芝华塔尼欧的少年
-
质粒DNA的超速离心分离
中科院上海生物化学研究所，上海 200031 余兴明
一、简述
近代质粒DNA分离纯化以从大肠杆菌中分离为代表，鉴于大局杆菌（E.coli）在分子生物学研究中的重要地位，从E.coli中分离纯化质控DNA〈Piasmid DNA〉成为近年来超离心技术中一个重要课题。而质粒DNA的快速分离纯化又对超离心设备（超速离心机、转头和附属设备）提出了更高要求。
E.coli是典型的原核细胞生物，由于原核细胞缺乏其核细胞所具有的那种由单位膜组成的可把多种功能组分分隔为专一化的和局部独立区域的内膜系统，因而没有其核细胞所包含的细胞器（核、内质网、高尔基体、线拉体、溶酶体等等）。电镜显微照片显示E.coli有两个可以区别的内部区域一一细胞质和核质，在它们外面围着一层较薄的细胞质膜和很厚的细胞壁，在细胞壁外部附着一些一端游离的鞭毛。质粒DNA位于核区，以细丝状存在，这种细丝状物在多种情况下是极长的环状DNA的一些片断所折叠起来的聚密体。
针对E.coli的显微结构待点，在进行超离心分离纯化质粒DNA之前的预处理顺序是：
E.coli→用溶菌酶去细胞壁→用表面活性剂如SDS、Trit X-100等EE细胞膜→用乙酸锅使DNA、RNA及蛋白质大部分沉淀(90%以上)。
沉淀物可以在加入TE缓冲液(10m-MTris-HCL lmMEDTA,pH8.0)后分子筛上住去蛋白,去RNA;也可以用超速离心法去蛋白居,去RNA，去级状DNA或DNA断片。本文将综述后一种方法在近年来的新进展.
二、质粒DNA超速离心分离的最新进展
1、 传统的分离方法：数年前，由于受设备条件限制，质粒DNA的分离一般用CsCl平衡等密度离心法，自形成梯度。以10~12ml单管容量为例，用甩平转头分离，36.000rpm×60小时，用角式转头分离45,OOOrpm×36小时，前者包括加减速在内共用去1.3亿转驱动部寿命，后者也要用去1亿转驱动部寿命，这对当时超速离心机总寿命为100~200亿转来看，无疑每次实验费用过高，加上CsCl用量多、价格贵等因素，使这类分离纯化工作成为非常昂贵的实验。
2、新进展：
（1）超速垂直管转头的离心分离（钦合金或碳纤维制造的）：从1975年垂直管转头向世后，近年来各主要离心机生产商开发的垂直管转头，单管容量0.2ml到4Oml，最高转速从50,000rpm到120,000rpm,RCFmax可达
700,OOOXg，90年代开发的新机型和转头己能够使质粒DNA垂直管离心分离实验做起来得心应手。
使用垂直管转头分离纯化质粒DNA的待点是：.
·由于沉降距离最短，离心时间最短，高效、低耗：
·离心管纵向剖面积远大子横向截面积，离心沉降时纯祥品区带的容量较大，在没有沉淀附着或沉淀附着很紧很密的条件下分离纯度高，样品加载量也较大；流体静压力,不会因静压过高而使生物体颗粒受到损伤.离心管内样品颗粒受到的流体静压为：
ω：角速度
r：样品颗粒所在位置与旋转中心距离（以厘米计）
r1:转头最小离心半径即rmin（厘米），在使用gmax离心时是液面和旋转中心的距离。
Pa:起始密度（对预形成梯度时为最小密度,对自形成梯度离心,为离心结束时最小密度）。
a：梯皮斜率
在超速离心中，P值相当大，一般认为P≤150Okg/cm2,才不致损伤生物体颗粒，垂直管转头（r-r1）很小,相对说P也相当小（102数量级），而对甩平转头，在离心前往往要进行P值校核，过大时，应降低转速。在用垂直管进行质粒DNA分离纯化时，RNA沉淀附在离心管壁部，在减速、梯度方向转换时,质粒DNA区带从沉淀区"擦"过，使DNA中混入少量RNA而影响纯度。
在极高转速离心时（如大于80,OOOrpm），由于RNA附着壁部较紧,这种影响较小。
(2)近垂直管转头离心分离：为了消除垂直管转头用于质粒DNA离心在壁部形成的RNA沉淀对已形成的DNA区带的污染，同时也为了改进一般斜角式转头（倾角25·~35·）由于沉降距离较长，因而分离时间也较长的缺点，近几年开发了多种近垂直管转头（即Near VerticalTube Rot时,简称NVT转头或Neo Angle Rotor,小假角转头,简称NT).它们的离心管纵剖面中心轴线与离心机驱动轴线之间夹角在7.5·~10·之间,转速从65,000rpm到120,OOOrpm，RCFmax可达646,000×g单管容量从2ml至13.5ml。NVT（或NT）转头的开发主要是为质粒DNA分离而设计，当然它也适用于线粒体DNA、染色体DNA、RNA及血清脂蛋白的分离·纯化。
使用NVT（NT）转头分离纯化质控DNA的特点是:
离心所需时间比垂直管转头稍长（增加30%~40%），但比一般斜角式转头短（为同类斜角式转头分离时间的60%~70%）。
虽然因为倾角小而使RNA版离心管外壁下滑分力较小，但在加入表面活性剂(如0.1%~0.001%Trimn X-100）后，RNA沉淀可以较快地滑向离心管底部（即在自形成梯度时,RNA已到达底部），在梯度转换过程中不影响质位DNA纯度；
流体静压小，极高速运转时也不会损伤生物体颗粒；
离心管纵剖面比一般角式及甩平转头部大，分离纯度高，样品加入量较大。
（3）不连续阶梯梯度分离:质校DNA分离纯化传统方法是采用金管CsCl自形成梯度平衡等密度离心法，离心开始时金管CsCl密度均一，样品均匀分布其中。
CsCl自形成梯度的离心时间可以用下式计算：
式中N：实际转速(rpm)
P:样品（如质粒DNA）在CsCl的浮动密度
r:从旋转中心到纯样品带中心的距离（厘米），作为初步结算，对质粒DNA离心，r位置可定在离心管中部，r平均刊点再偏外-10%。（rmax-rmin）。
F:取决于梯度材料及溶液初始密度的常系数〈表1〉。
S20.w：样品（质粒DNA）在20℃水中沉降系数，可参照有关文献决定。
[注]表中TCA为三氯乙酸,TFA为三氟乙酸
用以上公式算出的离心时间和实际离心结果非常接近。从公式可以看出T反比子（N4、r2），显然在CsCi不结晶析出的前提下提高（N4、r2）将会减少离心时间,而增加转速的效果特别明显。但是对于某些较低转速转头（如 65,000rpm以下）CsCl自形成梯度所需时间过长（10小时）以上，因此质粒DNA纯样品区带形成的时间也比较长.
作为对全管初始等密度条件的改进，近几年发展了阶梯形不连续CsCl梯度的平衡等密度离心，即离心管初始梯度分二部分：
下部：高密度区（p=1.80-1.81g/cm3），占总容量1/3。
上部：低密度区（p=1.46-1.48g/cm），占总容量2/3，实验证明，二阶不连续CsCl梯度可比全管等密度离心所需时间要短得多（以12ml垂直管转头为例，质粒DNA，CsCl梯度55,000rPm，20℃；不连续二阶梯度离心为5.5
小时,全管等密度离心为8小时）。
二阶不连续梯度离心，样品加在靠离心管底部的高密度区，无论对何种转头，其r很大；而且只存在样品的上浮而不存在低密度区（低离心力口速度区）样品的沉降；在接近DNA浮动
密度区初始密度差较大,自形成梯度，时间较短；由于以上原因缩短了离心时间。（4）超高速多级（转速）分离：很明显，根据T公式提高转速将会加速CsCl梯度的形成，离心时间也会相应缩短。但是，在某温度下的高转速，长时间离心分离对于较高密度的CsCl来说很可能产生局部结晶析出，而局部结品析出不仅会影响梯度，而且会因析出的固态CsCl因损伤离心管壁而造成离心失败或事故.为此,对于质粒DNA离心分离实验，由于新型超速机的可编程序运转的特点。可以从极高转速逐渐向稍低转速推移，每次实验分成很多转速挡，既提高了效率，又保证了实验成功和安全。
当然，这类实验是要经过多次摸索，才能形成常用的离心程序，美国Beckman公司和日本Hitact1i ko ki株式会社都在各自的先进的超速机上做了大量实验，并向用户推荐可靠、高效的离心理序[2、31。
三、典型的质粒DXA超速离心分离举例
1.传统分离举例：
例（1）单管容量为12rnl，最高转速在50,000rpm以下的角式转头，12PA密封管，各厂新型超速机。
样品+TE液（配成pH8.0），EB加入量0.2mg/ural，加入CsCl配成全管p=1.57g/ml45,000rpm×36小时，20℃，慢减速或55,000rprn×16小时+40,000rpm×1小时，20oC慢减速-分离结果:管中部稍下形成纯质粒DNA带，中部稍上出现DNA片断带，近底部为RNA沉淀，上浮物为蛋白质。
特点：分离结果较好，但纯样品带较宽，分离时间很长，用去近1亿转驱动部寿命。
例（2）单管容量为5ml，最高转速为65,000rpm的铁吊椅甩平转头，5PA管，样品配置同例（1）
特点：同例（5） （用去0.2亿转驱动部寿命）。
36,000rpm×55小时,20℃,或32,000rpm×70小时,20·c。
·分离结果及特点：分离结果很理想，质粒DNA带很窄，RNA沉降于离心管球底。但离心时间过长，成本较高（用去1.1亿~1.3亿转驱动部寿命）。
2.垂直管转头离心分离：
例（3）日本日立cp100α主机，P100VT转头（700,000×g,8×5ml），5PA密封管，样品及梯度配置同例(1)
100,000rpm×1小时50分,20℃,慢减速(7档)。
·特点:离心结果与例(1)相似,由于转速极高，壁部RNA沉淀很紧，在降速过程中对DNA污染很少。离心时间很短，高效，低成本(用去0.12亿转驱动部寿命)。
例(4)最高转速为50,000rpm的钦垂直管转头，容量8×40ml，40PA密封管，样品配置如例〈1〉50,000rpm×24小时，20℃，慢减速。
特点：大容量分离，RNA沉淀对DNA带稍有污染。
3.近垂直管转头分离
例（5）Beclunar1NVT90转头XL-90主机，8×5时，5PA密封管，转头最高转速90,OOOrpm，646,000×g。 样品+TE液（配成pH8.0），E·B加入量为0.2mg/mh，TritmX-100加入量为0.01%，加入Cscl配成p=1.55g/ml。78,000rpm×4小时，20℃，慢减速。
特点：由于Triton X-100的作用，RNA沉淀加速滑向离心管底，转头减速过程中对DNA没有污染，分离结果很理想（用去0.2亿转驱动部寿命）。
例（6）日本日立CS12OEX或美Beckman
TLX微量超速机，最高转速为120,OOOrpm的NVT（NT）转头，8×2时，2PA密封管，样品及梯度液配置基本同例（5），但CsCL配成p=1.55z/ml,120,000rprnX3小时，20℃，慢减速。
4.不连续阶梯梯度分离：
例（7）日本日立SRP83VT转头，80,000rprm，549,000g，8×5时，5PA密封管（日立CPα，β系列机或SC夏系列机），梯度液配置：
先配置TE液+Cscl，p=1.47g/时，共3.5ml，先注入5PA密封管。
再配置TE液+样品+CsCl配成p=1.81g/mh E.B.0.2mg/ml，共1.5ml用注射器伸入管底缓缓注入使原先的p=1.47液上浮。
83,ooorpm×1小时，20℃，慢加速，慢减速，结果同例(3)。
特点：由于使用了二阶不连续梯度,CsCl自形成梯度时间缩短。超高转速，RNA沉淀很紧，对DNA带污染很小，高效，低成本（只用去0.05亿转驱动部寿命）。缺点是样品加入量稍小。
例〈8〉日本日立RP55VF：转头，55,000rpm，293,000×g，12×5时，样品及梯皮液配置同例（7） 55,000rpm×4.5小时，20·c，慢加、减速。结果与例〈7〉相似。
5.超高速多级（转速）分离：
例（9）：BeckmanXL-90超速机，NVT-90转头90,000rpm，645,000xg，8×5ml，5.1PA密封管，样品及梯度液配置同例（5）。
多级分离：90,000rpm×l.5小时+87,000rpm×0.25小时+83,000rpm×0.25小时+81,000rpm×0.50小时+80,000rpm×0.50小时，20℃，慢减速。（以上实验亦可在日本目立CP100α或90α主机上做用PlOOVT转头，结果相同）。
特点：结果同例(5)，但时间降为3小时（0.16亿转）
例（10）Hitact1i微量超速CS-120EX或CS-10OEX微量超速机，SlOOAT5角式转头，100,OOOrpm，550,000×g，8×5ml，样品及梯度液配置与例(3)基本同，但样品+TE液配成p=1.55g/ER1。100,ooorpm×4.5小时+98,ooorpm×15分+96.ookpm×30分+94,ooorpm×30分+90,OOOrpm×25分+85.OOOrpmX30分（共7小时），20℃，慢减速。
特点：使用角式转头，微量超速机，在离心力较小的条件下（与大型超速机相比），离心时间较短，RNA沉向管底，分离结果很理想。
四、质粒DNA超速离心分离注意事项
1.防止污染 防止脱氢酶污染：脱氢酶能使DNA降解或变性，而它又无处不在（皮肤上，没清洗并没消毒的器具表面……），所以，在质粒DNA分离实验的每一个环节都要注意这一点．有效的办法是器具（离心管、盖、注射器、移液器、盛器等等）的消毒（蒸气消毒或0.1%焦破酸二乙商消毒）。虽然，我们可以加DFP（二异丙基确酸氟）或PMSF（苯用基确院氛）来抑制脱氢酶的降解使用,但主要手段还是清洗和消毒。为防止皮肤上核糖体污染，操作时应戴上手术用手套。
2.防止重金属盐中存在的重金属离子和DNA结合成复合物：CsCl为电离介质，在离心前CsCl应过柱以消除Cs离子，对接触样品的器皿也要清洗，并用去离子水冲洗。
3.样品的加载量 祥品加入量与样品浓度有关，为了提高分辨率，样品加入量应加以控制，合适的加入量应以前人实验作参考。自行试验时，每毫升梯度液样品量约为10μZ~20μg。
4.对于角式、垂直、近垂直转头的自形成梯度平衡等密度分离，可用。0~100Orpm快加速及1,000rprn~0慢减速，阶梯梯度则要求慢加速，慢减速，近代起这机都提供了很好的范例，供用户选择加、减速速率时参考。
5.转头在离心开始时温度应和离心运转时工作温度基本一致（土5·C），转头预冷温度过低（10oC以下）在极高转速，短时间离心时，可能因来不及升温而出现CsCl析出，使实验失败或发生事故。
6.合适的取样方法：质粒DNA超速离心分离加样较简易，离心后取样方法和操作水平将决定回收率和样品纯度。首先，取样环境应和离心工作温度相近（士5℃）；取样时实验台上应无振动源；根据实验室条件相应选择横向穿刺、底部空孔、离心管切割或用梯度仪收集。但无论哪一种方法部必须小心行事。
7.合适的pH值，核酸类佯品在实验全过程中都应保持在pH8.0的TE液中，pH值过高过低也会使DNA变性。
8.离心管及加液量：由于近代质位DNA的超速离心分离使用了非常高的转速，对7可心管材质要求也很高，一般做这类实验的离心管只用一次。最好是用密封管，而且一段以选择PA管为好。离心管存放朔不超过2~3年，使用密封管或有盖薄壁管样品要加满。使用甩平转头液面EE管口2~3毫米以防止弯月面溢液或管口翻卷。