基因

这是部很牛的片子《千钧一发》是1997年美国科幻电影，《Gattaca》由伊桑霍克、乌玛瑟曼、裘德洛主演。讲述了在不久的未来，通过基因工程加工出生的人才是正常人，而自然分娩的孩子则被视同“病人”。文森特就是这样一个病人，而他的弟弟安东则是正常人。但文森特却非常想参加由遗传精英组成的戛塔卡公司，因为那样才能参加前往迪坦星的太空旅行。他用因事故导致瘫痪的天才杰罗姆的血样和尿样报名参选，还赢得搭档艾琳的爱情。但一起凶杀案差点让文森特前功尽弃。事实澄清后，文森特的“缺憾”还是被艾琳知道了。但爱情的力量使艾琳原谅了他，文森特终于飞上了浩翰的太空。

基因诊断（gene diagnosis）是以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。它是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断技术，它的诞生与发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展。　　常用基因诊断技术：　　一、Southern印迹法（Southern blot）　　基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。　　当含有特定基因片段已原位转移到膜上后，即可与同位素标记了的探针进行杂交，并将杂交的信号显示出来。杂交通常在塑料袋中进行，袋内放置上述杂交滤膜，加入含有变性后探针的杂交溶液后，在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针。杂交后，洗去膜上的未组合的探针，将Ⅹ线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。　　二、聚合酶链反应　　近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。　　三、扩增片段长度多态性　　小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析.　　四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法　　当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.　　PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。　　五、单链构象多态性诊断法　　单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。

需要按照实际需求去选择，没有哪个最好的说法，合适的就是最好的常用基因诊断技术：一、Southern印迹法（Southern blot）基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。当含有特定基因片段已原位转移到膜上后，即可与同位素标记了的探针进行杂交，并将杂交的信号显示出来。杂交通常在塑料袋中进行，袋内放置上述杂交滤膜，加入含有变性后探针的杂交溶液后，在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针。杂交后，洗去膜上的未组合的探针，将Ⅹ线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。二、聚合酶链反应近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。三、扩增片段长度多态性小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析.四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。五、单链构象多态性诊断法单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。

人类基因组：指人体dna分子所携带的全部遗传信息。由24条双链的dna分子组成（包括1~22号染色体dna与x、y染色体dna），上边有30亿个碱基对，30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。30亿个碱基对，太庞大了，无法精确的告知你序列是什么样的。但可以告诉你：人类基因组计划：1、概念：是指分析测定人类基因组的核苷酸序列。2、主要内容：绘制人类基因组的四张图，即遗传图、物理图、序列图和转录图。绘制这四张图好比是建立一个“人体地图”，沿着地图中一个个路标，如“遗传标记”、“物理标记”等，可以一步步地找到每一个基因，搞清楚每一个基因的核苷酸序列。3、进展：2000年6月26日，6国科学家向世界宣布：“人类基因组草图”的绘制工作已经全部完成。预计到2003年，“人类基因组精图”的绘制工作也将全部完成。4、意义：（1）对于各种疾病，尤其是各种遗传病的诊断、治疗具有划时代的意义；（有利于疾病的诊断和治疗。）（2）对于进一步了解基因表达的调控机制、细胞的生长、分化和个体发育的机制，以及生物的进化等也具有重要的意义；（有利于研究基因的表达和调控机制）；（有利于研究生物的进化。）（3）将推动生物高新技术的发展，并产生巨大的经济效益。（有利于培育优良的动植物品种）。另外，美国奎格u2022文特研究所和多伦多儿童医院以及加州大学的研究者日前公布了奎格u2022文特本人的基因组序列，这是世界上第一次公布单个个体二倍体的基因组序列，初步分析报告发表在最新一期的《plos生物学》上。

　　李宝键教授在“展望21世纪的生命科学”一文中谈到基因组研究计划研究重要性时，引用《Scinence》上“第三次技术命革”中的一句话：“下一个传大时代将是基因组革命时代，它正处于初期阶段。”在当前的研究水平上，只要涉及生命体重要现象的课题，几乎离不开对基因及其作用的分析。2000年6月26日，英美两国首脑会同公私两大人基因组测序集团向世人正式宣告，人基因组的工作草图已绘制完成。科学家把这作为生命科学进入新时代的标志，即后基因组时代(post-genome era)。因此有必要对基因组及其研究内容和进展作一个了解。　　1基因组学及其研究内容ue004　　基因组(GENOME)一词是1920年Winkles从GENes和chromosOMEs组成的，用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构，标志分子生物学的诞生，随着各学科的发展，当前生物学研究进入新的进代，在生物大分子水平上将不同的研究技术和手段有机的结合以攻克生物学难题。ue004　　基因组研究可以理解为：(1)基因表达概况研究，即比较不同组织和不同发育阶段、正常状态与疾病状态，以及体外培养的细胞中基因表达模式的差异，技术包括传统的RTPCR，RNase保护试验，RNA印迹杂交，但是其不足是一次只能做一个。新的高通量表达分析方法包括微点阵(microarrary)，基因表达序列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)，DNA芯片(DNA chip)等；(2)基因产物-蛋白质功能研究，包括单个基因的蛋白质体外表达方法，以及蛋白质组研究；(3)蛋白质与蛋白质相互作用的研究，利用酵母双杂交系统，单杂交系统(one-hybrid sys　tem)，三杂交系统(thrdee-hybrid system)以及反向杂交系统(reverse hybrid system)等。　　1986年美国科学家Thomas Roderick提出了基因组学(Genomics)，指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱)，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。因此，基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc　tural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。随着1990年人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的实施并取得巨大成就，同时模式生物(model organisms)基因组计划也在进行，并先后完成了几个物种的序列分析，研究重心从开始揭示生命的所有遗传信息转移到从分子整体水平对功能的研究上。第一个标志是功能基因组学的产生，第二个标志是蛋白质组学(proteome)的兴起。　　2 结构基因组学研究内容ue004　　结构基因组学(structural genomics)是基因组学的一个重要组成部分和研究领域，它是一门通过基因作图、核苷酸序列分析确定基因组成、基因定位的科学。遗传信息在染色体上，但染色体不能直接用来测序，必须将基因组这一巨大的研究对象进行分解，使之成为较易操作的小的结构区域，这个过程就是基因作图。根据使用的标志和手段不同，作图有三种类型，即构建生物体基因组高分辨率的遗传图谱、物理图谱、转录图谱。　　2.1遗传图谱　　通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。绘制遗传连锁图的方法有很多，但是在DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)；80年代后出现的有STR(短串联重复序列，又称微卫星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷酸的多态性)分析。　　2.2物理图谱　　物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离［碱基对(bp)或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)的图谱。以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂交，使每隔100kb就有一个标志；二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：首先是构建数百kb的YAC(酵母人工染色体)，对YAC进行作图，得到重叠的YAC连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个kb的DNA片段水平上进行，将YAC随机切割后装入粘粒的作图称为高精度物理作图.　　2.3转录图谱ue004　　利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱被称为转录图谱。通过从cDNA文库中随机条区的克隆进行测序所获得的部分 cDNA的5＇或3＇端序列称为表达序列标签(EST)　，一般长300～500bp左右。一般说，mRNA的3＇ 端非翻译区(3＇-UTR)是代表每个基因的比较特异的序列，将对应于3＇-UTR的EST序列进行RH定位，即可构成由基因组成的STS图。截止到1998年12月底，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中分布的植物EST的数目总和已达几万条，所测定的人基因组的EST达180万条以上。这些EST不仅为基因组遗传图谱的构建提供了大量的分子标记，而且来自不同组织和器官的EST也为基因的功能研究提供了有价值的信息。此外，EST计划还为基因的鉴定提供了候选基因(cand　idantes)。其不足之处在于通过随机测序有时难以获得那些低丰度表达的基因和那些在特殊环境条件下(如生物胁迫和非生物胁迫)诱导表达的基因。因此，为了弥补EST计划的不足，必须开展基因组测序。通过分析基因组序列能够获得基因组结构的完整信息，如基因在染色体上的排列顺序，基因间的间隔区结构，启动子的结构以及内含子的分布等。　　3功能基因组学研究ue004　　功能基因组学(functional genomics)又往往被称为后基因组学(postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析，cDNA微阵列，DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异，因此需要建立模式生物体。　　比较基因组学(Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。目前从模式生物基因组研究中得出一些规律：模式生物基因组一般比较小，但编码基因的比例较高，重复顺序和非编码顺序较少；其G+C%比较高；内含子和外显子的结构组织比较保守，剪切位点在多种生物中一致；DNA 冗余，即重复；绝大多数的核心生物功能由相当数量的orthologous蛋白承担；Synteny连锁的同源基因在不同的基因组中有相同的连锁关系等。模式生物基因组研究揭示了人类疾病基因的功能，利用基因顺序上的同源性克隆人类疾病基因，利用模式生物实验系统上的优越性，在人类基因组研究中的应用比较作图分析复杂性状，加深对基因组结构的认识。 此外，可利用诱变技术测定未知基因，基因组多样性以及生物信息学（Bioinformatics）的应用。　　4蛋白质组学研究　　基因是遗传信息的携带者，而全部生物功能的执行者却是蛋白质，它有自身的活动规律，因而仅仅从基因的角度来研究是远远不够的，必须研究由基因转录和翻译出蛋白质的过程，才能真正揭示生命的活动规律，由此产生了研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科—　—蛋白质组学（proteomics）。蛋白质组（proteome）是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams于1994首先提出，并见于1995年7月的“Electrophonesis”上，指全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式，是一个基因、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分，蛋白质组学是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。它从蛋白质水平上探索蛋白质作用模式、功能机理、调节控制以及蛋白质群体内相互作用，为临床诊断、病理研究、药物筛选、药物开发、新陈代谢途径等提供理论依据和基础。ue004 蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，内容包括鉴定蛋白质表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作用方式等。它不同于传统的蛋白质学科，是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动来揭示生命规律。但由于蛋白质具有多样性和可变性，复杂性，低表达蛋白质难以检测等，应该明确其研究的艰难性。总体上研究可以分为两个方面：对蛋白质表达模式（或蛋白质组成）研究，对蛋白质功能模式（目前集中在蛋白质相互作用网络关系）研究。对蛋白质组研究可以提供如下信息：从基因序列预测的基因产物是否以及何时被翻译；基因产物的相对浓度；翻译后被修饰的程度等。由于蛋白质数目小于基因组中开放阅读框（ORF, open reading frame）数目，因此提出功能蛋白质组学（functional proteomics），功能蛋白质指在特定时间、特定环境和试验条件下基因组活跃表达的蛋白质，只是总蛋白质组的一部分。功能蛋白质组学研究是位于对个别蛋白质的传统蛋白质研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质研究之间的层次，是细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质。ue004　　对蛋白质组成分析鉴定，要求对蛋白质进行表征化，即分离、鉴定图谱化，包括两个步骤：蛋白质分离和鉴定。双向凝胶电泳（2-DGE）和质谱（MS）是主要的技术。近年来，有关技术和生物信息学在不断并迅速开发和发展中。蛋白质组研究技术体系包括：样品制备；双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-D PAGE）；蛋白质的染色；凝胶图像分析；蛋白质分析；蛋白质组数据库。其中三大关键是：双向凝胶电泳技术、质谱鉴定、计算机图像数据处理与蛋白质数据库。　　5与基因组学相关学科诞生ue004　　随着基因组学研究的不断深入，人类有望揭示生命物质世界的各种前所未知的规律，完全揭开生命之谜，进而驾驶生命，使之为人类的社会经济服务。基因组研究和其它学科研究交叉，促进一些学科诞生，如营养基因组学（nutritional genomics），环境基因组学（environmental genomics），药物基因组学（phamarcogenomics），病理基因组学（pathogenomics），生殖基因组学(reproductive genomics)，群体基因组学(population genomics)等。其中，生物信息学正成为备受关注的新型产业的支撑点。ue004　　生物信息学是以生物大分子为研究，以计算机为工具，运用数学和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象、组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门科学。研究重点体现在基因组学和蛋白质两个方面。首先是研究遗传物质的载体DNA及其编码的大分子量物质，以计算机为工具，研究各种学科交叉的生物信息学的方法，找出其规律性，进而发展出适合它的各种软件，对逐步增长的DNA 和蛋白质的序列和结构进行收集、整理、发布、提取、加工、分析和发现。由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。其关注的研究热点包括：序列对比，基因识别和DNA序列分析，蛋白质结构预测，分子进化，数据库中知识发现（Knowledge Discovery in Database, KDD）。这一领域的重大科学问题有：继续进行数据库的建立和优化；研究数据库的新理论、新技术、新软件；进行若干重要算法的比较分析；进行人类基因组的信息结构分析；从生物信息数据出发开展遗传密码起源和生物进化研究；培养生物信息专业人员，建立国家生物医学数据库和服务系统［5］。20世纪末生物学数据的大量积累将导致新的理论发现或重大科学发现。生物信息学是基于数据库与知识发现的研究，对生命科学带来革命性的变化，对医药、卫生、食品、农业等产业产生巨大的影响。　　邹承鲁教授在谈论21世纪的生命科学时讲到，生物学在20世纪已取得巨大的发展，数理科学广泛而又深刻地深入生物学的结果在新的高度上揭示了生命的奥妙，全面改变了生物学的面貌。生物学不仅是当前自然科学发展的热点，进入21世纪后将仍然如此。科学家称21世纪是信息时代。生物科学和信息科学结合，无疑是多个学科发展的必然结果。

基因组（GENOME）一词是1920年Winkles从GENes和chromosOEs铸成的，用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念（解涛等，2000）。1953年Watson和Crick发现DNA 双螺旋结构，标志分子生物学的诞生，随着各学科的发展，当前生物学研究进入新的时代，在生物大分子水平上将不同的研究技术和手段有机的结合以攻克生物学难题。基因组可以理解为：一，基因表达概况研究，即比较不同组织和不同发育阶段、正常状态与疾病状态，以及体外培养的细胞中基因表达模式的差异，技术包括传统的RT-PCR，Rnase保护试验，RNA印迹杂交。但是其不足是一次只能做一个，新的高通量表达分析方法包括微点阵（Microarrary），基因表达序列分析（serial analysis of gene expression, SAGE），DNA芯片（DNA chip）等；二，基因产物-蛋白质功能研究，包括单个基因的蛋白质体外表达方法，主要是利用DNA 重组技术，以及蛋白质组研究；三，蛋白质与蛋白质相互作用的研究，利用酵母双杂交系统，单杂交系统（one-hybrid system），三杂交系统(three-hybrid system)以及反向杂交系统(reverse hybrid system). 1986年美国科学家Thomas Roderick提出了基因组学（Genomics），指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学（李伟等，2000）。因此，基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学（structural genomics）和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学（functional genomics)，又被称为后基因组（postgenome）研究（李子银等，2000）。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息相同地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法及统计计算机分析为特征。（参考资料：http://www.newcorn.com.cn/lunwen/jiyinzuxue-duan.htm

随着后基因组计划的进行，近年来已衍生出许多新的名词和概念，对它们的领会有助于我们更好地理解今后该领域的进展。1、功能基因组学是基因组时代的核心和焦点。其所要解决的问题包括如何识别基因组组成元素及注释重要元素的功能。已经知道，蛋白质是生命状态的直接体现。与低等生物不同的是，人类基因序列中只有约5%的序列是编码区（指导合成蛋白质），这部分基因组元素被称为"开放阅读框架（ORF）"，预测所有ORF并研究其产物功能是当前功能基因组学的首要任务；另95%以上的序列是基因的调控序列，这部分元素被称作非编码区，其中有很多是具有生物学功能意义的片段，对于了解各相关基因之间的调控关系非常重要，因此，对非编码区的功能研究将是功能基因组学的下一步研究热点。以下一些概念有的是在进行功能基因组学研究的过程中所运用的方法和技术。2、生物信息学人类和各种模式生物的基因组序列汇成如潮水般的DNA信息量。利用这些生物学数据和计算机技术，对这些基因组资料进行大规模比较，寻找其最大相似性（同源性），或搜索序列上的局部特征，或研究由同一个祖先基因特化而来的对应基因，或用进化分析方法，从而能够鉴定和预测未知的ORF或非编码区各元件的生物学功能。方法包括最大序列相似性搜索和序列摸体搜索、进化印迹搜索等。3、比较基因组学基因组的各个基因及其产物之间互相关联，互相作用。对同一物种不同个体的基因组进行比较，以及对不同物种的基因组进行比较，不仅可以揭示生命的起源、进化等重大生物学问题，还具有潜在的实用价值。例如通过细菌和人类的基因组比较研究，有可能筛选出只在细菌中存在的基因，成为新的抗菌素的药靶。4、结构基因组学即借助计算机技术，模拟出未知基因的蛋白质产物的立体结构，从而根据结构与功能的关系进行预测，还可以深入探求蛋白质为何具有特定的生物学功能。结构类识别的方法包括晶体衍射法、"穿线"法、三维模体搜索法等。目前蛋白质数据库每年可得到2000-3000个蛋白质的数据。5、蛋白质组学蛋白质随发育阶段、特定组织甚至所处环境的变迁而变化，反映了蛋白质后加工等作用，蕴藏着巨大的动态的生命活动信息量。基因序列分析难以处理的没有任何可比较序列的"孤儿"基因，有望从蛋白质组的表达变化规律中找到其生物学功能的线索，进而揭示出其在整个功能网络中的地位。蛋白质组的核心技术包括质谱分析技术。6、整体生物学是后基因组学研究的高层次发展。孤立研究某个基因组成分或其产物的功能常常难以说明问题，必须确定其在生物学功能网络上的地位，例如将其纳入生化途径中才能体现其完整的生物学功能。在这方面，国外已经建立了大肠杆菌等5种基因组全序列已测定的微生物的20种氨基酸的代谢图谱。7、DNA芯片这里是指包被在固相载体上的用于DNA高密度微点阵杂交技术。它是微电子学和分子生物学结合产生的新技术。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。可用于DNA序列测定、基因表达分析、基因分型、基因多态性分析、疾病的诊断、突变分析、药物筛选和微生物的鉴定等（祥见下文）。8、基因敲除利用小鼠胚胎干细胞，在体外改变其基因后再生出来带某个突变基因的小鼠，比较突变小鼠与正常小鼠的表型差别，从而鉴定该基因的功能。目前利用带抗性基因标记的载体插入小鼠染色体的方法，可提供大量的各种基因突变的小鼠胚胎干细胞。9、药物基因组学这是后基因组提出的一项重要课题。研究的主要内容是人的基因多型性或变异性是如何影响药物效果和安全性的。人们早已发现，同一种药物以同一剂量标准用药，不同个体会产生不同的效果和副作用，这与个体间基因的差别密切相关。目前已开始鉴定那些与药物分布、活化、作用、代谢以及消失有关的基因及其变异的情况。这些研究将使病人治疗前的基因检测成为现实，根据检测结果因人施药，提供不同的既安全又有效的药物，这潜藏着巨大的社会效益。

分类: 理工学科 解析: 基因芯片，也叫DNA芯片，是在90年代中期发展出来的高科技产物。基因芯片大小如指甲盖一般，其基质一般是经过处理后的玻璃片。每个芯片的基面上都可划分出数万至数百万个小区。在指定的小区内，可固定大量具有特定功能、长约20个碱基序列的核酸分子（也叫分子探针）。 由于被固定的分子探针在基质上形成不同的探针阵列，利用分子杂交及平行处理原理，基因芯片可对遗传物质进行分子检测，因此可用于进行基因研究、法医鉴定、疾病检测和药物筛选等。基因芯片技术具有无可比拟的高效、快速和多参量特点，是在传统的生物技术如检测、杂交、分型和DNA测序技术等方面的一次重大创新和飞跃。 基因芯片在生命科学、医药研究、环境保护和农业等领域有极其重要的应用价值。在基因芯片的驱动下，人类正进入一个崭新的生物信息时代。 基因破译目前，由多国科学家参与的“人类基因组计划”，正力图在21世纪初绘制出完整的人类染色体排列图。众所周知，染色体是DNA的载体，基因是DNA上有遗传效应的片段，构成DNA的基本单位是四种碱基。由于每个人拥有30亿对碱基，破译所有DNA的碱基排列顺序无疑是一项巨型工程。与传统基因序列测定技术相比，基因芯片破译人类基因组和检测基因突变的速度要快数千倍。 基因芯片的检测速度之所以这么快，主要是因为基因芯片上有成千上万个微凝胶，可进行并行检测；同时，由于微凝胶是三维立体的，它相当于提供了一个三维检测平台，能固定住蛋白质和DNA并进行分析。 美国正在对基因芯片进行研究，已开发出能快速解读基因密码的“基因芯片”，使解读人类基因的速度比目前高1000倍。图1所示为一种内嵌基因芯片的基因检测装置。 图1 内嵌基因芯片的基因检测装置 基因诊断 通过使用基因芯片分析人类基因组，可找出致病的遗传基因。癌症、糖尿病等，都是遗传基因缺陷引起的疾病。医学和生物学研究人员将能在数秒钟内鉴定出最终会导致癌症等的突变基因。借助一小滴测试液，医生们能预测药物对病人的功效，可诊断出药物在治疗过程中的不良反应，还能当场鉴别出病人受到了何种细菌、病毒或其他微生物的感染。利用基因芯片分析遗传基因，将使10年后对糖尿病的确诊率达到50％以上。 未来人们在体检时，由搭载基因芯片的诊断机器人对受检者取血，转瞬间体检结果便可以显示在计算机屏幕上。利用基因诊断，医疗将从千篇一律的“大众医疗”的时代，进步到依据个人遗传基因而异的“定制医疗”的时代。 基因环保 基因芯片在环保方面也大有可为。基因芯片可高效地探测到由微生物或有机物引起的污染，还能帮助研究人员找到并合成具有解毒和消化污染物功能的天然酶基因。这种对环境友好的基因一旦被发现，研究人员将把它们转入普通的细菌中，然后用这种转基因细菌清理被污染的河流或土壤。 基因计算 DNA分子类似“计算机磁盘”，拥有信息的保存、复制、改写等功能。将螺旋状的DNA的分子拉直，其长度将超过人的身高，但若把它折叠起来，又可以缩小为直径只有几微米的小球。因此，DNA分子被视为超高密度、大容量的分子存储器。 基因芯片经过改进，利用不同生物状态表达不同的数字后还可用于制造生物计算机。基于基因芯片和基因算法，未来的生物信息学领域，将有望出现能与当今的计算机业硬件巨头――英特尔公司、软件巨头――微软公司相匹敌的生物信息企业。 基因芯片（Gene Chip）准确的讲（或者说是狭义的基因芯片）是指DNA芯片（DNA Chip），其原理是指利用现代探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术等微电子技术把大量分子生物学技术（包括南北印迹技术、探针杂交技术、PCR等）具体而微的固定在一定狭小的空间内，以实现高速度、高通量、集约化和低成本的分析技术。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片（biochip）、微阵列（Microarray）、DNA芯片（DNA chip），甚至蛋白芯片。 由于基因芯片高速度、高通量、集约化和低成本的特点，基诞生以来就受到科学界的广泛关注，正如晶体管电路向集成电路发展的经历一样，分子生物学技术的集成化正在使生命科学的研究和应用发生一场革命。

　　转基因技术是通过有性生殖过程实现的，作为生命科学的前沿技术，转基因技术已经逐渐走入了人们的生活。面是我整理的关于转基因技术论文，希望能对大家有所帮助!　　转基因技术论文篇一：《试谈转基因技术》 　　【摘要】 　　作为生命科学的前沿技术，转基因技术已经逐渐走入了人们的生活，应用领域不断开拓，在解决人类所面临的粮食短缺、环境污染、资源匮乏、效益衰减等重大问题上显示出日益重要的作用, 逐渐发展成为强大的现代生物技术产业。然而，由于转基因生物及其产品是否存在潜在风险尚无定论，故转基因生物及其产品的安全性成为全球的 热点 问题，并引起世界各国政府和许多国际组织的高度重视。 　　【关键词】转基因技术;发展现状;争议;生物安全管理 　　1 转基因技术简介 　　转基因技术(Transgene technology)是指根据人们的意愿，利用分子生物学 方法 ， 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。人们常说的"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"均为转基因的 同义词 。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为"遗传修饰过的生物体"(Genetically modified organism，简称GMO)。 　　转基因技术的优越性体现在：首先，转基因技术突破了传统技术的某些局限，其所转移的基因不受生物体间亲缘关系的限制，比如将人类的胰岛素基因导入到细菌体内，跨越了物种之间的界限。其次，转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期。因此，转基因技术对传统的育种技术进行了广泛的发展和比较完美的补充。 　　2 转基因技术方法 　　2.1 植物转基因方法。 　　转基因植物是指利用重组DNA技术将克隆的优良目的基因整合到植物的基因组中，并使其得以表达，从而获得的具有新的遗传性状的植物。方法有如下几种： 　　农杆菌介导法：农杆菌中有一种致瘤的环型DNA，称为Ti质粒。被农杆菌感染的植物之所以长瘤正是由于T―DNA插入了植物染色体。从此，人们便利用这种天然的转化体系向植物转基因。 　　基因枪：利用火药爆炸或高压气体加速(这一加速设备被称为基因枪)，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。 　　花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 　　2.2 动物转基因方法。 　　转基因动物是通过人工实验方法，将别的基因导入动物细胞，与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而繁殖，并且能够将别的基因信息遗传给后代，严格意义上说，转基因动物是人工创造的新动物。 　　转基因动物接受外来基因的细胞一般是受精卵。主要的转基因动物技术包括有： 　　核显微注射法：是动物转基因技术中最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。它可以直接获得纯系，实验周期短。 　　逆转录病毒载体法：指将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。此法优点在于无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝;将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。 　　胚胎干细胞介导法：是将基因导入胚胎于细胞;然后将转基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。其优点是：在将胚胎干细胞植入胚胎前，可以在体外选择一个特殊的基因型，用外源DNA转染以后，胚胎干细胞可以被克隆，继而可以筛选含有整合外源DNA的细胞用于细胞融合，由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。 　　3 转基因技术发展现状 　　目前，国际上获得的转基因植物已达100种以上。转基因作物已在美国、阿根廷及加拿大等国大面积 种植 ，在所有转基因作物中，转基因的大豆、玉米、棉花和油菜的种植面积占99%以上。中国政府十分重视生物技术的研究，中国正在研发的转基因作物和林木有47种，涉及的基因种类超过100种。以转基因山羊、奶牛生产LAt-PA，以转基因猪生产人血红蛋白等，这些基因产品具有高效、优质、廉价与相应的人体蛋白具有同样的生物活性，且多随乳汁分泌，便于分离纯化。 　　4 转基因技术的争议 　　随着转基因问题日益成为热点，越来越多的人开始关注转基因。科学家发明转基因技术的初衷是想利用该技术造福人类，既可加快农作物和家畜品种的改良速度，提高人类食物的品质，又可以生产珍贵的药用蛋白，为患病者带来福音。 　　但是，人类对自然界的干预是否会造成潜在的尚不可能预知的危险?由于一系列的争论，联合国也公开言论试图说明转基因产品是无害安全的，国际经合组织1993年提出了食品安全性评价的实质等同性原则，如果转基因动植物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。然而各国政府对于转基因的态度却转向两个方向。一方是以美国为代表的宽松政策，认为只要在科学上无法证明转基因产品的危害性都不应该限制。另一方以欧盟为代表的则认为只要不能否定其危害性就应该限定。 　　我国政府十分重视转基因生物安全管理问题，2001年5月，国务院颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，我国越来越重视转基因生物及其产品的安全性，并且密切关注国际上有关管理法规的动向。 　　转基因技术论文篇二：《试论转基因食品检测技术》 　　摘要：在基因工程技术开展的影响下，各国对转基因食品的研发也在不时放慢，而转基因食品的呈现随同着食品平安成绩，人们对转基因食品的信任度并不高，为了使人们可以对转基因食品停止自主选择，各个国度与组织机构要求企业对消费的转基因产品停止标识，这也对转基因食品剖析检测技术提出了更高的要求。本文引见了转基因食品剖析检测技术的内容，讨论其研讨进程，并对转基因食品剖析检测技术的将来开展停止了瞻望。 　　关键词：转基因食品;剖析检测技术;基因工程 　　20世纪70年代重组DNA技术的问世将生物技术带进基因工程时代，农业生物技术在世界范围内迅速崛起，转基因动物在全球范围内失掉普遍种植，随之而来的转基因食品也迅猛开展。由于转基因生物技术的普遍使用和转基因作物的大规模种植，转基因食品的平安性成绩也已惹起人们越来越多的关注。 　　一、转基因食品标识制度与剖析检测技术 　　我国在2015年对叶食品平安法曳的修订中有明白的指示，企业对转基因食品必需依照规则停止标识。目前国际中关于转基因食品标识制度次要分为强迫性标识与自愿性标识2种。在我国关于转基因食品的标识有着较为严厉的法律制度，关于企业消费与运营的产品直达基因食品含量超越阈值必需停止标识。而在一些欧美国度对转基因食品标识没有严厉的要求，只关于存有过敏要素的转基因食品停止标志。而在我国产品出口时需求停止严厉的剖析检测，关于合格的转基因食品同意出口并停止转基因标识，其也是产品流通的关键。由此可见标识的重要性[1]。而对转基因产品的标识需求经过剖析检测来完成，故转基因食品标识制度是转基因食品的重要标签。实践检测才能决议标识制度的树立，定性和定量剖析检测技术所到达的检测限为标识制度提供迷信根据;但是在实践检验检疫任务中标识制度是经过检测技术来完成的。因而，标识制度与剖析检测技术的关系非常亲密，二者互相影响，互相作用[2]。 　　二、、转基因食品成绩现状 　　2.1转基因食品概述 　　在基因工程中，应用DNA重组技术将外源性基因转移到其他生物体中，使生物体显现出特殊的遗传特征与生物性状，失掉新的基因重组的生物体就是转基因的内容。而所谓转基因食品则是使用这些特殊的生物体停止加工而成的食品。转基因在某种水平上只是应用外源性基因放慢生物体的生出息程，在基因工程中，转基因食品次要是为了延长作物生长周期尧添加作物产量尧添加抗病虫害才能，从而无效降低消费本钱，进步作物的消费效益。在目前的转基因研讨中，并没有发现食品中含有少量的毒素。但是由于转基因食品属于人工制造的外来生物体而非自然选择生成的物种，在基因漂流的进程中发生的基因序列的改动无法完全地停止掌握，外源性基因在与DNA停止重组时存在着不可控制的性状，因此对转基因食品的平安性也无法停止确切的定论[3]。 　　2.2转基因食品存在的成绩 　　转基因食品自呈现开端便成了一种十分具有争议的食品，越来越多的转基因食品流入市场与媒体的发酵使人们对转基因食品的平安性有了很大的质疑。而在转基因食品平安的成绩上，目前还没有严谨的迷信结论与研讨 报告 对其平安性给出确切的证据结论，其存在的成绩次要有以下几个方面。第一，转基因食品是由基因植入及基因重组构成的新的生物体，其本来具有的构造与成分能否发作了变化;第二，转基因食品不是自然界生成的产物，食用转基因食品能否会对人体发生负面影响，临时食用能否会有毒素的积聚，对人体的发育生长有什麼影响;第三，转基因作物不是在自然选择下呈现的产物，其能否会对生物链有影响，能否会毁坏生态均衡;第四，转基因作物是基因活动下的产物，这种状况下能否会呈现基因净化的状况，涉及到其他自然界的作物，使其基因发作改动[4]。由于上述这些成绩并没有失掉无效的处理，因此才迫切需求完好尧精确尧严谨的转基因食品剖析检测技术对其平安性停止保证，从而进一步完善我国转基因食品监管方面的迷信标准。 　　2.3转基因食品检测技术的内容和分类 　　目前，关于转基因食品的平安性次要依托转基因食品剖析检测来停止测定。而在转基因食品的剖析检测进程中，次要是对DNA尧蛋白质及核酸这3类物质停止测定，可以依据这3类物质分红3个品种的检测办法，在实践状况中可以依据需求停止检测办法的联用。由于蛋白质程度检测办法仅适用于未停止加工的食品检测和新颖食品范围，具有较大的局限性，因此现阶段外源基因测定办法的运用范围较为普遍[5]。 　　三、转基因食品检测技术的研讨 　　3.1蛋白质印迹检测技术 　　蛋白质印迹检测次要是应用聚丙烯酰氨凝胶电泳对转基因食品外源蛋白质停止别离，并与显色酶反响停止结合，从而使外源蛋白质可以无效地停止别离检测。这种检测办法次要是对转基因食品中不可溶蛋白质停止剖析，检测在转基因食品中的蛋白质含量，并与蛋白质预定限值停止比对。 　　3.2复合扩增PCR检测技术 　　目前在转基因食品检测中多重PCR检测技术是一种被普遍运用的检测手腕。PCR渊聚合酶链式反响冤普通只能对1个DNA片段停止缩小扩增检测。为了能在转基因食品检测中取得更片面的基因序列信息，在停止基因检测时应用PCR反响原理停止多重检测，由此构成了复合扩增PCR转基因食品检测技术。这种检测技术的使用可以无效提升检测效率，并且可以对基因序列多个靶位点同时停止检测，完成转基因食品检测的精确性与牢靠性[6]。 　　3.3外源DNA检测技术 　　转基因食品次要是将外源DNA导入生物体中，而对外源DNA的检测次要是对植入的DNA片段停止转基因食品基因序列特征的检测，以转基因食品DNA序列作为检测目的，转基因食品核酸程度检测作为最次要的转基因产品检测技术，其次要检测启动子尧基因和终止子，便于检测转基因食品。 　　3.4基因芯片检测技术 　　基因芯片是对转基因生物体的基因组序列停止测定，经过将转基因食品的DNA有规律排布在硅片或是玻片上构成微距阵。经过对基因芯片上的基因序列停止计算机软件的计算处置，从而取得转基因食品的基因特征与生物信息，这种办法可以精确无效地对转基因生物体的基因表达特征停止检测[7-9]。 　　3.5LAMP检测技术 　　LAMP渊环介导等温扩增冤技术是众多核苷酸扩增技术中的一种，这种技术在运用时没有特定的环境条件要求，只需求在恒温形态下就可以停止检测实验，操作技术较为复杂。LAMP检测技术次要是应用显色反响对转基因生物体停止察看，并且应用浊度仪对其在反响进程中发生的沉淀物停止检测判别，是一种较为复杂的检测技术。 　　3.6联用检测技术 　　联用检测技术次要是集合多种检测技术的优点对转基因食品停止无效的剖析检测，这样可以起到扬长避短的作用。在基因检测中，现有的联用检测技术有PCR技术与酶联免疫吸附法的结合运用等办法[10-11]。 　　四、结语 　　转基因食品剖析检测技术次要是对转基因食品的平安停止评价。目前，转基因食品剖析检测技术有多种，由于转基因食品的基因片段不同，因此采用的检测技术也需求根据实践需求停止选择，确保检测技术的无效性。在将来市场上会呈现越来越多的转基因食品，剖析检测技术作为其中重要的检测手腕也肯定会有新的开展。 　　转基因技术论文篇三：《浅议转基因食品消费者知情权保护制度》 　　[摘 要]转基因食品消费中存在的信息不对称及食品安全的不确定性引发了消费者的普遍关注，切实保障消费者的知情权有助于转基因食品的理性消费和转基因技术的健康发展。 　　因此，应借鉴美国和欧盟保障消费者知情权的主要制度，从标识制度、安全评价和检测制度以及公众参与制度等方面构建和完善我国转基因食品消费者知情权的保障体系。 　　[关键词]转基因食品;消费者;知情权。 　　二十世纪末以来，转基因食品在生活中得到了广泛的推广。 　　所谓转基因，就是利用分子生物学手段，将某些生物的基因转移到其他生物物种中去，使其出现原物种不具有的性状或产物，以转基因生物为原料加工生产的食品就是转基因食品。但另一方面，随着转基因技术日益普遍的运用，这一技术对人类健康可能带来的安全隐患也逐渐受到社会各界的关注。在转基因食品已经生产并上市的情况下，消费者的知情权具有正当性，应当予以保护。 　　一、消费者知情权的内涵。 　　消费者有权要求经营者按照法律规定的方式标明转基因食品及其相关服务的真实成份、所用原料、来源。如果食品含有转基因成份、所用原料为转基因产品、直接来自于转基因方法培育的作物、所提供的餐饮服务中涉及转基因食品等等，则消费者有权要求经营者在出售转基因食品或提供转基因食品相关的服务时，予以标明。消费者有权在交易过程中，就所售食品或所提供服务进行询问和了解，经营者应该耐心、细致地予以回答和说明。经营者在提供转基因食品或与转基因食品相关的服务时，无论食品或服务的优、缺点均应向消费者如实介绍。 　　二、消费者知情权保护制度的意义。 　　(一)转基因食品消费者知情权保护，是食品安全保障的重要方面。 　　由于转基因作物能更好地防治病虫害，抵御干旱，提高产量，营养成分高，因此发展前景十分广阔。但专家们也强调，发展转基因食品必须有严格监督、科学检验、加强立法和管理，以避免它对人类健康和环境造成损害。[1]而转基因食品消费者知情权保护法律制度，有助于通过消费者监督，促使食品生产者在转基因技术的运用上更加慎重，避免有害健康的食品进入消费领域，因而是食品安全保障的重要途径和手段。 　　(二)转基因食品消费者知情权保护，是消费者权益的重要体现。 　　知情权作为政治民主化的一种必要和结果，是公民依法享有的基本人身权利。消费者作为特定的民事主体，其享有知情权是政治领域的民主原则扩展到经济生活的必然要求，我国相关法律法规做出了明确规定。特别是消费者的知情权，还是其行使选择权的前提条件，消费者有权决定是否购买转基因食品。因而知情权对食品消费者的基本权益的全面实现有着至关重要的作用。然而，就目前我国转基因食品研发、生产、加工、销售等方面而言，消费者所应享有的知情权与社会现实有着极大差距，现行法律对此方面规定亦不完善。这种情况不利于对消费者基本权益的保护，也对转基因食品的规范管理造成负面影响。 　　三、国外转基因食品消费者知情权保护现状。 　　转基因食品信息公开，保障消费者充分享有知情权，是目前世界各国自转基因生物技术研发到转基因食品商业化生产销售过程中所需解决的重要课题。欧美等发达国家对于此有着较为完善的立法和管理体系。国外先进的信息透明化管理模式以及消费者知情权保护法律制度的研究与实践对我国有着重大的借鉴意义。其主要可归纳为三大模式： 　　(一)以欧盟为代表的严格限制型模式。 　　欧盟对转基因食品的认定根据过程而非最终产品。为保证消费者对食品拥有充分知情权，欧盟设立了专门机构，即欧盟食品安全管理局(EFSA)，负责评估与整个食物链相关的风险，不受其他机构管辖，独立开展工作。[2]并建立专门网站向公众提示食品风险问题，充分公开转基因食品自研发到销售的各环节信息。 　　在对消费者知情权法律保护方面，欧盟以《通用食品法》为主体，辅以大量食品标签法令和 广告 法令，构成高低有序，结构严谨的转基因食品信息公开制度。2003 年第 1829 号法令和1830 号法令规定：无论源自转基因生物的 DNA或蛋白质是否存在，只要食品包含转基因生物或由转基因生物制成，都要有特别标签加以标明。法令细化到标签规格制式，转基因含量限制等，种类扩展到数十类百余种。 　　(二)以美国为代表的宽松鼓励型模式。 　　美国对于转基因食品管理遵循的是“可靠性科学原则”，采取宽松式管理模式，奉行自律管制。但其仍十分注重公众知情权的法律保护，强调转基因技术研发、实践、生产、推广的透明性，并建立了有效的食品安全信息系统，定时发布转基因食品检测信息，在网络发布转基因食品名录、食品安全资源信息等，使食品安全信息最大限度予以公开。[3]美国《转基因食品安全管理草案》、《公共健康卫生法》、《联邦食品及药物管理现代化法》规定了转基因食品商业化申请流程，并将对公众公开相关技术资料等，作为取得食品和药物管理局(FDA)合法执照的必要条件。 　　(三)以日本为代表的折中模式日本对转基因食品采取的是在严格管制的同时加以鼓励的原则。为保护消费者知情权，日本政府颁布《转基因食品标识法》，对主要原料为已通过安全评价的转基因农产品，加工后仍残留重组 DNA或其编码的蛋白质食品，制定具体的标识办法。同时，由日本科学技术厅、农林水产省和厚生省共同管理转基因技术事项，定期公布转基因食品研发资料以及市场流通转基因食品名录。 　　国外转基因食品管理模式，不管其对转基因技术产品是否持谨慎态度，都将信息透明化、保证消费者充分知情权置于立法及管理优先考虑的方面，值得我国相关立法执法机构借鉴。 　　四、我国转基因食品消费者知情权保护现状。 　　我国政府高度关注现代生物技术，支持和鼓励转基因生物和转基因食品的研究。我国于 2000 年 8 月 8 日签署《卡塔赫纳生物安全议定书》的第 23 条规定：各缔约方应按其各自的法律规章，在关于改性活生物体的决策过程中征求公众的意见，并在不违反关于机密资料的情况下，向公众通报;缔约方应力求使公众知悉可通过何种方式公开获得生物安全资料。[4]2001 年 5月 23 日，国务院发布《农业转基因生物安全管理条例》，明确规定农业转基因生物实行安全评价制度，标志管理制度，生产许可制度，经营许可制度和安全审批制度。作为迄今为止我国级别最高、最全面的转基因技术管理条例，信息公开制度和知情权保护制度均未列入其中。 　　我国在转基因食品消费者知情权的保护方面在立法上取得重大成就的同时，也存在着一些弊端。如缺少专门生物技术安全立法，立法层次不高，研究、生产、销售等转基因技术重要阶段信息公开出现“真空管理”，[5]造成信息公开制度和知情同意制度严重缺失。转基因食品强制标识是保护消费者知情权最重要的手段，但随着转基因技术迅速发展，《农业转基因生物标识管理办法》所规定标识种类未进行更新补充，标识管理未向烟酒等进行细化规范，造成标识混乱，透露信息极为有限，对消费者充分行使知情权造成巨大阻碍。 　　五、完善我国转基因食品消费者知情权保护制度 措施 。 　　我国学术界在转基因食品消费者知情权法律保护方面，也做了较多的研究。具体来说，完善我国转基因食品消费者知情权保护制度，应加强以下三个工作重点： 　　第一，加强对转基因食品的标识管理。虽然转基因标识制度已经实施多年， 但在转基因食品标识上还存在诸多问题。一方面， 还有众多转基因食品没有进行标识;另一方面， 现有的进行了标识的转基因食品，其所作的标识多数不符合规范。因此，国家相关部门应在今后加强对转基因食品标识的监管工作。 　　第二，强调公众对转基因食品的知情权和选择权。公众对所消费的食品应拥有知情权和选择权， 公众只有充分地获得知情权， 才能享有选择权， 并最大限度地保护自己的权益。在目前转基因食品的风险和危害尚不明确的情况下， 消费者对其选择有些茫然难以避免。因此， 政府相关主管部门应提高转基因相关信息透明性和安全管理的公众可参与性， 比如在批准转基因生物环境释放和商业化生产时增加公众听证的程序。 　　第三，健全转基因食品检测、评估体系。首先， 建立独立的权威检测机构， 对转基因食品进行严格的检测， 保证其质量和安全性， 并逐渐形成一个覆盖全国的农业生物技术管理监督与监测网络体系。定时发布转基因食品名录供消费者参考。其次，严格控制转基因食品的生产、加工、贮运、销售直到进出口各环节， 使安全风险降至最低。[6]结合我国实际， 研制出一套切实可行的转基因食品安全评估体系， 将转基因食品置于规范化的管理和监控之中， 使消费者能放心地消费转基因食品。第三， 要加大执法力度。对未经申报审批而进行商业化生产的， 对不执行转基因食品标识制度的单位和个人， 应承担相应的法律责任，以保证转基因食品市场健康发展。 　　六、结语。

1.对的。Aa⊕Aa，由于Aa的基因组在减数分裂的时候随机分配分别产生有A基因组和a基因组的单倍体，自交重新恢复多倍体时随机组合，产生AA、Aa、aa基因型的子代，这个过程就是基因重组导致的子代性状分离。2.错的。同卵双生子从孟德尔理论上而言应当是完全一致的，造成差异的主要原因不在于基因重组——基因重组只体现在多个生殖细胞随机组合的情况下，而同卵双生至始至终只有一对生殖细胞的融合。只是在受精卵有丝分裂产生胚胎的过程中由于一些原因，在前期的某次分裂后两个细胞完全分开一段距离，由于细胞的全能性进而分别发育成为单独个体。那么同卵双生子的差异主要来源是，有丝分裂中严格分开的只有姐妹染色单体，而来自母体卵子中的部分细胞质遗传物质并不会严格等量分开，这就造成了些微的遗传物质差异，但这差异通常不会体现。另外一个产生同卵双生子的差异的来源是，随着生长，不同个体的发育总是会存在差异，由于各种后天因素的影响，同卵双生子也会有细微的形状差异。

【答案】：D探针是带有特殊可检测标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用于检测核酸样品中的特定基因。人工合成的寡核苷酸片段、克隆的基因组DNA、cDNA均可在DNA印迹和RNA印迹中作探针，为了提高RNA印迹的敏感性，亦可选用RNA片段作为探针，而蛋白质不符合探针的定义。

免疫学的实验基本是仪抗原和抗体的特异性反应为基础的，很少用到和基因组学有关的技术。只有在涉及免疫的分子生物学、HLA分型、基因工程的疫苗时，才会用到基因组技术，如PCR、RNA印迹、核酸酶保护分析法、原位杂交、DNA重组技术、DNA杂交等等。

基因诊断（gene diagnosis）是以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。它是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断技术，它的诞生与发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展。常用基因诊断技术：一、Southern印迹法（Southern blot）基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。当含有特定基因片段已原位转移到膜上后，即可与同位素标记了的探针进行杂交，并将杂交的信号显示出来。杂交通常在塑料袋中进行，袋内放置上述杂交滤膜，加入含有变性后探针的杂交溶液后，在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针。杂交后，洗去膜上的未组合的探针，将Ⅹ线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。二、聚合酶链反应近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。三、扩增片段长度多态性小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析.四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。五、单链构象多态性诊断法单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。

转基因动物与克隆动物的区别为：使用技术不同、性质不同、用途不同。一、使用技术不同1、转基因动物：转基因动物使用的是将重组基因转染整合到动物受体的技术。2、克隆动物：克隆动物使用的是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。二、性质不同1、转基因动物：转基因动物是通过基因调控网络设计乃至人工基因组转移进行全基因合成。2、克隆动物：克隆动物是通过载体构建与基因转移方法进行单基因克隆。三、用途不同1、转基因动物：用于识别动物发育过程中的基因及其活动，也可测出与动物发育相关的未知基因的表达特性。研究导人的异常基因的表型效应，可以了解基因结构和功能的关系，还可用于基因组印迹分析、遗传缺陷的矫正等。2、克隆动物：培育优良畜种和生产实验动物；生产转基因动物；生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。参考资料来源：百度百科——转基因动物百度百科——动物克隆

环境对基因的改变目前研究主要集中在表观遗传的领域,现在普遍认为环境并不会改变基因的序列,但是会影响基因的修饰,一部分的修饰可能能够通过基因组印迹的方式遗传给下一代,.关于环境改变基因,生物学里叫做获得性遗传,这个假设是拉马赫提出来的,感兴趣的话你可以去看一下获得性遗传的有关介绍.但是目前一直没有找到支持这一理论的证据,反而丑闻和笑话到出了不少.而关于黑人为什么黑,这是按照自然选择解释的.也就是较黑的人在非洲的环境下生存下来的几率更高,所以通过自然选择的一代代筛选,非洲人就越来越黑了.不过确实也可能是本来就黑,黑人从非洲走出来之后通过自然选择才变白的,要知道按照现在的关于线粒体基因研究里有个“夏娃”理论,所有人类都起源自非洲.

中学生物的教科书上就会讲，基因有所谓的显性隐性之分，然后就会据此出一大堆豌豆题和族谱题。然而，教科书上却从来没有讲到底为什么会有这样的区别。要理解这个问题，还真的谈及大学生物学专业才会学到的内容。不过，这个答案会尽量写得比较科普一些，希望高中生也能看得懂。1、一对等位基因并不是同时表达的。我们的核基因组，一半来自父亲，一半来自母亲。因此，常染色体和部分性染色体上的基因，至少都是双拷贝的，也因而有了“等位基因”一说。但是，并不是所有的基因，都能平等地表达这两份拷贝。换句话说，有些基因，只表达一份拷贝，而另外一份拷贝则被关掉了。这类基因叫做“印迹基因”（imprinted genes）。所以，由印迹基因控制的性状，就看哪一份拷贝能够正常工作了。而至于基因的印迹（gene imprinting）如何实现，就涉及表观遗传学的内容，大致上是DNA的甲基化和组蛋白的修饰，就不展开说了。2、其中一个等位基因显示出了减弱的或新的功能。印记基因在人类基因组中，仅占了很小一部分，大概只有100来个吧。因此，基因印迹仅仅解释了一小部分。当两份基因拷贝都能同时表达时，所谓的显隐性差异，就在于两份基因拷贝的DNA序列上的差异了。有的时候，某个DNA序列的变化，会导致它的蛋白质产物功能降低，从而影响性状。至于能够从多大程度上影响，就得看另外一份正常的基因拷贝能不能挽救这个局面。举个例子，以黄老板Ed Sheeran为代表的红发性状，是由一个叫MC1R基因的变异引起的。我们的肤色、发色，是由黑色素的类型和比例来决定的。黑色素有两种，一种叫黑色的真黑素（eumelanin，真的很黑的黑色素），一种是褐黑素（pheomelanin，红褐色的）。当真黑素多，褐黑素少时，发色就是偏黑色系的。反之，则是红发系。MC1R蛋白能够决定黑素细胞合成哪一种黑色素。当这个蛋白活性较高的时候，黑素细胞倾向于合成真黑素，而活性低的时候，就倾向于褐黑素。当MC1R基因突变成某些特定形式时，会导致MC1R蛋白活性降低。但是，在一般情况下，只有一份MC1R的突变还不足以产生红发性状，因为另外一份拷贝还会控制真黑素的合成，黑和红搅一起了嘛。而像黄老板这种，八九不离十，是两份MC1R基因都突变了。因此，我们就能明白，黄老板的红发性状，是由隐性突变的MC1R基因来控制的。

印迹的抑癌基因的杂合性丢失（LOH）、UPD或突变失活可能会导致某个抑癌基因的唯一有功能拷贝的丢失或不表达。印迹的癌基因的LOI或UPD则可能导致双等位基因表达，表达量成倍增加。印迹控制中心（指理论上可能会存在的某些对印迹现象有关键性影响的基因或顺式元件）的突变性失活, 可能会导致某个染色体印迹区域的多个印迹的癌基因的不正常表达。

研究发现，基因组印迹的分子机理与印迹基因DNA中胞嘧啶甲基化尤其是CpG岛的甲基化密切相关，胞嘧啶甲基化是DNA的一种共价修饰。另外还有特殊的染色质结构和反义转录产物等可能都是基因印迹产生和维持的重要因素。基因印迹中，卵子和精子中对同一基因的不同程度的甲基化，几乎所有的印迹基因都有一些序列成份在两个不同亲本来源的等位基因中仅有一方是甲基化。这些序列被称为“差异甲基化区域“（Differentially Methylated Regions）。它指基因组在传递信息的过程中，对基因或DNA片段打下标记或烙印的过程。

印迹基因在生长发育中尤其是胎儿和胎盘的生长发育中有重要作用，它还与细胞增殖有关，正常基因组印迹模式改变会引起一系列人类遗传性疾病，包括神经和精神发育异常的遗传性疾病以及儿童和成人的一些肿瘤。印迹基因还能帮助人们认识生物进化的本质。基因印迹在进化论意义上的优势可能就是有效地防止了单性生殖, 维持了遗传多样性, 但也增加了隐性突变转为显性的危险性。

印记基因是指仅一方亲本来源的同源基因表达,而来自另一亲本的不表达。 遗传印记技术不仅是一种生物学技术，而且是在涉及血缘分析和刑侦分析的民事领域也同样被采用的分析技术，因而是牵涉到社会演化问题的一个关键领域。从生物学研究的角度看，由于人们对基因组织的发展，使我们对DNA多态性的解释越来越完善，并使我们从中确认了每个生物具有的这种极端的独特性。 基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性，这种修饰常为DNA甲基化修饰，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。在生殖细胞形成早期，来自父方和母方的印记将全部被消除，父方等位基因在精母细胞形成精子时产生新的甲基化模式，但在受精时这种甲基化模式还将发生改变；母方等位基因甲基化模式在卵子发生时形成，因此在受精前来自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式。目前发现的印记基因大约80%成簇，这些成簇的基因被位于同一条链上的顺式作用位点所调控，该位点被称做印记中心(imprinting center, IC)。印记基因的存在反映了性别的竞争，从目前发现的印记基因来看，父方对胚胎的贡献是加速其发育，而母方则是限制胚胎发育速度，亲代通过印记基因来影响其下一代，使它们具有性别行为特异性以保证本方基因在遗传中的优势。 印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病。研究发现许多印记基因对胚胎和胎儿出生后的生长发育有重要的调节作用，对行为和大脑的功能也有很大的影响，印记基因的异常同样可诱发癌症

基因印迹（也称作基因组印迹或配子印迹 或亲源印迹）是近年来发现的一种不遵从孟德尔定律的依靠单亲传递某些遗传学性状的现象，也就是某些基因呈亲源依赖性的单等位基因表达，其另一等位基因不表达或表达极弱，仿佛这些基因的不同亲本来源的一对等位基因上带有某种可供识别的印迹，因此得名。具有这种现象的基因被称为印迹基因。基因印迹在体细胞的分裂中是传承的, 但在配子形成的过程中可以擦除和重新建立。基因印迹在人类遗传性疾病尤其是肿瘤发生中的作用正引起越来越多的注意。

基因组印记 是指基因组在传递遗传信息的过程中,对基因或DNA片段打下标识、烙印的过程。基因组印记(Genomic imprinting):又称遗传印记

基因组印迹（Genomic imprinting）又称基因组印记、遗传印迹、亲代印迹（Parental Imprinting ）或配子印迹，是指在配子或合子发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性的加工修饰 ，导致双亲中某一方的等位基因被沉默,从而使后代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性的现象。相应地，具有这种差异的基因就被称为印迹基因（imprinted genes）。

从遗传学中心法则看，基因表达沉默无非从两个水平研究，先将具体方法总结如下1基因组DNA水平1.1 构建基因重组打靶载体 基因功能研究中出现最早最成熟的技术就是基因敲除. 他是根据同源重组的原理, 利用分子生物学技术增强和减弱甚至灭活某特定靶基因表达水平, 然后观察实验动物整体功能状态的变化, 推测靶基因的功能[1]. 基因敲除技术可在整体动物水平研究基因功能, 但是完全基因敲除使小鼠所有细胞基因组上都存在基因的缺失或突变, 有些重要的靶基因敲除或导入会严重影响动物胚胎的发育, 导致胚胎早期死亡或严重的发育缺陷, 使得突变无法传代, 不利于在小鼠各个发育阶段进行该基因功能的分析. 条件基因敲除技术(conditional gene knock out)的建立为此难题找到了解决的办法. 1994年, Gu et al [2]应用Cre/loxP重组酶系统实现了外源基因的时间特异性表达, 在此基础上条件基因敲除技术得以形成. 条件基因敲除技术是在基因敲除基础上结合Cre/loxP系统而形成的, 他可以做到在特定时间, 组织, 细胞中将靶基因敲除, 从而可以真实的反映特定组织或细胞中靶基因被敲除或修饰后的结果, 避免在发育早期所有细胞和组织中完全敲除目的基因后可能产生的胚胎早期死亡或严重的发育障碍[3-5]. 基因敲除的优点是基因灭活效果确切可靠, 缺点是技术复杂, 费时费力.1.2 反义寡核苷酸技术反义寡核苷酸技术是指采用一类经人工合成或构建的反义表达载体表达的寡核苷酸片段, 长度多为15-30个核苷酸, 导入细胞或者个体体内, 根据碱基互补原理, 通过与靶DNA或者mRNA结合形成双链杂交体激活核酸酶H, 裂解靶mRNA阻断蛋白质的翻译, 或者与DNA结合成三链结构或与单链DNA结合成双链结构以阻止靶基因的复制或转录, 以及与mRNA AP位点结合干扰其剪接、加工和运输, 在mRNA水平上发挥作用, 从而干扰其表达, 阻止其翻译成蛋白质[6]. 具体的作用机制目前尚未完全清楚. 反义寡核苷酸因为是针对特定的靶mRNA(DNA)的序列设计合成, 因此具有极高的特异性, 并且容易设计和体外大量合成. 另外反义寡核苷酸不含病毒序列, 不会产生免疫反应, 也不会整合入宿主染色体内, 这都为其作为药物应用于临床提供了可能. 1998年, 第1个反义药物Vitravene(Fomivirsen)被美国FDA批准通过, 用以治疗由巨细胞病毒(cytomegalovirus)引起的艾滋患者的视网膜炎[7]. 目前反义寡核苷酸技术在动物体内外的应用已经非常普遍[8-9]. 今后要注意的是, 如何对反义寡核苷酸进行更加有效的化学修饰以提高其稳定性, 延长其半衰期, 增加其作用时间和如何定点作用于特定部位, 使靶组织最大效率地吸收反义核酸, 提高其作用效果, 减轻毒副作用[10].1.3 甲基化寡核苷酸技术 表观遗传学(epigenetics)是与遗传学(genetics)相对应的概念. 遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化, 包括基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定性等;而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化, 包括DNA甲基化、组蛋白脱乙酰化和染色质构象变化等; 表观基因组学(epigenomics)则是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究, 以抑癌基因为代表的CpG岛甲基化所致基因转录失活已经成为肿瘤表观基因组学研究的重点内容[23-25]. 所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下, 基因组5"端CpG二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上共价结合一个甲基基团. 由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系, 特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活, DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容, 研究DNA甲基化与肿瘤的关系成为当前分子生物学的热点之一. 目前的研究已经表明: 肿瘤细胞和组织中存在异常的DNA甲基化状态, 表现为基因组整体甲基化水平降低, 导致遗传不稳定性增加;组织特异性基因的启动子区域出现从头甲基化从而导致基因被关闭; 原癌基因多为低甲基化或不充分甲基化, 低甲基化使原癌基因活化, 导致重新开放或异常表达, 形成突变热点, 增加染色体的不稳定性; 抑癌基因多为过度甲基化, 过度甲基化导致表达失活[26-27]. 这些因素综合起来导致基因表达异常, 引起细胞恶变, 最终导致肿瘤的发生[28-30].在哺乳动物中, 甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG). 通常细胞中CpG二核苷酸的甲基化分布并不是均一的, 大约50%的基因在启动子区域有CpG二核苷酸的富集现象, 一般该区域的长度从0.5-2 kb不等. 该区域与基因的转录有密切的关系, 通常处于非甲基化状态. 处于非甲基化状态的启动子, 环绕的染色质呈现为开放的构象, 允许转录因子和其他的激活物靠近. 此外, 转录因子的占据也使其他的转录抑制因子和染色质重塑蛋白等难以接近启动子, 最终表现为启动基因表达[31-33]. 相反, CpG岛高甲基化的启动子则呈现为关闭的构象, 不但使转录因子无法靠近, 而且还有助于甲基胞嘧啶结合蛋白﹑转录辅阻遏蛋白﹑DNA甲基转移酶等对转录有抑制作用的蛋白结合于启动子区, 启动子失去功能, 结果基因转录灭活而沉默[34-35]. 很多资料表明, 基因启动子异常高甲基化可以导致其转录灭活[36-39]. Zhu et al [40]通过甲基化寡核苷酸诱导ERβ基因启动子区和外显子区CpG岛特异性甲基化发现, 在前列腺癌细胞中, 是ERβ基因启动子区(而不是外显子区)CpG岛的高甲基化导致了ERβ基因转录失活. 去甲基化试剂作用前列腺癌细胞后, ERβ mRNA恢复表达.

转基因动物所运用到的技术：基因工程(转基因)、早期胚胎培养(动物细胞培养)、胚胎移植。克隆动物所运用的生物技术：动物细胞核移植、早期胚胎培养(动物细胞培养)、胚胎移植。另外，选修三还有一个试管动物也需要记住，用到技术有体外受精、早期胚胎培养(动物细胞培养)、胚胎移植。转基因动物就是把其它动物的一个或者几个有用的基因载入动物的胚胎或者细胞中,使这种动物能够产生这个基因的功能,合成这个基因所控制的蛋白质,进而改善生物性状。例如，某种产生抗生素的细菌产生抗生素的基因转录到奶牛的产奶相关的基因中,就可以产生出能生产抗生素的奶牛；克隆动物就是把动物的体细胞细胞核放进一个去核卵细胞中,利用细胞的全能性,重新发育层一个生命个体。这个细胞核包含该种动物的所有遗传物质,能够成长为一个完善的个体,拥有该细胞核的母体的相同的特征,各个系统能够完全发育,具有生殖能力。如果在克隆过程中，导入的细胞核已经包含了外源基因（即转基因），所产生的动物就是转基因克隆动物。

第一，母性DNA是无法改变的，卵原细胞直接转换成卵子的，有常识的人应该知道。第二，干细胞的问题，我不知道母婴能否传递。但是如果能那么代孕不是也有风险了？那么到底是什么造成了子肖前夫的现象呢？我也百思不得其解，只得到了三种可能。第一：心理作用，可能是风言风语太多，小孩那么小，谁能看出来像谁啊？人都一个样，而且DNA要是你的，一定没问题。第二：如我所说，近年来有人研究出表观遗传学。但是表观遗传学和先父遗传不是一个概念，有人混淆了而已。表观遗传学指的是环境，以及父母习性可能对以后孩子的基因表达上做出影响。我假设这种影响成立，那么也不是前夫基因影响的，只有可能是母亲影响的，表观遗传学是新科学，我做出假设：可能是母亲怀孕前（注意前，形成受精卵后卵子表达不会做出改变了。），朝思暮想前夫，想多了自然给外基因（表观遗传学详解）一个指令，影响了小孩外观基因表达，但是真正DNA还是亲父的！第三：就是网上种种子肖前夫都是谣言，而且谣言可能性很大！我观察了，故事叙述很相似，可能出自同人之手，第二所有现象解说都用的是最早那篇先父遗传的解说。基本一字不漏的抄下来的。让人怀疑啊，其他什么提问等等，我也怀疑是组织性的恶意宣传。至于古代的子肖前夫现象，我想应该是孩子真的是前夫的，那时候没有DNA技术，所以无法证明。“子肖前夫”这个词是古时候传下来的，但和现在歹人们形容的先父遗传是两回事。以上是我研究了两天的成功，我知道很多朋友都和我一样心里有一根刺难受。但是我能说的是，第一！这个假设是真的概率很低很低，外国论坛我上过，基本都不信，说很在废除的了（本人外国留学的，可以保证。）第二，就算是真的，那么全世界起码百分之60到70的人和你一样，完全不需要不平衡。第三，说道最烂最烂了，如果你不信我前面的所说的那些推理，你硬要相信先父遗传。那你也要想啊！它顶多改变的是母亲的基因，你精子的基因是全部传承给后代的啊！虽然很搞笑，但是我想指出，变先父遗传的朋友们，有没有想过，按照你们的论点下来，就是两个男人的基因组成了这个小孩的...（有点恶心了嗯嗯！）所以大家放心吧，这个都是小事。所以不要给歹人影响自己的心情了。一切都是谣言！

日前，加州大学圣迭戈分校研究人员开发了一个程序，可以在DNA序列的基础上预测表观遗传学修饰的定位。他们用这个程序对人类胚胎细胞进行了分析。相关研究论文刊登在了近期出版的《自然-方法》杂志上。论文第一作者 John Whitaker 表示：“虽然我们的细胞执行着不同的功能，但它们都有同样的遗传学蓝图。皮肤细胞提供保护，神经细胞发送信号，它们之间存在差异是因为有不同的基因被活化或沉默。”这些基因活化模式，受到表观遗传学修饰的控制。表观遗传学修饰可以在不改变DNA序列的基础上，决定特定细胞中的基因是否被读取。研究人员分析了有表观遗传学修饰和无表观遗传学修饰的序列，鉴定了与这些修饰有关的DNA模式。他们在此基础上开发了软件Epigram，Epigram是一个通过DNA模体预测组蛋白修饰和DNA甲基化模式的分析软件。http://www.bio360.net/news/show/11682.html

影响：任何一个层面异常，都将影响染色质结构和基因表达，导致复杂综合征、多因素疾病以及癌症。和DNA序列改变不同的是，许多表观遗传的改变是可逆的，这就为疾病的治疗提供乐观的前景。 表观遗传三个层面调控基因表达： DNA修饰：DNA共价结合一个修饰基团，使具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状态。 蛋白修饰：通过对特殊蛋白修饰或改变蛋白的构象实现对基因表达的调控。非编码RNA调控：通过某些机制实现对基因转录的调控，如RNA干扰。

谓表观遗传学,核仁显性,就是通过各种表观遗传的修饰方式来对基因进行调控.所以,基因组印记（genomic impriting）,已知的表观遗传现象有,就是不改变基因的序列,基因表达的表观遗传学调控：DNA甲基化（DNA methylation）.目前,通过对基因的修饰来调控基因的表达,母体效应（maternal effects）,基因沉默（gene silencing）,休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等

表观遗传学又称“拟遗传学”、“表遗传学”、“外遗传学”以及“后遗传学”（英文epigenetics），在生物学和特定的遗传学领域，研究的是在不改变dna序列的提前下，某些机制所引起的可遗传的基因表达或细胞表现型的变化。表观遗传学是20世纪80年代逐渐兴起的一门学科，是在研究与经典孟德尔遗传学遗传法则不相符的许多生命现象过程中逐步发展起来的。表观遗传现象包括dna甲基化、rna干扰、组织蛋白修饰等。与经典遗传学以研究基因序列影响生物学功能为核心相比，表观遗传学主要研究这些“表观遗传现象”的建立和维持的机制。其主要研究内容包括大致两方面内容。一类为基因选择性转录表达的调控，有dna甲基化，基因印记，组蛋白共价修饰，染色质重塑。另一类为基因转录后的调控，包含基因组中非编码的rna，微小rna，反义rna，内含子及核糖开关等。表观遗传学指基因组相关功能上的改变而并不涉及核苷酸序列的变化。例如dna甲基化和组蛋白修饰，两者均能在不改变dna序列的前提下调节基因的表达。阻遏蛋白能通过结合沉默基因从而控制基因的表达。这些变化可能通过细胞分裂得以保留，并且可能持续几代。然而，这些变化都不涉及任何基因序列的改变，取而代之的是这些非基因因素导致生物体的基因表现出（或“自我表达”）不同。由于目前尚不清楚组蛋白的化学修饰是否可遗传，有人对于用此术语描述组蛋白的化学修饰也提出了异议。————————————————————————————————————————表观基因组（英语：epigenome）记录着一生物体的dna和组蛋白的一系列化学变化；这些变化可以被传递给该生物体的子代。改变表观基因会导致染色体结构以及基因作用发生变化。[1]表观基因参与基因表达、个体发展、组织分化和转座子的抑制过程。不同于其底层的基因，表观基因对于个体而言并不是基本静态不变的，而是可以被环境因素动态更改的。表观基因现在是癌症研究的热门话题之一。人类肿瘤由dna甲基化和组蛋白修改模式的破坏造成。————————————————————————————————两者有相互交叉的地方，就好像遗传学和基因组学一样。但总的来说，表观基因组学是基于表观遗传学的基础上，所以表观遗传学范围要大一点。

基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性，这种修饰常为DNA甲基化修饰，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。在生殖细胞形成早期，来自父方和母方的印记将全部被消除，父方等位基因在精母细胞形成精子时产生新的甲基化模式，但在受精时这种甲基化模式还将发生改变；母方等位基因甲基化模式在卵子发生时形成，因此在受精前来自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式。发现的印记基因大约80%成簇，这些成簇的基因被位于同一条链上的顺式作用位点所调控，该位点被称做印记中心(imprinting center, IC)。印记基因的存在反映了性别的竞争，从发现的印记基因来看，父方对胚胎的贡献是加速其发育，而母方则是限制胚胎发育速度，亲代通过印记基因来影响其下一代，使它们具有性别行为特异性以保证本方基因在遗传中的优势。印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病。研究发现许多印记基因对胚胎和胎儿出生后的生长发育有重要的调节作用，对行为和大脑的功能也有很大的影响，印记基因的异常同样可诱发癌症。 -巨舌-巨人症综合征(BWS )BWS患者表现为胚胎和胎盘过度增生，巨舌，巨大发育，儿童期易发生肿瘤。该病主要是由11号染色体上的IGF2和CDKN1C两个印记基因的错误表达引发，IGF2为父本表达的等位基因，CDKN1C为母本表达的等位基因。父本单亲二体型(uniparental disomies, UPDs)是引发BWS的主要原因，即IGF2基因双倍表达，CDKN1C基因不表达；次要原因是母本的CDKN1C等位基因发生突变[22]；极少数病例是由于母本的染色体发生移位造成CDKN1C基因失活和(或)造成母本的IGF2基因表达。其它一些印记基因在胚胎发育过程中的过量或缺失表达也可导致类似于BWS的综合征，如原来母本表达的IPL基因的不表达或母本的ASCL2基因逃避印记都将导致胚胎的过度发育。这表明父本表达的等位基因对胚胎的生长有促进作用，而母本表达的等位基因对胚胎的发育起到限制作用。基因组印记与Prader-Willi/Angelman综合征(PWS/AS)PWS表现为肥胖、身材矮小和轻度智力发育迟缓；AS表现为共济失调、过度活跃、严重智障、少语、表情愉悦，这两种疾病都和神经功能失调相关。PWS是由于突变导致父本印记基因在大脑中高表达所致，如SNPNP基因高表达；AS是由于母本的UBE3A基因的缺失或受到抑制所致，该基因编码泛素蛋白连接酶并在脑中表达。父本表达的SNRNP基因的微缺失可导致PWS，而在其上游进一步缺失则可导致AS，这说明这两个区域就是印记中心所在的位置。如果缺失父本染色体上的PWS印记中心将导致SNRNP基因以及附近的父本表达的等位基因被抑制，而缺失父本染色体上的AS印记中心则没什么变化，但若缺失母本染色体上的AS印记中心将导致UBE3A被抑制而导致AS。 印记丢失不仅影响胚胎发育并可诱发出生后的发育异常，从而导致癌症发生。如果抑癌基因有活性的等位基因失活便提高了发生癌症的几率，例如IGF2基因印记丢失将导致多种肿瘤,如Wilm"s 瘤。和印记丢失相关的疾病还有成神经细胞瘤，急性早幼粒细胞性白血病，横纹肌肉瘤和散发的骨肉瘤等。与基因组印记相关的疾病常常是由于印记丢失导致两个等位基因同时表达，或突变导致有活性的等位基因失活所致。调控基因簇的印记中心发生突变将导致一系列基因不表达，引发复杂综合征。基因组印记的本质仍为DNA修饰和蛋白修饰，所以和印记相关的蛋白发生突变也将导致表观遗传疾病。

所谓表观遗传学,就是不改变基因的序列,通过对基因的修饰来调控基因的表达.所以,基因表达的表观遗传学调控,就是通过各种表观遗传的修饰方式来对基因进行调控.目前,已知的表观遗传现象有：DNA甲基化（DNA methylation）,基因组印记（genomic impriting）,母体效应（maternal effects）,基因沉默（gene silencing）,核仁显性,休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等.

表观遗传学又称“拟遗传学”、“表遗传学”、“外遗传学”以及“后遗传学”（英文epigenetics），在生物学和特定的遗传学领域，研究的是在不改变DNA序列的提前下，某些机制所引起的可遗传的基因表达或细胞表现型的变化。表观遗传学是20世纪80年代逐渐兴起的一门学科，是在研究与经典孟德尔遗传学遗传法则不相符的许多生命现象过程中逐步发展起来的。表观遗传现象包括DNA甲基化、RNA干扰、组织蛋白修饰等。与经典遗传学以研究基因序列影响生物学功能为核心相比，表观遗传学主要研究这些“表观遗传现象”的建立和维持的机制。其主要研究内容包括大致两方面内容。一类为基因选择性转录表达的调控，有DNA甲基化，基因印记，组蛋白共价修饰，染色质重塑。另一类为基因转录后的调控，包含基因组中非编码的RNA，微小RNA，反义RNA，内含子及核糖开关等。表观遗传学指基因组相关功能上的改变而并不涉及核苷酸序列的变化。例如DNA甲基化和组蛋白修饰，两者均能在不改变DNA序列的前提下调节基因的表达。阻遏蛋白能通过结合沉默基因从而控制基因的表达。这些变化可能通过细胞分裂得以保留，并且可能持续几代。然而，这些变化都不涉及任何基因序列的改变，取而代之的是这些非基因因素导致生物体的基因表现出（或“自我表达”）不同。由于目前尚不清楚组蛋白的化学修饰是否可遗传，有人对于用此术语描述组蛋白的化学修饰也提出了异议。————————————————————————————————————————表观基因组（英语：Epigenome）记录着一生物体的DNA和组蛋白的一系列化学变化；这些变化可以被传递给该生物体的子代。 改变表观基因会导致染色体结构以及基因作用发生变化。[1] 表观基因参与基因表达、个体发展、组织分化和转座子的抑制过程。不同于其底层的基因，表观基因对于个体而言并不是基本静态不变的，而是可以被环境因素动态更改的。表观基因现在是癌症研究的热门话题之一。 人类肿瘤由 DNA 甲基化和组蛋白修改模式的破坏造成。————————————————————————————————两者有相互交叉的地方，就好像遗传学和基因组学一样。但总的来说，表观基因组学是基于表观遗传学的基础上，所以表观遗传学范围要大一点。

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic impriting），母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等。印记基因可通过如下主要途径参与肿瘤的形成：①抑癌基因的两个等位基因若发生杂合缺失（loss of heterozygosity，LOH）或UPD等事件，使有功能的拷贝失活；②原癌基因印记丢失（loss of imprinting，LOI），导致双等位基因表达，基因产物成倍增加；③印迹中心功能丧失引起一组相关印记基因异常表达而导致癌变。 最早在Wilm"s瘤观察到印迹基因与癌相关，当时的研究发现，11p的杂合缺失总是母源等位基因的丢失。随后研究又发现，在11p15有成簇的印记基因，包括父源表达的IGF2，母源表达的生长抑制基因H19和CDKNIC（p57KIP2），这就提示，在11p15母源基因丢失时，导致了IGF2的表达保留，而上述两个生长抑制基因失去表达。目前已发现人类的多种癌症与印迹基因有关，不同类型的成人和儿童肿瘤中存在IGF2基因的印记丢失，包括乳腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、绒癌和睾丸肿瘤等。

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic imprinting），母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等。表观遗传学是与遗传学(genetic)相对应的概念。遗传学是指基于基因序列改变所 致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学 则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变 化等；表观基因组学(epigenomics) 则是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。

所谓表观遗传学，就是不改变基因的序列，通过对基因的修饰来调控基因的表达。所以，基因表达的表观遗传学调控，就是通过各种表观遗传的修饰方式来对基因进行调控。目前，已知的表观遗传现象有：dna甲基化（dnamethylation），基因组印记（genomicimpriting），母体效应（maternaleffects），基因沉默（genesilencing），核仁显性，休眠转座子激活和rna编辑（rnaediting）等。

所谓表观遗传学,就是不改变基因的序列,通过对基因的修饰来调控基因的表达.所以,基因表达的表观遗传学调控,就是通过各种表观遗传的修饰方式来对基因进行调控.目前,已知的表观遗传现象有：DNA甲基化（DNA methylation）,基因组印记（genomic impriting）,母体效应（maternal effects）,基因沉默（gene silencing）,核仁显性,休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等.

1表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科2 表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic impriting），母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等。3 组印记与癌症 印记丢失不仅影响胚胎发育并可诱发出生后的发育异常，从而导致癌症发生。如果抑癌基因有活性的等位基因失活便提高了发生癌症的几率，例如IGF2基因印记丢失将导致多种肿瘤,如Wilm"s 瘤。和印记丢失相关的疾病还有成神经细胞瘤，急性早幼粒细胞性白血病，横纹肌肉瘤和散发的骨肉瘤等。

谓表观遗传学,核仁显性,就是通过各种表观遗传的修饰方式来对基因进行调控.所以,基因组印记（genomic impriting）,已知的表观遗传现象有,就是不改变基因的序列,基因表达的表观遗传学调控：DNA甲基化（DNA methylation）.目前,通过对基因的修饰来调控基因的表达,母体效应（maternal effects）,基因沉默（gene silencing）,休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等.

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic impriting），母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等。印记基因可通过如下主要途径参与肿瘤的形成：①抑癌基因的两个等位基因若发生杂合缺失（loss of heterozygosity，LOH）或UPD等事件，使有功能的拷贝失活；②原癌基因印记丢失（loss of imprinting，LOI），导致双等位基因表达，基因产物成倍增加；③印迹中心功能丧失引起一组相关印记基因异常表达而导致癌变。 最早在Wilm"s瘤观察到印迹基因与癌相关，当时的研究发现，11p的杂合缺失总是母源等位基因的丢失。随后研究又发现，在11p15有成簇的印记基因，包括父源表达的IGF2，母源表达的生长抑制基因H19和CDKNIC（p57KIP2），这就提示，在11p15母源基因丢失时，导致了IGF2的表达保留，而上述两个生长抑制基因失去表达。目前已发现人类的多种癌症与印迹基因有关，不同类型的成人和儿童肿瘤中存在IGF2基因的印记丢失，包括乳腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、绒癌和睾丸肿瘤等。

表观遗传学是指表观遗传学改变 (DNA 甲基化、组蛋白修饰和非编码 RNA 如 miRNA) 对 表观基因组基因表达的调节，这种调节不依赖基因序列的改变且可遗传表观。因素如 DNA 甲基化、组蛋白修饰和 miRNA 是对环境刺激因素变化的反映，这些表观遗传学因素相互作用以调节基因表达，控制细胞表型，所有这些表观遗传学因素都是维持机体内环境稳定所必需的，有助于正常生理功能的发挥。组蛋白的翻译后修饰不仅与染色体的重塑和功能紧密相关，而且在决定细胞命运、细胞生长以及致癌作用的过程中发挥着重要的作用，如组蛋白磷酸化就在有丝分裂、细胞死亡、DNA 损伤修复、DNA 复制和重组过程中发挥着直接的作用。组蛋白翻译后修饰多发生在组蛋白的 N-端尾部，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、ADP-核糖基化、泛素化和小分子泛素化修饰，这些修饰有助于其他蛋白质与 DNA 的结合，从而产生协同或者拮抗作用来调控基因转录。例如，乙酰化使组蛋白尾部正电荷减少，从而削弱了与带负电荷 DNA 骨架的作用，而促进染色质呈开放状态, 甲基化激活或抑制基因功能主要依赖于修饰的位点，主要与赖氨酸残基的单甲基化、双甲基化或三甲基化有关。组蛋白修饰最基本的作用是调控基因表达。例如组蛋白甲基化多导致基因沉默，去甲基化则相反；乙酰化一般是转录激活，去乙酰化则相反。当然，也可在此基础上产生复杂的生物学效应。例如组蛋白去乙酰化酶 HDAC 可影响免疫系统；H3K4me3、H3K9me2 能够调控记忆的形成, 而且 H3K 甲基化与 X 染色体失活、基因组印记和异染色质形成有关；H3 乙酰化通过多种机制调控以来 ATP 的染色质重塑 ，并参与炎症反应；H2A、H2B 泛素化则与 DNA 损害反应有关；而 H3S28 磷酸化与 H3K27 乙酰化可激活转录并拮抗聚梳基因 polycomb 沉默，另外磷酸化不仅是某些信号转导通路的重要中间步骤，而且常与其他类型的修饰相互作用，共同参与细胞分裂、影响细胞周期。乙酰化是这些修饰中研究得最多的。组蛋白乙酰化与基因活化以及 DNA 复制相关，组蛋白的去乙酰化和基因的失活相关。乙酰化转移酶（HATs）主要是在组蛋白 H3、H4 的 N 端尾上的赖氨酸加上乙酰基，去乙酰化酶（HDACs）则相反，不同位置的修饰均需要特定的酶来完成。乙酰化酶家族可作为辅激活因子调控转录，调节细胞周期，参与 DNA 损伤修复，还可作为 DNA 结合蛋白。去乙酰化酶家族则和染色体易位、转录调控、基因沉默、细胞周期、细胞分化和增殖以及细胞凋亡相关。组蛋白乙酰化和去乙酰化乙酰化修饰是一个在细胞核或细胞质的亚细胞器内广泛存在的翻译后修饰调控机制，参与了转录、趋化作用、新陈代谢、细胞信号转导、应激反应、蛋白质水解、细胞凋亡，以及神经元的发育等多个过程。赖氨酸乙酰化是一种典型的蛋白质翻译后修饰，最先在组蛋白中被发现。所以，起初的赖氨酸乙酰化研究一直集中于组蛋白领域 (Histone H1, H2, H3, H4)，研究人员发现这种修饰能够调节很多细胞功能，例如基因表达、核染色质重构和细胞周期。直到最近十年，赖氨酸乙酰化才被证明能够发生在除了组蛋白的其他蛋白质中，而且同样能够影响许多细胞内的调控过程。自从发现第 1 个非组蛋白 p53 的赖氨酸乙酰化修饰以来，越来越多的赖氨酸乙酰化修饰被发现，其中转录因子占了相当的比重。Choudhary 等鉴定出 29 个转录因子上的 40 个乙酰化位点，这些赖氨酸乙酰化修饰的转录因子调控着细胞中不同的生物学过程。（蛋白质乙酰化修饰研究进展）目前，对于 p53 的乙酰化修饰已经研究得较为清楚，在 p300/CBP 的催化下，p53 的 C 端 DNA 结合调控区域上发生多个赖氨酸位点的乙酰化修饰，从而激活 p53 上特异 DNA 结合区域的活化。还比如 AP-1，ATF-5，BMAL1，CBP,Cytokeratin，E2F-4,EF-1,HMG-1,Hsp90,Hsp70,ku-70,stat3,Ub,NF-E4,NF-Kb-p65 P73,Nrf2,P300,PTEN,Ref-1 等，修饰后的蛋白质可以对细胞内的各类通路进行精确的调节与控制。组蛋白甲基化是指在组蛋白甲基转移酶催化下组蛋白 H3 和 H4 的 N 端赖氨酸或者精氨酸残基发生的甲基化，组蛋白赖氨酸甲基化由不同的特异性组蛋白赖氨酸甲基转移酶催化。SUV39 蛋白是第一个被发现的组蛋白甲基转移酶，能特异性地使组蛋白 H3K9 甲基化。根据每一位点甲基化程度的不同，赖氨酸残基能分别被单甲基化、双甲基化和三甲基化。组蛋白磷酸化在有丝分裂、细胞死亡、DNA 损伤修复、DNA 复制和重组过程中发挥着直接的作用。例如，组蛋白 H3N 端的磷酸化可能促进染色质在有丝分裂期间的凝集。在哺乳动物中，aurora B 是有丝分裂时 H3S10 磷酸化的激酶，但是在存在 aurora B 对 H3S10 的磷酸化是不够的。牛痘苗相关激酶 1 是哺乳动物 NHK1 的同系物，它能在体内和体外直接使组蛋白 H3T3 和 H3S10 磷酸化，而失去 VPK1 的活性，组蛋白 H3 的磷酸化也将减少。组蛋白 H1 被细胞周期蛋白依赖的磷酸化是其翻译后主要的修饰作用。组蛋白 H1 的磷酸化能够影响 DNA 二级结构的改变和染色体凝集状态的改变。另一方面，组蛋白 H1 的磷酸化需要 DNA 的复制，并且激活 DNA 复制的蛋白激酶也促进组蛋白 H1 的磷酸化。组蛋白 H4 N 端的磷酸化可能促进染色质在有丝分裂期间的凝集。组蛋白 H1 的磷酸化能够影响 DNA 二级结构的改变和染色体凝集状态的改变。此外，组蛋白 H1 的磷酸化需要 DNA 的复制，并且激活 DNA 复制的蛋白激酶也促进组蛋白 H1 的磷酸化。因此，二者存在一个协同发生的机制。

X染色体上。次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷症（hgprt缺陷症）呈X连锁隐性遗传,基因定位于Xq26-q27.2,患者均为男性,患者的母亲为致病基因携带者.1964年,Lesch和Nyhan曾描述了这样一种病例:患儿发作性地用牙齿咬伤自己的指尖和口唇,或将自己的脚插入车轮的辐条之间,患儿的知觉是正常的,一边由于疼痛而悲叫,一边仍继续这种自残行为.当时医学界将这种疾病称为Lesch-Nyhan综合征(Lesch-Nyhan syndrome,OMIM #300322)或自毁容貌(self-mutilation)综合征.本病是一种由于次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT)缺陷所致的疾病,故又称为HGPRT缺陷症.HGPRT是体内核酸补救合成途径的关键酶,它的缺陷使次黄嘌呤,鸟嘌呤向相应核苷酸的转化受阻,底物在体内堆积,特别是在神经系统中的堆积,进而引起发病。

拒绝赌博：被称作心灵杀手的“赌博”与“毒品”一起并称为危害人类心灵的杀手，作为赌博，其危害性常常是家破人亡。Part1：古人看赌博一掷千金浑是胆，家无四壁不知贫，赌博历来为世人所深恶痛绝。蒲松龄在《日用俗字》中说：“天下之倾家者，莫过于赌博，天下之败德者，亦莫甚于赌博。”清代吴文晖在《赌徒》诗中吟道：“相唤相互日征逐，野狐迷人无此酷。一场赌博几家贫，后车谁鉴前车覆”。黄安涛的《戒赌诗》曰：已将华屋付他人，那惜良田贻祖父；室人交滴泪如雨，典到嫁时衣太苦；出门郎又摇摊去，厨下无烟炊断午；”，形象生动地道出了赌博的危害无穷，真诚地劝戒世人戒赌。Part2：如何戒赌？为了帮助身边的亲人朋友戒掉赌瘾， 我们该怎么办呢？首先， 建议大家须认识到赌瘾是一种不能强行控制的病态，要求戒赌不能强迫“一步到位”，可采取逐步减少赌注金额和赌博时间的办法，循序渐进戒赌；其次，对嗜赌者要有足够的耐心和关怀，不要吝啬家庭的温暖和身体力行的鼓励，亲人言语之间切忌埋怨或恶语相向，否则可能导致其“破罐破摔”；再次，应鼓励嗜赌者参与有益身心的活动，远离赌博的外部环境;最后，鼓励和支持赌友创业干实事，这种支持不应只是金钱上的帮助，更多应是技术上、信息上的扶持以及情感上的寄托。Part3：赌博成瘾的原因其实说一千道一万最好的方法就是防患与未然。大家可能发现其实我们身边的人并不是每个人都对赌博那么热衷上瘾，即使人为让他天天赌博也不会上瘾。这到底是什么原因呢？基因解码的科学家告诉您，其实赌博成瘾是跟我们身体里的基因有关系的呢。成瘾有关的基因可能有10个或者100个，但每一个基因都会提高染上赌瘾的可能性。若要知道一个人是否有赌瘾，可以通过基因解码，将基因信息中隐藏的信息解读出来。然后针对性的进行预防，就能做到未雨绸缪、防患于未然。Part4：案例分享佳学基因儿童成长呵护基因解码赌博成瘾项目曾检测出一位只有几岁孩子有赌博成瘾的风险，审慎的基因信息分析鉴定了赌瘾产生的原因。在三岁时就得以发现，将会对孩子的理解、教育产生多大的帮助啊！当这份基因解码报告经过特快专递，送到孩子父母的手中后，母亲尤其欣喜地告诉我们，对孩子的基因信息分析常准确。因为尽管孩子的母亲和孩子的父亲虽然都很正能量，但是却很喜欢博彩游戏。每次玩儿的时候都有其他任何娱乐项目无法替代的快感。所以孩子的赌瘾高风险正是来自于父母的基因传递。在这次检测中，父母不仅验证了来自基因的赌性，同时也获得其他另外104项关于孩子的潜能开发和健康成长的关键信息。手中有了养育孩子的说明书，让家长对孩子的关照更坦然、更有信心。知道的力量：知道疾病风险，我们会有更多的时间去改变生活方式，去寻找治疗方法，或许疾病会延缓甚至不发生；知道致病原因，我们会更准确的制定治疗方案，或许就不会错过治疗时间，不会白白浪费金钱；知道，我们会卸下精神的枷锁，而不必每天都活在未知的恐惧中！佳学基因简介：佳学基因医学技术（北京）有限公司是由我国著名分子生物学家黄家学教授所带领的医学专家团队打造的、一个专注于基因信息解读的高科技公司。基因解码，为基因检测升级换代！

要配对的有。获取目的基因 构件表达载体跟谜底基因的检测与鉴定。基本操作步骤提取目的基因　　获取目的基因是实施基因工程的第一步。如植物的抗病（抗病毒 抗细菌）基因， 转基因荧光蝌蚪种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。 　　要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。 　　直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。 　　用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。 　　目前人工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。 目的基因与运载体结合　　基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 　　将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体， 首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。 将目的基因导入受体细胞　　将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。 　　基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌和动植物细胞等。 　　用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。例如，如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。 目的基因的检测和表达　　目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。 　　以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

在DNA分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变，使得碱基配对必须遵循一定的规律，这就是Adenine（A，腺嘌呤）一定与Thymine（T，胸腺嘧啶）配对，Guanine（G，鸟嘌呤）一定与Cytosine（C，胞嘧啶）配对，反之亦然。

碱基互补配对原则是在自然界就存在的规则。。。因为碱基之间有识别性。。。。腺嘌呤与胸腺嘧啶之间有两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间有三个氢键，即A＝T, G≡C根据碱基互补配对的原则，一条链上的A一定等于互补链上的T；一条链上的G一定等于互补链上的C，反之如此。因此，可推知多条用于碱基计算的规律。规律一：在一个双链DNA分子中，A=T、G=C。即：A+G=T+C或A+C=T+G。也就是说，嘌呤碱基总数等于嘧啶碱基总数，各占全部碱基总数的50%。规律二：在双链DNA分子中，两个互补配对的碱基之和的比值与该DNA分子中每一单链中这一比值相等。(A1+A2+T1+T2)/(G1+G2+C1+C2)=(A1+T1)/(G1+C1)=(A2+T2)/(G2+C2)规律三：DNA分子一条链中，两个不互补配对的碱基之和的比值等于另一互补链中这一比值的倒数，即DNA分子一条链中 的比值等于其互补链中这一比值的倒数。(A1+G1)/(T1+C1)=(T2+C2)/(A2+G2)规律四：在双链DNA分子中，互补的两个碱基和占全部碱基的比值等于其中任何一条单链占该碱基比例的比值，且等于其转录形成的mRNA中该种比例的比值。即双链(A+T)%或(G+C)%=任意单链 (A+T)%或(G+C)%=mRNA中 (A+U)%或(G+C)%。 规律五：不同生物的DNA分子中，其互补配对的碱基之和的比值(A+T)/(G+C)不同，代表了每种生物DNA分子的特异性。

碱基互补配对原则是在自然界就存在的规则。。。因为碱基之间有识别性。。。。腺嘌呤与胸腺嘧啶之间有两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间有三个氢键，即A＝T, G≡C根据碱基互补配对的原则，一条链上的A一定等于互补链上的T；一条链上的G一定等于互补链上的C，反之如此。因此，可推知多条用于碱基计算的规律。规律一：在一个双链DNA分子中，A=T、G=C。即：A+G=T+C或A+C=T+G。也就是说，嘌呤碱基总数等于嘧啶碱基总数，各占全部碱基总数的50%。规律二：在双链DNA分子中，两个互补配对的碱基之和的比值与该DNA分子中每一单链中这一比值相等。(A1+A2+T1+T2)/(G1+G2+C1+C2)=(A1+T1)/(G1+C1)=(A2+T2)/(G2+C2)规律三：DNA分子一条链中，两个不互补配对的碱基之和的比值等于另一互补链中这一比值的倒数，即DNA分子一条链中 的比值等于其互补链中这一比值的倒数。(A1+G1)/(T1+C1)=(T2+C2)/(A2+G2)规律四：在双链DNA分子中，互补的两个碱基和占全部碱基的比值等于其中任何一条单链占该碱基比例的比值，且等于其转录形成的mRNA中该种比例的比值。即双链(A+T)%或(G+C)%=任意单链 (A+T)%或(G+C)%=mRNA中 (A+U)%或(G+C)%。 规律五：不同生物的DNA分子中，其互补配对的碱基之和的比值(A+T)/(G+C)不同，代表了每种生物DNA分子的特异性。

基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerasechainreaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。PCR技术是由Cetus公司和加利福尼亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为KaryBmulis和HeneryA、Erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首次报道PCR方法以来，PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人KaryB、mulis获1993年诺贝尔化学奖。为了使PCR技术在临床上迅速得以普及，我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技术变得简单、微量化、不易发生污染，从而使PCR技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。一、PCR的基本原理和基本程序PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在TaqDNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5"到3"方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量，n为PCR的循环次数。E为PCR循环扩增效率。设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次，靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若E=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物—模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。PCR反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和扩增效率，起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量，dNTp浓度，非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。二、PCR的特点（一）特异性高：首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymeraseI的Klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的TaqDNA聚合酶，在热变性处理时不被灭活，不必在每次循环扩增中再加入新酶，可以在较高温度下连续反应，显著地提高PCR产物的特异性，序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一，足可以提供特异性分析，选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。（二）高度敏感：理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上，实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。（三）快速及无放射性：一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增，加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成，不用分离提纯病毒，DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物，可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测，省去费时繁杂的提纯程序，扩增产物用一般电泳分析即可，不一定用同位素，无放射性易于推广。（四）简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱繁琐的基因方法，可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因，省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点，扩增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相应酶切位点的载体中。（五）可扩增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA，再将得到的单链cDNA进行PCR扩增，即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段，有些外显子分散在一段很长的DNA中，难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板，则可将外显子集中，用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。三、PCR方法（一）试剂（1）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生物都有自己特异的引物。（2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。（3）10×PCR缓冲液：500mmol/lKCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/LMgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。（4）5mmol/LdNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。（5）DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。（二）操作程序过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下：（1）向一微量离心管中依次加入DNA模板102-105拷贝引物各1μmol/LdNTP各200μmol/L10×PCR缓冲液1/10体积ddH2O补到终体积（终体积50μl-100μl）混匀后，离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25μl，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。（2）加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。（3）冷至延伸温度时，加入1-5uTaqDNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。（4）PCR的循环程序为：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。PCR尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解，就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。他们先从组织标本中提取DNA，再用PCR进行特异性的DNA扩增，应用这种方法，他们成功地从保存30至40年之久的组织标本DNA中扩增了HPV病毒基因片段。但这种方法需要提取DNA，操作比较繁琐。1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。加入400μl二甲苯脱脂，离心除去二甲苯，用400μl95%乙醇洗去残余二甲苯。离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应基质，将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法进行DNA扩增。在应用PCR方法检测RNA病毒时，首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增，因为PCR只能对DNA模板进行扩增，我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR，简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录，反转录需要在反转录酶的作用下完成。四、PCR反应的基本条件及其对PCR的影响（一）模板核酸PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。（二）引物PCR结果的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由特异引物限定的。因此，引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高，且需纯化。冻干引物于-20℃至少保存12-24个月，液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。PCR反应中引物的量也影响PCR扩增效果，当PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.2～1μmol/L为宜，但我们实验发现，最适浓度远远低于此浓度。（三）缓冲液PCR反应的缓冲液的目的是给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，△pKa值为-0.021/℃。因此，20mmol/lTris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中，pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。反应混合液中50mmol/L以内的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/lNaCl或50mmol/L以上的KCl则抑制TaqDNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+，其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明胶（0.01%）或Tween20（0.05%～0.1%）有助于酶的稳定，反应中加入5mmol/l的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。（四）Mg2+Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性，这是TaqDNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。因为TaqDNA聚合酶需要的是游离Mg2+。（五）三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入（即所谓的“热力背信”），因此应当避免。一般认为最适的dNTP浓度为50～200μmol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。（六）耐热DNA聚合酶PCR之所以能得到广泛应用，主要是因为TaqDNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段。TaqDNA聚合酶是从水生栖热菌ThermusAquaticus（Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶，使用TaqDNA聚合酶不仅简化了PCR程序，也极大地增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高（79℃），使引物在高温下进行退火和延伸，这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在PCR反应中，每100μl反应液中含1-2.5uTaqDNA聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。TaqDNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。（七）温度循环参数1．变性温度与时间PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开，才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高，时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响TaqDNA聚合酶的活性，所以通常选用变性温度为95℃30s为宜。在PCR反应中第一个循环变性最重要，需时间较长，因模板DNA的链比较长。2．复性温度与时间变性温度是PCR反应成败的关键，复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但是容易出现引物与靶DNA的错配，增加非特异性结合，温度太高不利于复性，大多数PCR反应的复性温度在55℃左右。确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。3．延伸温度与时间引物延伸温度一般为72℃。这个温度即考虑了TaqDNA聚合酶的活性，又考虑到引物和靶基因的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量，72℃时，核苷酸的合成速度为35-100个核苷酸/S，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。4．循环数：循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时、要增加循环次数。另外，酶活性不好，或量不足时也要增加循环次数、以便达到有效的扩增量。五、PCR标本的制备在将TaqDNA聚合酶引入PCR反应，并使之达到自动化之后，PCR反应已变得十分的简单了。但是PCR样品的采集及制备却并非同样简单，而且，许多PCR的失败都归因于标本的制备不当。用于PCR的标本必须经适当处理后才能使用，因为标本中的许多杂质能抑制TaqDNA聚合酶的活性。另外，处理标本可使待扩增DNA暴露，能与引物复性。关于PCR标本制备各种专业书中介绍了许多，我们实验发现操作复杂、不慎便容易造成污染，且不实用。现介绍一种简单快速的处理方法即3%异硫氰酸胍和待检标本混合100℃，10min，离心取上清作为PCR模板即可。六、PCR实验中常见问题对策所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。（一）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因是：TaqDNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。所以在实验中出现假阴性失败时，首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶、增加5-10次循环，一般都会获得成功。如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确，采集标本是否有问题。为了防止假阴性的出现在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高质量好的酶。同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补，尤其是要绝对保证引物的3′端与靶基因的互补。对变异较大的扩增对象，宜采用巢式（Nested）PCR或doublePCR。在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。PCR反应的各温度点的设置要合理。（二）假阳性：PCR结果的假阳性是对被检测标本而言，而反应系统中所扩增的产物是真实的。因为PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增，而造成结果判断上的失误，所以污染是PCR假阳性的主要根源。PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。七、PCR扩增产物的分析法PCR扩增DNA片段只是一个重要手段。扩增片段的检测和分析才是目的，根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小，有助于扩增产物的鉴定，点杂交除可鉴定扩增产物外，还有助于产物的分型；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性与敏感性，最近发展的一系列产物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于产物的精确分析。（一）凝胶电泳分析法PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以前者最常用，通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中，仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解，稍冷后倒入电泳槽。电泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去离子水漂洗2次，每次15min，于UV灯下观察结果并拍照。凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小，检测扩增的情况，还可以用来纯化扩增产物。（二）点杂交当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或法医检验，用非放射性物质（生物素、荧光素和地高辛等）标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。非放射性标记物质稳定性高，使用方便、安全、检测速度快。（三）微孔板夹心杂交法该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域杂交，漂洗后显色即可判断结果，该法需要两个杂交过程来检测一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV的检测，其敏感度可达5个HBvDNA分子。此法的敏感性和特异性与PCR32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA,适于临床实验室常规应用。（四）PCR-ELISA法本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5"端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列。因此，可以通过修饰一个引物的5′端使其携带便于PCR产物固定的功能基因，而通过另一引物5′-端的修饰使产物便于检测。

原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA,这就得到了需要的目的基因了。扩展资料：PCR的每个循环过程包括高温变性、低温退火、中温延伸三个不同的事件：1、变性：加热使模板DNA在高温下（94℃左右）双链间的氢键断裂而形成两条单链。2、退火：使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。3、延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5"一3"方向复制出互补DNA。参考资料来源：百度百科-PCR技术

基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。 PCR技术是由Cetus公司和加利福尼亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为Kary B mulis和HeneryA、Erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首次报道PCR方法以来，PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人Kary B、mulis获1993年诺贝尔化学奖。 为了使PCR技术在临床上迅速得以普及，我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技术变得简单、微量化、不易发生污染，从而使PCR技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。 一、PCR的基本原理和基本程序 PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5"到3"方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。 PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量，n为PCR的循环次数。E为PCR循环扩增效率。设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次，靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若E=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物—模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。PCR反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和扩增效率，起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量，dNTp 浓度，非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。 二、PCR的特点 （一）特异性高：首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶，在热变性处理时不被灭活，不必在每次循环扩增中再加入新酶，可以在较高温度下连续反应，显著地提高PCR产物的特异性，序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一，足可以提供特异性分析，选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。 （二）高度敏感：理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上，实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。 （三）快速及无放射性：一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增，加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成，不用分离提纯病毒，DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物，可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测，省去费时繁杂的提纯程序，扩增产物用一般电泳分析即可，不一定用同位素，无放射性易于推广。 （四）简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱繁琐的基因方法，可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因，省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点，扩增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相应酶切位点的载体中。 （五）可扩增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA，再将得到的单链cDNA进行PCR扩增，即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段，有些外显子分散在一段很长的DNA中，难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板，则可将外显子集中，用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。 三、PCR方法 （一）试剂 （1）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生 物都有自己特异的引物。 （2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。 （3）10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。 （4）5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。 （5）DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。 （二）操作程序 过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下： （1）向一微量离心管中依次加入 DNA模板 102-105拷贝 引物 各1μmol/L dNTP 各200μmol/L 10×PCR缓冲液 1/10体积 ddH2O 补到终体积（终体积50μl-100μl） 混匀后，离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25μl，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。 （2）加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。 （3）冷至延伸温度时，加入1-5u Taq DNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。 （4）PCR的循环程序为：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。 PCR尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解，就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。他们先从组织标本中提取DNA，再用PCR进行特异性的DNA扩增，应用这种方法，他们成功地从保存30至40年之久的组织标本DNA中扩增了HPV病毒基因片段。但这种方法需要提取DNA，操作比较繁琐。1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。加入400μl二甲苯脱脂，离心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去残余二甲苯。离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应基质，将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法进行DNA扩增。 在应用PCR方法检测RNA病毒时，首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增，因为PCR只能对DNA模板进行扩增，我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR，简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录，反转录需要在反转录酶的作用下完成。 四、PCR反应的基本条件及其对PCR的影响 （一）模板核酸 PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。 （二）引物 PCR结果的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由特异引物限定的。因此，引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高，且需纯化。冻干引物于-20℃至少保存12-24个月，液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。 PCR反应中引物的量也影响PCR扩增效果，当PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.2～1μmol/L为宜，但我们实验发现，最适浓度远远低于此浓度。 （三）缓冲液 PCR反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，△pKa值为-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中，pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。 反应混合液中50mmol/L以内的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+，其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明胶（0.01%）或Tween 20（0.05% ～0.1%）有助于酶的稳定，反应中加入5mmol/l 的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。 （四）Mg2+ Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性，这是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp 的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。因为Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。 （五）三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） 四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入（即所谓的“热力背信”），因此应当避免。一般认为最适的dNTP浓度为50～200μmol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。 （六）耐热DNA聚合酶 PCR之所以能得到广泛应用，主要是因为Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不仅简化了PCR程序，也极大地增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高（79℃），使引物在高温下进行退火和延伸，这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在PCR反应中，每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。 （七）温度循环参数 1．变性温度与时间 PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开，才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高，时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响Taq DNA聚合酶的活性，所以通常选用变性温度为95℃30s为宜。在PCR反应中第一个循环变性最重要，需时间较长，因模板DNA的链比较长。 2．复性温度与时间 变性温度是PCR反应成败的关键，复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但是容易出现引物与靶DNA的错配，增加非特异性结合，温度太高不利于复性，大多数PCR反应的复性温度在55℃左右。确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。 3．延伸温度与时间 引物延伸温度一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性，又考虑到引物和靶基因的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量，72℃时，核苷酸的合成速度为35-100个核苷酸/S，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。 4．循环数： 循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时、要增加循环次数。另外，酶活性不好，或量不足时也要增加循环次数、以便达到有效的扩增量。 五、PCR标本的制备 在将Taq DNA聚合酶引入PCR反应，并使之达到自动化之后，PCR反应已变得十分的简单了。但是PCR样品的采集及制备却并非同样简单，而且，许多PCR的失败都归因于标本的制备不当。用于PCR的标本必须经适当处理后才能使用，因为标本中的许多杂质能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外，处理标本可使待扩增DNA暴露，能与引物复性。关于PCR标本制备各种专业书中介绍了许多，我们实验发现操作复杂、不慎便容易造成污染，且不实用。现介绍一种简单快速的处理方法即3%异硫氰酸胍和待检标本混合100℃，10min，离心取上清作为PCR模板即可。 六、PCR实验中常见问题对策 所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。 （一）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因是：Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。所以在实验中出现假阴性失败时，首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循环，一般都会获得成功。如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确，采集标本是否有问题。为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高质量好的酶。同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补，尤其是要绝对保证引物的3′端与靶基因的互补。对变异较大的扩增对象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。PCR反应的各温度点的设置要合理。 （二）假阳性：PCR结果的假阳性是对被检测标本而言，而反应系统中所扩增的产物是真实的。因为PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增，而造成结果判断上的失误，所以污染是PCR假阳性的主要根源。PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。 七、PCR扩增产物的分析法 PCR扩增DNA片段只是一个重要手段。扩增片段的检测和分析才是目的，根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小，有助于扩增产物的鉴定，点杂交除可鉴定扩增产物外，还有助于产物的分型；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性与敏感性，最近发展的一系列产物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于产物的精确分析。 （一）凝胶电泳分析法 PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以前者最常用，通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中，仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解，稍冷后倒入电泳槽。 电泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去离子水漂洗2次，每次15min，于UV灯下观察结果并拍照。 凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小，检测扩增的情况，还可以用来纯化扩增产物。 （二）点杂交 当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或法医检验，用非放射性物质（生物素、荧光素和地高辛等）标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。非放射性标记物质稳定性高，使用方便、安全、检测速度快。 （三）微孔板夹心杂交法 该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域杂交，漂洗后显色即可判断结果，该法需要两个杂交过程来检测一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV的检测，其敏感度可达5个HBv DNA分子。此法的敏感性和特异性与PCR 32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA,适于临床实验室常规应用。 （四）PCR-ELISA法 本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5"端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列。因此，可以通过修饰一个引物的5′端使其携带便于PCR产物固定的功能基因，而通过另一引物5′-端的修饰使产物便于检测。

Sanger法测序原理：　利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3"-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3"-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脱氧核糖的3"位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5"-引物端和以ddC残基为3"端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。

　　sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准！　　sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准，是包括荧光定量PCR Taqman探针法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。科研领域发表基因检测相关文章，必须要有sanger测序验证数据予以支持。　　sanger测序之所以是目前基因检测的国际金标准，是因为sanger测序原理非常科学，过程非常缜密，结果真实可视，准确率非常高，达到99.999%。不需要建库，属于直接测序，直接读取结果，连续读取数据（不是一个点），不需要推导结论，过程明朗数据支撑充分。这项技术是虽然经过了38年，但应用仍然广泛，还是测序的主力军，好多检测其他方法不能替代，她金标准的地位几十年内很难替代。

基因检测的方法不胜枚举，基本的步骤是样本的获取（包括血液、唾液、组织样本等）——处理（如DNA的提取与纯化、文库构建等）——序列测定——序列分析——结果解读——报告撰写。广泛应用的核酸序列测定方法是直接测序法，目前最先进而且被广泛使用的方法和仪器有第一代的Sanger测序法，第二代的高通量测序法（如美国Illumina公司的Hiseq测序仪和华大基因子公司CompleteGenomics开发的测序方法）等。目前也已出现被称为第三代测序技术的方法，如单分子实时DNA测序法。第一代：sanger测序第一代的Sanger测序技术的优点是，测序读长长，能达到800-1K bp，且测序用时短，只需要几十分钟即可完成一次测序，测序准确度高，目前仍是测序的金标准；缺点是通量低、成本高。第二代：高通量测序（NGS）第二代测序技术的优点是测序通量和效率高，成本低廉；缺点是测序读长普遍较短，且用时较长。以目前应用最为广泛的测序仪之一的illumina公司Hiseq2000测序仪为例，其一次测序的数据产出量可达500Gb，但读长为100 bp，且需要耗时14天左右。而Life technology公司的IonProton测序仪是边合成边通过反应体系电位的微小差别来测定碱基序列。第三代：单分子/纳米孔测序由于第二代技术存在短读长和耗时长的缺陷，人们希望第三代测序技术能解决这些缺陷，所以第三代测序技术在长读长和短耗时出发，目前尚未完全成熟，市场应用面还不算广，而且各种测序仪之间差异较大，测序原理也是各出奇招。如Pacific Bioscience公司则是通过在PCR合成DNA的过程中，用显微镜检测由荧光基团标记的dNTP反应后释放出的荧光来测序。而一直未投产的牛津大学研发的测序仪，则是通过检测由核酸外切酶剪切DNA时，“掉落”到检测微孔的核苷酸来测序。

现在全基因组测序用鸟枪法，把所有DNA打碎成短片段，测出所有片段的序列再用超级计算机进行拼接。你说的是老方法，先构建大的长片段文库，这些长片段互相重叠，能涵盖全部基因组，即所谓的骨架scaffold。然后在对文库里每一个克隆进行亚克隆，应该还进行亚亚克隆，得到可以直接测序的短片段克隆，即所谓的可以测序得到Reads的克隆。每个Reads的序列拼接起来，逐级拼接，最后得出每一个长片段克隆的序列，最后进行长片段克隆的拼接，得到每一条染色体的序列。实际上老方法就是分级克隆，再拼接，鸟枪法就是直接得到短片段，不经过克隆，对短片段直接测序、拼接。人类基因组计划最初使用老方法，后来一个公司使用了鸟枪法，最后两种方法同时完成。

基因检测的方法不胜枚举，基本的步骤是样本的获取（包括血液、唾液、组织样本等）——处理（如DNA的提取与纯化、文库构建等）——序列测定——序列分析——结果解读——报告撰写。广泛应用的核酸序列测定方法是直接测序法，目前最先进而且被广泛使用的方法和仪器有第一代的Sanger测序法，第二代的高通量测序法（如美国Illumina公司的Hiseq测序仪和华大基因子公司CompleteGenomics开发的测序方法）等。目前也已出现被称为第三代测序技术的方法，如单分子实时DNA测序法。第一代：sanger测序第一代的Sanger测序技术的优点是，测序读长长，能达到800-1K bp，且测序用时短，只需要几十分钟即可完成一次测序，测序准确度高，目前仍是测序的金标准；缺点是通量低、成本高。第二代：高通量测序（NGS）第二代测序技术的优点是测序通量和效率高，成本低廉；缺点是测序读长普遍较短，且用时较长。以目前应用最为广泛的测序仪之一的illumina公司Hiseq2000测序仪为例，其一次测序的数据产出量可达500Gb，但读长为100 bp，且需要耗时14天左右。而Life technology公司的IonProton测序仪是边合成边通过反应体系电位的微小差别来测定碱基序列。第三代：单分子/纳米孔测序由于第二代技术存在短读长和耗时长的缺陷，人们希望第三代测序技术能解决这些缺陷，所以第三代测序技术在长读长和短耗时出发，目前尚未完全成熟，市场应用面还不算广，而且各种测序仪之间差异较大，测序原理也是各出奇招。如Pacific Bioscience公司则是通过在PCR合成DNA的过程中，用显微镜检测由荧光基团标记的dNTP反应后释放出的荧光来测序。而一直未投产的牛津大学研发的测序仪，则是通过检测由核酸外切酶剪切DNA时，“掉落”到检测微孔的核苷酸来测序。

基因测序是可以不用计算机的。只不过现在光电技术和计算机的应用使得高通量自动快速测序成为可能。目前用于测序的技术主要有Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法，目前Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

摘要： 从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）[1] 发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上图1（右键打开图片可查看大图，下同）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基[1]。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2"和3"都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个 网址 为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。 第二代测序技术 总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。表1和图3对第一代和第二代测序技术各自的特点以及测序成本作了一个简单的比较5，以下我将对这三种主要的第二代测序技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。 Illumine Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的2,4。这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法，它的测序过程主要分为以下4步，如图4. u200b （1）DNA待测文库构建 利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。 u200b （2）Flowcell Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。 u200b （3）桥式PCR扩增与变性 桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增，如图4.a所示。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。 （4）测序 测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3"-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3"-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间，测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约为1周。 Roche 454 Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理是（图5 abc）2： （1）DNA文库制备 454测序系统的文件构建方式和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库（图5a）。 （2）Emulsion PCR （乳液PCR，其实是一个注水到油的独特过程） 454当然DNA扩增过程也和illumina的截然不同，它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。 乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”（水包油），基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。 这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增，并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后，可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。 （3）焦磷酸测序 测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上。这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。 测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，从而导致荧光淬灭，以便使测序反应进入下一个循环。由于454测序技术中，每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，当前454技术的平均读长可达400bp，并且454技术和illumina的Solexa和Hiseq技术不同，它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，这就有可能导致结果不准确。也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。 Solid技术 Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。它基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序（图6）2,4。它的原理是： （1）DNA文库构建 片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。 （2）Emulsion PCR Solid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsion PCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。在扩增的同时对扩增产物的3"端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。3"修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域（图6-a）。Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。 （3）连接酶测序 这一步是Solid测序的独特之处。它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3"-XXnnnzzz-5"。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5"末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图6-a）。这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。这种测序方法也称之为两碱基测序法。当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号，图6-a和图6-b中的比色版所表示的是第1，2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。在记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序。不过值得注意的是，通过这种测序方法，每次测序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在测到末尾后，要将新合成的链变性，洗脱。接着用引物n-1进行第二轮测序。引物n-1与引物n的区别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基（图6-a. 8）。也即是，通过引物n-1在引物n的基础上将测序位置往3"端移动一个碱基位置，因而就能测定第0、1位和第5、6位……第二轮测序完成，依此类推，直至第五轮测序，最终可以完成所有位置的碱基测序，并且每个位置的碱基均被检测了两次。该技术的读长在2×50bp，后续序列拼接同样比较复杂。由于双次检测，这一技术的原始测序准确性高达99.94%，而15x覆盖率时的准确性更是达到了99.999%，应该说是目前第二代测序技术中准确性最高的了。但在荧光解码阶段，鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发生错误就容易产生连锁的解码错误。 第三代测序技术 测序技术在近两三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。 其中PacBio SMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想5，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是： DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记 4 种碱基（即是dNTP）,在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个 DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。PacBio SMRT技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW（零模波导孔）原理：如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。小孔直径有考究,如果直径大于微波波长,能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来，从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长,能量不会辐射到周围，而是保持直线状态（光衍射的原理）,从而可起保护作用。同理,在一个反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔, 即 ZMW(零模波导孔),外径 100多纳米,比检测激光波长小(数百纳米),激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限制在一个小范围(体积20X 10-21 L)里,正好足够覆盖需要检测的部分,使得信号仅来自这个小反应区域,孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中,从而实现将背景降到最低。另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息（图7）。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%,但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。 Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术5。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基（图8）。 该公司在去年基因组生物学技术进展年会(AGBT)上推出第一款商业化的纳米孔测序仪，引起了科学界的极大关注。纳米孔测序（和其他第三代测序技术）有望解决目前测序平台的不足，纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb;错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端;数据可实时读取;通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成);起始DNA在测序过程中不被破坏;以及样品制备简单又便宜。理论上，它也能直接测序RNA。 纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。并且改方法的测序准确性可达99.8%，而且一旦发现测序错误也能较容易地进行纠正。但目前似乎还没有应用该技术的相关报道。 其他测序技术 目前还有一种基于半导体芯片的新一代革命性测序技术——Ion Torrent6。该技术使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片， 一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应池中的PH发生改变，位于池下的离子感受器感受到H+离子信号，H+离子信号再直接转化为数字信号，从而读出DNA序列（图9）。这一技术的发明人同时也是454测序技术的发明人之一——Jonathan Rothberg，它的文库和样本制备跟454技术很像，甚至可以说就是454的翻版，只是测序过程中不是通过检测焦磷酸荧光显色，而是通过检测H+信号的变化来获得序列碱基信息。Ion Torrent相比于其他测序技术来说，不需要昂贵的物理成像等设备，因此，成本相对来说会低，体积也会比较小，同时操作也要更为简单，速度也相当快速，除了2天文库制作时间，整个上机测序可在2-3.5小时内完成，不过整个芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常适合小基因组和外显子验证的测序。 小结 以上，对各代测序技术的原理做了简要的阐述，这三代测序技术的特点比较汇总在以下表1和表2中。其中测序成本，读长和通量是评估该测序技术先进与否的三个重要指标。第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外，其测序核心原理（除Solid是边连接边测序之外）都是基于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，并要保持二代技术的高通量，低成本的优点。 表1：测序技术的比较 表2：主流测序机器的成本测序比较 以下图10展示了当前全球测序仪的分布情况。图中的几个热点区主要分布在中国的深圳（主要是华大），南欧，西欧和美国。 参考文献 原文链接： http://www.huangshujia.me/2013/08/02/2013-08-02-An-Introduction-of-NGS-Sequence.html

1、焦磷酸测序法测序法的基本原理是双脱氧终止法，是进行基因突变检测的可靠方法，也是使用最多的方法。但其过程繁琐、耗时长，灵敏度不高，对环境和操作者有危害，故在临床应用中存在一定的限制。焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力。为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。2、微数字聚合酶链反应该方法为将样品作大倍数稀释和细分，直至每个细分试样中所含有的待测分子数不超过1个，再将每个细分试样同时在相同条件下聚合酶链反应后，通过基因芯片逐个计数。该方法为绝对定量的方法。3、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。该法一般用于检测已知的突变位点。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1976年，台湾科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右）。DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5"-3")的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。4、高效液相色谱法该方法是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异而进行检测的，可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段。与测序法相比，该法简单、快速，不仅可用于已知突变的检测，还可用于未知突变的扫描。但只能检查有无突变，不能检测出突变类型，结果判断容易出错。5、单链构象异构多态分析技术依据单链DNA在某一种非变性环境中具有其特定的第二构象，构象不同导致电泳的迁移率不同，从而将正常链与突变链分离出来。与测序法相比，灵敏性更高。参考资料来源：百度百科-基因突变检测

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基因的基本组成单位是：脱氧核糖核苷酸。基本单位：脱氧核苷酸，由dAMP、dGMP、dCMP和dTMP等四种脱氧核苷酸组成。脱氧核糖核苷酸，简称脱氧核苷酸，是脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，简称DNA）的基本单位。绝大部分存在于细胞核和染色质中，并与组织蛋白结合在一起。一个脱氧核糖核苷酸分子由三个分子组成：一分子含氮碱基、一分子脱氧核糖、一分子磷酸。脱氧核苷酸是DNA的基本结构和功能单位，决定生物的多样性的就是脱氧核苷酸中四种碱基：腺嘌呤（adenine，缩写为A），胸腺嘧啶（thymine，缩写为T），胞嘧啶（禅行cytosine，缩写为C）和鸟嘌呤（guanine，缩写为G）——排列顺序的不同。脱氧核糖核苷酸功能、合成与分解：一、功能。1、脱氧核苷酸是细胞核和线粒体DNA合成和修复的底物。2、dCTP还可能参与磷脂的合成。3、维护细胞完整性和存活。4、脱氧核苷酸供应出现问题，易导致细胞遗传不稳定，增加对突变剂的敏感。二、合成。1、脱氧核苷酸的从头合成：核糖核苷二磷酸在核糖核苷酸还原酶催化下生成脱氧核苷二磷酸，后者再经核苷二磷酸激酶的磷酸化，生成脱氧核苷三磷酸。2、脱氧核苷酸生物合成的补救途径：使用预先形成的脱氧核苷酸和一系列的脱氧核苷激酶、脱氧核苷一磷酸激酶和核苷二磷酸激酶，生成脱氧核苷三磷酸。这两个合成途径提供特定脱氧核苷酸用于DNA合成和修复的能力不同。

参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子都受NF-κB的调控，包括：TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、COX2、趋化因子、粘附分子、集落刺激因子等。此外，锌指蛋白A20、血红素加氧酶-1 (HO-1)等一些抗炎和与细胞凋亡有关的分子如：肿瘤坏死因子受体相关因子-1（tumour-necrosis factor receptor associated factor -1，TRAF-1），抗细胞凋亡的蛋白-1和-2（inhibitor of apoptosis 1/2 , IAP1/ IAP2），TNF 受体相关因子（receptor–associated factors ，TRAF1 /TRAF2），Bcl-2 同源体 A1/Bfl-1和 IEX-IL也都受NF-κB的调控。

真核生物全基因组测序通常采用以下几种方法:1. 短片段序列拼接法(Shotgun sequencing)。先将基因组DNA机械粉碎为较短的片段,再进行序列测定,最后通过生物信息学的方法拼接成完整的基因组序列。这种方法较常用。2. BAC测序(BAC-by-BAC sequencing)。首先根据BAC克隆技术构建真核生物DNA文库,然后选择覆盖整个基因组的BAC克隆进行序列测定,最后拼接组装。这种方法较传统,现已较少使用。3. 茎环序列测定(Scaffolding)。在短枪排序的结果基础上,设计特异探针进行茎环测定,获得较长的DNA序列,这些长序列作为参考序列拼接短片段,获得初步的基因组序列。4. 生物信息学预测和验证(Bioinformatics prediction)。通过已知的相关生物体的基因组信息,利用生物信息学软件进行同源序列预测和比较,设计DNA片段进行验证测序,最后与短片段序列拼接产生基因组序列。5. 第三代测序补充(Third Generation Sequencing)。采用帕比奥或纳米孔等第三代测序平台获得较长的读长序列,与第二代测序的短片段序列结合,可以更容易拼接出高质量的基因组序列。

迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，这些基因所在区段是噬菌体生长繁殖所必需的，在表达载体构建中为不可替代区；而另一部分基因对于噬菌体生长周期不是必需的，这些基因所在区域就称为可替代区，如果用外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，正是这一特点构成了λ噬菌体作为外源基因表达载体的基础。野生型λ噬菌体DNA必须经过改造才能成为理想的载体，其构建过程主要有：①删除基因组中非必需区，建立外源DNA片段的替换点，增加承载外源DNA片段的容量。②在非必需区内插入或替换选择的标记基因和目的基因。③建立重组λDNA分子的体外包装系统，使之有效地感染受体细胞。简而言之，将目的基因插入或替换进入病毒基因组的可替代区，再利用病毒的侵染性，将目的基因导入受体细胞，这就是病毒作为“分子运输车”的基本机理。

位点特异性重组系统由介导基因重组的重组酶和相应的特异性位点组成。重组酶是源于细菌或酵母,可识别特异位点发生精确重组的一类酶。根据序列的同源性及催化氨基酸的特性,重组酶可分为酪氨酸和丝氨酸两个家族[2]。重组酶Cre、Flp、R以及Xis均属于酪氨酸家族,loxp、frt、rs和attp为相应的特异性位点,这些特异性位点DNA序列各异,但大体结构相似,一般均由几十个碱基组成,含有一个6～8bp的核心区域和一对反向重复序列。位点特异性重组系统始于对λ噬菌体溶源化的过程研究,之后人们对其他位点特异性重组系统的重组酶、识别位点、重组机理等进行了深入的研究[3-4]。特异性重组系统在控制植物外源DNA序列的整合中有着重要的作用,它能产生基因的定位。

质粒，噬菌体，动植物病毒

目前经常使用的载体,主要有质粒和病毒两类.携带目的基因的质粒,它本身就是一种稳定而独立的重组DNA分子.因此重组质粒进入受体细胞后,常不需要把所携带的基因转到受体细胞的染色体上去,就会进行自我复制,异源性DNA也得到了复制.另外,叶绿体和线粒体DNA等作为新型运载体,携带目的基因进入受体细胞后,也是游离在细胞质中. 　　除了质粒之外,噬菌体、动植物病毒等也可以作为载体.利用病毒作为基因运载体时,所携带的目的基因一般需要整合到受体细胞的染色体DNA中去,才能成为稳定的结构而独立复制传递.例如λ噬菌体侵染细菌后,并不伤害受体细胞地和细菌拟核DNA整合到一起,随着细菌拟核DNA复制而复制；采用农杆菌介导的遗传转化方法而导入的外源基因,通常都是被整合到染色体DNA中,因此由此获得的转基因植物相关性状呈孟德尔式遗传. 　　在自然界中,SV40等致癌病毒侵染后形成的DNA就是整合到宿主细胞染色体DNA中进行复制的；HIV侵入宿主细胞后经过逆转录形成DNA,形成的DNA再拼接到宿主细胞的核DNA中.

原核微生物的基因重组 （一）转化 (transformation) 转化是细菌中最早被发现的遗传物质转移形式。 l928 年 Griffith 用肺炎链球菌对小鼠的感染实验以及 10 多年后 Avery 等体外转化过程的实现，转化因子 DNA 的证实，是现代生命科学发展的重要起点。 1 ．几个概念 转化 受体菌直接吸收了来自供体菌的 DNA 片段，通过交换把它整合到自己的基因组中，从而获得了新的遗传特性的现象。 转化子（ transformant ） 受体细胞经复制分裂后出现了供体性状的子代。 感受态 (competence) 细菌能够从周围环境中吸收 DNA 分子进行转化的生理状态。（二) 转导 (transduction) 1952 年 Zinder 和 Lederberg 在验证鼠伤寒沙门氏菌是否也存在接合现象时发现了转导现象。 通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的 DNA 片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新性状的受体细胞，称为转导子 (transductant) 。携带供体部分遗传物质 (DNA 片段 ) 的噬菌体称为转导噬菌体。在噬菌体内仅含有供体菌 DNA 的称为完全缺陷噬茵体；在噬菌体内同时含有供体 DNA 和噬菌体 DNA 的称为部分缺陷噬菌体 ( 部分噬菌体 DNA 被供体 DNA 所替换 ) 。根据噬菌体和转导 DNA 产生途径的不同，可将转导分为普遍性转导和局限性转导。 1 ．普遍性转导 (general transduction) 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片断的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。 普遍性转导的机制——“包裹选择模型”，当噬菌体侵染敏感细菌并在细菌内大量复制增殖时，亦把寄主 DNA 降解为许多小的片段，在装配时，少数噬菌体 (10 -6 一 10 -8 ) 错误地包装了宿主的 DNA 片段并能形成“噬菌体”，这种噬菌体称普遍性转导噬菌体 ( 为完全缺陷噬菌体 ) 。随着细菌的裂解，转导噬菌体也被大量释放。当这些转导噬菌体再次侵染受体菌时，其中的供体 DNA 片段被注入受体菌。 如果该 DNA 片段能与受体菌 DNA 同源区段配对，通过遗传物质的双交换而进行基因重组并形成稳定的转导子，称完全普遍性转导。如鼠伤寒沙门氏菌的 P22 噬菌体、大肠杆菌的 P1 噬菌体和枯草芽孢杆菌的 PBS1 和 SP10 等噬菌体中都能进行完全转导。 如果该 DNA 片断不能与受体菌 DNA 进行交换、整合和复制，只以游离和稳定的状态存在，而仅进行转录、转译和性状表达，称流产转异。发生流产转导的细胞在其进行分裂后，只能将这段外源 DNA 分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因转录、转译而形成的少量产物 -- 酶，因此在表型上仍可出现轻微的供体菌特征，每经分裂一次，就受到一次“稀释”。所以能在选择培养基上形成微小菌落就成了流成转导子的特点。 2 ．局限性转导 (specialized transduction) 通过部分缺陷噬的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象）。转导后获得了供体部分遗传特性的重组受体细胞称为局限转导子。 (1) 局限性转导的机制——“杂种形成模型” λ噬菌体的线状双链 DNA 分子的两端为 12 个核苷酸单链（粘性未端 cos 位点），在溶源状态下，以前噬菌体状态存在于细胞染色体上。被诱导后，在裂解细菌时，其以粘性末端形成的环状分子通过滚环复制形成一个含多个基因组的 DNA 多联体，以 2 个 cos 位点之间的距离决定其包装片段的大小而进行切割、包装，最终形成转导噬菌体。在极少数情况下 ( 约 10 -5 ) ，在前噬菌体两端邻近位点上与细菌染色体发生错误的切割，使其重新形成的环状 DNA 中，同时失去前噬菌体的一部分 DNA 和增加了一段相应长度的细菌宿主染色体 DNA ，这样形成的杂合 DNA 可正常被包装、复制。形成的新转导噬菌体称为部分缺陷噬体。因为λ前噬菌体位点两端是细菌染色体的 gal + ( 发酵半乳糖基因 ) 和 bio + ( 利用生物素基因 ) ，故形成的转导噬菌体通常带有 gal + 或 bi0 + 基因，故这些部分缺陷噬菌体表示为λ dga1( 缺陷型半乳糖转导噬菌体 ) 或λ dbio( 缺陷性生物素转导噬菌体 ) 。这些转导噬菌体可重新侵入受体菌，侵入后，噬菌体 DNA 与受体菌的 DNA 同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性。 （ 2 ）局限性转导中的低频转导与高频转导 低频转导 (LFT) ：由于宿主染色体上进行不正常切离的频率极低，因而在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例是极低（ 10 -4 --10 -6 ）的，这种裂解物称为 LFT 裂解物。 LFT 裂解物在低 m.o.i(multiplicity of infection) 情况下感染宿主，就可获得极少量的转导子。高频转导 (HFT) ：形成转导子的频率很高，理论上可达 50 ％，故称之为高频转导。其原因是因为供体菌为双重溶源菌，它同时有两种噬菌体整合在细菌的染色体上。例如，大肠杆菌 K12 株，其双重溶源菌为 E.coli K12( λ / λ dg), 即其前噬体体有λ和λ dg 为缺陷噬菌体，带有供体 gal + 基因，但丢失了部分噬菌体本身的 DNA ；而λ噬菌体为正常噬菌体，不带 gal 基因，但起辅助作用，称为辅助噬菌体，可弥补λ dg 的不足，使λ dg 也能成为“完整噬菌体”而释放。这样，一个细菌便可同时等量地释放出λ dg 和λ两种噬菌体，这时的裂解物称为 HFT 裂解物，当用低 m.o.i 的 HFT 裂解物去感染另一个 E.coligal - 受体菌，是可高频率的把它转化为能发酵乳糖的 E.coli gal + 转导子。这种方式称为高频转导。 当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组，而使后者获得了除免疫以外的新性的现象，称为溶源转变。( 三 ) 接合 (conjugation) 指供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触，而实现大段的 DNA 传递现象。 Iederberg 和 Tatum 于 1946 年设计了一个有名的实验，才证明了原核生物的接合现象。他们筛选出了两种不同营养缺陷型的大肠杆菌 K12 突变株，其中 A 菌株是 met- 、 bio- ， B 菌株是 thr- 、 Leu- ，将它们在完全培养基上混合培养后，再涂布于基本培养基上。结果发现，在基本培养基上出现了 met + 、 bi0 + 、 thr + 、 1eu + 的原养型菌落 ( 约为 10 -7 ) ，而分别涂布的两种亲本菌株对照组都不出现任何菌落。进一步的实验证实，上述遗传重组的形成，是两个亲本细胞接合以后发生基因重组的结果。在细菌中，接合现象发研究最清楚的是 E.coli ，研究发现 E.coli 是有性别分化的，决定性别的是一种质粒，即 F 因子。（四）原生质体融合（ protoplast fusion ） 通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程 . 能进行原生质体融合的细胞是极其广泛的，不仅包括原核生物，而且还包括各种真核细胞。

基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,如何获得目的DNA片段就成为基因工程的关键问题.所需目的基因的来源,不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因.常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选直接获取1.从基因文库中获取 这个没什么就是现成的基因储存在受体菌上你用的时候提取出来就好了（基因组文库法 就是原教材中的用限制性内切酶直接获取.利用λ噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下：① 选用特定限制性内切酶,DNA进行部分酶解,得到DNA限制性片段② 选用适当的限制性内切酶酶解λ噬菌体载体DNA.③ 经适当处理,将基因组DNA限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组.④ 利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒.⑤ 以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌,形成大量噬菌斑,从而形成含有整个DNA的重组DNA群体,即文库.2.cDNA文库法（即原教材中提到的逆转录法）.cDNA文库,是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体.虽然可用基因组文库法来获取真核生物的目的基因,但是由于高等真核生物基因组DNA文库比其cDNA文库大得多,相关工作量同样大得多.更为重要的是,在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子,但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在,所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列,即不能表达真核生物DNA.而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除）,所以可以以真核生物成熟mRNA为模板,逆转录而成的cDNA可被大肠杆菌表达.因此,在基因工程中,cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法.3.直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”,又叫“散弹射击法”.这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟,无论哪一颗弹粒击中目标,都能把鸟打下来.鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段,将这些片段分别载入运载体,然后通过运载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增）,从中找出含有目的基因的细胞,再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来.如许多抗虫,抗病毒的基因都可以用上述方法获得.用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲目性.人工合成1.(主要是序列已知的基因).主要是通过DNA自动合成仪,通过固相亚磷酸酰胺法合成,具体过程可以网上查询,反正是可以按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列,一般适于分子较小而不易获得的基因.对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物,再利用引物获得目的基因.2.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术.它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定.过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成.PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑他只是给目的基因的扩增

呵呵，最近怎么这么多人问噬菌体啊。。。用λ噬菌体做为载体。1. BamH1酶解载体DNA，回收λ噬菌体DNA基因组的长臂与短臂2.同样用BamH1或其他适合的酶酶解基因并回收目的片段3.用碱性磷酸酶处理以防止片段间相互连接。4. 臂与目的片段在较高浓度下相互连接形成较长的线性产物 uf06c噬菌体在体内复制产生多拷贝的基因组线性分子。 这些多连体在cos位点处切开，产生单个λ基因组，再被包装进噬菌体颗粒。 噬菌体外壳蛋白及其DNA加工酶的混合液可在体外将连接后的线性分子包装成噬菌体颗粒。 不含插入片段的λ末端连接物，或远远小于或大于最佳长度20kb的插入片段以及同时含有两条左臂或右臂的重组体是不能生存的。提纯重组后的λ噬菌体先将高浓度未被侵染的，可培养形成连续菌苔的细胞涂布于琼脂板上2.再涂布来自包装反应的被侵染的大肠杆菌细胞 3.在培养后的菌苔上由于反复感染和裂解循环，单个感染细胞处会形成空白区域既噬菌斑。uf0a7重组λDNA 的纯化从噬菌斑中分离出噬菌体颗粒再纯化 从用特异重组噬菌斑感染的培养物的上清中纯化

基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,如何获得目的DNA片段就成为基因工程的关键问题.所需目的基因的来源,不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因.常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选直接获取1.从基因文库中获取 这个没什么就是现成的基因储存在受体菌上你用的时候提取出来就好了（基因组文库法 就是原教材中的用限制性内切酶直接获取.利用λ噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下：① 选用特定限制性内切酶,DNA进行部分酶解,得到DNA限制性片段② 选用适当的限制性内切酶酶解λ噬菌体载体DNA.③ 经适当处理,将基因组DNA限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组.④ 利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒.⑤ 以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌,形成大量噬菌斑,从而形成含有整个DNA的重组DNA群体,即文库.2.cDNA文库法（即原教材中提到的逆转录法）.cDNA文库,是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体.虽然可用基因组文库法来获取真核生物的目的基因,但是由于高等真核生物基因组DNA文库比其cDNA文库大得多,相关工作量同样大得多.更为重要的是,在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子,但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在,所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列,即不能表达真核生物DNA.而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除）,所以可以以真核生物成熟mRNA为模板,逆转录而成的cDNA可被大肠杆菌表达.因此,在基因工程中,cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法.3.直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”,又叫“散弹射击法”.这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟,无论哪一颗弹粒击中目标,都能把鸟打下来.鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段,将这些片段分别载入运载体,然后通过运载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增）,从中找出含有目的基因的细胞,再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来.如许多抗虫,抗病毒的基因都可以用上述方法获得.用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲目性.人工合成1.(主要是序列已知的基因).主要是通过DNA自动合成仪,通过固相亚磷酸酰胺法合成,具体过程可以网上查询,反正是可以按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列,一般适于分子较小而不易获得的基因.对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物,再利用引物获得目的基因.2.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术.它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定.过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成.PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑他只是给目的基因的扩增

大体上应该是可以的，因为噬菌体有环状DNA分子。可以作为载体

基因重组是指一个基因的DNA序列是由两个或两个以上的亲本DNA组合起来的。基因重组是遗传的基本现象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重组现象。减数分裂可能发生基因重组。基因重组的特点是双DNA链间进行物质交换。真核生物，重组发生在减数分裂期同源染色体的非姊妹染色单体间，细菌可发生在转化或转导过程中，通常称这类重组为同源重组（homologous recombination），即只要两条DNA序列相同或接近，重组可在此序列的任何一点发生。然而在原核生物中，有时基因重组依赖于小范围的同源序列的联会，重组只限于该小范围内，只涉及特定位点的同源区，把这类重组称作位点专一性重组(site-specific recombination），此外还有一种重组方式，完全不依赖于序列间的同源性，使一段DNA序列插入另一段中，在形成重组分子时依赖于DNA复制完成重组，称此类重组为异常重组（illegitimate recombination），也称复制性重组（replicative recombination）。 自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种进化的基础。自然界的基因转移的方式有：接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞（细菌）转移至另一细胞(细菌），这种类型的DNA转移称为接合作用（conjugation ）。转化作用（transformation) 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。转导作用：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用（transduction）。转座：大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA 序列包括插入序列和转座子。由插人序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座（transposition ）。基因重组：在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。基因重组包括位点特异性的重组和同源重组两种类型。有整合酶催化的在两个DNA序列特异位点间发生的整合，产生位点特异的重组。特异重组依赖特异的DNA序列，如λ噬菌体的整和酶可识别噬菌体DNA和宿主染色体的特异靶位点，并进行选择性整合；反转录病毒整合酶识别整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列等。另外有发生在同源序列间的同源重组，又称基本重组。同源重组依赖两分子间序列的相同或相似性，将外源DNA整合进宿主染色体。 历史：1936年F. M. Burnet发表了噬菌体能产生突变体的观点，其噬菌斑的外形和野生型的有明显区别，可惜未能引起重视，以致噬菌体遗传学延迟了十几年才得以建立。1946年第11届冷泉港学术讨论会上，在宣布一基因一酶学说的胜利，及Ledernerg、Tatum细菌杂交实验报告的同时，Hershey和Luria宣布发现了噬菌体的r，h突变，Delbrück和Hershey发表了他们各自发现的噬菌体重组，这四项重大的发现分别在1958年和1969年获得了诺贝尔奖。后两项的发现有力地推动了噬菌体遗传学的发展。噬菌体的基因重组和细菌不同，而和真核的重组十分相似。杂交是用标记不同的噬菌体之间进行。然后计算重组噬菌体占总的子代噬菌体的比例来确定重组值。一般可以选用2－4个基因差异的噬菌体来混合感染细菌。首先把不同类型的噬菌体混合起来和细菌一起涂布在固体培养基上，细菌的浓度要达到可以长成菌苔（lawn）的水平，噬菌体的浓度要很稀。每个噬菌体感染一个细菌，经过裂解周期，宿主细胞破裂后，释放出的子噬菌体又去感染周围的细菌，结果在菌苔上形成一个圆形清亮的斑，称为噬菌斑（plaque），而一个噬菌斑来自最初涂布平板时的一个噬菌体。噬菌斑的形态必须选择容易区别的，以表示噬菌体的相应表型。单个的噬菌体只能在电镜下才可观察其形态，突变引起其形态变化没有电镜是无法鉴别的，但突变影响到生活周期，会产生不同的噬菌斑，因此通过噬菌斑的观察我们很容易观察基因型的变化与重组。Hershey等用T2噬菌体的两个不同表型特征：噬菌斑的形态和宿主范围来进行杂交。一个噬菌体的基因型是h+r，另一个噬菌体的基因型是h r+。h+表示宿主范围（hostrange），是野生型，能在E.coliB菌株上生长，r 表示快速溶菌（rapid lysis），产生的噬菌斑大，边缘清楚。h噬菌体能在E.coli B和B/2品系上生长，r+产生小而边缘模糊的噬菌斑，能产生透明的噬菌斑，而h+因只能裂解E.coli B，所以在B和B/2的混合菌上产生的噬菌斑是半透明的。杂交时hr+和h+r混合感染E.coli B和B/2，在B和B/2混合菌苔上出现了四种噬菌斑，表明h r+ 和h+r之间有一部分染色体在B菌株的细胞中进行了重组，释放出的子噬菌体有一部分的基因型为h+r+和h r。我们利用下面的公式就可以计算出和两个位点的重组值：重组值=（h+r++h r）/总噬菌斑数×100%此重组值也表示两个连锁基因之间的遗传距离。

噬菌体菌株的什么基因突变后会产生100%的溶解感染噬菌体的生活史分成两种途径—裂解途径和溶原途）。 仅能裂解生长的噬菌体叫烈性噬菌体（virulent）。 溶原反应只存在在双链DNA噬菌体中，这类噬菌体称为温和性噬菌体（temperate），它们感染细胞质，并不复制。 染色体整合到宿主的染色体中，此时的噬菌体称为原噬菌体。带有原噬菌体的细菌称为溶原性细菌，当它可导致敏感性细菌裂解，故称“溶原”。

蛋白泛素化修饰或者用siRNA（或shRNA）干涉处理。DNA和染色体水平：基因丢失、基因修饰、基因重排、基因扩增、染色体结构变化。转录水平调控：转录起始、延伸、终止均有影响。原核生物借助于操纵子，真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用进行调控。转录后水平调控：真核生物原初转录产物经过加工成为成熟的mRNA，包括加帽、加尾、甲基化修饰等。扩展资料：首先要构建增进转录的载体；为使克隆的目的基因得到有效的表达，必须将目的基因置于强的启动子控制之下：应用乳糖启动子，色氨酸启动子，λ噬菌体左向转录启动子等构建了较为理想的载体。通过修饰调整使目的基因处于正确转译相位。调节SD序列与转译起始位点之间的距离，使克隆基因最有效地表达。除了以大肠杆菌作为表达外源基因的宿主外，在枯草杆菌中也表达产生了乙型肝炎病毒核心抗原、口蹄疫病毒的主要抗原、人的β干扰素以及分泌型的人胰岛素原C肽。参考资料来源：百度百科-基因表达方法

..刚好学到 基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,如何获得目的DNA片段就成为基因工程的关键问题。所需目的基因的来源,不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选 直接获取 1.从基因文库中获取 这个没什么就是现成的基因储存在受体菌上你用的时候提取出来就好了（基因组文库法 就是原教材中的用限制性内切酶直接获取。利用λ噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下：① 选用特定限制性内切酶， DNA进行部分酶解，得到DNA限制性片段② 选用适当的限制性内切酶酶解λ噬菌体载体DNA。③ 经适当处理，将基因组DNA限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组。④ 利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。⑤ 以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从而形成含有整个DNA的重组DNA群体，即文库。）经典解释 2.cDNA文库法（即原教材中提到的逆转录法）。cDNA文库，是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。虽然可用基因组文库法来获取真核生物的目的基因，但是由于高等真核生物基因组DNA文库比其cDNA文库大得多，相关工作量同样大得多。更为重要的是，在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在，所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不能表达真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除），所以可以以真核生物成熟mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大肠杆菌表达。因此，在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。 3.直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。 用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。 人工合成 1.(主要是序列已知的基因)。主要是通过DNA自动合成仪，通过固相亚磷酸酰胺法合成，具体过程可以网上查询，反正是可以按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列，一般适于分子较小而不易获得的基因。对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物，再利用引物获得目的基因。 2.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑 他只是给目的基因的扩增

λ噬菌体的基因组长达50 Kb，共61个基因。

目前经常使用的载体，主要有质粒和病毒两类。携带目的基因的质粒，它本身就是一种稳定而独立的重组DNA分子。因此重组质粒进入受体细胞后，常不需要把所携带的基因转到受体细胞的染色体上去，就会进行自我复制，异源性DNA也得到了复制。另外，叶绿体和线粒体DNA等作为新型运载体，携带目的基因进入受体细胞后，也是游离在细胞质中。　　除了质粒之外，噬菌体、动植物病毒等也可以作为载体。利用病毒作为基因运载体时，所携带的目的基因一般需要整合到受体细胞的染色体DNA中去，才能成为稳定的结构而独立复制传递。例如λ噬菌体侵染细菌后，并不伤害受体细胞地和细菌拟核DNA整合到一起，随着细菌拟核DNA复制而复制；采用农杆菌介导的遗传转化方法而导入的外源基因，通常都是被整合到染色体DNA中，因此由此获得的转基因植物相关性状呈孟德尔式遗传。　　在自然界中，SV40等致癌病毒侵染后形成的DNA就是整合到宿主细胞染色体DNA中进行复制的；HIV侵入宿主细胞后经过逆转录形成DNA，形成的DNA再拼接到宿主细胞的核DNA中。

λ噬菌体的衍生物是一种经过人工改造的λ噬菌体，可用于基因工程的载体。它是一种温和噬菌体，遗传物质是DNA，专门侵染大肠杆菌。因此，不可作为动物基因工程的载体。

λ噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖（图2）：①溶菌性方式（lytic pathway）：在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，λDNA经多次复制合成许多子代λDNA，于是装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。②溶原性方式（lysogenic pathway）：进入细菌的λDNA可整合(integrate）入细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体(prophage)，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。图2　λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式λ噬菌体整个基因组如图3所示，可分为三个部分，①左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。②中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 利用λ噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。现在广泛使用的λ噬菌体载体也是已作过许多人工改造的，主要的改造是：①设计去除λDNA上的一些限制性酶切点。这是因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。②在中段非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacI-lacZ"序列，和多克隆位点等。由此可构建出两类λ噬菌体作载体；一类是插入型载体，可将外来序列插中段，常用的λgt系列载体，一般容许插入5-7kb外来DNA；另一类是转换型载体，即可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。图3　野生型λ噬菌体DNA及相应的λ噬菌体DNA图谱插入或置换中段外来的DNA长度是有一定限制的，当噬菌体DNA长度大于野生型λ噬菌体基因组105%或小于78%时，包装而成的噬菌体存活力显著下降。所以λ噬菌体载体可插入长5-20kb的外来DNA，这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。如果将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA而端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。

载体条件： ① 分子量小，携带外源DNA片段进入受体细胞; ② 复制子，能独立于染色体进行自主复制； ③ 多克隆位点（MCS）； ④ 标记基因，便于选择； ⑤ 拷贝数高，易于分离； ⑥ 安全。 λDNA的特点 ① 噬菌体为温和噬菌体。 ② DNA为双链线性DNA,长度为48502 bp,具有多种限制酶的识别序列,便于外源DNA片段的插入和置换. ③两端有cos位点，可以环化。 cos位点（cohensive-end site）： DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。 λ噬菌体基因组特点 DNA上有66个基因，有一半是必需的，与自身的活动有关；其他约1/3是非必需基因。 λ噬菌体载体的优点 比一般质粒载体容量大的多，可达20kb； 体外包装反应效力高，通常比质粒载体克隆效率 高100倍，适于构建cDNA文库和真核生物基因组文库