工具酶

一,限制性内切酶(Endonucleosase) (一)限制性内切酶(Endonucleosase)的发现与分类 1) 50年代初发现细菌能将外来 DNA 片段在某些专一位点上切断,从而保证其不为外来噬菌体所感染,而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护,这种现象叫做限制-修饰,它们由三个基因位点所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年后,人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理: hsd R---限制性内切酶 hsd M---限制性甲基化酶 hsd S---控制两个系统的表达 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶,Hind II和Hind III,为基因工程技术的诞生奠定了基础. 截止到目前为止,已经分离出400余种II类酶,搞清识别位点的有300种,商品化的约有一百种,而实验室常用的有二十种 . 2)限制性核酸内切酶可分为三大类: I类 能识别专一的 核苷酸 顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性. II类 识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断 III类 识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部. 因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶. (二)II类限制性内切酶的命名及特性 命名原则:取属名的第一个字母大写,取种名的前两个字母小写,构成基本名称.该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等.如存在变种和品系,取变种或品系的一个字母.若酶存在于质粒上,则需大写字母表示非染色体遗传因子. 如,HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶.EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上. (三)II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4,5,6碱基对,这些碱基对的顺序呈回文结构(Palindromic),而且切点就在其内部,如EcoRI 5"-GAATTC-3" . DNA被限制性内切酶切开之后,呈现两种断口: 钝端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等 粘端(粘性末端)如:EcoR I等 图2-1 限制性内切酶产生的末端 (四)识别位点在DNA分子中的频率 对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸(44)有一个识别位点,而六碱基的酶大约4096(46)个核苷酸有一个识别序列,计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的.实践中这种方法不完全正确,如λ DNA长49kb,对于六碱基的酶应该有12个切割位点,实际上要少一些,如Bgl II只有6个,BamHI只有5个,而SalI只有2个. 二,甲基化酶 在专一位点上甲基化,与限制性内切酶相对应. (一)大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶: 可在5"GATC3"序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,这样可使一些识别顺序中含有5"GATC3"的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)则不会因为N6A的甲基化而失去活性,因为这两种酶对底物的特异性不同. dcm甲基化酶 此酶在序列5"CCAGG3"或5"CCTGG3"中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影响的限制性内切酶是EcoR II. (二) 甲基化酶在基因工程中用途 许多II类限制性内切酶,都存在着相对的甲基化酶,它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上,封闭酶切位点,从而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上,从而使DNA免受EcoRI的切割. 三,T4-DNA连接酶(T4-DNA Ligase) 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,连接修复3"端羟基和5"端磷酸基因,脱水形成3"-5"磷酸二酯键 连接双链DNA上的单链缺口(Nick),因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端 连接RNA模板上的DNA链缺口 连接平头双链DNA速度很慢,在高浓度的底物和酶的作用下方可进行,这属于分子之间的连接. 四,核酸酶 作用: 降解磷酸二酯键 分为:外切酶 内切酶 (一) Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性,双链特异的内切酶活性.依赖于Ca2+ 用途: 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化 (二)E. coli外切酶III 只降解DNA分子的一条链,产生单链的DNA分子. (三)S1核酸酶(来源于米曲霉菌) 特性: 1. 降解单链DNA或RNA,降解DNA的速度大于降解的速度 2. 降解发生的方式为内切和外切 3. 酶切活性需4.0-4.5pH环境,Zn2+激活 4. 酶量过大时会降解双链核酸,因为双链降解活性比单链低75000倍 (四) DNase I: 来自于牛胰腺, 既可以降解单链也可以降解双链,没有特异性,产生单核苷酸或短链 五,聚合酶 (一)DNA聚合酶I 5"-3"聚合酶活性 3"-5"外切酶活性 5"-3"外切酶活性 核酸内切酶活性 可以被枯草杆菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5"-3"外切酶活性的分子. (二) Klenow酶 该酶无5"-3"外切活性,保留了5"-3"聚合活性及3"-5"外切活性,基因工程中利用该酶: 修复限制性内切酶造成的5"突出的粘性末端 标记DNA探针 催化cDNA第二条链的合成 末端终止法测序 图2-4 Klenow 酶的作用方式 (三) T4 DNA聚合酶 与Klenow酶相似,外切酶活性更高.体外诱变反应中效率很高. (四)T7 DNA聚合酶 测序酶 (五) Taq DNA聚合酶 耐高温,主要用于 PCR 反应. (六) 逆转录酶:将mRNA转录成cDNA AMV逆转录酶(鸟类成髓细胞性白血病病毒) DNA聚合酶活性 RNase H活性 DNA内切酶活性 核酸结合活性 M-MLV逆转录酶(Moloney鼠白血病病毒) 两种逆转录酶的区别 肽链的组成 禽酶2条肽链,具聚合酶和很强的RNase H活性 鼠酶1条,较弱的RNase H活性 反应的最适温度 禽酶42°C,二级结构丰富RNA,禽酶效率高 反应的最适pH值 禽酶pH 8.3 鼠酶pH 7.6 六,DNA修饰酶 有大量的修饰酶,主要的有以下几种: 1) 碱性磷酸酯酶(来自于大肠杆菌或小牛肠道)可以去掉DNA分子的5"端的磷酸基团. 2) polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌,在5"端增加磷酸基团. 3) 末端脱氧核苷酸 转移酶 (terminal deoxynucleotidyl tansferase) 来自于小牛胸腺 组织 ,在DNA分子的3"端增加一个或多个脱氧核苷酸. 4) Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构 第二节 DNA的切割反应 一,缓冲系统的组成 II类酶的酶活条件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM 根据不同酶对盐离子要求不同,可将缓冲液分为以下三种情况: 高盐:100-150mM 中盐:50-100mM 低盐:0-50mM 二,酶切操作 DNA量的确定,加入酶量的确定,发应体积的确定(20μl),反应时间的确定,1-1.5hr,一般为37℃,但也有例外,如Taq I在65°C时活性最高. 单位限制性内切酶定义为:在最佳缓冲系统和20μl体积中反应1小时,完全水解1μgDNA所需的酶量. 三,酶切结果分析 (一) 酶切片段的检测 1) 通过凝胶电泳分离,根据分子量分离.根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段,聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子. 2) DNA分子的检测 a. 染色EB,DNA分子小于25ng,很难检测到 b. 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子. (二)估计DNA分子的大小 根据DNA分子的迁移率,可以用公式计算出分子量D=a-b(logM) D是移动的距离,M是分子量,a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变. 也可以根据已知大小的片段进行比较,误差约在5%左右. 四,多酶联合酶解 对于对浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶解; 对于对浓度要求不同的酶,可以: 1. 低盐浓度的酶先切,后补加NaCL 2. 一种酶切后,换缓冲液,加5mM NaAc 0.1体积,2体积乙醇,冰浴5min,4℃离心10min, 干燥 五,定位酶切位点 建立酶切图谱需要一系列的酶. 首先确定每一种酶切后产生的分子量和片段的数目; 然后进行双酶切; 比较酶切和双酶切的结果,绘制酶切图谱; 含糊的位点可以通过部分酶切解决,可以短时间的酶切或者在4°C条件下进行. 六, 限制性内切酶的star活性 在PH不合适,或甘油浓度过高≥10%时,限制性内切酶的切割位点会出现非专一性,因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下. 第三节 DNA片段的连接 重组DNA分子构建的最后一步是连接,通过连接酶完成.相对而言,钝端的连接效率较低,因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会.而粘性末端的连接效率较高,因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对.这种暂时的,碱基配对结构可以提高连接的效率.在分子克隆的连接方式主要有以下几种: 一,连接方式 (一)相同粘性末端的连接 来源: 相同的酶 同尾酶 问题: 极性有两种可能 同尾酶连接后,不能用任何一种酶酶切.称为"焊死". (二)平头末端的连接 粘性末端--分子内部连接,平头末端--分子间的连接. 提高连接效率的方法: 加大酶用量(10倍) 加大平头末端底物的浓度 加入10%PEG(8000),促进分子间的有效作用 加入单价阳离子, 150-200mM NaCl 提高反应温度 平头连接同样存在两种极性 (三)不同粘性末端的连接 突出5"末端 Klenow补平,或S1核酸酶切平,然后平头连接 突出3"末端 T4-DNApol切平,然后平头连接 突出末端不同 Klenow补平,或S1核酸酶切平 连接后,可能恢复限制性位点,甚至还可能产生新的位点.XbaI与HindIII( XbaI恢复), XbaI与EcoRI(均保留),BamHI与Bgl II(产生ClaI位点) (四)人工粘性末端的连接 5"突出的末端 外源片段先用Klenow补平;然后用TdT补加polyC;载体片段也用Klenow补平,加polyG,退火不经连接即可转化.目的是:不使酶切位点遭受破坏. 3"突出的末端 外源片段先用TdT加polyG;载体片段加polyC;然后退火;再用Klenow补齐;连接 平头末端 可直接用TdT补加末端,但以加polyA/T为佳.这样稍微 加热 ,AT区就会出现单链区域,然后用S1核酸酶水解即可回收片段 (五)粘端与平端的连接 linker : 人工合成的,含有限制性内切酶识别序列的,短的双链DNA片段. – 连接的效率较高 – 酶切时可能破坏DNA分子的完整. adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸. (六)粘性末端的更换 在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口 – BamHI酶切片段用Klenow补平,或用S1酶切平;连接一段linker或Adaptor,使之产生EcoRI粘性末端.这样BamHI切口就换成了EcoRI切口 . – 由AluI更换EcoRI:AluI切开,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切开,Klenow补平,连接,原来含有AluI的片段变成含有EcoRI 二,重组率 重组率:连接反应结束后,含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比.较为理想的重组率为25-75% 提高重组率的方法: 连接反应条件 外源片段:载体=2:1-10:1(分子数),增加碰撞机会,减少自身环化. 载体除磷 (磷酸酯酶5"除磷). TdT在3"端增加人工粘性末端,防止载体自我环化 (责任编辑：大汉昆仑王)

基因工程工具酶主要包括限制酶、聚合酶、连接酶、修饰酶和核酸酶五大类，具体解释如下：1、DNA限制性内切酶生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息；2、连接酶它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5"-PO4与另一DNA链的3"-OH生成磷酸二酯键；3、聚合酶系专司生物催化合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的一类酶的统称；4、核酸酶核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸，它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环；5、修饰酶体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节。扩展资料：工具酶的相关应用——多重放大技术：为了获得更高的检测灵敏度，将多种信号放大技术结合起来使用是一种有效途径。基于切刻内切酶与DNA聚合酶组合作用的等温循环链置换放大技术，是近年来被广泛使用的一种工具酶组合信号放大技术。该技术的基本原理是：通过碱基的互补配对杂交形成切刻内切酶的识别位点后，切刻内切酶在该位点对其中的一条核酸链进行切刻作用产生3′端为羟基的切口。聚合酶识别该切口的3′端，以未切割的序列为模板，沿着3′到5′的方向复制聚合置换被切割链的另一段序列，最后形成一条完整的双链结构。形成的双链DNA再次被切刻内切酶识别剪切，启动聚合酶反应。参考资料来源：百度百科-工具酶

工具酶：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶，核酸酶和修饰酶五大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。1、DNA限制性内切酶生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息；2、连接酶它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5"-PO4与另一DNA链的3"-OH生成磷酸二酯键；3、聚合酶系专司生物催化合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的一类酶的统称；4、核酸酶核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸，它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环；5、修饰酶体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节。

工具酶：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶，核酸酶和修饰酶五大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。1、DNA限制性内切酶生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息；2、连接酶它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5"-PO4与另一DNA链的3"-OH生成磷酸二酯键；3、聚合酶系专司生物催化合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的一类酶的统称；4、核酸酶核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸，它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环；5、修饰酶体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节。

分子克隆中常用的工具酶连接酶、T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶、核酸酶、琼脂糖酶、蛋白酶、溶菌酶以及一些DNA 结合蛋白。分子克隆在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。工具酶：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶，核酸酶和修饰酶五大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。

【答案】：因多核苷酸磷酸化酶催化的反应平衡是趋向于RNA降解的。要使反应向着生成RNA的方向进行，必须有高浓度的核苷二磷酸(NDP)存在。此外，多核苷酸磷酸化酶催化的RNA的合成不需要模板，因此该酶催化合成的RNA的核苷酸顺序是随机的，翻译出的蛋白质的氨基酸排列顺序也是随机的，不是细胞所需要的。细胞用这个酶及其他的核酸酶使无用的RNA降解，以调节着细胞中RNA的半衰期，使RNA保持在一定的水平上。