小蛮~ 李忆如，赵灵儿与李逍遥之女。出生后不久，母亲赵灵儿便与水魔兽同归于尽，因此忆如对于母亲一直没有什么印象。在圣姑家的那段日子，由傀儡虫支撑身体的林月如曾照顾过忆如一段日子，因此忆如认林月如为干娘、其父林天南为外公。 傀儡虫很快失效，李逍遥便带着忆如回到余杭县，交由婶婶李大娘抚养。为使忆如不再受到伤害、以致重陷女娲族的宿命之中，李逍遥和李大娘将客栈转让给同村的丁家，举家迁往灵儿的故居——仙灵岛，并在岛上设下重重机关，防止外人进入。 仙剑云之凡李忆如女儿小蛮的父母亲是谁揭秘 随后李逍遥上了蜀山、继任了蜀山仙剑派掌门之位，因事务繁忙，忆如久久才能见到父亲一面。但还有李大娘的悉心照料，以及父母故友的照顾，忆如健康、快乐的成长，爽朗、单纯、心胸宽广、调皮可爱、好奇心强，既好恶作剧，又好打抱不平，往往令亲友哭笑不得。 八岁那年，魔族掌旗使孔璘为让魔尊复活，命手下幻魅画妖假扮灵儿，将李逍遥诱入幻画卷轴。忆如在仙灵岛苦等父亲不得，便随着李逍遥昔日之同村玩伴王小虎踏上往蜀山寻父之旅，由此开始涉足江湖。 在镇江“南林北沈”比武大会上结识王小虎有青梅竹马之情的仙霞派弟子沈欺霜，因误闯月凉山与身负父母血仇的苏媚结下了深厚友情，又在碧湖村遇上王小虎少时故友喻南松，一路上还收服了锦八爷、扬枭、蕴儿等御灵。然而忆如和苏媚均不知，八年前错杀苏媚父母的那对男女，正是忆如的父亲李逍遥和干娘林月如。 仙剑云之凡李忆如女儿小蛮的父母亲是谁揭秘 忆如和王小虎寻至荆州武林 大会，仍不见李逍遥踪影，会上闻魔器“九转回魂珠”被盗，追踪至邪雾森林，终于发现苏媚狐妖的身份。二人体谅苏媚的苦衷，均不介怀苏媚过往的欺骗，王小虎甚至为维护苏媚力战群雄，幸得开封摩诃禅寺方丈千叶禅师解围，三人结伴继续往蜀山前行。谁知行至半途，在沱江一带遇上带林月如来此寻药的圣姑，得知逍遥已失踪。 为找寻逍遥的踪迹，圣姑将灵儿的过往告诉忆如，着她前往玲珑福地取回逍遥藏于此中的天蛇杖，以施展女娲族的回魂仙梦法术。望着仍带余温的天蛇杖，忆如遥思亡母，心伤不已。回到圣姑居所，忆如带苏媚看望仍昏迷着的林月如，苏媚方始惊觉仇人就在眼前，但念及与忆如的友情，终不忍对月如下手，悄悄黯然离去。 借着回魂仙梦，忆如终于看到逍遥被画妖诱骗入幻画卷轴的一幕，二人决定前往鬼都请天鬼皇帮忙寻出孔璘。途经彩璃集，遇上仙霞五奇正布阵伏击孔璘，不料双方混战时，忆如跌入阵中，欺霜为救忆如，致使阵法出现破绽，欺霜的四位师姐妹均遭孔璘毒手。安葬好师姐妹，欺霜亦随忆如和小虎上路，欲找孔璘报仇。 仙剑云之凡李忆如女儿小蛮的父母亲是谁揭秘 在天鬼皇的协助下，三人终于得到画轴，并得千叶禅师相助，进入画轴欲救出陷入幻境不可自拔的李逍遥。岂料假扮灵儿的画妖见久久不能劝服逍遥启动七星剑阵，便趁机掳走忆如，自己假扮忆如继续亲近逍遥。众人顺利救出逍遥，却不知身边的“忆如”是假的，直至在五华山遇见孔璘方知真相。孔璘挟持忆如进入剑阵，剑阵被触动，逍遥被迫与剑阵搏斗。 孔璘以为得逞，放下忆如，自行带着三魔器来到魔尊面前，忆如、小虎、欺霜、苏媚四人虽合力杀死孔璘，但魔尊已吸收了魔器的力量得以复苏，幸而逍遥在紧急关头率剑阵彻底将其消灭，但逍遥也因此耗尽功力。苏媚欲趁机报父母血仇，逍遥得知原委，愧疚不已，坦然受死，然忆如与小虎极力阻止，苏媚不忍伤害友情和爱情，又一次放弃了报仇的机会，独自离去。忆如为治好月如的伤，向千叶借得“九转回魂珠”，欺霜返回仙霞派，而忆如和小虎则陪逍遥往圣姑居所疗 伤。 仙剑云之凡李忆如女儿小蛮的父母亲是谁揭秘 不料一波甫平，一波又起。圣姑发现“九转回魂珠”含有剧毒，众人误会是苏媚所为，小虎因此与苏媚决裂。此时天下间妖魔顿起，四处作乱，而逍遥伤势未愈，托忆如、小虎、欺霜上峨眉山请仙霞派掌门清柔真人出面主持大局。忆如和小虎刚至峨眉山便发现仙霞派遇袭，清柔真人言有一强大妖魔将在开封出现，命忆如、小虎、欺霜三人前去查探。临行前，清柔真人为忆如激发了体内潜藏的巨大灵力。 三人在开封郊外见到数之不尽的妖魔，只得用隐身术潜入摩诃禅寺，正巧撞见苏媚为“九转回魂珠”被下毒一事找千叶讨公道，众人方知千叶便是清柔真人所言的妖魔。争执间，千叶对失去利用价值的弟子喻南松下毒手，并将众人封入禁咒空间。 仙剑云之凡李忆如女儿小蛮的父母亲是谁揭秘 苏媚为救小虎和忆如，不惜牺牲自己破解禁咒空间的机关，被打回原型。愤怒的忆如、小虎和欺霜直闯禅寺密道，与千叶决一生死。无奈千叶的力量太过强大，三人连手亦不敌，危急之际，空中传来灵儿的声音和一股力量，破解了千叶的金身，并让三人的功力增强。千叶元气大伤，三人趁势消灭了这一元凶，天下又恢复了和平。 之后，林月如在“九转回魂珠”力量的帮助下恢复为常人，而忆如也终于得偿多年的心愿，带着逍遥和月如回到灵儿自幼生长、与逍遥结缘的仙灵岛，一家团聚。 长大后的李忆如为寻找因调查魔族余孽行踪不明的李逍遥偷偷离家。李忆如在杭州客栈遇到正在寻找治疗苗疆瘟疫的净魂草的魔尊之子韩仲晰，于是告知韩仲晰静魂草是在乱葬岗中，于是二人便一同前往寻找。在相处过程中，与韩仲晰、司徒御雪结下一段不解之缘。

淘宝商城上的奢侈品都是真的么？ 商城的东西我也比较相信，因为同事经常在商城买东西，不过都是熟知的品牌才买，每次买回来的东西都跟店里的一样，不过说实在的，在商城买也没比在店里买便宜多少。如果买太贵重的东西，建议最好到柜台买。 不是，也有可能买到假货，我一般都是在江诚易网购上面买，到现在还没有出现过假货。 淘宝商城走秀网旗舰店的奢侈品是真的吗？ 假的离谱，什么客服咨询投诉就永远能那几个人，别想有好的服务，建议三思购买，买了就等着后悔。没人能约束他，比较霸道。 淘宝商城卖奢侈品有市场吗？ 一般来说卖真的奢侈品是要看地段的，但是在网上卖一般没有前景，因为如果真的要买奢侈品的人绝对不会因为便宜个几千块钱，而提心吊胆地买一个自己不能确定的奢侈品，因为一般金额大的东西大部分人会选择实体店 淘宝商城上的鞋子是真的吗 淘宝商城的鞋子应该都是真的，鞋子上的数字码是表示鞋子款式，颜色等信息。 淘宝商城上的东西是真的吗？ 真假都有。一般说来，国内产的东西基本是真的，进口商品您就要多比较了。 是正品或是仿货，卖家正常都会自己说明。您自己也要多看看店主的信用评价里其他买家的评价。 现在淘宝商城上的nike或adi是真的吗。 楼上说的太绝对了 也太简单了 商城有原价卖假货的 而且不给鞋标 所以 还是发链接到这里 鉴别一下 淘宝商城上卖的薇姿是真的么? 商城应该还行吧~~~网购还是谨慎点好~~~ 淘宝商城的品牌都是真的吗 淘宝商城也是个人经营的 淘宝商城上的商品都是正品吗？ 嗯,商城里的东西不错就是贵点,信誉度是很高的!!! 可以购买~~~

　　正泰按钮开关怎么样?正泰按钮开关的分类类型有哪些呢?今天为大家推荐的就是这几个方面的信息，由此入手可以得知正泰集团是技术规模成熟的厂家机构，它们具有高新技术保障，而且产品的装饰性能和使用的价值也更胜一筹，旗下的正泰开关分类丰富，具体可以根据用途进行划分，根据结构或者是接触的类型和开关数量进行分类，对应的效果和能够达到的优势特点是完全不一样的，我们应该具体情况具体了解，也可以综合下文进行学习，相信这样子就可以结合实际所需购置一款合适合理的正泰按钮开关了。　　　　一、正泰按钮开关介绍　　品牌介绍　　浙江正泰电器股份有限公司成立于1997年8月，是正泰集团核心控股公司，也是中国低压电器行业产销量最大企业。公司专业从事配电电器、控制电器、终端电器、电源电器和电力电子等100多个系列、10000多种规格的低压电器产品的研发、生产和销售。公司荣获全国质量管理奖、首届浙江省政府质量奖、首届温州市市长质量奖，并于2010年1月21日在上海证券交易所成功上市，成为中国第一家以低压电器为主业的A股上市公司　　　　特点介绍　　1、高新技术：正泰开关插座三重防雷技术、专利新型儿童保护门设计、专利鞍型接点端子、抗电磁干扰设计等领先科技和设计有效地保护电器，保障安全。专利悬摆技术、特有的磷青铜镀镍工艺、精选德国拜耳材质以及严谨的生产制造与品质管理，造就开关插座可靠耐用的品质，其中开关使用寿命达到8万次，是国家标准的两倍。　　　　2、装饰性能：正泰装饰开关行业首次创新，采用领先IMR科技，打造出正泰装饰开关，满足不同家装风格。正泰家庭组合插座颠覆传统单个开关和插座拼装的做法，创新性采用集成化设计，将开关和插座等完美整合，外观简洁漂亮，美化墙面，而且使用方便，接线便捷，彻底解决单个开关和插座拼装带来的不美观、不安全的问题。　　二、正泰开关分类类型介绍　　按照用途分类：波动开关，波段开关，录放开关，电源开关，预选开关，限位开关，控制开关，转换开关，隔离开关，行程开关，墙壁开关，智能防火开关等。　　按照结构分类：微动开关，船型开关，钮子开关，拨动开关，按钮开关，按键开关，还有时尚潮流的薄膜开关、点开关。　　按照接触类型分类：开关按接触类型可分为a型触点、b型触点和c型触点三种。接触类型是指，“操作(按下)开关后，触点闭合”这种操作状况和触点状态的关系。需要根据用途选择合适接触类型的开关。　　按照开关数分类：单控开关、双控开关、多控开关、调光开关、调速开关、防溅盒、门铃开关、感应开关、触摸开关、遥控开关、智能开关、插卡取电开关、浴霸专用开关。　　　　今天为大家推荐的是关于正泰按钮开关的介绍，包括特点和品牌两个方面的信息，由此入手可以得知正泰电器是知名的开关电器品牌，厂家技术规模成熟，售后服务有所保障，旗下的按钮开关不仅仅因为高新技术的原因，所以具有安全和使用寿命以及可靠耐用品质方面的优良特色，而且它们装饰性能也十分不错，还可以根据用途结构、接触的类型、开关的数量进行详细细致的分类，具体不妨参考上文，结合实际购置一款合适的产品吧。

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没有小蛮不幸福小蛮娘是忆如，这是肯定的，但是小蛮父亲倒地是谁，一直也没个定论。其实关于忆如的故事，大部分是在09年的仙剑ol里面。不过姚仙当初说过，仙剑ol的故事大家可以当同人看，和电视剧一样处理就好了。那么小蛮她爹倒地是谁，李忆如嫁给了何人，这就成了仙剑史上最大的谜团。先说下小蛮她爹不会是韩仲晰的原因。先推测李忆如年龄。剑OL剧情，李忆如和韩仲晰相遇，李忆如16岁。仙剑五，李逍遥至少58岁，仙剑五前结局时，李逍遥38岁。仙剑一剧情开始，逍遥19岁，结局时，差不多过了一年，赵灵儿怀胎十月，差不多就是一年，逍遥20岁。那么，逍遥大忆如20岁，因此，五前结局，忆如18岁。五前结局，雨柔出生，雨柔大小蛮四岁，雨柔出生四年后，小蛮出生，此时忆如22岁。忆如不可能怀胎6年除非出现类似紫萱那样封印女儿的特殊情况。然后，如果小蛮的父亲是韩仲晰，由于韩仲晰是魔族，所以小蛮应该也有魔族血统。但是根据仙剑五剧情，主角一行人来到神魔之井大门前面，守门的两位魔将只允许姜云凡和龙幽通过，却不允许小蛮和雨柔通过。可见，小蛮无魔族血统，其父不可能是魔族。结论：小蛮之父，忆如的丈夫不是韩仲晰。最后，虽然可以得出结论小蛮的父亲不是韩仲晰，但是也不知道小蛮的父亲到底时谁？唯一能得出结论是忆如22岁才生的小蛮~那么小蛮的父亲到底是谁呢，求姚仙给解释啊。

正泰的发展史，既是一家民营企业的创业史，更是一部中国自主品牌的成长史。二十余年励精图治，正泰一步步向国际化迈进。 起步与积累阶段（1984年～1990年） 1984年7月创立“求精开关厂”（正泰集团与德力西集团的前身）。从5万元起家，本着“精益求精”的精神，依靠质量和信誉求得生存，完成原始资本积累，为企业的发展奠定了基础。 定向发展阶段（1991年～1993年） 1991年建立中美合资正泰电器有限公司，引进国外先进技术和设备，充分利用合资企业的优惠政策，发展壮大企业实力，并确立了电器专业化发展方向。标志性的事件是1993年9月正泰首栋办公大楼落成，提出“重塑温州电器新形象”的口号。 规模扩张与集团化经营阶段（1994年～1996年） 1994年2月，成立国内低压电器行业第一家企业集团。以资本为纽带，以市场为导向，以产品为龙头，以品牌为中心，横向联合，走上规模经济之路，使企业迅速发展壮大。 集团化向控股（集团）公司过渡阶段（1997年～2002年） 1997年7月21日，集团内首家规范的股份有限公司“浙江正泰电器股份有限公司”经浙江省人民政府批准成立。以此为契机，对集团所属企业进行股份制改造，组建股份有限公司和有限责任公司，按照现代企业制度的要求发展企业，并向国际化企业迈进。 提升与跨越阶段（2003年至今） 确立“打造国际性电气制造基地”目标，逐步形成柳市为低压、仪表和建筑电器制造基地，上海为高压输配电设备制造基地、嘉兴为输配电配套设备基地，杭州为工业自动化和太阳能生产基地的“长三角布局”。自主创新成为企业发展主旋律，先后获得各种国内外专利200多项，领衔和参与制订各种行业标准30多项。同时，加快企业上市工作，推进资本经营与产品、产业经营同步发展，互为促进。

win10关闭自动更新的方法：工具：win10系统1、对于Windows10专业版及其以上版本的操作系统，可以通过组策略编辑器来控制Windows10系统的更新功能，那么先按下Windows徽标键+R键，打开运行窗口命令，在窗口命令中输入“gpedit.msc”。2、打开组策略编辑器以后，先依次点击计算机配置-管理模板-Windows组件菜单选项。3、接下来，在Windows组件菜单窗口中，点击选择“Windows更新”子菜单项，然后在右侧的配置选项中找到“配置自动更新”。4、双击右侧的“配置自动更新”选项，在打开的页面中默认是未配置选项，如果想关闭自动更新功能，要在左侧选项中选择“已禁用”，然后点击确定按钮，这样便可以顺利关闭Windows10系统的自动更新功能。注：系统更新是提升性能的，关闭了自动更新，自己要记得更新系统。

还不错的哦。

朋友，这里你确实弄错了仙剑4中韩菱纱的大伯是叫 韩北旷以下是仙剑4中相关剧情的对话韩菱纱：你……把头抬起来，让我看一看好吗？慕容紫英：菱纱？划船人：……韩菱纱：你、你不敢吗？！你到底是谁？划船人：…………韩菱纱：……划船人：……唉，丫头，你还是这么精灵，真拿你没办法……韩菱纱：伯父，真的是你？！怎么可能？！慕容紫英：……！韩菱纱：伯父，为什么你会在这里？为什么你要装作不认识我？要不是、要不是我认出你的轮廓……韩北旷：丫头，你就当作没看见伯父好不好？韩菱纱：不好！我明明看见了！你都不知道，我有多想你，在转轮镜台的时候，我以为你已经转世去了，所以才不出现……韩北旷：傻丫头，我要是转世，今天不就救不了你了？韩菱纱：……伯父，你说什么救不了我？为什么你会在这里划船？韩北旷：……不止是我……几乎所有韩家人，死后都会在鬼界做苦役……我便是负责摆渡这青竹船，必要时往来人鬼两界……韩菱纱：苦役？那是什么？他们怎么能让你做这种事呢？！韩北旷：…………韩菱纱：伯父，你说嘛！告诉我好不好？韩北旷：丫头，我刚才不想与你相认，就是在犹豫要不要告诉你一些事，对你来讲，现在就知道这些，未免过于沉重了……韩菱纱：伯父，到底是怎么回事？！我要知道！韩北旷：唉……韩氏世代盗墓，总以为人已入土，墓中器皿当可拿来救助活人，但如今你来了鬼界，应该知晓，鬼也如活人一般，有自己的感情、自己的种种思念……韩北旷：我们一族惊扰死者，不仅生死薄上阳寿短暂，很多都只活到二三十岁，即便死后，也一样要做苦役来赎罪，待到罪孽偿清，才可再入轮回了……　韩菱纱：竟然、竟然这样……韩菱纱：也就是说……我一直在找的长生之法，根本没有用？不管我怎么努力，也不能让族人活得更长久一些……韩北旷：丫头，我知道你很努力了，但是有些东西，冥冥之中自有安排，不是你一个人能够争得过……韩菱纱：那，爹和娘呢？他们在哪？韩北旷：……自然也在鬼界的其他地方赎罪。韩菱纱：……韩北旷：丫头，你老实告诉我，你是不是一直很气自己爹娘？觉得他们待你不好？韩菱纱：我……韩北旷：唉，他们啊，知道自己多半命不长久，所以才故意对你冷淡，就是怕你依赖惯了，万一双亲离世，会太伤心，这世上又哪有爹娘不喜欢自己的孩子呢？韩菱纱：伯父，你说的、都是真的吗？！韩北旷：当然是真的！记得你还小的时候，你爹每天晚上非要在床边看你睡着了，他才肯睡，他就是有股傻劲，总觉得不多看几眼，多唤你几声名字，以后就没机会了……韩菱纱：……真是个傻爹爹，还有娘，也好笨！韩菱纱：人活一辈子，本来就够短暂了，他们还要在意这在意那，害我伤心了好多年……韩北旷：……丫头……你真的长大了，看事情有自己的想法了……韩北旷：……似乎、也结识了很好的朋友……旁边这两位都是吧？云天河：对啊，我和菱纱是很要好的朋友，呵呵。慕容紫英：晚辈慕容紫英，刚才多有失礼了。韩北旷：慕容？难道是大燕国的遗族？慕容紫英：……！前辈如何得知？韩北旷：唉，我也是脑中灵光一闪而过，想到很久以前有一对夫妇，前去轮回井投胎……眉目间和你很有几分神似……而且慕容这个姓可不多见，曾是燕国的大家之姓……韩北旷：你爹……是不是叫慕容承？慕容紫英：……正是家父。韩北旷：那就没错了。慕容紫英：…………原来……原来爹和娘都已经过世……这么久了……韩北旷：你也不用太过伤心，你爹和你娘神色平和，生前应该是过得很安泰。韩北旷：只是他们似乎有些遗憾，没能在死之前再见自己的小儿子一面，说是因为那孩子年幼时体弱，家里不但请来道士替他批命取名，更是将他送去了仙山上修行，但愿他能活得长命百岁。慕容紫英：……爹、娘…………韩菱纱：（紫英……）韩北旷：鬼界有种说法，叫作生前种种隔世抛，与其一直挂念，不如在心里希望过世的亲人朋友，投胎以后能够一生顺遂……慕容紫英：……多谢前辈指点，晚辈……晚辈都明白……韩菱纱：（哪有那么容易看透，紫英你又在逞强了……不然为什么要露出那种悲伤的神情……）韩北旷：唉，是我该谢谢你们，一直照顾我家丫头。韩菱纱：伯父，你说什么呢……旁边这个倒也罢了，后面的那个啊，可是我一直在照顾他呀！韩北旷：哈哈，不管怎样，伯父今天能见到你，觉得很高兴……韩菱纱：我也是……伯父，你先别走，再多和我说些话好不好？韩北旷：……时候差不多，你们该回阳间了。韩菱纱：伯父，我会告诉族人，让他们别再去惊扰死者了……不过有机会的话，我还是要去找长生之法。韩北旷：丫头，别总那样辛苦，多为自己想想吧。韩北旷：你出落得这么漂亮，记得找个好相公嫁了！我看你身后两个都不错啊！哈哈！韩菱纱：伯父！++++++++++++++++++++++++++++++++++++至于韩仲晰，是仙剑OL中的角色按照仙剑OL的说明，是仙剑2中在五华山被李逍遥杀死的魔尊的儿子以下是其相关信息姓名：韩仲晰（灵为伐天）种族：人族（伐天与真正的韩仲晰融合后为魔族）年龄：未知父亲：韩医仙（真正韩仲晰的父亲）、仙二魔尊（非重楼，伐天的父亲）姐姐：韩梦慈（真正韩仲晰的姐姐）姐妹：月柔霞（伐天的姐妹，仙二魔尊之女，她与伐天的年龄大小未知。）姐夫（也可能为妹夫）：姜清（月柔霞的丈夫）外甥女：姜婉儿（清柔师太，仙霞派掌门，月柔霞与姜清之女）养母：阿奴（韩仲晰称其为姑姑，仙五海棠夫人）武器：魔刀喜欢：李忆如两个根本就不是一个人至于小蛮，也只能确认是李忆如的女儿姑且不谈仙剑OL不被姚仙认可的事情，单说其中，也只说了李忆如与韩仲晰的一段感情，并没有结果祝你玩得愉快!!!

　　断路器其实就是一种开关装置，这种开关装置能够在规定的时间内承载和开断异常回路条件下的电流，是一种配电环节中十分必要的设备，断路器的分类也是十分广泛的，按断路器的使用范围可以分为高压断路器与低压断路器，我们一般将3kV以上断路器的称为高压电器，断路器的品牌也是十分繁多的，那么今天我们就挑选了一些品牌来为大家做一个具体的介绍。　　　　施耐德　　全球能效管理专家施耐德电气为100多个国家的能源以及基础设施、工业、数据中心以及网络、楼宇与住宅市场提供整体解决方案，其中在能源和基础设施、工业过程控制、楼宇自动化与数据中心与网络等市场处于世界领先的地位，在住宅应用领域也拥有强大市场能力。致力于为客户提供安全、可靠、高效能源，施耐德电气2010年销售额为196亿欧元，拥有110，000多名员工。　　　　ABB　　ABB集团位列全球500强企业之一，集团总部在瑞士苏黎世。ABB由两个历史100多年国际性企业瑞典阿西亚公司(ASEA)与瑞士布朗勃法瑞公司(BBCBrownBoveri)在1988年合并而形成的。两公司分别成立于1883年与1891年。ABB是电力与自动化技术领域的领导厂商。ABB技术可帮助电力、公共事业与工业客户提高业绩，同时降低对环境不良影响。ABB集团业务遍布了全球100多个国家，拥有13万名的员工，2010年销售额高达了320亿美元。　　　　正泰　　浙江正泰电器股份有限公司创立于1997年8月，是正泰集团核心的控股公司，也是中国低压电器行业产销量最大的企业。公司专业从事配电电器、控制电器、终端电器、电源电器与电力电子等100多个系列、10000多种规格低压电器产品的研发、生产和销售。公司荣获全国质量管理奖、首届浙江省政府质量奖、首届温州市市长质量奖，并于2010年1月21日在上海证券交易所成功的上市，成为中国第一家以低压电器为主业A股上市公司。　　　　在上文中，我们为大家介绍了有关断路器的品牌的一些信息，我们在这篇文章中一共为大家介绍了三个品牌的信息，这三个品牌分别是施耐德、ABB以及正泰，其实这三个品牌相信大家在生活中或多或少也有听说过，这三个品牌算得上是经验比较丰富且质量也值得大家信任的大品牌，如果大家有购买断路器的想法，不妨参考这三个品牌下面的产品，具体细节可以咨询商家。土巴兔在线免费为大家提供“各家装修报价、1-4家本地装修公司、3套装修设计方案”，还有装修避坑攻略！点击此链接：【https://www.to8to.com/yezhu/zxbj-cszy.php?to8to_from=seo_zhidao_m_jiare&wb】，就能免费领取哦~