DNA

DNA复制过程中如果出错，有可能导致某些基因发生突变，对于生物来说，发生基因突变如果再导致性状的改变对生物大多时候是不利的。但这个改变并不是绝对不利的，基因突变有可以使生物出现更适应环境的性状。所以，DAN复制中若出现错误,对生物就有害，这句话是不对的。扩展资料：DNA双螺旋的解旋DNA在复制的时候，在DNA解旋酶的作用下，双链首先解开，形成了复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质和酶参与的较复杂的复制过程（1）单链DNA结合蛋白（single—stranded DNA binding protein,ssbDNA蛋白）ssbDNA蛋白是较牢固结合在单链DNA上的蛋白质。原核生物ssbDNA蛋白和DNA结合时表现出协同效应：如果第一个ssbDNA蛋白结合到DNA上去能力为1，第二个的结合能力可高达103；真核生物细胞里的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则不表现上述效应。ssbDNA蛋白作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，以四聚体的形式存在于复制叉处，等待单链复制后才脱下来，重新循环。因此，ssbDNA蛋白仅保持单链的存在，是不起解旋作用。（2）DNA解链酶（DNA helicase）DNA解链酶可以通过水解ATP获得能量以解开双链DNA。这一种解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。若双链DNA中有单链末端或切口，则DNA解链酶能首先结合在这一部分，然后逐步向双链的方向移动。复制时，大部分DNA解旋酶沿滞后模板的5"—〉3"方向并随着复制叉的前进而移动，只有个别解旋酶（Rep蛋白）是沿着3"—〉5"方向移动。因而推测Rep蛋白和特定DNA解链酶是分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA。（3）DNA解链过程DNA在复制前不仅为双螺旋而且处于超螺旋状态，而超螺旋状态的存在为解链前的必须结构状态，参与解链的除解链酶外有一些特定蛋白质，比如大肠杆菌中的Dna蛋白等。一旦DNA局部双链被解开，就必须有ssbDNA蛋白以稳定解开单链，保证此局部不会恢复为双链。两条单链DNA复制的引发过程是有所差异，可是不论是前导链还是后随链，都需要一段RNA引物用于开始子链DNA合成。因此前导链和后随链的差别在于前者从复制起始点开始按5"—3"持续的合成下去、不形成冈崎片段、后者则随着复制叉的出现、不断合成长约2—3kb的冈崎片段。参考资料：DNA复制_百度百科

为DNA蛋白质之一种，是与单链DNA有强的亲和性，与DNA复制、遗传的重组等DNA代谢有关的蛋白质。也称螺旋不稳定蛋白质（helixdestabili－zingprotein），又称解DNA旋卷蛋白质（DNAuntwistingprotein）。此蛋白质与单链DNA协同（cooperative）结合，其结合与DNA碱基的排列是非特异性的。此蛋白质结合的DNA使DNA多聚酶的活性增高，并促进重组过程。单链DNA结合蛋白质在生物界广泛存在，B．Alberts等最早发现了噬菌体T4基因32形成的这种蛋白质。以后从细菌、霉菌、两栖类和哺乳类等细胞中也有分离出来。

　　参与复制主要的酶和蛋白质因子介绍如下：　　(1)DNA聚合酶：①原核细胞：以大肠杆菌为例，已发现DNA聚合酶Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ，都是多功能酶，既有5"→3"聚合酶活性，又有3"→5"外切酶活性，DNA聚合酶Ⅰ还有5"→3"外切酶活性。DNA聚合酶Ⅰ的主要功能是修复DNA的损伤，在复制中还能切除RNA引物并填补留下的空隙。DNA聚合酶Ⅱ的作用是损伤修复。DNA聚合酶Ⅲ是DNA的复制酶。新近研究发现的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ，它们涉及DNA的错误倾向修复。　　②真核细胞：DNA聚合酶α，β，γ，δ和ε，其中DNA聚合酶α和δ真正具有合成新链的复制作用；β和ε参与DNA的损伤修复，γ负责线粒体DNA的复制。　　(2)引物合成酶和引发体：引物合成酶又称引发酶，催化RNA引物的合成，该酶作用时需与另外的蛋白结合形成引发体才具有催化活性。　　(3)DNA连接酶：催化双链DNA一条链上切口处相邻5"-磷酸基和3"-羟基生成磷酸二酯键的酶。连接酶作用的过程中，在原核细胞中以NAD+提供能量，在真核细胞中以ATP提供能量。　　(4)DNA解螺旋酶：催化：DNA双螺旋解链的酶。　　(5)DNA单链结合蛋白(SSB)：与DNA分开的单链结合，起稳定DNA的单链、阻止复性和保护单链不被核酸酶降解的作用。　　(6)拓扑异构酶Ⅰ：消除DNA的负超螺旋，改变DNA的超螺旋数。　　(7)拓扑异构酶Ⅱ：引入负超螺旋，消除复制叉前进带来的扭曲张力。

这个问得好……我觉得主要是因为，RNA的转录量很多，而且RNA酶是没有修复功能的，而复制有。前者错误几率比后者大得多。DNA复制要求十分精细，而转录因为量很大，所以可以弥补。我想降解可能也是和这个类似。

1、DNA复制机理——半保留复制 半保留复制(semiconservative replication)是DNA生物合成的一个重要特征。是指DNA合成（复制）时，双链解开，分别作为模板（template）指导DNA的合成，合成的子代新生双链DNA中，总有一条来自亲代DNA...... 2、DNA复制的酶类 参与DNA复制的主要物质有：底物，即dATP,dGTP,dCTP 和 dTTP，总称为dNTP； DNA聚合酶（polymerase）；模板（template），即双链DNA解开形成的单链；引物（primer）,引导新生DNA的产生；其他...... 3、DNA复制过程 DNA复制时，首先需要解开双链，再生成引发体，在引发体的基础上开始合成新链。复制中的新链总是沿5′向3′端方向延伸，即底物dNTP去掉焦磷酸并以磷酸二酯键方式连接在延伸中的DNA链3′端的-OH上，一个接一个地叠加。由于DNA的双链的走向...... 4、DNA复制过程的调控 原核及其它低等生物与高等生物DNA复制的调控模式可能不同，同一生物的调控模式也可有不同的变化。对DNA复制的调节既有正调节也有负调节。

不管是双链RNA还是单链DNA,都是自然界内常见的物质. 一般的RNA都有二级结构.自身可以形成部分的双链区,比如,16S RNA的二级结构图. 在自然界中,也有细胞内自己产生的RNA,可以与mRNA等部分序列互补成双链RNA,调控转录和翻译,比如,miRNA. 还有一些双链RNA的病毒,常见于植物RNA病毒. 单链DNA在DNA转录或复制活跃时,结合单链结合蛋白,会形成部分的单链结构.单链DNA病毒也常见于动物病毒或噬菌体. 在自然界中,微生物有时也会形成单股的DNA,以便于DNA转移,比如F质粒转移. 除此之外,三链DNA也很常见哦~

甲醛变性凝胶电泳并不能区分相相同大小的ssDNA和ssRNA.因为二者长度一致，在凝胶中泳动速率也一致。目前有可分离ssRNA和ssDNA的技术，我只是看过一个设想，但没有后续的实验报道。即使用纯化的SSB蛋白（就是单链DNA结合蛋白，其体内功能是DNA复制时结合解旋酶解开而成的单链DNA，防止复性）作为亲和柱固相，亲和层析DNA/RNA溶液，由于SSB能够特异性的结合ssDNA，因此能够分离ssDNA和ssRNA。此外，如果不要求得率的话，直接用RNaseI处理即可获得ssDNA。

DNA复制时前导链与随从链的合成有哪些不同1．简述分子生物学的中心法则及其扩充。2．何谓DNA的半保留复制？简述复制的主要过程。3．DNA复制时，应具备哪些条件？4．造成DNA损伤的因素是什么？损伤的修复方式有哪几种？5．简述DNA损伤的修复类型。1．1958年，Crick提出了分子生物学的中心法则。DNA是遗传的主要物质，携带有遗传信息。通过复制，遗传信息从亲代DNA传到子代DNA。DNA把遗传物质传递给RNA的过程称为转录。RNA通过翻译，以三个碱基序列决定一个氨基酸这种遗传密码方式，决定蛋白质的基本结构。这种遗传信息的传递规律称为中心法则。其扩充包括在反转录酶的作用下以RNA为模板，指导DNA合成的反转录过程。同时RNA本身也可以进行复制及翻译成蛋白质。2． DNA在复制时，亲代DNA两条链均可作为模板，生成两个完全相同的子代DNA，每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，称为半保留复制。复制的主要过程是：(1)拓扑异构酶松弛超螺旋；(2)解螺旋酶将双股螺旋打开；(3)单链DNA结合蛋白结合在每条单链上，以维持两条单链处于分开状态；(4)引物酶催化合成RNA引物；(5) DNA 聚合酶Ⅲ 催化合成新的DNA 的领头链及冈崎片段；(6)RNA酶水解引物， DNA聚合酶Ⅰ催化填补空隙；(7) DNA连接酶将冈崎片段拼接起来以完成随从链的合成。3． (1)底物：以脱氧三磷酸核苷为底物，总称dNTP，包括dATP 、dGTP 、dCTP 、dTTP。(2)模板：要有母链DNA为模板必须先解链，解旋。双链解开后，两链均可做模板。(3)酶和蛋白质因子：DNA聚合酶等，还需要特定的蛋白质因子。(4)引物：以小段RNA作为引物。4． 造成DNA损伤的因素及损伤的修复方式：(1)引起DNA损伤的因素：主要是一些物理和化学因素，如紫外线照射，电离辐射，化学诱变剂等。(2)损伤修复的方式有：光修复、切除修复、重组修复和SOS修复。5． 修复是指针对已经发生的缺陷而施行的补救机制，主要有光修复、切除修复、重组修复和SOS修复。光修复：通过光修复酶催化完成的，需300～600nm波长照射即可活化，可使嘧啶二聚体分解为原来的非聚合状态，DNA完全恢复正常。切除修复：细胞内主要的修复机制，主要有核酸内切酶、DNA聚合酶Ⅰ及连接酶完成修复。重组修复：先复制再修复。损伤部位因无模板指引，复制出来的新子链会出现缺口，通过核酸酶将另一股健康的母链与缺口部分进行交换。SOS修复：SOS是国际海难信号，SOS修复是一类应急性的修复方式，是由于DNA损伤广泛以至于难以继续复制由此而诱发出一系列复杂的反应。1．简述三种RNA在蛋白质合成中的作用。2．试述复制、转录、翻译的方向性。3．简述原核生物蛋白质翻译延长过程。1．（1）mRNA的作用：以一定结构的mRNA作为直接模板合成一定结构的多肽链，将mRNA上带有遗传信息的核苷酸顺序翻译成氨基酸顺序，即mRNA是通过其模板作用传递遗传信息，指导蛋白质的合成。（2）tRNA的作用：tRNA是转运氨基酸的工具。作为蛋白质合成原料的20种氨基酸各有其特定的tRNA，而且一种氨基酸常有数种tRNA来运载。（3）rRNA的作用：它和蛋白质结合成核蛋白体，是蛋白质合成的场所。2．（1）复制的方向性：DNA复制时，每个复制子可形成两个复制叉，如模板单链DNA3"→5"的方向与复制叉方向相同，则是连续复制；如果模板方向和复制叉方向相反，则DNA合成为不连续合成。（2）转录的方向性：DNA模板解链方向是3"→5"；转录RNA合成的方向是5"→3"。（3）翻译的方向性：核蛋白体沿mRNA从5"→3"方向进行翻译，所合成的多肽链方向是由N端→C端。3．（1）进位：氨基酰-tRNA根据遗传密码的指引，进入核糖体A位；（2）转肽（成肽）：在转肽酶作用下，将P位点上肽酰基转移到A位点氨基酰-tRNA上，在A位上形成肽键，肽链延长；（3）转位（移位）：核糖体在mRNA上以5"→3"移动三个核苷酸距离，卸载的tRNA离开P位点移至E位，在A位上新形成肽酰-tRNA又移到P位上，下一个密码子对应A位点。1．区别酶蛋白与蛋白酶。2．酶蛋白与辅助因子的相互关系如何？3．简述“诱导契合假说”。 4．简述Km和Vmax的意义。5．区别酶的激活与酶原的激活。1．酶蛋白与蛋白酶是两个完全不同的概念。酶蛋白是全酶的一部分，结合酶中蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分称为辅助因子，全酶等于酶蛋白＋辅助因子。只有全酶才具有催化作用，将酶蛋白与辅助因子分开后，均无催化作用。如琥珀酸脱氢酶是由酶蛋白部分和辅助因子FAD结合构成的，只有琥珀酸脱氢酶这一全酶才具有催化活性。而蛋白酶是水解蛋白质的酶，为一完整的酶，具有水解蛋白质的作用，属于单纯蛋白酶类，胰蛋白酶是胰腺分泌的水解蛋白质的酶。2．（1）酶蛋白与辅助因子组成全酶，单独哪一种都没有催化活性；（2）一种酶蛋白只能结合一种辅助因子形成全酶，催化一定的化学反应； （3）一种辅助因子可与不同酶蛋白结合成不同的全酶，催化不同的化学反应；（4）酶蛋白决定反应的特异性，而辅助因子具体参加化学反应，决定酶促反应的性质。3．酶在发挥其催化作用之前，必须先与底物密切结合。这种结合不是锁与钥匙式的机械关系，而是在酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，这一过程称为酶－底物结合的诱导契合假说。酶的构象改变有利于与底物结合；底物也在酶的诱导下发生变形，处于不稳定状态，易受酶的催化攻击，这种不稳定状态称为过渡态。过渡态的底物与酶的活性中心结构最相吻合，从而降低反应的活化能。4．Km（米氏常数）：（1）Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。（2）当ES解离成E和S的速度大大超过分解成E和P的速度时，Km值近似于ES的解离常数Ks。在这种情况下，Km值可用来表示酶对底物的亲和力。此时，Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物的亲和力愈大。Ks值和Km值的涵义不同，不能互相代替使用。（3）Km值是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、酶所催化的底物和外界环境（如温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关。各种酶的Km值范围很广，大致在10－2~10mmol/L之间。Vmax（最大速度）：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度。如果酶的总浓度已知，便可从Vmax计算酶的转换数。酶的转换数定义是：当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变为产物的分子数。对于生理性底物，大多数酶的转换数在1~104/秒之间。5．酶的激活与酶原的激活不同。酶的激活是使已具有活性的酶活性增高，即使酶的活性由小变大。如氯离子是唾液淀粉酶的激活剂，唾液淀粉酶本身就具有水解淀粉的能力，只是活性较低，加入氯离子后，使水解淀粉能力增强。而酶原的激活是使本来无活性的酶原转变成有活性的酶，即使无活性变为有活性。如肠激酶是胰蛋白酶原的激活剂，胰蛋白酶原本身没有水解蛋白质的能力，当加入肠激酶后，肠激酶能引起胰蛋白酶原分子结构改变，并使之转变成胰蛋白酶，后者具有水解蛋白质的作用。1．糖酵解的生理意义？2．糖异生的生理意义？3．磷酸戊糖途径的生理意义？4．NADPH有哪些重要的生理意义？5．什么是糖异生的三个“能障”？克服这三个“能障”需要哪些酶？6．血糖的来源和去路？7．三羧酸循环的生理意义是什么？1．⑴糖酵解最主要的生理意义在于迅速提供能量，这对肌收缩更为重要。当机体缺氧或剧烈运动，肌局部血液不足时，能量主要通过糖酵解获得。⑵在生理条件下，某些组织细胞通过糖酵解获得能量。成熟红细胞没有线粒体，完全依赖糖酵解供应能量。神经、白细胞、骨髓等代谢极为活跃，即使不缺氧，也常由糖酵解提供部分能量。2．⑴当空腹或饥饿时，体内糖的来源不足，依赖甘油、氨基酸等异生成葡萄糖以维持血糖水平恒定，保证主要依赖葡萄糖供能的组织(如脑组织)功能正常。⑵糖异生是肝补充或恢复糖原储备的重要途径。⑶长期饥饿时，肾糖异生增强，有利于维持酸碱平衡，对于防止饥饿造成的代谢性酸中毒有重要作用。3．⑴是体内产生5-磷酸核糖的重要途径，核糖是核酸和游离核苷酸的组成成分。⑵产生NADPH+H+：①作为供氢体参与体内的许多合成代谢；如从乙酰CoA合成脂酸、胆固醇。②参与体内的羟化反应，是加单氧酶系的供氢体。与生物合成有关，如胆汁酸或某些类固醇激素的合成等；与生物转化有关。③是谷胱甘肽还原酶的辅酶，维持谷胱甘肽处于还原状态，还原型的谷胱甘肽可以保护一些含有-SH基的蛋白质或酶免受氧化剂尤其是过氧化物的损害。对维持红细胞的完整性起重要作用，同时防止高铁血红蛋白生成。⑶磷酸戊糖途径与糖酵解、糖有氧氧化及糖醛酸途径相通。4．⑴NADPH作为供氢体参与体内许多合成代谢。 如从乙酰CoA合成脂酸、胆固醇。⑵参与体内的羟化反应，是加单氧酶系的供氢体。与生物合成有关，如胆汁酸或某些类固醇激素的合成等；与生物转化有关。⑶是谷胱甘肽还原酶的辅酶，维持谷胱甘肽于还原状态。还原型谷胱甘肽能保护巯基酶的活性，对维持红细胞的完整性起重要作用，同时防止高铁血红蛋白生成。5．糖酵解过程中由已糖激酶，6-磷酸果糖激酶-1和丙酮酸激酶催化的反应不可逆，这三个不可逆反应是糖异生的三个“能障”。克服这三个“能障”需要四个限速酶，即丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，果糖双（二）磷酸酶-1和葡萄糖-6-磷酸酶。6．来源：⑴食物中糖经消化、吸收。⑵肝糖原分解。⑶非糖物质糖异生。去路：⑴彻底氧化分解，生成CO2和H2O，释放能量。 ⑵合成肝糖原，肌糖原。⑶转变为非糖物质：脂类、氨基酸等。 ⑷转变成其他糖。7．⑴是三大营养素的最终代谢通路。 ⑵是糖、脂肪、氨基酸代谢联系的枢纽。⑶为其他合成代谢提供小分子前体。 ⑷为氧化磷酸化反应生成ATP提供NADH+H+和FADH2。1．为何蛋白质的含氮量能表示蛋白质相对含量实验中又是如何依此原理计算蛋白质含量的2．何谓肽键和肽链及蛋白质的一级结构3．什么是蛋白质的二级结构它主要有哪几种各有何结构特征4．举例说明蛋白质的四级结构。5．变性后蛋白质有何变化？6．组成蛋白质的基本单位是什么？结构有何特点？1．各种蛋白质的含氮量颇为接近，平均为16％，因此测定蛋白质的含氮量就可推算出蛋白质含量。常用的公式为：蛋白质含量(克％)=每克样品含氮克数×6.25×100。2．一个氨基酸的α－羧基和另一个氨基酸的α－氨基进行脱水缩合反应，生成的酰胺键称为肽键，肽键具有双键性质。由许多氨基酸通过肽键相连而形成长链，称为肽链。肽链有两端:游离α－氨基的一端称为N－端，游离α－羧基的一端称为C－端。蛋白质一级结构是指多肽链中氨基酸排列顺序，它的主要化学键为肽键。3．蛋白质二级结构是指多肽链主链原子的局部空间排布，不包括侧链的构象。它主要有α－螺旋、β－折叠、β－转角和无规卷曲四种。在α－螺旋结构中，多肽链主链围绕中心轴以右手螺旋方式旋转上升，每隔3.6个氨基酸残基上升一圈。氨基酸残基的侧链伸向螺旋外侧。每个氨基酸残基的亚氨基上的氢与第四个氨基酸残基羰基上的氧形成氢键，以维持α－螺旋稳定。在β－折叠结构中，多肽链的肽键平面折叠成锯齿状结构，侧链交错位于锯齿状结构的上下方。两条以上肽链或一条肽链内的若干肽段平行排列，通过链间羰基氧和亚氨基氢形成氢键，维持β－折叠构象的稳定。在球状蛋白质分子中，肽链主链常出现180o回折，回折部分称为β－转角，β－转角通常由4个氨基酸残基组成，第二个残基常为脯氨酸。无规卷曲是指肽链中没有确定规律的结构。4．蛋白质四级结构是指蛋白质分子中具有完整三级结构的各亚基在空间排布的相对位置。例如血红蛋白，它是由1个α亚基和1个β亚基组成一个单体，二个单体呈对角排列，形成特定的空间位置关系。四个亚基间共有8个非共价键，维系其四级结构的稳定性。5．生物学活性丧失，溶解度降低，易被蛋白酶水解，粘度增加。6．组成蛋白质的基本单位是氨基酸，它们都是α－氨基酸。除甘氨酸外，α－碳原子都是不对称碳原子，均为L–α–氨基酸。

A、题干中“rep蛋白可以将DNA双链解旋”可知，rep蛋白能使A与T、C与G之间的氢键断裂，A正确； B、高温处理DNA分子也可以使DNA双链解旋，B错误； C、DNA复制的过程的特点为边解旋边复制、DNA分子复制的方式是半保留复制，C正确； D、根据题干中“rep蛋白可以将DNA双链解旋，结合蛋白可以和解旋的DNA单链结合”可知，可以促进DNA复制，D错误． 故选：AC．

以原核生物DNA复制过程予以简要说明　1．DNA双螺旋的解旋 　　DNA在复制时,其双链首先解开,形成复制叉,而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程 　　（1）单链DNA结合蛋白（single—stranded DNA binding protein,ssbDNA蛋白） 　ssbDNA蛋白是较牢固的结合在单链DNA上的蛋白质.原核生物ssbDNA蛋白与DNA结合时表现出协同效应：若第1个ssbDNA蛋白结合到DNA上去能力为1,第2个的结合能力可高达103；真核生物细胞中的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则不表现上述效应.ssbDNA蛋白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构,它以四聚体的形式存在于复制叉处,待单链复制后才脱下来,重新循环.所以,ssbDNA蛋白只保持单链的存在,不起解旋作用.（2）DNA解链酶（DNA helicase） DNA解链酶能通过水解ATP获得能量以解开双链DNA.这种解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在.如果双链DNA中有单链末端或切口,则DNA解链酶可以首先结合在这一部分,然后逐步向双链方向移动.复制时,大部分DNA解旋酶可沿滞后模板的5"—〉3"方向并随着复制叉的前进而移动,只有个别解旋酶（Rep蛋白）是沿着3"—〉5"方向移动的.故推测Rep蛋白和特定DNA解链酶是分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA.

这是鼎鼎大名的半不连续复制（http://baike.baidu.com/view/3112426.htm）。DNA复制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，通过转录激活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白质结合在被解开的链上。引发前体(preprimosome)，在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶(primase)组装成引发体(primosome)。引发体可以在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引发体在滞后链上沿5"→3"方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后)，在一定距离上反复合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成冈崎片段使用。滞后链模板环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。（简单的说就是绕了个圈！）这样，当DNA聚合酶Ⅲ沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从DNA聚合酶Ⅲ上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度)。而且，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移动。http://v.youku.com/v_show/id_XNDkwNDU2NzY=.html

应该是DnaA蛋白吧？参与DNA复制的起始，DNA复制的第一步是，DnaA蛋白与复制起始位点9bp重复序列结合，由于DnaA是ATP结合蛋白，它水解ATP释放的能量促使DNA双链在13bp重复序列去解开，促使单链结合蛋白SSB与DNA单链区结合。

dna复制的三个过程分别是起始阶段、延长阶段和终止阶段。参与DNA复制的物质：1、解旋酶DNA复制涉及的第一个问题就是DNA的两条单链要在复制叉位置解开。DNA双链并不会自动解旋，细胞中有一类特殊的蛋白质可以促使DNA在复制叉处打开，这就是解旋酶。解旋酶可以和单链DNA以及ATP结合，利用ATP水解生成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。2、单链DNA结合蛋白解旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA极不稳定，很快就会重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。在细胞内有大量单链DNA结合蛋白（single strand DNA binding protein, SSB），能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对或降解。SSB结合到单链DNA上之后，使DNA呈伸展状态，有利于复制的进行。当新DNA链合成到某一位置时，该处的SSB便会脱落，脱落的SSB可以重复利用。DNA链的延伸：DNA新链的延伸由DNA聚合酶III所催化。为了复制的不断进行，解旋酶须沿着模板前进，边移动边解开双链。由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就可能造成复制叉难以再继续前进，但在细胞内DNA的复制不会因出现拓扑学问题而停止，因为拓扑异构酶会解决这一问题。随着引发体合成RNA引物，DNA聚合酶III开始不断地将引物延伸，合成DNA。DNA聚合酶III是一个多亚基复合二聚体，一个单体用于前导链的合成，另一个单体用于滞后链的合成，因此它可以在同一时间分别复制DNA前导链和滞后链。虽然DNA前导链和滞后链复制的方向不同，但如果滞后链模板环绕DNA聚合酶III，并通过DNA聚合酶III，然后再折向未解链的双链DNA的方向，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向进行。

A、根据题干中“双螺旋解开后会产生一段单链区，DNA结合蛋白（SSB）能很快地与单链结合”，说明SSB不是一种解开DNA双螺旋的解旋酶，A错误； B、根据题干信息可知，SSB与单链的结合将利于DNA复制，B错误； C、根据题干信息可知，SSB与DNA单链既可结合也可分开，C正确； D、根据题干信息可知，SSB是一种DNA结合蛋白，故与单链的结合不遵循碱基互补配对原则，D错误． 故选：C．

DNA在体内通过半保留复制的方式不断合成新的DNA链。在体外人工基因合成无需模板，不受基因来源限制也可以进行DNA合成。人工基因合成的方法是基于亚磷酰胺的DNA合成法，也是今天Oligo自动化生产所采用的主要方法。该方法包括（1）去保护。酸催化去除DMT（二甲氧基三苯基甲基）基团，以便下一轮碱基（dA、dC、dG和dT）添加。（2）碱基偶联。将含有DMT保护基团护的亚磷酰胺通过四唑活化剂加到未保护的5′u2006OH末端。（3）加帽。将游离的5′u2006OH乙酰化，以防止进一步的链延伸所造成的单碱基缺失。（4）氧化。通过碘液将磷酸三酯氧化为磷酸盐，进入一个反应循环。由于随着链延长所带来的化学反应效率、合成纯度以及产率的下降，目前该方法合成的Oligo长度一般不超过200个核苷酸（nt）。随后，通过人工进行PCR片段扩增和组装合成基因。

防止两条互补单链再次结合为双螺旋，维持单链状态。防止单链区域形成链内二级结构。保护单链区域，防止被核酸酶水解。刺激某些酶的活性。其他功能。

在细胞核中,与DNA结合的蛋白质可分为两类——组蛋白和非组蛋白.组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4中含有大量的带碱性R基氨基酸,在水溶液中带正电,它们易和DNA上带负电荷的磷酸基团相互结合.组蛋白H2A、H2B、H3、H4先和DNA结合成念珠状,当H1参与到其中时,组蛋白和DNA结合成线状的染色线.染色线在一些非组蛋白的帮助下进一步缩合成光学显微镜下可见的棒状结构——染色体.当DNA复制或者表达时,染色体会全部或部分解开,DNA暴露在染色体外.此时一些带有特殊化学结构的蛋白质就会和DNA结合.这些蛋白质也属于非组蛋白,它们中有参与DNA复制的酶、参与转录的酶或参与复制转录调控的蛋白质.其与DNA结合方式主要通过氢键或其与DNA结构相互补的空间结构和DNA特殊碱基序列结合.

DNA复制的过程 DNA复制过程大致可以分为复制的引发，DNA链的延伸和DNA复制的终止三个阶段。 (一)DNA复制的引发 复制的引发(Priming)阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子，RNA引物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3"-OH末端复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滞后链模板转录一短的RNA分子。在有些DNA复制中，(如质粒ColE)，该RNA分子经过加式成为DNA复制的引物。但是，在大部分DNA复制中，该RNA分子没有引物作用。它的作用似乎只是分开两条DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板DNA上开始合成RNA引物，这个过程称为转录激活(transcriptional activation)，在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的dnaA蛋白。这两种蛋白质可以和复制起点处DNA上高度保守的4个9bp长的序列结合，其具体功能尚不清楚。可能是这些蛋白质与DNA复制起点结合后能促进DNA聚合酶Ⅲ复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶。DNA复制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，通过转录激活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白质结合在被解开的链上。由复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n"蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶(primase)组装成引发体(primosome)。引发体可以在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引发体在滞后链上沿5"→3"方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后)，在一定距离上反复合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷酸长。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。 为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3"-OH端而进入DNA链的延伸阶段。 (二)DNA链的延伸 DNA新生链的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必须由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学上的问题:由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。但是，在细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。有两种机制可以防止这种现象发生:[1]DNA在生物细胞中本身就是超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和;[2]DNA拓扑异构酶Ⅰ要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而DNA拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链，再由DNA聚合酶Ⅲ合成新的DNA链。前已述及DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶催化，该酶是由7种蛋白质(多肽)组成的聚合体，称为全酶。全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。α亚基具有聚合功能和5"→3"外切酶活性，ε亚基具有3"→5"外切酶活性。另外，全酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。 在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶Ⅲ在同一时间分别进行复制DNA前导链和滞后链。如果滞后链模板环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。 这样，当DNA聚合酶Ⅲ沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从DNA聚合酶Ⅲ上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度)。而且，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移动。 按上述DNA复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体(replisome)。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通过其5"→3"外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5"→3"合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。 (三)DNA复制的终止 过去认为，DNA一旦复制开始，就会将该DNA分子全部复制完毕，才终止其DNA复制。但最近的实验表明，在DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少在NDA复制终止阶段令人困惑的一个问题是，线性DNA分子两端是如何完成其复制的?已知DNA复制都要有RNA引物参与。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合Ⅰ所填充。但是，在线性分子的两端以5"→3"为模板的滞后链的合成，其末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。 在研究T7DNA复制时，这个问题部分地得到了解决。T7DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。而且，在T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3"端单链尾巴，两个子代DNA的3"端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。 在研究痘病毒复制时，发现了线性DNA分子完成末端复制的第二种方式。痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。然后，在发夹的中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。这样，在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。在真核生物染色体线性DNA分子复制时，尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。但最近的实验表明，真核生物染色体末端DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端DNA序列加在刚刚完成复制的DNA末端。这种机制首先在四膜虫中发现。该生物细胞的线性DNA分子末端有30-70拷贝的5"TTGGGG3"序列，该细胞中存在一种酶可以将TTGGGG序列加在事先已存在的单键DNA末端的TTGGGG序列上。这样有较长的末端单链DNA，可以被引物酶重新引发或其他的酶蛋白引发而合成RNA引物，并由DNA聚合酶将其变成双链DNA。这样就可以避免其DNA随着复制的不断进行而逐渐变短。 在环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在上述问题。环状DNA复制到最后，由DNA拓扑异构酶Ⅱ切开双链DNA，将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA。

DnaA蛋白在E.coliDNA复制的调控中的作用是 A.功能上类似于酵母起点识别复合物(ORC)，与DNA结合，导致DNA双螺旋的局部解链。 B.增加DNApolⅢ的进行性。 C.起始后随链上冈崎片段的合成。 D.与复制起始区一系列13bp的富含A-T的重复序列结合，在复制叉前进时防止DNA的弯折。 E.在复制叉处解除解螺旋酶活性带来的扭曲张力 正确答案：A

复制的过程和参与酶及因子 复制的过程分四个阶段.第一阶段,亲代DNA分子超螺旋的构象变化及双螺旋的解链,将复制的模板展现出来.第二阶段为复制的引发阶段,有引物RNA进行5′～3′方向的合成.第三阶段为DNA链的延长,在引物RNA合成基础上,进行DNA链的5′～3′方向合成,前导链连续地合成出一条长链,随从链合成出冈崎片段.去除RNA引物后,片段间形成了空隙,DNA聚合酶作用使各个片段靠近.在连接酶作用下,各片段连接成为一条长链.第四阶段为终止阶段,复制叉行进到一定部位就停止前进,最后前导链与随从链分别与各自的模板形成两个子代DNA分子,到此复制过程就完成了. 螺旋的松弛与解链 包括超螺旋的构象变化及双螺旋的解链,参与者主要为拓扑异构酶、解链酶及单链结合蛋白等. DNA聚合酶 在原核生物及真核生物,DNA聚合酶有几种类型. （1）原核生物大肠杆菌DNA聚合酶 1)DNA聚合酶Ⅰ.在随从链合成时,先合成了许多冈崎片段,而后由于RNA引物的去除形成了空隙,此时DNA PolⅠ它催化聚合反应,延长了各个片段,从而填补了片段间的间隙,使以上片段得以靠近,为片段连接成长链创造了条件.所以DNA polⅠ的聚合作用主要是在填补随从链片段间空隙上发挥作用. DNA PolⅠ还具有3′→5′外切酶活性可识别并去除错误的碱基.这种活性在DNA复制中起了校对功能.DNA PolⅠ的校对活性对DNA复制的准确性起着重要作用. DNA PolⅠ还具有5′→3′外切酶活性.5′→3′外切酶活性也有修正错误的功能,补充其3′→5′外切酶修正错误的作用.例如紫外照射产生的嘧啶二聚体,就是在其5′→3′切酶作用下切除的. DNA Pol Ⅲ结构中不对称的二聚体,同时分别催化着前导链和随从链的合成. DNA Pol Ⅲ也具有3′→5′外切酶活性,所以对于DNA复制也有校对的功能,可停止加入或除去错误的核苷酸然后继续加正确的核苷酸.因此,DNA PolⅢ配合DNAPolI可将复制的错误率大大地降低,从10-4降为10-6或更少. 当此片段接近前方的片段时,由DNA Pol Ⅲ的5′→3′外切酶活性切除了RNA引物,造成了片段间的空间；继而DNA PolI催化进行5′→3′方向的聚合作用,填补了片段间的空隙.PolⅠ PolⅡ PolⅢ 酶活性 5′→3′聚合作用 3′→5′外切酶活性 5′→3′外切酶活性+ + + + + - + + + 体外链延长速度(核苷酸/分) 600 30 9000 分子数/细胞 400 不详 10～20 功能 修复合成 去除引物填补空隙 校对 不详 复制 校对（2）真核生物DNA聚合酶. 真核生物DNA Pol有α、β、γ、δ及 ε五种. 真核生物的DNA复制是在DNA聚合酶α与DNA聚合酶δ互配合下催化进行的,还有一些酶及蛋白质因子参与反应.DNA Polα与引发酶共同起引发作用,然后由DNA Polδ催化前导链及随从链的合成.DNA Polγ是线粒体中DNA复制酶. DNA Polδ及ε均有外切酶活性,因此也有编辑功能,校正复制中的错误.它们的5′→3′外切酶活性可能在切除引物RNA中有作用.（2）真核生物DNA聚合酶. 真核生物DNA Pol有α、β、γ、δ及 ε五种. 酶活性5′→3′聚合作用 3′→5′外切作用 α β γ δ ε +- +- ++ ++ ++ 细胞内定位 功能 核 复制、引发 核 修复 线粒体 复制 核 复制 核 复制真核生物DNA的复制特点 真核生物中复制进行的速度约为50个核苷酸／秒,仅为原核生物的1／10,但真核生物染色体上DNA复制起始点有多个,因此可以从几个起始点上同时进行复制. 三 修复（一）DNA复制过程中的校正修复 DNA复制过程中会发生错误的,这可以由DNA聚合酶来修正错误.在大肠杆菌DNA复制过程中,如果有错误核苷酸掺入,DNA聚合暂时停止催化聚合作用,而是由DNA PolⅠ或 Pol的Ⅲ 3′→5′外切酶活性切除错误的碱基,然后继续再催化正确的聚合作用.真核生物DNA Polδ也具有此种校对作用.所以DNA聚合酶的校对作用是DNA复制中的修复形式,可使错配率下降至10－6. 其他能够保证DNA复制准确性的机制在于： （1）以亲代DNA为模板,按碱基互补配对方式进行DNA复制. （2）细胞内DNA错配修复机制,可使错配减少至10-9以下. （二）DNA的损伤修复 修复是指针对已发生了的缺陷而施行的补救机制,DNA的修复机制的有数种方式,有光修复、切除修复、重组修复、SOS修复等,其中以切除修复最为重要. 1光修复 通过光修复酶催化而完成的,仅需300-600nm波长照射即可活化,普遍存在于各种生物,人体细胞中也有发现.通过此酶作用,可使环丁基二聚体分解为原来的非聚合状态,DNA完全恢复正常. 2切除修复 切除修复是指对DNA损伤部位先行切除,继而进行正确的合成,补充被切除的片段.大肠杆菌有两种切除修复方式. 3重组修复 当DNA分子的损伤面较大,还来不及修复完善就进行复制时,损伤部位因无模板指引,复制出来的新子链会出现缺口,这时,就靠重组蛋白recA的核酸酶活性将别一股健康的母链与缺口部分进行交换,以填补缺口. 4 SOS修复 指DNA损伤时,应急而诱导产生的修复作用,称为SOS修复.在正常情况下,修复蛋白的合成是处于低水平状态的,这是由于它们的mRNA合成受到阻遏蛋白的抑制.

DNA复制时前导链与随从链的合成有哪些不同1．简述分子生物学的中心法则及其扩充。2．何谓DNA的半保留复制？简述复制的主要过程。3．DNA复制时，应具备哪些条件？4．造成DNA损伤的因素是什么？损伤的修复方式有哪几种？5．简述DNA损伤的修复类型。1．1958年，Crick提出了分子生物学的中心法则。DNA是遗传的主要物质，携带有遗传信息。通过复制，遗传信息从亲代DNA传到子代DNA。DNA把遗传物质传递给RNA的过程称为转录。RNA通过翻译，以三个碱基序列决定一个氨基酸这种遗传密码方式，决定蛋白质的基本结构。这种遗传信息的传递规律称为中心法则。其扩充包括在反转录酶的作用下以RNA为模板，指导DNA合成的反转录过程。同时RNA本身也可以进行复制及翻译成蛋白质。2． DNA在复制时，亲代DNA两条链均可作为模板，生成两个完全相同的子代DNA，每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，称为半保留复制。复制的主要过程是：(1)拓扑异构酶松弛超螺旋；(2)解螺旋酶将双股螺旋打开；(3)单链DNA结合蛋白结合在每条单链上，以维持两条单链处于分开状态；(4)引物酶催化合成RNA引物；(5) DNA 聚合酶Ⅲ 催化合成新的DNA 的领头链及冈崎片段；(6)RNA酶水解引物， DNA聚合酶Ⅰ催化填补空隙；(7) DNA连接酶将冈崎片段拼接起来以完成随从链的合成。3． (1)底物：以脱氧三磷酸核苷为底物，总称dNTP，包括dATP 、dGTP 、dCTP 、dTTP。(2)模板：要有母链DNA为模板必须先解链，解旋。双链解开后，两链均可做模板。(3)酶和蛋白质因子：DNA聚合酶等，还需要特定的蛋白质因子。(4)引物：以小段RNA作为引物。4． 造成DNA损伤的因素及损伤的修复方式：(1)引起DNA损伤的因素：主要是一些物理和化学因素，如紫外线照射，电离辐射，化学诱变剂等。(2)损伤修复的方式有：光修复、切除修复、重组修复和SOS修复。5． 修复是指针对已经发生的缺陷而施行的补救机制，主要有光修复、切除修复、重组修复和SOS修复。光修复：通过光修复酶催化完成的，需300～600nm波长照射即可活化，可使嘧啶二聚体分解为原来的非聚合状态，DNA完全恢复正常。切除修复：细胞内主要的修复机制，主要有核酸内切酶、DNA聚合酶Ⅰ及连接酶完成修复。重组修复：先复制再修复。损伤部位因无模板指引，复制出来的新子链会出现缺口，通过核酸酶将另一股健康的母链与缺口部分进行交换。SOS修复：SOS是国际海难信号，SOS修复是一类应急性的修复方式，是由于DNA损伤广泛以至于难以继续复制由此而诱发出一系列复杂的反应。1．简述三种RNA在蛋白质合成中的作用。2．试述复制、转录、翻译的方向性。3．简述原核生物蛋白质翻译延长过程。1．（1）mRNA的作用：以一定结构的mRNA作为直接模板合成一定结构的多肽链，将mRNA上带有遗传信息的核苷酸顺序翻译成氨基酸顺序，即mRNA是通过其模板作用传递遗传信息，指导蛋白质的合成。（2）tRNA的作用：tRNA是转运氨基酸的工具。作为蛋白质合成原料的20种氨基酸各有其特定的tRNA，而且一种氨基酸常有数种tRNA来运载。（3）rRNA的作用：它和蛋白质结合成核蛋白体，是蛋白质合成的场所。2．（1）复制的方向性：DNA复制时，每个复制子可形成两个复制叉，如模板单链DNA3"→5"的方向与复制叉方向相同，则是连续复制；如果模板方向和复制叉方向相反，则DNA合成为不连续合成。（2）转录的方向性：DNA模板解链方向是3"→5"；转录RNA合成的方向是5"→3"。（3）翻译的方向性：核蛋白体沿mRNA从5"→3"方向进行翻译，所合成的多肽链方向是由N端→C端。3．（1）进位：氨基酰-tRNA根据遗传密码的指引，进入核糖体A位；（2）转肽（成肽）：在转肽酶作用下，将P位点上肽酰基转移到A位点氨基酰-tRNA上，在A位上形成肽键，肽链延长；（3）转位（移位）：核糖体在mRNA上以5"→3"移动三个核苷酸距离，卸载的tRNA离开P位点移至E位，在A位上新形成肽酰-tRNA又移到P位上，下一个密码子对应A位点。1．区别酶蛋白与蛋白酶。2．酶蛋白与辅助因子的相互关系如何？3．简述“诱导契合假说”。 4．简述Km和Vmax的意义。5．区别酶的激活与酶原的激活。1．酶蛋白与蛋白酶是两个完全不同的概念。酶蛋白是全酶的一部分，结合酶中蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分称为辅助因子，全酶等于酶蛋白＋辅助因子。只有全酶才具有催化作用，将酶蛋白与辅助因子分开后，均无催化作用。如琥珀酸脱氢酶是由酶蛋白部分和辅助因子FAD结合构成的，只有琥珀酸脱氢酶这一全酶才具有催化活性。而蛋白酶是水解蛋白质的酶，为一完整的酶，具有水解蛋白质的作用，属于单纯蛋白酶类，胰蛋白酶是胰腺分泌的水解蛋白质的酶。2．（1）酶蛋白与辅助因子组成全酶，单独哪一种都没有催化活性；（2）一种酶蛋白只能结合一种辅助因子形成全酶，催化一定的化学反应； （3）一种辅助因子可与不同酶蛋白结合成不同的全酶，催化不同的化学反应；（4）酶蛋白决定反应的特异性，而辅助因子具体参加化学反应，决定酶促反应的性质。3．酶在发挥其催化作用之前，必须先与底物密切结合。这种结合不是锁与钥匙式的机械关系，而是在酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，这一过程称为酶－底物结合的诱导契合假说。酶的构象改变有利于与底物结合；底物也在酶的诱导下发生变形，处于不稳定状态，易受酶的催化攻击，这种不稳定状态称为过渡态。过渡态的底物与酶的活性中心结构最相吻合，从而降低反应的活化能。4．Km（米氏常数）：（1）Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。（2）当ES解离成E和S的速度大大超过分解成E和P的速度时，Km值近似于ES的解离常数Ks。在这种情况下，Km值可用来表示酶对底物的亲和力。此时，Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物的亲和力愈大。Ks值和Km值的涵义不同，不能互相代替使用。（3）Km值是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、酶所催化的底物和外界环境（如温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关。各种酶的Km值范围很广，大致在10－2~10mmol/L之间。Vmax（最大速度）：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度。如果酶的总浓度已知，便可从Vmax计算酶的转换数。酶的转换数定义是：当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变为产物的分子数。对于生理性底物，大多数酶的转换数在1~104/秒之间。5．酶的激活与酶原的激活不同。酶的激活是使已具有活性的酶活性增高，即使酶的活性由小变大。如氯离子是唾液淀粉酶的激活剂，唾液淀粉酶本身就具有水解淀粉的能力，只是活性较低，加入氯离子后，使水解淀粉能力增强。而酶原的激活是使本来无活性的酶原转变成有活性的酶，即使无活性变为有活性。如肠激酶是胰蛋白酶原的激活剂，胰蛋白酶原本身没有水解蛋白质的能力，当加入肠激酶后，肠激酶能引起胰蛋白酶原分子结构改变，并使之转变成胰蛋白酶，后者具有水解蛋白质的作用。1．糖酵解的生理意义？2．糖异生的生理意义？3．磷酸戊糖途径的生理意义？4．NADPH有哪些重要的生理意义？5．什么是糖异生的三个“能障”？克服这三个“能障”需要哪些酶？6．血糖的来源和去路？7．三羧酸循环的生理意义是什么？1．⑴糖酵解最主要的生理意义在于迅速提供能量，这对肌收缩更为重要。当机体缺氧或剧烈运动，肌局部血液不足时，能量主要通过糖酵解获得。⑵在生理条件下，某些组织细胞通过糖酵解获得能量。成熟红细胞没有线粒体，完全依赖糖酵解供应能量。神经、白细胞、骨髓等代谢极为活跃，即使不缺氧，也常由糖酵解提供部分能量。2．⑴当空腹或饥饿时，体内糖的来源不足，依赖甘油、氨基酸等异生成葡萄糖以维持血糖水平恒定，保证主要依赖葡萄糖供能的组织(如脑组织)功能正常。⑵糖异生是肝补充或恢复糖原储备的重要途径。⑶长期饥饿时，肾糖异生增强，有利于维持酸碱平衡，对于防止饥饿造成的代谢性酸中毒有重要作用。3．⑴是体内产生5-磷酸核糖的重要途径，核糖是核酸和游离核苷酸的组成成分。⑵产生NADPH+H+：①作为供氢体参与体内的许多合成代谢；如从乙酰CoA合成脂酸、胆固醇。②参与体内的羟化反应，是加单氧酶系的供氢体。与生物合成有关，如胆汁酸或某些类固醇激素的合成等；与生物转化有关。③是谷胱甘肽还原酶的辅酶，维持谷胱甘肽处于还原状态，还原型的谷胱甘肽可以保护一些含有-SH基的蛋白质或酶免受氧化剂尤其是过氧化物的损害。对维持红细胞的完整性起重要作用，同时防止高铁血红蛋白生成。⑶磷酸戊糖途径与糖酵解、糖有氧氧化及糖醛酸途径相通。4．⑴NADPH作为供氢体参与体内许多合成代谢。 如从乙酰CoA合成脂酸、胆固醇。⑵参与体内的羟化反应，是加单氧酶系的供氢体。与生物合成有关，如胆汁酸或某些类固醇激素的合成等；与生物转化有关。⑶是谷胱甘肽还原酶的辅酶，维持谷胱甘肽于还原状态。还原型谷胱甘肽能保护巯基酶的活性，对维持红细胞的完整性起重要作用，同时防止高铁血红蛋白生成。5．糖酵解过程中由已糖激酶，6-磷酸果糖激酶-1和丙酮酸激酶催化的反应不可逆，这三个不可逆反应是糖异生的三个“能障”。克服这三个“能障”需要四个限速酶，即丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，果糖双（二）磷酸酶-1和葡萄糖-6-磷酸酶。6．来源：⑴食物中糖经消化、吸收。⑵肝糖原分解。⑶非糖物质糖异生。去路：⑴彻底氧化分解，生成CO2和H2O，释放能量。 ⑵合成肝糖原，肌糖原。⑶转变为非糖物质：脂类、氨基酸等。 ⑷转变成其他糖。7．⑴是三大营养素的最终代谢通路。 ⑵是糖、脂肪、氨基酸代谢联系的枢纽。⑶为其他合成代谢提供小分子前体。 ⑷为氧化磷酸化反应生成ATP提供NADH+H+和FADH2。1．为何蛋白质的含氮量能表示蛋白质相对含量实验中又是如何依此原理计算蛋白质含量的2．何谓肽键和肽链及蛋白质的一级结构3．什么是蛋白质的二级结构它主要有哪几种各有何结构特征4．举例说明蛋白质的四级结构。5．变性后蛋白质有何变化？6．组成蛋白质的基本单位是什么？结构有何特点？1．各种蛋白质的含氮量颇为接近，平均为16％，因此测定蛋白质的含氮量就可推算出蛋白质含量。常用的公式为：蛋白质含量(克％)=每克样品含氮克数×6.25×100。2．一个氨基酸的α－羧基和另一个氨基酸的α－氨基进行脱水缩合反应，生成的酰胺键称为肽键，肽键具有双键性质。由许多氨基酸通过肽键相连而形成长链，称为肽链。肽链有两端:游离α－氨基的一端称为N－端，游离α－羧基的一端称为C－端。蛋白质一级结构是指多肽链中氨基酸排列顺序，它的主要化学键为肽键。3．蛋白质二级结构是指多肽链主链原子的局部空间排布，不包括侧链的构象。它主要有α－螺旋、β－折叠、β－转角和无规卷曲四种。在α－螺旋结构中，多肽链主链围绕中心轴以右手螺旋方式旋转上升，每隔3.6个氨基酸残基上升一圈。氨基酸残基的侧链伸向螺旋外侧。每个氨基酸残基的亚氨基上的氢与第四个氨基酸残基羰基上的氧形成氢键，以维持α－螺旋稳定。在β－折叠结构中，多肽链的肽键平面折叠成锯齿状结构，侧链交错位于锯齿状结构的上下方。两条以上肽链或一条肽链内的若干肽段平行排列，通过链间羰基氧和亚氨基氢形成氢键，维持β－折叠构象的稳定。在球状蛋白质分子中，肽链主链常出现180o回折，回折部分称为β－转角，β－转角通常由4个氨基酸残基组成，第二个残基常为脯氨酸。无规卷曲是指肽链中没有确定规律的结构。4．蛋白质四级结构是指蛋白质分子中具有完整三级结构的各亚基在空间排布的相对位置。例如血红蛋白，它是由1个α亚基和1个β亚基组成一个单体，二个单体呈对角排列，形成特定的空间位置关系。四个亚基间共有8个非共价键，维系其四级结构的稳定性。5．生物学活性丧失，溶解度降低，易被蛋白酶水解，粘度增加。6．组成蛋白质的基本单位是氨基酸，它们都是α－氨基酸。除甘氨酸外，α－碳原子都是不对称碳原子，均为L–α–氨基酸。

1、DNA聚合酶Ⅲ二酯键，作用是合成DNA新链中的3＇-5＇磷酸。2、DNA聚合酶Ⅰ，作用是校读、切除引物、填补空缺。3、拓扑异构酶，作用是松弛DNA超螺旋结构成双螺旋。4、解螺旋酶，作用是解开DNA双螺旋结构成两条单链。5、单链DNA结合蛋白，作用是维持单链DNA处于稳定状态。6、引物酶，作用是合成DNA复制所需的RNA引物。7、DNA连接酶，作用是将随从链中各冈崎片段连接起来。扩展资料：DNA复制主要分为起始、延长和终止三个阶段。1、复制的起始：主要是在拓扑异构酶和解螺旋酶的作用下松弛超螺旋和解开双链，并由单链DNA结合蛋白保护和稳定单链，引物酶识别起始点，按照碱基配对原则，以DNA链为模板，按5＇→3＇方向合成RNA引物。2、复制的延长：在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，以四种dNTP为原料，以DNA为模板，按照碱基互补原则，在引物的3＇—OH末端合成DNA链。其中，一条链的合成是连续合成的称为前导链，另一条链首先合成冈崎片段称为随从链。3、复制的终止：在DNA聚合酶Ⅰ的作用下切除引物并填补引物遗留空缺，最后在DNA连接酶的作用下连接冈崎片段，形成两个完整的子代DNA分子，从而完成DNA复制。

可以结合。原核细胞在转录时DNA与RNA聚合酶结合，而RNA聚合酶本质就是蛋白质，所以原核细胞DAN可以与蛋白质结合。

组蛋白组蛋白（histones）真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质，含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸特别多，二者加起来约为所有氨基酸残基的1/4。组蛋白与带负电荷的双螺旋DNA结合成DNA-组蛋白复合物。因氨基酸成分和分子量不同，主要分成5类。真核生物细胞核中组蛋白的含量约为每克DNA 1克，大部分真核生物中有5种组蛋白，两栖类、鱼类和鸟类还有H5以替代或补充H1。染色质是由许多核小体组成的，H2A，H2B，H3和H4各2个分子构成的8聚体是核小体的核心部分，H1的作用是与线形 DNA结合以帮助后者形成高级结构。组蛋白是已知蛋白质中最保守的，例如，人类和豌豆的H4氨基酸序列只有两个不同，人类和酵母的H4氨基酸序列也只有8个不同，这说明H4的氨基酸序列在约109年间几乎是恒定的。早在1888年德国化学家科塞（A.Kossel）已从细胞核中分离出组蛋白，并认识到它们作为碱性物质应在核中与核酸结合，但直到1974年才了解组蛋白的确切作用。一些实验室随后证明组蛋白以独特的方式构成核小体的组分。非组蛋白(nonhistone proteins)非组蛋白是指细胞核中组蛋白以外的酸性蛋白质。非组蛋白不仅包括以DNA作为底物的酶，也包括作用于组蛋白的一些酶, 如组蛋白甲基化酶。此外还包括DNA结合蛋白、组蛋白结合蛋白和调节蛋白。由于非组蛋白常常与DNA或组蛋白结合, 所以在染色质或染色体中也有非组蛋白的存在, 如染色体骨架蛋白。 生物学的知识博大精深的，为生活，为健康都是不可缺少的一门。

原核细胞结构简单,拟核中的DNA要比真核细胞的DNA分子小很多,而且很多都是环状DNA,因此结构自然比较稳定,不需要组蛋白的结合.不可能结合,因为外来的蛋白都会被降解掉.

蛋白质与DNA的关系主要有：1.DNA指导蛋白质的合成：DNA可以通过转录和翻译过程来控制蛋白质的合成。2.在真核生物细胞核中，DNA和蛋白质共同构成了染色体（或染色质）。3.DNA的复制、表达等过程需要蛋白质的参与（比如酶类）。

DNA复制过程 以原核生物DNA复制过程予以简要说明 1．DNA双螺旋的解旋 DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程 （1）单链DNA结合蛋白（single—strandedDNAbindingprotein,ssbDNA蛋白） ssbDNA蛋白是较牢固的结合在单链DNA上的蛋白质。原核生物ssbDNA蛋白与DNA结合时表现出协同效应：若第1个ssbDNA蛋白结合到DNA上去能力为1，第2个的结合能力可高达103；真核生物细胞中的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则不表现上述效应。ssbDNA蛋白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体的形式存在于复制叉处，待单链复制后才脱下来，重新循环。所以，ssbDNA蛋白只保持单链的存在，不起解旋作用。 （2）DNA解链酶（DNAhelicase） DNA解链酶能通过水解ATP获得能量以解开双链DNA。这种解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。如果双链DNA中有单链末端或切口，则DNA解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。复制时，大部分DNA解旋酶可沿滞后模板的5"—〉3"方向并随着复制叉的前进而移动，只有个别解旋酶（Rep蛋白）是沿着3"—〉5"方向移动的。故推测Rep蛋白和特定DNA解链酶是分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA。 （3）DNA解链过程 DNA在复制前不仅是双螺旋而且处于超螺旋状态，而超螺旋状态的存在是解链前的必须结构状态，参与解链的除解链酶外还有一些特定蛋白质，如大肠杆菌中的Dna蛋白等。一旦DNA局部双链解开，就必须有ssbDNA蛋白以稳定解开的单链，保证此局部不会恢复成双链。两条单链DNA复制的引发过程有所差异，但是不论是前导链还是后随链，都需要一段RNA引物用于开始子链DNA的合成。因此前导链与后随链的差别在于前者从复制起始点开始按5"—3"持续的合成下去，不形成冈崎片段，后者则随着复制叉的出现，不断合成长约2—3kb的冈崎片段。 2．冈崎片段与半不连续复制 因DNA的两条链是反向平行的，故在复制叉附近解开的DNA链，一条是5"—〉3"方向，另一条是3"—〉5"方向，两个模板极性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5"—〉3"方向，不是3"—〉5"方向，因而无法解释DNA的两条链同时进行复制的问题。为解释DNA两条链各自模板合成子链等速复制现象，日本学者冈崎（Okazaki）等人提出了DNA的半连续复制（semidiscontinuousreplication）模型。1968年冈崎用3H脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取DNA，变性后用超离心方法得到了许多3H标记的，被后人称作冈崎片段的DNA。延长标记时间后，冈崎片段可转变为成熟DNA链，因此这些片段必然是复制过程中的中间产物。另一个实验也证明DNA复制过程中首先合成较小的片段，即用DNA连接酶温度敏感突变株进行试验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量小DNA片段积累，表明DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再由连接酶链成大分子DNA。一般说，原核生物的冈崎片段比真核生物的长。深入研究还证明，前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界具有普遍性，故称为DNA双螺旋的半不连续复制。 3．复制的引发和终止 所有的DNA的复制都是从一个固定的起始点开始的，而DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，不能从头合成DNA链，新DNA的复制是如何形成的？经大量实验研究证明，DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶从RNA引物3"端开始合成新的DNA链。对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点，一直合成下去。对于后随链，引发过程较为复杂，需要多种蛋白质和酶参与。后随链的引发过程由引发体来完成。引发体由6种蛋白质构成，预引体或引体前体把这6种蛋白质结合在一起并和引发酶或引物过程酶进一步组装形成引发体。引发体似火车头一样在后随链分叉的方向前进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由RNA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶I将缺口补齐，再由DNA连接酶将每两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA.。 （四）端粒和端粒酶 1941年美籍印度人麦克林托克（McClintock）就提出了端粒(telomere)的假说，认为染色体末端必然存在一种特殊结构——端粒。现在已知染色体端粒的作用至少有二：①保护染色体末端免受损伤，使染色体保持稳定；②与核纤层相连，使染色体得以定位。 在弄清楚DNA复制过程之后，20世纪70年代科学家对DNA复制时新链5"端的RNA引物被切除后，空缺是如何被填补的提出了质疑。如不填补岂不是DNA每复制一次就短一点。以后随链复制为例，当RNA引物被切除后，冈崎片段之间是由DNA聚合酶I催化合成的DNA填补之，然后再由DNA连接酶将它们连接成一条完整的链。但是DNA聚合酶I催化合成DNA时，需要自由3"—OH作为引物，最后余下子链的5"无法填补，于是染色体就短了一点。 在正常体细胞中普遍存在着染色体酶复制一次端粒就短一次的现象。人们推测，可能一旦端粒缩短到某一阈限长度一下时，他们就会发出一个警报，指令细胞进入衰老；或许是当细胞判断出它们的染色体已变得太短了，于是分裂也就停止了，造成正常体细胞寿命有一定界限。但是在癌细胞中染色体端粒却一直维持在一定长度上，这是为什么？这是因为DNA复制后，把染色体末端短缺部分补上需要端粒酶，这是一种含有RNA的酶，它既解决了模板，又解决了引物的问题。在生殖细胞和85%癌细胞中都测出了端粒酶具有活性，但是在正常体细胞中却无活性，20世纪90年代中期，Blackburn首次在原生动物中克隆出端粒酶基因。 端粒酶在癌细胞中具有活性，它不仅使癌细胞可以不断分裂增生，而且它为癌变前的细胞或已经是癌性的细胞提供了时间，以积累附加的突变，即等于增加它们复制，侵入和最终转移的能力。同时人们也由此萌生了开发以端粒为靶的药物，即通过抑制癌细胞中端粒酶活性而达到治疗癌症的目的。 至于真核细胞DNA末端的结构特点，早就在1978年Blackburn就以原生动物四膜出（一种纤毛虫）为例说明之：①迥纹形式的发夹环；②仅由C,A组成的简单序列大量重复（C4A2）20~70；③链上有许多缺口（nicks）。

对DNA结合蛋白，又称螺旋失稳蛋白，DNA解链蛋白，单链DNA结合蛋白。是解链酶(unwinding enzyme)类中的一种类型，当DNA发生暂时性熔化时，它与DNA单链区结合而促使反应偏向单链的形成，使DNA在大大低于Tm(解链温度)的温度下发生双链的分离，双螺旋则在复制叉的前方分开，并在复制叉处稳定单链结构，阻止再形成双螺旋。http://baike.baidu.com/view/1958952.htm

DNA的复制是一个复杂的过程，需要DNA模板、合成原料——三磷酸核苷酸、酶和蛋白质等多种物质的参与。解旋酶：DNA复制涉及的第一个问题就是DNA两条链要在复制叉位置解开。DNA双螺旋并不会自动解旋，细胞中有一类特殊的蛋白质可以促使DNA在复制叉处打开，这就是解旋酶。解旋酶可以和单链DNA以及ATP结合，利用ATP分解生成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。单链DNA结合蛋白：解旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA极不稳定，很快就会重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。在细胞内有大量单链DNA结合蛋白（single strand DNA binding protein，SSB），能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对或降解。SSB结合到单链DNA上之后，使DNA呈伸展状态，有利于复制的进行。当新DNA链合成到某一位置时，该处的SSB便会脱落，可以重复利用。DNA拓扑异构酶：DNA在细胞内往往以超螺旋状态存在，DNA拓扑异构酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。DNA拓扑异构酶有两类。DNA拓扑异构酶I的作用是暂时切断一条DNA链，形成酶—DNA共价中间物，使超螺旋DNA松弛，再将切断的单链DNA连接起来，不需要任何辅助因子，如大肠杆菌的ε蛋白；DNA拓扑异构酶Ⅱ能将负超螺旋引入DNA分子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解提供能量，如大肠杆菌中的DNA旋转酶。引物酶：引物酶在复制起点处合成RNA引物，引发DNA的复制。它与RNA聚合酶的区别在于可以催化核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的聚合，而RNA聚合酶只能催化核糖核苷酸的聚合，其功能是启动DNA转录合成RNA，将遗传信息由DNA传递到RNA。DNA聚合酶：DNA聚合酶最早是在大肠杆菌中发现的，以后陆续在其他原核生物中找到。它们的共同性质是：以dNTP为前体催化DNA合成；需要模板和引物的存在；不能起始合成新的DNA链；催化dNTP加到生长中的DNA链的3′—OH末端；催化DNA合成的方向是5′→3′。DNA连接酶：DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上的缺口的酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5′?磷酸基团的末端与另一DNA链的3′—OH生成磷酸二酯键。只有两条紧邻的DNA链才能被DNA连接酶催化连接。

不对.DNA解旋有专门的DNA解旋酶,单链DNA结合蛋白只是结合单链,不能解旋.

dna复制时会招募ssb蛋白他能稳定单链结构防止复性防止被dna酶水解解链需要解链酶复制时是dnab蛋白做解链酶

我又翻出了我尘封的生物化学课本···首先。DNA聚合酶I的主要作用是切去冈崎片段5"端得引物。DNA聚合酶III是DNA复制的主要酶。然后，复制的第一步是解旋，这个没什么说的。然后复制开始前必须合成引物，所以（4）是二个。因为是滞后链，所以再2、1、3。所以，整个为54213

检测：用足迹法，又称为足印法（footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法。用于检测与特定蛋白质结合 的DNA序列的部位,可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。其原理为：DNA和蛋白质结合以后便不会被DNAase分解，在测序时便出现空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸对数目。在用酶移出与蛋白质结合的DNA后，又可测出被结合处DNA的序列。 纯化：蛋白质和dna均可用电泳方法进行分离纯化。 DNA带负电，电泳向正极移动，由于不同DNA片段的大小不同，所以电泳时移动速度不同。因此可以分离。不同的蛋白质在不同的缓冲液中所带电荷一般不同，分子质量也一般是不同的，因此利用以上两方面的差别，电泳时不同蛋白质移动方向，移动速度不同，可以彼此分开。

在细胞核中，与DNA结合的蛋白质可分为两类——组蛋白和非组蛋白。组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4中含有大量的带碱性R基氨基酸，在水溶液中带正电，它们易和DNA上带负电荷的磷酸基团相互结合。组蛋白H2A、H2B、H3、H4先和DNA结合成念珠状，当H1参与到其中时，组蛋白和DNA结合成线状的染色线。染色线在一些非组蛋白的帮助下进一步缩合成光学显微镜下可见的棒状结构——染色体。当DNA复制或者表达时，染色体会全部或部分解开，DNA暴露在染色体外。此时一些带有特殊化学结构的蛋白质就会和DNA结合。这些蛋白质也属于非组蛋白，它们中有参与DNA复制的酶、参与转录的酶或参与复制转录调控的蛋白质。其与DNA结合方式主要通过氢键或其与DNA结构相互补的空间结构和DNA特殊碱基序列结合。

染色体的主要化学成份是DNA和蛋白质构成,染色体上的蛋白质有两类：一类是低分子量的碱性蛋白即组蛋白（histones）,另一类是酸性蛋白质,即非组蛋白蛋白质（non-histone proteins） 染色体中组蛋白是富含碱性氨基酸的蛋白质,与带负电荷的双螺旋DNA结合成DNA-组蛋白复合物,因为DNA形成高级染色质结构不仅仅是自身超螺旋,还有组蛋白结合 而且组蛋白对于基因的表达调控有重要影响,属于表观遗传学的研究范畴

dna和组蛋白结合形成核小体。由几种组蛋白： 每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200 bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。这时染色质的压缩包装 比(packing ratio）为6左右，即DNA由伸展状态压缩了近6倍。200 bpDNA为平均长度；不同组织、不同类型的细胞，以及同一细胞里染色体的不同区段中，盘绕在组蛋白八聚体核心外面的DNA长度是不同的。如真菌的可以短到只有154 bp，而海胆精子的可以长达260bp，但一般的变动范围在180bp到200bp之间。在这 200bp中，146 bp是直接盘绕在组蛋白八聚体核心外面，这些DNA不易被核酸酶消化，其余的DNA是用于连接下一个核小体。连接相邻2个核小体的DNA分子上结合了另一种组蛋白H1。组蛋白H1包含了一组密切相关的蛋白质，其数量相当于核心组蛋白的一半，所以很容易从染色质中抽提出来。所有的H1被除去后 也不会影响到核小体的结构，这表明H1是位于蛋白质核心之外的。

分裂间期有丝分裂间期分为G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成后期） 三个阶段,其中G1期与G2期进行RNA（即核糖核酸）的复制与有关蛋白质的合成,S期进行DNA的复制.其中,G1期主要是染色体蛋白质和DNA解旋酶的合成,G2期主要是细胞分裂期有关酶与纺锤丝蛋白质的合成.在有丝分裂间期,染色质没有高度螺旋化形成染色体,而是以染色质的形式进行DNA（即脱氧核糖核酸）单链复制.有丝分裂间期是有丝分裂全部过程重要准备过程,是一个重要的基础工作

DNA与PRO之间的相互作用时指顺式作用和反式作用银子之间的特异识别与结合.结合PRO有自己的DNA结合结构域,靠DNA螺旋大沟中的氢键的特异识别,以非共价键与DNA识别,来执行不同的功能. 不好意思开始把问题想简单了

如图：DNA复制起始一共涉及到DnaA、DnaB、DnaC、HU、引物合成酶、单链DNA结合蛋白、RNA聚合酶、DNA旋转酶、Dam甲基化酶，一共是9种重要的酶或蛋白质，都很重要。如果是5种的话，我认为DnaA、DnaB、引物合成酶、单链DNA结合蛋白、Dam甲基化酶比较重要。功能见图

这个不是一两句话 就能说清的...我这有PPT 很详细，需要的M我1．DNA双螺旋的解旋 DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程（1）单链DNA结合蛋白（single—stranded DNA binding protein, ssbDNA蛋白） ssbDNA蛋白是较牢固的结合在单链DNA上的蛋白质。原核生物ssbDNA蛋白与DNA结合时表现出协同效应：若第1个ssbDNA蛋白结合到DNA上去能力为1，第2个的结合能力可高达103；真核生物细胞中的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则不表现上述效应。ssbDNA蛋白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体的形式存在于复制叉处，待单链复制后才脱下来，重新循环。所以，ssbDNA蛋白只保持单链的存在，不起解旋作用。（2）DNA解链酶（DNA helicase） DNA解链酶能通过水解ATP获得能量以解开双链DNA。这种解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。如果双链DNA中有单链末端或切口，则 DNA解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。复制时，大部分DNA解旋酶可沿滞后模板的5"—〉3"方向并随着复制叉的前进而移动，只有个别解旋酶（Rep蛋白）是沿着3"—〉5"方向移动的。故推测Rep蛋白和特定DNA解链酶是分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA。（3）DNA解链过程 DNA在复制前不仅是双螺旋而且处于超螺旋状态，而超螺旋状态的存在是解链前的必须结构状态，参与解链的除解链酶外还有一些特定蛋白质，如大肠杆菌中的 Dna蛋白等。一旦DNA局部双链解开，就必须有ssbDNA蛋白以稳定解开的单链，保证此局部不会恢复成双链。两条单链DNA复制的引发过程有所差异，但是不论是前导链还是后随链，都需要一段RNA引物用于开始子链DNA的合成。因此前导链与后随链的差别在于前者从复制起始点开始按5"—3"持续的合成下去，不形成冈崎片段，后者则随着复制叉的出现，不断合成长约2—3kb的冈崎片段。2．冈崎片段与半不连续复制 因DNA的两条链是反向平行的，故在复制叉附近解开的DNA链，一条是5"—〉3"方向，另一条是3"—〉5"方向，两个模板极性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5"—〉3"方向，不是3"—〉5"方向，因而无法解释DNA的两条链同时进行复制的问题。为解释DNA两条链各自模板合成子链等速复制现象，日本学者冈崎（Okazaki）等人提出了DNA的半连续复制（semidiscontinuous replication）模型。1968年冈崎用3H脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取DNA，变性后用超离心方法得到了许多3H 标记的，被后人称作冈崎片段的DNA。延长标记时间后，冈崎片段可转变为成熟DNA链，因此这些片段必然是复制过程中的中间产物。另一个实验也证明DNA 复制过程中首先合成较小的片段，即用DNA连接酶温度敏感突变株进行试验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量小DNA片段积累，表明DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再由连接酶链成大分子DNA。一般说，原核生物的冈崎片段比真核生物的长。深入研究还证明，前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界具有普遍性，故称为DNA双螺旋的半不连续复制。3．复制的引发和终止 所有的DNA的复制都是从一个固定的起始点开始的，而DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，不能从头合成DNA链，新DNA的复制是如何形成的？经大量实验研究证明，DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶从RNA引物3"端开始合成新的DNA链。对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点，一直合成下去。对于后随链，引发过程较为复杂，需要多种蛋白质和酶参与。后随链的引发过程由引发体来完成。引发体由6种蛋白质构成，预引体或引体前体把这6种蛋白质结合在一起并和引发酶或引物过程酶进一步组装形成引发体。引发体似火车头一样在后随链分叉的方向前进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶 III 作用合成DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由RNA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 将缺口补齐，再由DNA连接酶将每两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA.。

DNA和RNA相同点：1、元素相同，组成元素认为都是CHONP。2、成分相同，都含有五碳糖、磷酸。DNA和RNA不同点：1、分布不同，即DNA主要在细胞核内，RNA主要在细胞质中。2、数量不同，DNA是由两条脱氧核苷酸链组成，RNA只有一条核糖核苷酸链组成。3、它们的核糖不同，前者是脱氧核糖，后者是核糖。4、DNA是双螺旋结构，RNA是单螺旋结构的。5、结构上看，DNA是双螺旋结构，即双链，RNA则一般为单链。6、碱基的不同，前者为A、T、C、G，后者为A、U、C、G。扩展资料：所有DNA功能都取决于其与特定蛋白质的相互作用。这些相互作用可以是非特异性的，也可以是极其特异性的。还有许多可以结合DNA的酶，其中，在DNA转录和复制中复制DNA序列的聚合酶特别重要。在碱性氨基酸残基上所发生的化学修饰有甲基化、磷酸化与乙酰化等，这些化学作用可使DNA与组织蛋白之间的作用强度发生变化，进而使DNA与转录因子接触的难易度改变，影响转录作用的速率。其他位于染色体内的非专一性DNA结合蛋白，还包括一种能优先与DNA结合，并使其扭曲的高移动性群蛋白。这类蛋白质可以改变核小体的排列方式，产生更复杂的染色质结构。

作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域：①DNA结合域（DNA binding domain）,多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成；②转录激活域（activating domain）,常由30-100氨基酸残基组成,这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺。

DNA与蛋白质可以组成：染色体。不过还可以组成的是：噬菌体(DNA+蛋白质)。

研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法一、引言在许多的细胞生命活动中,例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题.重组DNA技术的发展,人们已分离到了许多重要的基因.现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性.为此需要：a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件；b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子；这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用.研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验；c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验； f、拉下实验.二、凝胶阻滞实验1、概念：凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）,要叫做DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术.2、原理：在凝胶电泳中,由于电场的作用,裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比.如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质,那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞,于是朝正极移动的距离也就相应的缩短,因而在凝胶中出现滞后的条带,这就是凝胶阻滞实验的基本原理.3、过程:1)x09首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子）2)x09用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点）3)x09这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育,于是产生DNA-蛋白质复合物4)x09在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳5)x09最后进行放射自显影,分析电泳结果4、实验结果的分析：a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部,这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；b、如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带,这就表明细胞提取物存在可与探针DNA结合的转录因子蛋白质.5、DNA竞争实验：DNA竞争实验（DNA competitive assay）的具体做法如下：在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA（competitor DNA）,如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质,那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的,这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉,而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态,可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带；如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子,结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带.6、应用：a、凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中,是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质；b、DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位；c、通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；d、也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子.三、足迹实验1、定义:足迹实验（foot-printing assay）,是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法.2、原理：当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用,而不会产生出相应的切割分子,结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区,俗称为“足迹”.3过程：将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记,并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端,于是便得到了一条单链末端标记的双链DNA在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可以）混合,形成DNA-蛋白质复合体在反应混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之达到平均每条DNA链,只发生一次磷酸二酯键的断裂：a、如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质,使DNase I消化之后,便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸,2个核苷酸,3个核苷酸------等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的连续的DNA片段梯度群体；b、如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合,被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNase I酶的降解作用；除去蛋白,加样在20%序列胶上进行电泳分离,实验分两组:a、实验组：DNA+蛋白质混合物b、对照组：只有DNA,未与蛋白质提取物进行温育最后进行放射性自显影,分析实验结果.4、结果判断:实验组凝胶电泳显示的序列,出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较,便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列.5、其他的足迹实验方法：除了DNase1足迹试验之外,目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验,例如：a、x09自由羟基足迹实验；b、菲咯啉铜足迹实验；c、DMS(硫酸二甲酯)足迹实验DMS(硫酸二甲酯)足迹实验的原理DMS能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化,而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割.如果DNA分子中某一区段同转录因子结合,就可以避免发生G残基的甲基化而免受六氢吡啶的切割作用.四、甲基化干扰实验1、概念：甲基化干扰实验（Methylation interference assay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化,而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法.应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化,对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应,从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式.2、实验步骤：用DMS处理靶DNA使之局部甲基化（平均每条DNA只发生一个G碱基甲基化作用）同细胞蛋白质提取物一起进行温育,促进使DNA与蛋白质的结合进行凝胶电泳形成两种靶DNA条带：a、x09其一没有同蛋白质结合的DNA正常电泳条带b、其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的DNA电泳条带将这两种DNA电泳条带分别从凝胶中切出,并用六氢吡啶进行切割,结果为：a、甲基化的G残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够同未发生甲基化的正常的结合位点结合,所以在转录因子DNA结合位点序列中的G残基如果被DMS甲基化之后,转录因子就无法同其结合位点（顺式元件）发生结合作用,从而使得结合位点中的G残基同样也要被六氢吡啶切割；b、不具有甲基化G残基的靶DNA 序列则不会被切割将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的DNA条带,经六氢吡啶切割作用之后,再进行凝胶电泳作放射自显影,读片并分析结果3、结果判断：a、同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列,经六氢吡啶切割之后,电泳分离呈现两条带,有一个空白区b、不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列,经六氢吡啶切割后,电泳分离呈现三条带,没有空白区域的出现.4、应用：a、甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系；b、是足迹实验的一种有效的补充手段,可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置5、缺点：DMS只能使DNA序列中的G和A残基甲基化,而不能使T和C残基甲基化.五、体内足迹实验上面讨论的三种研究转录因子与DNA相互作用的方法,有一个共同的不足之处在于它们是在体外进行的实验,因此人们就会考虑这些实验结果是否能够反映细胞内发生的真实生命过程,即细胞内发生的真实的DNA与蛋白质的相互作用情况.为了解答这个问题,科学家就设计出了一种体内足迹试验（in vivo foot-printing assay）,该方法可以看做是体外DMS足迹实验的一个变种.1、原理：体内足迹试验的原理原则上同体外DMS足迹实验无本质差别,即a、DMS能够使G残基甲基化；b、六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基；c、同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化,于是不会被六氢吡啶切割；d、同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较,就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带.2、过程：用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞,使渗透到胞内的DMS浓度恰好导致天然染色体DNA的G残基发生甲基化对这些经过DMS处理的细胞提取DNA,并在体外加入六氢吡啶作消化反应PCR扩增后作凝胶电泳分析,因为在体外实验中用的是克隆的DNA片段其数量足够,而在体内足迹实验中用的是从染色体DNA中分离获得的任何一种特异的DNA,其数量是微不足道的,所以需要经PCR扩增以获得足够数量的特异DNA放射自显影,读片并记录读片的结果3、结果判断：a、能够同转录因子蛋白质结合的DNA区段其中G残基受到保护因而不会被DMS甲基化避免了六氢吡啶的切割作用；b、体外裸露的DNA分子上,G残基被DMS甲基化而被六氢吡啶切割.六、拉下实验（Pull-down assay）拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro）,是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法.其基本原理是将某种小肽（例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等）的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组,表达为融合蛋白.分离纯化融合蛋白并与磁珠结合,使之固相化之后,再与表达目的蛋白的细胞提取物混合保温适当时间,例如在4℃下保温过夜,使目标蛋白同已经固定在磁珠表面的融合蛋白中的诱饵蛋白充分的结合.离心收集与固定化的融合蛋白（即与磁珠相互结合的融合蛋白）中的诱饵蛋白相结合的目的蛋白,经过煮沸处理使目的蛋白与诱饵蛋白相脱离从而从固相支持物（例如磁珠）上脱离下来,收集样品,再与目标蛋白的抗体作Western blotting分析,以检测出与诱饵蛋白的目标的目标蛋白.染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 　　真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在.因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径.染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法.它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息.CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系.而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用.由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用. 　　染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法.这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰.ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系.近年来,这种技术得到不断的发展和完善.采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具. 　　它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来.IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法.目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的.实验最需要注意点就是抗体的性质.抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应.建议仔细检查抗体的说明书.特别是多抗的特异性是问题.其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质.多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解.为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合.另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白.即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果.再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验.每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例.抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清.缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释. 　　ChIP的一般流程： 　　甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析. 　　在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR.但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了.此外还有一些由ChIP衍生出来的方法.例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品）.GST沉淀实验（GST-pull down实验）（细胞外蛋白质相互作用）5-11上面提到,用酵母双杂交方法筛选到的蛋白需要作进一步的鉴定.鉴定方法之一就是 GST沉淀实验.GST 沉淀实验主要是用来证明蛋白质胞外的相互作用.蛋白质在胞外的相互作用排除了酵母细胞内复杂体系的干扰,比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物理的相互作用.同酵母双杂交实验一样,运用此法也可以证明相互作用的蛋白分子中是否有参与调节作用的结构域或 motif.GSTx09沉淀实验原理就是,把你要研究的蛋白基因亚克隆到带有GST（谷胱甘肽转移酶）基因的原核表达载体中,并在细菌中表达 GST 融合蛋白（GST-X）.把 GST 融合蛋白挂到带有 GST 地物的 Sepharose beads 上,然后把另一种蛋（Y）白加入其中.由于蛋白质之间的结合作用,形成了这样的复合物：GST-X----Y.这一复合物与固体支持物（Sepharose beads）又结合在一起,可以被沉淀下来.此法又有在不同情况下的具体应用,以下一一作介绍.（1）x09GST 融合蛋白与重组蛋白的相互作用GST 融合蛋白是在原核表达的,所以没有经过过多的象真核细胞内具有的蛋白修饰作用.所以另一种用来检验相互作用的蛋白也可以用原核表达出来,也就是所谓的重组蛋白.当 GST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来,然后用重组蛋白的抗体作 Western blotting 检测.（2） GST 融合蛋白与体外 TNT 系统合成的多肽或蛋白的相互作用用来检验与GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT体外蛋白合成体系进行合成,并且还可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便于检测的标签.GST融合蛋白沉淀下来的蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽的抗体或标签抗体进行Western blotting检测.如果蛋白之间结合力非常弱,用Western blotting检测方法难以检测到,你可以在TNT体外合成时给蛋白进行同位素（S32）标记.这样沉淀下来的蛋白进行放射自显影,检测灵敏度将极大提高.（3） GST 融合蛋白与细胞内源性蛋白质的相互作用GST融合蛋白还可以把细胞提取物中有相互作用的内源性蛋白质沉淀下来.如果内源性蛋白含量低或结合力弱,可以采用脉冲法使细胞在某一段时间内合成的所有蛋白质都标记上放射性同位素（S32）,然后提取细胞总蛋白与GST融合蛋白温育.GST融合蛋白沉淀下的带有放射性标记的蛋白跑电泳,进行放射自显影.（4） GST 融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质的相互作用当内源性蛋白质含量低,并且有可能影响蛋白质的相互作用,也可以把该蛋白的基因转染到靶细胞内进行过表达,然后检验蛋白质相互作用.（5） GST 融合蛋白与待测蛋白的相互作用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关在进行 GST 沉淀实验时,有时也会遇到比较复杂的情况,具体情况具体分析,分别对待.比如,两个蛋白质之间发生相互作用时有可能与蛋白磷酸化状态有关.或者蛋白首先被磷酸化后方能产生相互作用,或者磷酸化的蛋白必需脱磷酸化后才能产生相互作用.如果你确实在你的实验中发现了其中一种情况,这将是一个非常有意义的结果.3,x09免疫共沉淀（co-immunoprecipitation ）（细胞内蛋白质相互作用）9-16免疫共沉淀技术用来证明蛋白质在胞内是否有相互作用.一般来说,两种蛋白在细胞内发生相互作用时会形成两种蛋白的复合物,这样就可以先用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来,然后用另一种蛋白的抗体进行 Western blotting 检测,看两种蛋白之间是否确实形成免疫复合物,并能与 protein A/G agarose 一起沉淀下来.免疫共沉淀原理简单,但技术极为复杂.因为细胞内蛋白种类繁多,制约因素多.如果两种蛋白之间可以发生相互作用,并不是这两种蛋白所有分子都参与结合作用,也可能只有极少部分蛋白分子结合在一起（足以满足细胞功能需要）.在提取细胞蛋白时,如果条件不当就会破坏两种相互作用蛋白形成的复合物的稳定性,使得免疫共沉淀实验失败.如果两种蛋白在细胞内的结合力确实非常弱,那么免疫共沉淀也难以成功.如果知道发生相互作用的两个蛋白都是胞核蛋白,那么可以通过提取核蛋白,再进行免疫共沉淀实验,这样会大大减低背景的干扰.关于两种蛋白质之间胞内的相互作用,有时确实无法用免疫共沉淀实验证明.（1） 细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀证明蛋白质胞内相互作用时,可以选择一个高效瞬时过表达系统（至于这一系统是否有内源性靶蛋白无关紧要）.一般采取 COS 细胞作为真核表达株.把两种蛋白基因共转染到 COS 细胞内进行表达.由于人为进行大量表达,所以在胞内两种蛋白形成相互作用的复合物的量也相应增多.如果你手头没有这两种蛋白的抗体,可以把这两种蛋白的一端分别加上标签以融合蛋白形式表达,然后用商业化的抗标签抗体进行免疫共沉淀和 Western blotting 检测.（2） 细胞内源性蛋白的免疫共沉淀把两种蛋白共转染到 COS 细胞内进行过表达,进行免疫共沉淀实验,相对容易成功,但是这一结果毕竟具有人工性,不能代表生理条件下真实的蛋白质相互作用.要想克服这一弱点,可以做内源性的免疫共沉淀实验.这一技术要求极高,难度极大,但也最有说服力.因为细胞内内源性蛋白含量低,结合在一起形成复合物的量更低,难以检测.首先要证明所选择的细胞系是否具有这两种内源性的蛋白.另外,用于免疫沉淀和 Western blotting 检测的抗体要好.细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温和,以保持蛋白复合物的天然结构.（3） 组织内蛋白的免疫共沉淀在体外可以大量培养细胞,然后制备细胞提取物,做内源性免疫共沉淀.由此可以推广到做组织内免疫共沉淀.取动物组织（脑、肝、脾等）,切碎,匀浆,提取组织蛋白,进行免疫共沉淀实验.这一结果代表活体中蛋白质相互作用.4,x09蛋白质细胞内定位实验17-22另一种经常用来检验蛋白质相互作用的方法是蛋白质细胞内定位技术.此法较为直观,可以看到两种有相互作用的蛋白质在细胞内的分布（膜上、胞浆、胞核或其它细胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞浆中某一部位或核内共定位等等）.有时相互作用的蛋白由于细胞内某种功能的需要结合在一起时,使得两种蛋白的分布发生变化.比如,某种蛋白也许在核内,当它与另一种具有穿梭功能的蛋白结合时,有可能被转运到胞浆中.这种情况的共定位则较为典型.在进行蛋白质共定位（1） 利用有色荧光蛋白标记技术进行蛋白定位研究此法也可称为活细胞定位.把两种具有相互作用的蛋白分别克隆到带有两种不同颜色荧光蛋白（绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白）的载体中,共转染到功能细胞中（一般选用 COS7 细胞）表达带有荧光的融合蛋白.这样,相互作用的两种蛋白就被标上不同的荧光,可以在细胞内用荧光显微镜直接观测.在进行精确细胞定位或共定位时,必须用共聚焦荧光显微镜观测.因为共聚焦荧光显微镜（相当于医院给病人诊断的 CT）观测的是细胞内一个切面上的颜色.如果在一个切面上在同一区域看到两种颜色,就提示这两种蛋白在该区域内有相互作用.普通荧光显微镜看到的是一个立体图象,无法确定蛋白质共定位现象.在进行定位或共定位同时,也可以对细胞核进行染色.这样,在细胞中就有三种颜色.细胞核的显色帮助你确定共定位发生的位置.上面介绍的活细胞定位,其优点是表达的荧光蛋白荧光强,没有背景,观测方便.但缺点是相互作用的蛋白由于标上荧光蛋白,实际上是两个融合蛋白.融合蛋白的定位结果或共定位结果是否与天然蛋白分布一致,有待于进一步确定.而利用免疫荧光标记技术可以避免这一缺点.（2） 利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位研究免疫荧光的原理是,首先把细胞进行固定,然后用待检测靶蛋白的抗体（一抗）与细胞内靶蛋白进行免疫反应,再用荧光素（如 FITC 和 TRITC 等）标记的二抗与一抗进行反应.这样就在细胞内形成免疫复合物（靶蛋白----一抗---二抗）,结果靶蛋白被标上颜色,然后可用共聚焦荧光显微镜观测定位与共定位结果.免疫荧光技术最大优点就是可用来检测细胞内源性蛋白的定位及相互作用.当然也可以对靶细胞进行转染表达目的蛋白,然后标记目的蛋白进行观测.免疫荧光技术的缺点是荧光相对较弱并且背景较高,结果受到干扰,所以这项技术不好掌握.为了结果的可靠性,要求严格设计阳性对照与阴性对照.（3） 细胞内蛋白动态定位有时细胞在正常状态下,有相互作用的蛋白在胞内可能暂时分开,没有共定位现象发生.但是在某一个特定情况下,如细胞受到外界刺激时,细胞本身会产生应急反应,这时暂时分离的蛋白有可能发生相互作用,并产生共定位现象.所以在进行共定位研究时,可根据具体情况具体分析,必要时观测细胞内蛋白动态定位结果.

1.DNA的转录：DNA在细胞核内，根据碱基互补配对原则，和基因的选择性表达等，转录出mRNA（信使RNA），信使RNA上携带的就是特定的DNA序列，叫做密码子，密码子对应不同的氨基酸。2.mRNA的翻译：mRNA通过核孔来到细胞质中的核糖体上，根据密码子的不同，tRNA（转运RNA）上有反密码子和携带的特定氨基酸。根据碱基互补配对的方式，tRNA和mRNA结合，那么就会有不同的氨基酸，通过脱水缩合的方式形成肽键，多个氨基酸通过肽链结合形成肽链。3.肽链：多个肽链通过高尔基体，内质网等加工，在空间上通过折叠，反转，螺旋等方式形成空间结构。从而形成具有生物活性的蛋白质。

在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。重组DNA技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要：a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件；b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子；这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验；c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验； f、拉下实验。研究蛋白质/ 核酸相互作用近期采用的新技术有：核酸适体技术、生物信息学方法、蛋白质芯片技术以及纳米技术等。凝胶阻滞实验1、概念：凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），要叫做DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。2、原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。3、过程:首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子）用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点）这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生DNA-蛋白质复合物在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳最后进行放射自显影，分析电泳结果4、实验结果的分析：a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；b、如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带，这就表明细胞提取物存在可与探针DNA结合的转录因子蛋白质。5、DNA竞争实验：DNA竞争实验（DNA competitive assay）的具体做法如下：在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA（competitor DNA），如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉，而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态，可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带；如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子，结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带。6、应用：a、凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质；b、DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位；c、通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；d、也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。DNaseI足迹实验1、定义:足迹实验（foot-printing assay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。2、原理：当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为“足迹”。3过程：将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记，并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端，于是便得到了一条单链末端标记的双链DNA在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白质复合体在反应混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之达到平均每条DNA链，只发生一次磷酸二酯键的断裂：a、如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，使DNase I消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸，2个核苷酸，3个核苷酸------等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的连续的DNA片段梯度群体；b、如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNase I酶的降解作用；除去蛋白，加样在20%序列胶上进行电泳分离，实验分两组:a、实验组：DNA+蛋白质混合物b、对照组：只有DNA，未与蛋白质提取物进行温育最后进行放射性自显影，分析实验结果。4、结果判断:实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。5、其他的足迹实验方法：除了DNase1足迹试验之外，目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验，例如：a、 自由羟基足迹实验；b、菲咯啉铜足迹实验；c、DMS(硫酸二甲酯)足迹实验DMS(硫酸二甲酯)足迹实验的原理DMS能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割。如果DNA分子中某一区段同转录因子结合，就可以避免发生G残基的甲基化而免受六氢吡啶的切割作用。甲基化干扰实验1、概念：甲基化干扰实验（Methylation interference assay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化，对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。2、实验步骤：用DMS处理靶DNA使之局部甲基化（平均每条DNA只发生一个G碱基甲基化作用）同细胞蛋白质提取物一起进行温育，促进使DNA与蛋白质的结合进行凝胶电泳形成两种靶DNA条带：a、 其一没有同蛋白质结合的DNA正常电泳条带b、其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的DNA电泳条带将这两种DNA电泳条带分别从凝胶中切出，并用六氢吡啶进行切割，结果为：a)、甲基化的G残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够同未发生甲基化的正常的结合位点结合，所以在转录因子DNA结合位点序列中的G残基如果被DMS甲基化之后，转录因子就无法同其结合位点（顺式元件）发生结合作用，从而使得结合位点中的G残基同样也要被六氢吡啶切割；b)、不具有甲基化G残基的靶DNA 序列则不会被切割将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的DNA条带，经六氢吡啶切割作用之后，再进行凝胶电泳作放射自显影，读片并分析结果3、结果判断：a、同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割之后，电泳分离呈现两条带，有一个空白区b、不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割后，电泳分离呈现三条带，没有空白区域的出现。4、应用：a、甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系；b、是足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置5、缺点：DMS只能使DNA序列中的G和A残基甲基化，而不能使T和C残基甲基化。体内足迹实验上面讨论的三种研究转录因子与DNA相互作用的方法，有一个共同的不足之处在于它们是在体外进行的实验，因此人们就会考虑这些实验结果是否能够反映细胞内发生的真实生命过程，即细胞内发生的真实的DNA与蛋白质的相互作用情况。为了解答这个问题，科学家就设计出了一种体内足迹试验（in vivo foot-printing assay），该方法可以看做是体外DMS足迹实验的一个变种。1、原理：体内足迹试验的原理原则上同体外DMS足迹实验无本质差别，即a、DMS能够使G残基甲基化；b、六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基；c、同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化，于是不会被六氢吡啶切割；d、同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较，就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带。2、过程：用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞，使渗透到胞内的DMS浓度恰好导致天然染色体DNA的G残基发生甲基化对这些经过DMS处理的细胞提取DNA，并在体外加入六氢吡啶作消化反应PCR扩增后作凝胶电泳分析，因为在体外实验中用的是克隆的DNA片段其数量足够，而在体内足迹实验中用的是从染色体DNA中分离获得的任何一种特异的DNA，其数量是微不足道的，所以需要经PCR扩增以获得足够数量的特异DNA放射自显影，读片并记录读片的结果3、结果判断：a、能够同转录因子蛋白质结合的DNA区段其中G残基受到保护因而不会被DMS甲基化避免了六氢吡啶的切割作用；b、体外裸露的DNA分子上，G残基被DMS甲基化而被六氢吡啶切割。拉下实验（Pull-down assay）拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。其基本原理是将某种小肽（例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等）的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组，表达为融合蛋白。分离纯化融合蛋白并与磁珠结合，使之固相化之后，再与表达目的蛋白的细胞提取物混合保温适当时间，例如在4℃下保温过夜，使目标蛋白同已经固定在磁珠表面的融合蛋白中的诱饵蛋白充分的结合。离心收集与固定化的融合蛋白（即与磁珠相互结合的融合蛋白）中的诱饵蛋白相结合的目的蛋白，经过煮沸处理使目的蛋白与诱饵蛋白相脱离从而从固相支持物（例如磁珠）上脱离下来，收集样品，再与目标蛋白的抗体作Western blotting分析，以检测出与诱饵蛋白的目标的目标蛋白。一些新的研究蛋白质/ 核酸相互作用的方法和技术，主要从核酸适体技术、生物信息学方法、蛋白质芯片技术以及纳米技术等方面进行综述。核酸适体技术核酸适体(aptamer)指的是经过一种新的体外筛选技术——指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸，可以是RNA 也可以是DNA，长度一般为25~60 个核苷酸。SELEX 的筛选流程首先是利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有1014~1015 个单链寡核苷酸序列的随机文库，序列长度往往在25~35 个核苷酸之间，单链的随机寡核苷酸序列容易形成可与蛋白质等配体特异性共价结合的二级结构，在这一高亲和力特异性结合的基础之上配体蛋白质同随机文库相互作用，选择性分离出核酸适体后，然后通过PCR或RT-PCR 等技术进行扩增。次一级文库再与配体蛋白质相互作用，反复多次循环，即可获得与配体蛋白质特异性高亲和力结合的核酸适体。核酸适体与配体间的亲合力(解离常数在皮摩和纳摩之间)常要强于抗原抗体之间的亲合力[3]。核酸适体所结合的靶分子范围非常广泛，除蛋白质之外，还能作用于酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞黏附分子、植物凝集素、完整的病毒颗粒、病原菌等[4]。适体从20 世纪90 年代初出现以后，就得到了科研工作者的广泛关注，适体的研究工作得到了快速的发展。SELEX 筛选技术和核酸适体的高亲和性在蛋白质/ 核酸相互作用的研究中发挥了重要的作用。Wen等[5]研究了同细菌噬菌体Ff 基因5蛋白(g5p) 高亲和力结合的核酸适体，发现G 富集基序对于形成g5p 连接启动子结构，提供实际的g5p 连接位点具有重要的意义。White 等[6]利用SELEX 技术研究了一种PUM2HD (短小杆菌素同源结构域)及其RNA 核酸适体，发现在PUM2 氨基端有Ser和Glu/Ala富集区，并且PEB ( PUM2 连接元件)与果蝇反应元件的3"端具有亲缘关系，但又互不相同。Bouvent等[7]利用NRE(核仁蛋白识别元件) 发现了RNA 茎环上的RBD1 和RBD2 (折叠元件结构域)，这对了解模式蛋白识别RNA 的结构过程具有重要意义。核酸适体以及SELEX 技术给蛋白质/ 核酸相互作用研究提供了一种新颖的研究方法，科研人员可以控制筛选条件得到与待研究蛋白质相互结合的核酸适体，避免了天然条件下研究蛋白质/ 核酸相互作用的困难性。但目前对核酸适体与靶蛋白相互作用的分析是在筛选条件与天然条件相同的假设基础上进行的，在这种筛选条件下得到的核酸适体与蛋白质之间的相互作用，和天然状态下的蛋白质/ 核酸之间的相互作用到底有何异同，这是一个亟待解决的问题，此问题的解决必将推动蛋白质/ 核酸相互作用的研究进展。生物信息学方法生物信息学是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。它包含着生物信息的获取、处理、存储、分配、分析和解释的所有方面。具体地说，生物信息学是用数理和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈现指数增长的生物学数据的一门学科。Luscombe和Thornton[8]利用氨基酸序列的保守性构建计算机算法来预测蛋白质/DNA复合体中DNA的结合位点。Selvaraj等[9]将蛋白质/核酸复合体中原子电荷势能作为训练数据集，利用人工智能技术来预测蛋白质对DNA 的识别位点。Ahmad 等[10]将蛋白质的序列组成、可溶解性以及二级结构等信息数据用人工神经网络算法进行训练，构建了在线蛋白质/ 核酸结合预测技术，预测成功率达到了69%。此后Ahmad 和Sarai[11]将此技术进一步加强，在训练人工神经网络时加入了蛋白质进化关系的信息，使预测成功率提高了8.7%。目前建立在蛋白质/ 核酸相互作用基础上的较重要的数据库为蛋白质- 核酸识别数据库(http://gibk26.bse.kyutech.ac.jp/jouhou/3dinsight/recognition.html)，利用该数据库能帮助研究者了解核酸被蛋白质识别的机制。该数据库包括以下几个组成部分。2.1　蛋白质-核酸复合物数据库　蛋白质-核酸复合物数据库是一个包含蛋白质- 核酸复合物结构数据的数据库。这些数据根据蛋白质的识别序列和复合物中DNA 形式进行分类。使用者可以通过关键词、识别序列、D N A 形式等进行搜索，并且搜索结果可以直接链接到3DinSight数据库(在此处，可以通过三维结构浏览器，如RasMol 或者VRML 查看含有序列位点和突变位点的三维结构图)。该数据库也能让使用者检测依赖于序列的构象参数和DNA 的柔韧性，并以图表形式显示结果。2.2　核苷酸-氨基酸相互作用数据库　核苷酸-氨基酸相互作用数据库搜集核苷酸和氨基酸间4 埃大小内的成对原子，能让使用者找到成对的核苷酸和氨基酸。使用者可以指定残基名称( 核苷酸或氨基酸)、原子类型和侧链/ 骨干。搜索后，带有距离值的所有原子对将被显示。搜索可直接链接到3DinSight 数据库，以RasMol 图片形式自动地突出展示复合物结构中所有原子对。使用者可以检测到每个结构中核苷酸和氨基酸的特别相互作用。2.3　蛋白质-核酸相互作用的热力学数据库(ProNIT)蛋白质- 核酸相互作用的热力学数据库包含有序列、结构和一些热力学参量(如分裂常数、结合常数、吉布斯自由能的转换、焓和热容量、活性)等信息。该数据库允许使用者用不同条件(多种分类和显示选项)搜索数据。此外，ProNIT 超链接于其他重要的数据库，如PDB、核酸数据库NDB 、酶代码EC、蛋白质信息资源PIR 和ProTherm 等等。当前，在分子生物学和信息科学快速发展的影响下，生物信息学已经成为生物领域的指导科学，利用生物信息学方法研究蛋白质/核酸相互作用可以大大缩短研究工作的时间，达到事半功倍的效果。但受限于当前计算科学和算法领域的发展情况，生物信息学得到的结果与实际的结果还存在一定的偏差，仍需开展进一步的实验工作来进行验证。生物芯片技术　生物芯片技术是基于生物大分子间相互作用的大规模并行分析方法，使得生命科学研究中所涉及的样品反应、检测、分析等过程得以连续化、集成化和微型化，现已成为当今生命科学研究领域发展最快的技术之一。目前的生物芯片主要有核酸芯片、蛋白质芯片和糖体芯片等几大类。蛋白质芯片是依靠手工、压印或喷墨的方法将探针蛋白点样在化学膜、凝胶、微孔板或玻片上形成阵列，经过与样品的杂交捕获靶蛋白，再用原子力显微镜、磷光成像仪、光密度仪或激光共聚焦扫描仪进行检测，获得靶蛋白表达的种类、数量及关联等信息。蛋白质芯片已经广泛用于研究蛋白质与核酸的相互作用，已成为一种进行高通量蛋白质与DNA 或RNA作用筛选的有效方法。Ge[12]运用蛋白质芯片检测蛋白质与核酸相互作用，他将包括通用转录因子、激活蛋白和辅激活蛋白在内的48种纯化蛋白质点样在硝酸纤维素膜制成通用蛋白质芯片，用腺病毒主要晚期启动子64 bp 双链DNA 片段、腺病毒主要晚期启动子64 bp 负链DNA 和SV40 早期前体mRNA 杂交，结果证明蛋白质芯片上的所有蛋白质都能够不同程度地特异性识别和结合双链和单链寡核苷酸片段，并且结合双链DNA 和单链DNA 的总体模式基本相同，说明大多数D N A 结合蛋白既能和双链DNA 结合，也能够和单链DNA 结合。蛋白质芯片与RNA 的作用研究表明，蛋白质芯片能够成功地分析RNA 与蛋白质间的识别性结合。蛋白质芯片技术最大优点在于快速和高通量，以往科研人员作研究时一次只能研究少量生物样品，借助蛋白质芯片，一次实验可同时研究大量生物样本，加速了蛋白质/ 核酸相互作用的研究。蛋白质芯片技术目前存在的问题有：(1)蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的变化便可能引起最后结果的不同，实验条件不易控制，使得实验结果的可重复性相对不足；(2) 目前用于蛋白质芯片制备的固相介质，如化学膜、凝胶和玻片都存在一些缺点，蛋白质在固相基质表面的固定往往会造成其解折叠，从而失去生物活性；(3)对结果的扫描、去除背景、数据处理等，目前还不能做得很完美，会导致假阳性、假阴性的存在。纳米技术纳米技术(nano scale technology) 是一门在0.1~100nm 空间尺度内操纵原子和分子，对材料进行加工、制造具有特定功能的产品、或对某物质进行研究，掌握其原子和分子的运动规律和特性的崭新高技术学科。核酸和蛋白质等生物大分子的大小也是在纳米尺度，随着科学技术的快速发展，越来越多的纳米技术被用来研究生物大分子。在蛋白质/ 核酸相互作用的研究工作中，目前使用较新的技术是利用纳米孔技术来进行研究。纳米孔(nanopore)，可以简单地定义为内径为1~100nm 的微小洞孔，一般孔径应大于洞孔深度，或者处于同一量级。如果孔的深度远大于孔径，就称之为纳米孔道。纳米孔有天然存在的生物纳米孔，也有人工加工的纳米孔。它们都可以用来进行生命科学的相关研究，但是，理想的生物化学或生物物理研究应采用孔径稳定、坚固耐用、物化性能良好的固体纳米孔，这样的纳米孔应该由质地坚硬的固体薄膜材料加工制作。Li等[16]利用聚焦离子束(FIB)制作纳米孔，利用纳米孔将双螺旋DNA 从组蛋白八聚体上剥离下来，并探测这一过程，从而可以揭示核小体中包含的许多生物化学、物理信息。这是由于处于电场中的核小体在电场的作用下，DNA 分子穿越纳米孔，同时由于纳米孔的阻挡力，使组蛋白不能穿越，从而诱使DNA 从组蛋白八聚体上分离下来。通过准确检测DNA 分子穿孔过程中引起的电流阻塞效应，可将DNA 与组蛋白的相互作用的一些性质反映出来。目前已经取得了阶段性的成果。在纳米尺度上研究核酸与蛋白质相互作用，相较于其他的研究方法，优点是能够在生物活性环境中，保持生物大分子受到最少化学修饰干扰的状态下，对生物大分子的空间结构、动态变化、生化特性等进行直接研究。相信该技术可以提供更多、更详细的生物大分子相互作用、蛋白质功能等方面的信息，帮助我们解决一些深层次的生物学疑难问题。目前阻碍此方法广泛应用的一个最大难题是如何在纳米尺度上更好的操纵生物大分子，这需要生物科学、电子科学、材料科学等多学科的共同进展来推动此方法的发展和应用。

DNA复制过程 以原核生物DNA复制过程予以简要说明 1．DNA双螺旋的解旋 DNA在复制时,其双链首先解开,形成复制叉,而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程 （1）单链DNA结合蛋白（single—stranded DNA binding protein, ssbDNA蛋白） ssbDNA蛋白是较牢固的结合在单链DNA上的蛋白质.原核生物ssbDNA蛋白与DNA结合时表现出协同效应：若第1个ssbDNA蛋白结合到DNA上去能力为1,第2个的结合能力可高达103；真核生物细胞中的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则不表现上述效应.ssbDNA蛋白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构,它以四聚体的形式存在于复制叉处,待单链复制后才脱下来,重新循环.所以,ssbDNA蛋白只保持单链的存在,不起解旋作用. （2）DNA解链酶（DNA helicase） DNA解链酶能通过水解ATP获得能量以解开双链DNA.这种解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在.如果双链DNA中有单链末端或切口,则 DNA解链酶可以首先结合在这一部分,然后逐步向双链方向移动.复制时,大部分DNA解旋酶可沿滞后模板的5"—〉3"方向并随着复制叉的前进而移动,只有个别解旋酶（Rep蛋白）是沿着3"—〉5"方向移动的.故推测Rep蛋白和特定DNA解链酶是分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA. （3）DNA解链过程 DNA在复制前不仅是双螺旋而且处于超螺旋状态,而超螺旋状态的存在是解链前的必须结构状态,参与解链的除解链酶外还有一些特定蛋白质,如大肠杆菌中的 Dna蛋白等.一旦DNA局部双链解开,就必须有ssbDNA蛋白以稳定解开的单链,保证此局部不会恢复成双链.两条单链DNA复制的引发过程有所差异,但是不论是前导链还是后随链,都需要一段RNA引物用于开始子链DNA的合成.因此前导链与后随链的差别在于前者从复制起始点开始按5"—3"持续的合成下去,不形成冈崎片段,后者则随着复制叉的出现,不断合成长约2—3kb的冈崎片段. 2．冈崎片段与半不连续复制 因DNA的两条链是反向平行的,故在复制叉附近解开的DNA链,一条是5"—〉3"方向,另一条是3"—〉5"方向,两个模板极性不同.所有已知DNA聚合酶合成方向均是5"—〉3"方向,不是3"—〉5"方向,因而无法解释DNA的两条链同时进行复制的问题.为解释DNA两条链各自模板合成子链等速复制现象,日本学者冈崎（Okazaki）等人提出了DNA的半连续复制（semidiscontinuous replication）模型.1968年冈崎用3H脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌,提取DNA,变性后用超离心方法得到了许多3H 标记的,被后人称作冈崎片段的DNA.延长标记时间后,冈崎片段可转变为成熟DNA链,因此这些片段必然是复制过程中的中间产物.另一个实验也证明DNA 复制过程中首先合成较小的片段,即用DNA连接酶温度敏感突变株进行试验,在连接酶不起作用的温度下,便有大量小DNA片段积累,表明DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段,然后再由连接酶链成大分子DNA.一般说,原核生物的冈崎片段比真核生物的长.深入研究还证明,前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界具有普遍性,故称为DNA双螺旋的半不连续复制. 3．复制的引发和终止 所有的DNA的复制都是从一个固定的起始点开始的,而DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链,不能从头合成DNA链,新DNA的复制是如何形成的?经大量实验研究证明,DNA复制时,往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物,再由聚合酶从RNA引物3"端开始合成新的DNA链.对于前导链来说,这一引发过程比较简单,只要有一段RNA引物,DNA聚合酶就能以此为起点,一直合成下去.对于后随链,引发过程较为复杂,需要多种蛋白质和酶参与.后随链的引发过程由引发体来完成.引发体由6种蛋白质构成,预引体或引体前体把这6种蛋白质结合在一起并和引发酶或引物过程酶进一步组装形成引发体.引发体似火车头一样在后随链分叉的方向前进,并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNA短链,再由DNA聚合酶 III 作用合成DNA,直至遇到下一个引物或冈崎片段为止.由RNA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 将缺口补齐,再由DNA连接酶将每两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA.. （四）端粒和端粒酶 1941年美籍印度人麦克林托克（Mc Clintock）就提出了端粒(telomere)的假说,认为染色体末端必然存在一种特殊结构——端粒.现在已知染色体端粒的作用至少有二：① 保护染色体末端免受损伤,使染色体保持稳定；② 与核纤层相连,使染色体得以定位. 在弄清楚DNA复制过程之后,20世纪70年代科学家对DNA复制时新链5"端的RNA引物被切除后,空缺是如何被填补的提出了质疑.如不填补岂不是 DNA每复制一次就短一点.以后随链复制为例,当RNA引物被切除后,冈崎片段之间是由DNA聚合酶 I 催化合成的DNA填补之,然后再由DNA连接酶将它们连接成一条完整的链.但是DNA聚合酶 I 催化合成DNA时,需要自由3"—OH作为引物,最后余下子链的5"无法填补,于是染色体就短了一点. 在正常体细胞中普遍存在着染色体酶复制一次端粒就短一次的现象.人们推测,可能一旦端粒缩短到某一阈限长度一下时,他们就会发出一个警报,指令细胞进入衰老；或许是当细胞判断出它们的染色体已变得太短了,于是分裂也就停止了,造成正常体细胞寿命有一定界限.但是在癌细胞中染色体端粒却一直维持在一定长度上,这是为什么?这是因为DNA复制后,把染色体末端短缺部分补上需要端粒酶,这是一种含有RNA的酶,它既解决了模板,又解决了引物的问题.在生殖细胞和85%癌细胞中都测出了端粒酶具有活性,但是在正常体细胞中却无活性,20世纪90年代中期,Blackburn首次在原生动物中克隆出端粒酶基因. 端粒酶在癌细胞中具有活性,它不仅使癌细胞可以不断分裂增生,而且它为癌变前的细胞或已经是癌性的细胞提供了时间,以积累附加的突变,即等于增加它们复制,侵入和最终转移的能力.同时人们也由此萌生了开发以端粒为靶的药物,即通过抑制癌细胞中端粒酶活性而达到治疗癌症的目的. 至于真核细胞DNA末端的结构特点,早就在1978年Blackburn就以原生动物四膜出（一种纤毛虫）为例说明之：① 迥纹形式的发夹环；② 仅由C,A组成的简单序列大量重复（C4A2）20~70；③ 链上有许多缺口（nicks）.

好问题。组蛋白带有很多的Lys和Arg，这两种氨基酸有碱性侧链，他们带的正电可以有效与DNA的负电中和，因此组蛋白可以和DNA双螺旋紧密结合。其他的原因包括DNA和组蛋白之间的氢键、疏水作用等。更详细的内容可以看第六版《Molecular Biology of the Cell》的190页前后，图文并茂并且内容比这里更详尽。

不太正确，DNA分子与蛋白质分子缠绕结合在一起在分裂间期是以染色质（呈细丝状）存在于细胞核；而在分裂期才是以染色体（呈棒状，由染色质高度螺旋形成，属同种物质）存在细胞质（此时无细胞核）。

蛋白质结合到DNA上可能因为，稳定蛋白质，比如组蛋白和DNA结合，长链通过不断卷曲等形成密集的结构，还有相互作用，比如DNA的复制需要酶的作用，酶结合到DNA上，解链酶，聚合酶，连接酶等。

dna复制时单链结合蛋白是否是必须的单链结合蛋白（SSB，single strand DNA-binding protein）：又称DNA结合蛋白，是DNA复制所必须酶。DNA解旋后，DNA分子只要碱基配对，就有结合成双链的趋向。SSB结合于螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生的单链区，防止新形成的单链DNA重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解的蛋白质。ssb作用时表现协同效应，保证SSB在下游区段的继续结合。它不像聚合酶那样沿着复制方向向前移动，而是不停的结合，脱离。

组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4等,这些蛋白质固定地与DNA结合,与DNA一起形成染色体； 非组蛋白：DNA聚合酶、RNA聚合酶、解旋酶、调节基因表达的蛋白质等,这些蛋白质只在特定情况下才与DNA结合,功能执行完毕就会和DNA分开.

核小体是组成染色体的基本结构单位，它是由8个组蛋白分子组成的八聚体和外绕1.75圈DNA组成的。在相邻的两个核小体之间，有长约50～60个碱基对的DNA连接线。在相邻的连接线之间结合着一个第5种组蛋白（H1）的分子。密集成串的核小体形成了核质中的100埃左右的纤维，这就是染色体的“一级结构”。在这里，DNA分子大约被压缩了7倍。 染色体的一级结构经螺旋化形成中空的线状体，称为螺线体或核丝，这是染色体的“二级结构”，其外径约300埃，内径100埃，相邻螺旋间距为110埃。螺丝体的每一周螺旋包括6个核小体，因此DNA的长度在这个等级上又被再压缩了6倍。 300埃左右的螺线体（二级结构）再进一步螺旋化，形成直径为0.4微米（μm）的筒状体，称为超螺旋体。这就是染色体的“三级结构”。到这里，DNA又再被压缩了40倍。超螺旋体进一步折叠盘绕后，形成染色单体—染色体的“四级结构”。两条染色单体组成一条染色体。到这里，DNA的长度又再被压缩了5倍。从染色体的一级结构到四级结构，DNA分子一共被压缩了 7×6×40×5=8400倍。例如，人的染色体中DNA分子伸展开来的长度平均约为几个厘米，而染色体被压缩到只有几微米长。

研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法一、引言 在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。重组DNA技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要：a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件；b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子；这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验；c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验； f、拉下实验。二、凝胶阻滞实验1、概念： 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），要叫做DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。2、原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。3、过程:1) 首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子）2) 用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点）3) 这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生DNA-蛋白质复合物4) 在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳5) 最后进行放射自显影，分析电泳结果4、实验结果的分析： a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；b、如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带，这就表明细胞提取物存在可与探针DNA结合的转录因子蛋白质。5、DNA竞争实验：DNA竞争实验（DNA competitive assay）的具体做法如下：在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA（competitor DNA），如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉，而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态，可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带；如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子，结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带。6、应用： a、凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质； b、DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位； c、通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响； d、也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。三、足迹实验1、定义:足迹实验（foot-printing assay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。2、原理： 当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为“足迹”。3过程： 将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记，并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端，于是便得到了一条单链末端标记的双链DNA在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白质复合体在反应混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之达到平均每条DNA链，只发生一次磷酸二酯键的断裂：a、如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，使DNase I消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸，2个核苷酸，3个核苷酸------等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的连续的DNA片段梯度群体；b、如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNase I酶的降解作用；除去蛋白，加样在20%序列胶上进行电泳分离，实验分两组:a、实验组：DNA+蛋白质混合物b、对照组：只有DNA，未与蛋白质提取物进行温育最后进行放射性自显影，分析实验结果。4、结果判断:实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。5、其他的足迹实验方法：除了DNase1足迹试验之外，目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验，例如：a、 自由羟基足迹实验；b、菲咯啉铜足迹实验；c、DMS(硫酸二甲酯)足迹实验DMS(硫酸二甲酯)足迹实验的原理DMS能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割。如果DNA分子中某一区段同转录因子结合，就可以避免发生G残基的甲基化而免受六氢吡啶的切割作用。四、甲基化干扰实验1、概念：甲基化干扰实验（Methylation interference assay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化，对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。2、实验步骤： 用DMS处理靶DNA使之局部甲基化（平均每条DNA只发生一个G碱基甲基化作用） 同细胞蛋白质提取物一起进行温育，促进使DNA与蛋白质的结合 进行凝胶电泳形成两种靶DNA条带：a、 其一没有同蛋白质结合的DNA正常电泳条带b、其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的DNA电泳条带将这两种DNA电泳条带分别从凝胶中切出，并用六氢吡啶进行切割，结果为： a、甲基化的G残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够同未发生甲基化的正常的结合位点结合，所以在转录因子DNA结合位点序列中的G残基如果被DMS甲基化之后，转录因子就无法同其结合位点（顺式元件）发生结合作用，从而使得结合位点中的G残基同样也要被六氢吡啶切割； b、不具有甲基化G残基的靶DNA 序列则不会被切割 将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的DNA条带，经六氢吡啶切割作用之后，再进行凝胶电泳 作放射自显影，读片并分析结果3、结果判断： a、同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割之后，电泳分离呈现两条带，有一个空白区 b、不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割后，电泳分离呈现三条带，没有空白区域的出现。4、应用： a、甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系； b、是足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置5、缺点： DMS只能使DNA序列中的G和A残基甲基化，而不能使T和C残基甲基化。五、体内足迹实验上面讨论的三种研究转录因子与DNA相互作用的方法，有一个共同的不足之处在于它们是在体外进行的实验，因此人们就会考虑这些实验结果是否能够反映细胞内发生的真实生命过程，即细胞内发生的真实的DNA与蛋白质的相互作用情况。为了解答这个问题，科学家就设计出了一种体内足迹试验（in vivo foot-printing assay），该方法可以看做是体外DMS足迹实验的一个变种。1、原理： 体内足迹试验的原理原则上同体外DMS足迹实验无本质差别，即 a、DMS能够使G残基甲基化； b、六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基； c、同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化，于是不会被六氢吡啶切割； d、同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较，就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带。2、过程： 用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞，使渗透到胞内的DMS浓度恰好导致天然染色体DNA的G残基发生甲基化 对这些经过DMS处理的细胞提取DNA，并在体外加入六氢吡啶作消化反应 PCR扩增后作凝胶电泳分析，因为在体外实验中用的是克隆的DNA片段其数量足够，而在体内足迹实验中用的是从染色体DNA中分离获得的任何一种特异的DNA，其数量是微不足道的，所以需要经PCR扩增以获得足够数量的特异DNA 放射自显影，读片并记录读片的结果3、结果判断： a、能够同转录因子蛋白质结合的DNA区段其中G残基受到保护因而不会被DMS甲基化避免了六氢吡啶的切割作用； b、体外裸露的DNA分子上，G残基被DMS甲基化而被六氢吡啶切割。六、拉下实验（Pull-down assay） 拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。其基本原理是将某种小肽（例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等）的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组，表达为融合蛋白。分离纯化融合蛋白并与磁珠结合，使之固相化之后，再与表达目的蛋白的细胞提取物混合保温适当时间，例如在4℃下保温过夜，使目标蛋白同已经固定在磁珠表面的融合蛋白中的诱饵蛋白充分的结合。离心收集与固定化的融合蛋白（即与磁珠相互结合的融合蛋白）中的诱饵蛋白相结合的目的蛋白，经过煮沸处理使目的蛋白与诱饵蛋白相脱离从而从固相支持物（例如磁珠）上脱离下来，收集样品，再与目标蛋白的抗体作Western blotting分析，以检测出与诱饵蛋白的目标的目标蛋白。染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 　　真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 　　染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。 　　它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。 　　ChIP的一般流程： 　　甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。 　　在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。GST沉淀实验（GST-pull down实验）（细胞外蛋白质相互作用）5-11上面提到，用酵母双杂交方法筛选到的蛋白需要作进一步的鉴定。鉴定方法之一就是 GST沉淀实验。GST 沉淀实验主要是用来证明蛋白质胞外的相互作用。蛋白质在胞外的相互作用排除了酵母细胞内复杂体系的干扰，，比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物理的相互作用。同酵母双杂交实验一样，运用此法也可以证明相互作用的蛋白分子中是否有参与调节作用的结构域或 motif。GST 沉淀实验原理就是，把你要研究的蛋白基因亚克隆到带有GST（谷胱甘肽转移酶）基因的原核表达载体中，并在细菌中表达 GST 融合蛋白（GST-X）。把 GST 融合蛋白挂到带有 GST 地物的 Sepharose beads 上，然后把另一种蛋（Y）白加入其中。由于蛋白质之间的结合作用，形成了这样的复合物：GST-X----Y。这一复合物与固体支持物（Sepharose beads）又结合在一起，可以被沉淀下来。此法又有在不同情况下的具体应用，以下一一作介绍。（1） GST 融合蛋白与重组蛋白的相互作用GST 融合蛋白是在原核表达的，所以没有经过过多的象真核细胞内具有的蛋白修饰作用。所以另一种用来检验相互作用的蛋白也可以用原核表达出来，也就是所谓的重组蛋白。当 GST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来，然后用重组蛋白的抗体作 Western blotting 检测。（2） GST 融合蛋白与体外 TNT 系统合成的多肽或蛋白的相互作用用来检验与GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT体外蛋白合成体系进行合成，并且还可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便于检测的标签。GST融合蛋白沉淀下来的蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽的抗体或标签抗体进行Western blotting检测。如果蛋白之间结合力非常弱，用Western blotting检测方法难以检测到，你可以在TNT体外合成时给蛋白进行同位素（S32）标记。这样沉淀下来的蛋白进行放射自显影，检测灵敏度将极大提高。（3） GST 融合蛋白与细胞内源性蛋白质的相互作用 GST融合蛋白还可以把细胞提取物中有相互作用的内源性蛋白质沉淀下来。如果内源性蛋白含量低或结合力弱，可以采用脉冲法使细胞在某一段时间内合成的所有蛋白质都标记上放射性同位素（S32），然后提取细胞总蛋白与GST融合蛋白温育。GST融合蛋白沉淀下的带有放射性标记的蛋白跑电泳，进行放射自显影。（4） GST 融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质的相互作用当内源性蛋白质含量低，并且有可能影响蛋白质的相互作用，也可以把该蛋白的基因转染到靶细胞内进行过表达，然后检验蛋白质相互作用。（5） GST 融合蛋白与待测蛋白的相互作用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关在进行 GST 沉淀实验时，有时也会遇到比较复杂的情况，具体情况具体分析，分别对待。比如，两个蛋白质之间发生相互作用时有可能与蛋白磷酸化状态有关。或者蛋白首先被磷酸化后方能产生相互作用，或者磷酸化的蛋白必需脱磷酸化后才能产生相互作用。如果你确实在你的实验中发现了其中一种情况，这将是一个非常有意义的结果。3， 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation ）（细胞内蛋白质相互作用）9-16免疫共沉淀技术用来证明蛋白质在胞内是否有相互作用。一般来说，两种蛋白在细胞内发生相互作用时会形成两种蛋白的复合物，这样就可以先用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来，然后用另一种蛋白的抗体进行 Western blotting 检测，看两种蛋白之间是否确实形成免疫复合物，并能与 protein A/G agarose 一起沉淀下来。免疫共沉淀原理简单，但技术极为复杂。因为细胞内蛋白种类繁多，制约因素多。如果两种蛋白之间可以发生相互作用，并不是这两种蛋白所有分子都参与结合作用，也可能只有极少部分蛋白分子结合在一起（足以满足细胞功能需要）。在提取细胞蛋白时，如果条件不当就会破坏两种相互作用蛋白形成的复合物的稳定性，使得免疫共沉淀实验失败。如果两种蛋白在细胞内的结合力确实非常弱，那么免疫共沉淀也难以成功。如果知道发生相互作用的两个蛋白都是胞核蛋白，那么可以通过提取核蛋白，再进行免疫共沉淀实验，这样会大大减低背景的干扰。关于两种蛋白质之间胞内的相互作用，有时确实无法用免疫共沉淀实验证明。（1） 细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀证明蛋白质胞内相互作用时，可以选择一个高效瞬时过表达系统（至于这一系统是否有内源性靶蛋白无关紧要）。一般采取 COS 细胞作为真核表达株。把两种蛋白基因共转染到 COS 细胞内进行表达。由于人为进行大量表达，所以在胞内两种蛋白形成相互作用的复合物的量也相应增多。如果你手头没有这两种蛋白的抗体，可以把这两种蛋白的一端分别加上标签以融合蛋白形式表达，然后用商业化的抗标签抗体进行免疫共沉淀和 Western blotting 检测。（2） 细胞内源性蛋白的免疫共沉淀把两种蛋白共转染到 COS 细胞内进行过表达，进行免疫共沉淀实验，相对容易成功，但是这一结果毕竟具有人工性，不能代表生理条件下真实的蛋白质相互作用。要想克服这一弱点，可以做内源性的免疫共沉淀实验。这一技术要求极高，难度极大，但也最有说服力。因为细胞内内源性蛋白含量低，结合在一起形成复合物的量更低，难以检测。首先要证明所选择的细胞系是否具有这两种内源性的蛋白。另外，用于免疫沉淀和 Western blotting 检测的抗体要好。细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温和，以保持蛋白复合物的天然结构。（3） 组织内蛋白的免疫共沉淀在体外可以大量培养细胞，然后制备细胞提取物，做内源性免疫共沉淀。由此可以推广到做组织内免疫共沉淀。取动物组织（脑、肝、脾等），切碎，匀浆，提取组织蛋白，进行免疫共沉淀实验。这一结果代表活体中蛋白质相互作用。4， 蛋白质细胞内定位实验17-22另一种经常用来检验蛋白质相互作用的方法是蛋白质细胞内定位技术。此法较为直观，可以看到两种有相互作用的蛋白质在细胞内的分布（膜上、胞浆、胞核或其它细胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞浆中某一部位或核内共定位等等）。有时相互作用的蛋白由于细胞内某种功能的需要结合在一起时，使得两种蛋白的分布发生变化。比如，某种蛋白也许在核内，当它与另一种具有穿梭功能的蛋白结合时，有可能被转运到胞浆中。这种情况的共定位则较为典型。在进行蛋白质共定位（1） 利用有色荧光蛋白标记技术进行蛋白定位研究此法也可称为活细胞定位。把两种具有相互作用的蛋白分别克隆到带有两种不同颜色荧光蛋白（绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白）的载体中，共转染到功能细胞中（一般选用 COS7 细胞）表达带有荧光的融合蛋白。这样，相互作用的两种蛋白就被标上不同的荧光，可以在细胞内用荧光显微镜直接观测。在进行精确细胞定位或共定位时，必须用共聚焦荧光显微镜观测。因为共聚焦荧光显微镜（相当于医院给病人诊断的 CT）观测的是细胞内一个切面上的颜色。如果在一个切面上在同一区域看到两种颜色，就提示这两种蛋白在该区域内有相互作用。普通荧光显微镜看到的是一个立体图象，无法确定蛋白质共定位现象。在进行定位或共定位同时，也可以对细胞核进行染色。这样，在细胞中就有三种颜色。细胞核的显色帮助你确定共定位发生的位置。上面介绍的活细胞定位，其优点是表达的荧光蛋白荧光强，没有背景，观测方便。但缺点是相互作用的蛋白由于标上荧光蛋白，实际上是两个融合蛋白。融合蛋白的定位结果或共定位结果是否与天然蛋白分布一致，有待于进一步确定。而利用免疫荧光标记技术可以避免这一缺点。（2） 利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位研究免疫荧光的原理是，首先把细胞进行固定，然后用待检测靶蛋白的抗体（一抗）与细胞内靶蛋白进行免疫反应，再用荧光素（如 FITC 和 TRITC 等）标记的二抗与一抗进行反应。这样就在细胞内形成免疫复合物（靶蛋白----一抗---二抗），结果靶蛋白被标上颜色，然后可用共聚焦荧光显微镜观测定位与共定位结果。免疫荧光技术最大优点就是可用来检测细胞内源性蛋白的定位及相互作用。当然也可以对靶细胞进行转染表达目的蛋白，然后标记目的蛋白进行观测。免疫荧光技术的缺点是荧光相对较弱并且背景较高，结果受到干扰，所以这项技术不好掌握。为了结果的可靠性，要求严格设计阳性对照与阴性对照。（3） 细胞内蛋白动态定位有时细胞在正常状态下，有相互作用的蛋白在胞内可能暂时分开，没有共定位现象发生。但是在某一个特定情况下，如细胞受到外界刺激时，细胞本身会产生应急反应，这时暂时分离的蛋白有可能发生相互作用，并产生共定位现象。所以在进行共定位研究时，可根据具体情况具体分析，必要时观测细胞内蛋白动态定位结果。

用足迹法就可以！ 又称为足印法（footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法。用于检测与特定蛋白质结合 的DNA序列的部位,可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。其原理为：DNA和蛋白质结合以后便不会被DNAase分解，在测序时便出现空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸对数目。在用酶移出与蛋白质结合的DNA后，又可测出被结合处DNA的序列。

组蛋白（histones）为基础的DNA相关蛋白，其分子量介于11.2～21.5KDa之间，其作用为稳定DNA双链，也可能在基因调节中起作用。组蛋白可分为五种：H1、H2A、H2B、H3和H4，这五种组蛋白类型都有各自对应的自身抗体。组蛋白与DNA一起形成了紧密结合的核小体。其中心由H3-H3-H4-H4四聚体组成，H2A-H2B二聚体位于其两侧。组蛋白部分被DNA双链围绕两圈(共146个碱基对)。核小体象一串珍珠一样结合在一起，在结合区，DNA（连接DNA）与组蛋白H1相连接。荧光模式与抗dsDNA抗体相似，抗组蛋白抗体在HEp-2细胞的细胞核中也呈现均质型荧光。分裂期细胞的浓缩染色体荧光增强。用灵长类肝组织，则可见到细胞核为均质型、有时为粗块状荧光。抗组蛋白抗体不引起绿蝇短膜虫动基质产生荧光。还可选用欧蒙抗组蛋白ELISA试剂盒对抗组蛋白抗体进行单特异性测定。

　　参与复制主要的酶和蛋白质因子介绍如下：　　(1)DNA聚合酶：①原核细胞：以大肠杆菌为例，已发现DNA聚合酶Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ，都是多功能酶，既有5"→3"聚合酶活性，又有3"→5"外切酶活性，DNA聚合酶Ⅰ还有5"→3"外切酶活性。DNA聚合酶Ⅰ的主要功能是修复DNA的损伤，在复制中还能切除RNA引物并填补留下的空隙。DNA聚合酶Ⅱ的作用是损伤修复。DNA聚合酶Ⅲ是DNA的复制酶。新近研究发现的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ，它们涉及DNA的错误倾向修复。　　②真核细胞：DNA聚合酶α，β，γ，δ和ε，其中DNA聚合酶α和δ真正具有合成新链的复制作用；β和ε参与DNA的损伤修复，γ负责线粒体DNA的复制。　　(2)引物合成酶和引发体：引物合成酶又称引发酶，催化RNA引物的合成，该酶作用时需与另外的蛋白结合形成引发体才具有催化活性。　　(3)DNA连接酶：催化双链DNA一条链上切口处相邻5"-磷酸基和3"-羟基生成磷酸二酯键的酶。连接酶作用的过程中，在原核细胞中以NAD+提供能量，在真核细胞中以ATP提供能量。　　(4)DNA解螺旋酶：催化：DNA双螺旋解链的酶。　　(5)DNA单链结合蛋白(SSB)：与DNA分开的单链结合，起稳定DNA的单链、阻止复性和保护单链不被核酸酶降解的作用。　　(6)拓扑异构酶Ⅰ：消除DNA的负超螺旋，改变DNA的超螺旋数。　　(7)拓扑异构酶Ⅱ：引入负超螺旋，消除复制叉前进带来的扭曲张力。

单链DNA结合蛋白（Single-stranded DNA-binding protein，缩写SSB或SSBP）又称单链结合蛋白，是专门负责与DNA单链区域结合的一种蛋白质，为DNA复制、重组和修复所必需的成分。

染色体由DNA和蛋白质构成的，一般说蛋白质和DNA结合的产物都是指染色体，而原核细胞只有DNA没有染色体的。真核细胞有染色体。

推测一个蛋白A调控一些相关基因b，能够做哪些实验证明(1)蛋白质磷酸化后分子量变大.设计实验：空白组（阴性对照）,蛋白质A基因敲除,western blot检验蛋白B；实验组,对蛋白质A进行RNA干扰,干扰前后分别进行western,也针对B；阳性对照,AB同时表达,对B做western.同时利用磷酸化抗体定性检测B的磷酸化情况.(2)由于可以磷酸化的氨基酸只有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸,所以修饰位点主要围绕这三种氨基酸的位置来进行.1、对可能磷酸化的位点进行点突变,比较突变前后的迁移率.2、分段表达蛋白质B,然后检测蛋白质A+/-的条件下做western,详见（1）.3、利用几种已知磷酸化位点的蛋白激酶对B进行磷酸化实验,相当于利用磷酸化过程把潜在的磷酸化位点孩窢粉喝莠估疯台弗郡屏蔽,方法类似于1.

核小体是组成染色体的基本结构单位,它是由8个组蛋白分子组成的八聚体和外绕1.75圈DNA组成的.在相邻的两个核小体之间,有长约50～60个碱基对的DNA连接线.在相邻的连接线之间结合着一个第5种组蛋白（H1）的分子.密集成串的核小体形成了核质中的100埃左右的纤维,这就是染色体的“一级结构”.在这里,DNA分子大约被压缩了7倍. 染色体的一级结构经螺旋化形成中空的线状体,称为螺线体或核丝,这是染色体的“二级结构”,其外径约300埃,内径100埃,相邻螺旋间距为110埃.螺丝体的每一周螺旋包括6个核小体,因此DNA的长度在这个等级上又被再压缩了6倍. 300埃左右的螺线体（二级结构）再进一步螺旋化,形成直径为0.4微米（μm）的筒状体,称为超螺旋体.这就是染色体的“三级结构”.到这里,DNA又再被压缩了40倍.超螺旋体进一步折叠盘绕后,形成染色单体—染色体的“四级结构”.两条染色单体组成一条染色体.到这里,DNA的长度又再被压缩了5倍.从染色体的一级结构到四级结构,DNA分子一共被压缩了 7×6×40×5=8400倍.例如,人的染色体中DNA分子伸展开来的长度平均约为几个厘米,而染色体被压缩到只有几微米长.

DNA是遗传物质，而蛋白质是具体功能的执行者。但是在体外，DNA是没有任何生理功能的。DNA的出现，必需要有很多的配套“设备（蛋白质）”也随之出现才有用。换个说法就是DNA本身没有生物活性，需要蛋白质才能体现它的作用！

　　参与复制主要的酶和蛋白质因子介绍如下：　　(1)DNA聚合酶：①原核细胞：以大肠杆菌为例，已发现DNA聚合酶Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ，都是多功能酶，既有5"→3"聚合酶活性，又有3"→5"外切酶活性，DNA聚合酶Ⅰ还有5"→3"外切酶活性。DNA聚合酶Ⅰ的主要功能是修复DNA的损伤，在复制中还能切除RNA引物并填补留下的空隙。DNA聚合酶Ⅱ的作用是损伤修复。DNA聚合酶Ⅲ是DNA的复制酶。新近研究发现的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ，它们涉及DNA的错误倾向修复。　　②真核细胞：DNA聚合酶α，β，γ，δ和ε，其中DNA聚合酶α和δ真正具有合成新链的复制作用；β和ε参与DNA的损伤修复，γ负责线粒体DNA的复制。　　(2)引物合成酶和引发体：引物合成酶又称引发酶，催化RNA引物的合成，该酶作用时需与另外的蛋白结合形成引发体才具有催化活性。　　(3)DNA连接酶：催化双链DNA一条链上切口处相邻5"-磷酸基和3"-羟基生成磷酸二酯键的酶。连接酶作用的过程中，在原核细胞中以NAD+提供能量，在真核细胞中以ATP提供能量。　　(4)DNA解螺旋酶：催化：DNA双螺旋解链的酶。　　(5)DNA单链结合蛋白(SSB)：与DNA分开的单链结合，起稳定DNA的单链、阻止复性和保护单链不被核酸酶降解的作用。　　(6)拓扑异构酶Ⅰ：消除DNA的负超螺旋，改变DNA的超螺旋数。　　(7)拓扑异构酶Ⅱ：引入负超螺旋，消除复制叉前进带来的扭曲张力。

主要有以下这五种：1.螺旋-环-螺旋2.螺旋-转角-螺旋3.亮氨酸拉链4.锌指结构5.HMG框

如图：DNA复制起始一共涉及到DnaA、DnaB、DnaC、HU、引物合成酶、单链DNA结合蛋白、RNA聚合酶、DNA旋转酶、Dam甲基化酶,一共是9种重要的酶或蛋白质,都很重要. 如果是5种的话,我认为DnaA、DnaB、引物合成酶、单链DNA结合蛋白、Dam甲基化酶比较重要.功能见图

称为单链DNA结合蛋白（SSB，single strand DNA-binding protein）定义：结合于螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生的单链区，防止新形成的单链DNA重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解的蛋白质，称为单链DNA结合蛋白。

DNA序列特异性结合蛋白一般在小沟里识别和结合DNA。（） A.正确 B.错误 正确答案：B

锌指zinc finger 指的只是一个空间结构。每个蛋白的氨基酸序列不同，所以能结合的DNA或者RNA的部位也不一样。这是转录因子结合DNA的基础。这句话应该理解为：大部分的转录因子（DNA结合蛋白）都含有锌指。在于DNA结合的时候，确实是α-螺旋能镶嵌于DNA的大沟中。但是并不是说含有锌指的蛋白都能结合DNA或者RNA。有一大类蛋白（受体蛋白）也含有这个结构，但是不结合DNA。

前两句错了。　　第一句：生物的细胞壁都可以被纤维素酶和果胶分解掉。　　植物细胞的细胞壁可以被这两种酶分解掉，但细菌的细胞壁是肽聚糖，需溶菌酶才能分解掉。　　第二句：叶绿体中的dna与蛋白质结合形成染色体。　　叶绿体中的dna是裸露的，没有与蛋白质结合形成染色体。　　第三句：促甲状腺素只能与甲状腺细胞接触，是由于甲状腺细胞具有特定的膜蛋白质。　　对。

相互依存，相互调节，共同作用。1，蛋白质的合成信息来源于DNA；2，DNA的组装，复制和转录离不开各种酶，即蛋白质；3，染色质由DNA和蛋白质共同构成，遗传信息的储存、复制、表达和调控都依赖于这两种生物大分子的相互作用；

应该是DnaA蛋白吧？参与DNA复制的起始，DNA复制的第一步是，DnaA蛋白与复制起始位点9bp重复序列结合，由于DnaA是ATP结合蛋白，它水解ATP释放的能量促使DNA双链在13bp重复序列去解开，促使单链结合蛋白SSB与DNA单链区结合。

在细胞核中，与DNA结合的蛋白质可分为两类——组蛋白和非组蛋白。组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4中含有大量的带碱性R基氨基酸，在水溶液中带正电，它们易和DNA上带负电荷的磷酸基团相互结合。组蛋白H2A、H2B、H3、H4先和DNA结合成念珠状，当H1参与到其中时，组蛋白和DNA结合成线状的染色线。染色线在一些非组蛋白的帮助下进一步缩合成光学显微镜下可见的棒状结构——染色体。当DNA复制或者表达时，染色体会全部或部分解开，DNA暴露在染色体外。此时一些带有特殊化学结构的蛋白质就会和DNA结合。这些蛋白质也属于非组蛋白，它们中有参与DNA复制的酶、参与转录的酶或参与复制转录调控的蛋白质。其与DNA结合方式主要通过氢键或其与DNA结构相互补的空间结构和DNA特殊碱基序列结合。

螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA不会长久存在，会很快重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。然而，在细胞内有大量单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein SSBP)能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。SSBP与螺旋酶不一样，它不具备酶的活性，不和ATP结合。在大肠杆菌细胞中主要SSBP是177肽所组成的四聚体，可以和单链DNA上相瓴的32个核苷酸结合。一个SSBP四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSBP四聚体现相邻的单链DNA结合，这个过程称为协同结合(cooperative binding)，SSBP结合到单链DNA上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链DNA作为模板。SSBP可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSBP便会脱落，并被重复利用。

蛋白能结合到DNA上是因为这类DNA结合蛋白具有序列及结构上的特征能够与DNA结合有相互作用。而这些特征如今也被用来作DNA蛋白结合域的预测。目前只有几千个DNA-蛋白复合物的结构解析出来（protein data bank，PDB），而在真核生物中，预测约有6-7%的基因编码的蛋白是DNA结合蛋白，也就是通过序列和结构预测的方法得到的。

核小体是组成染色体的基本结构单位,它是由8个组蛋白分子组成的八聚体和外绕1.75圈DNA组成的.在相邻的两个核小体之间,有长约50～60个碱基对的DNA连接线.在相邻的连接线之间结合着一个第5种组蛋白（H1）的分子.密集成串的核小体形成了核质中的100埃左右的纤维,这就是染色体的“一级结构”.在这里,DNA分子大约被压缩了7倍. 染色体的一级结构经螺旋化形成中空的线状体,称为螺线体或核丝,这是染色体的“二级结构”,其外径约300埃,内径100埃,相邻螺旋间距为110埃.螺丝体的每一周螺旋包括6个核小体,因此DNA的长度在这个等级上又被再压缩了6倍. 300埃左右的螺线体（二级结构）再进一步螺旋化,形成直径为0.4微米（μm）的筒状体,称为超螺旋体.这就是染色体的“三级结构”.到这里,DNA又再被压缩了40倍.超螺旋体进一步折叠盘绕后,形成染色单体—染色体的“四级结构”.两条染色单体组成一条染色体.到这里,DNA的长度又再被压缩了5倍.从染色体的一级结构到四级结构,DNA分子一共被压缩了 7×6×40×5=8400倍.例如,人的染色体中DNA分子伸展开来的长度平均约为几个厘米,而染色体被压缩到只有几微米长.

请问你是问的DNA和蛋白质之间的关系还是DNA和蛋白质之间相互作用的方式？如果是前者，参看楼上。如果是后者，那么最明显的例子是转录因子。转录因子在细胞质中成为成熟蛋白之后，被转运到细胞核中，形成有功能的蛋白质三级结构，转录因子具有DNA结合结构域和转录激活结构域，DNA结合结构域具有亮氨酸拉链，螺旋-环-螺旋，等等5种主要结构，并依靠这些三级结构，与目的DNA片段识别和结合，这一段DNA片段一般是基因的启动子区，在依靠转录激活结构域，促进RNA聚合酶III的活性，促进转录进行，启动下游基因表达。

就DNA本身来说,它的物质组成是脱氧核糖核酸,无蛋白质. 但是当DNA以染色质丝或染色体形态存在于生物体中时,会有与之结合的蛋白质,称为DNA结合蛋白.有的帮助DNA形成染色体的基本结构,比如核小体组蛋白使DNA缠绕于其上形成核小体（图）,这一类称为组蛋白；有的于DNA的一部分序列结合,控制DNA的表达,这一类称为非组蛋白. 所以可以说DNA上有蛋白质,蛋白质对DNA的表达有调控作用,并与DNA共同形成更高级的空间结构. 希望讲清楚了,不懂再追问吧~

为DNA蛋白质之一种，是与单链DNA有强的亲和性，与DNA复制、遗传的重组等DNA代谢有关的蛋白质。也称螺旋不稳定蛋白质（helix destabili－zing protein），又称解DNA旋卷蛋白质（DNAuntwisting protein）。此蛋白质与单链DNA协同（cooperative）结合，其结合与DNA碱基的排列是非特异性的。此蛋白质结合的DNA使DNA多聚酶的活性增高，并促进重组过程。单链DNA结合蛋白质在生物界广泛存在，B．Alberts等最早发现了噬菌体T4基因32形成的这种蛋白质。以后从细菌、霉菌、两栖类和哺乳类等细胞中也有分离出来。

锌指结构一种常出现在DNA结合蛋白中的一种结构基元。是由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn2+构成，形成的结构像手指状。锌指结构指的是在很多蛋白中存在的一类具有指状结构的结构域，这些具有锌指结构的蛋白大多都是与基因表达的调控有关的功能蛋白。锌指结构的共同特征是通过肽链中氨基酸残基的特征集团与Zn2+的结合来稳定一种很短的，可自我折叠成“手指”形状的的多肽空间构型。亮氨酸拉链出现地DNA结合蛋白质和其它蛋白质中的一种结构基元。当来自同一个或不同多肽链的两个两用性的α-螺旋的疏水面（常常含有亮氨酸残基）相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构时就形成了亮氨酸拉链。

DNA与蛋白质结合遵循碱基互补配对原则。