引物设计

你设计的引物是否有用？在做实验之前可以做一个电子PCR qPCR引物设计+在线验证 方法一：NCBI上-probe 1.之前NCBI上有一个probe选项可以直接设计引物，上面会给出上下游序列。比如搜索小鼠nanog基因，它给出了这样的两条引物： 上游引物：TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT 下游引物：ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT 方法二：Primer3web 参考： Primer3web在线引物设计--2分钟学会步骤极简的引物设计！ - 哔哩哔哩 (bilibili.com) 2.1. 寻找基因序列 以human p53为例进行引物设计。 PubMed官网： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed 第一步：下拉条目选择核苷酸（Nucleotide） 第二步：输入基因+物种+mRNA（例如：p53 human mRNA） 第三步：点击搜索（Search） 第四步：单击选择 左边栏的（mRNA4.782） 第五步：单击进入第一条（Homo sapiensu2002mRNAu2002foru2002P53, complete cds）为我们所寻找的p53 human mRNA 第六步：单击选择Features中的CDS 选项 第七步：单击选择FASTA 格式就会出现这个 基因的CDS系列 2.2.开始设计引物 Primer3web官网： http://primer3.ut.ee/ 进入Primer3web官网后，执行以下操作： 第一步：下拉条目选择物种（HUMAN） 第二步：在输入框中输入刚刚复制来的CDS序列 第三步：单击获取引物（Pick Primers） 第四步：引物序列输出；在最终结果中，有四对引物供选择。 选择合适的引物：怎样算合适？ 首先看看引物的就是扩增长度，100~300bp 间比较好扩增； 引物长度在 20~25bp 较好，而且上下游引物间不要相差超过 5bp； 再就是看看 Tm 值，60℃左右，相差不要超过 1℃。 再加一点： 既然是设计qPCR引物，那么一定要跨外显子设计，这样可以避免基因组DNA的影响CT值，如果没有跨越外显子，则扩增出来的溶解曲线CT值就会偏小。那么怎样知道自己设计出来的引物有没有跨外显子设计呢？ 答案是可以根据自己设计的引物所在的基因组位置去和NCBI上该基因的外显子和内含子的连接位置进行对比。直接看那个基因的mRNA的join位置即可。 方法三：NCBI-BLAST-primer-blast 以上引物设计完成后还要自己手动去查找引物是否跨越了内含子，太麻烦了。那么再普及更方便的办法。 参考： https://www.biomart.cn/experiment/430/457/460/2282619.htm 3.1:在NCBI上找到目的基因的mRNA序列 打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因-》找到你要的种属，打开-》显示基因信息，找到“mRNA and protein”前面那个NM***********,号码复制下来。 注意：这个时候会看到有很多条NM****信息，表示这个基因不同的isoform,通过查找文献以及这些基因序列后面的解释来确定。如果不清楚，一般选择最长的那条。 3.2:开始设计跨越外显子的引物 打开NCBI上-BLAST-primer-blast网站，将上面复制的mRNA编号输入序列框中，下拉选项中选择你的物种，然后在Exon junction span下拉框选择Primer must span an exon-exon junction，设置引物长度最小和最大值，然后点击Get primer。就可以跳到Primer-BLAST Results页面。这个过程会有点长，稍微等一下。出来后，里面有个Graphical view of primer pairs那一栏，会告诉设计出来的几对引物分别跨越了哪几个外显子。 在这些跨越外显子的引物对中选择最好的那对： a).一对引物中只要有一个引物跨越了外显子就可以了。（因为一个引物跨了内含子，这条引物就不会和基因组DNA匹配，就算另外一个引物和基因组DNA匹配了，一条引物是扩不出来东西的。因为一条引物扩增达不到指数增长，扩了几十个循环后，信号就被指数增长的正确匹配的信号给掩盖了。就像在普通PCR中，只加上游或者下游引物，PCR出来绝对是没有东西的。因为产量太低了。） b). 一对引物之间的距离不要太长，因为扩增产物要求在100-300bp之间比较好，过长会影响CT值变小。 验证自己设计的引物PCR出来什么东西呢？可以做一个电子PCR看看。 1.UCSC-Tools-In-Silico PCR 进入UCSC,选择Tools的In-Silico PCR,输入上下游引物，target选择genome assembly,点击submit，或者如果这样出不来，记得勾选Flip Reverse Primer。因为可能上下游弄反了。提交后顺利的话，会出来一大段序列，上面会告诉你这个电子PCR做完后产出的序列在染色体上的位置及起止长度.然后再NCBI的gene选项输入自己PCR的目的基因，看看目的基因的起始位置，就知道这个PCR出来的是不是目的基因序列了。 注意：OCR产出的序列只可能是目的基因的一部分，对比一下序列起始位置就知道了。因为设计引物时是用目的基因设计的，PCR出来的是两条引物之间的序列。 进入NCBI-BLAST-primerBLAST;或者直接进入这个网址： Primer designing tool (nih.gov) 在primer parameter输入你刚刚设计的上下游引物 在database下拉选项选择Refseq mRNA 再点击Get primer； 等一会，会卡一会 才出来。 出来了一个Detailed primer reports;上面写了Products on target template都是Homo sapiens tumor protein p53 (TP53)的不同转录本，且出来的产物长度也一样。说明这对引物扩增出来的就是这个基因。 两种验证方法优缺点： UCSC验证方法可以检验你扩增出来的所有序列； 而NCBI的BLAST只能给出扩增出来的东西是不是你要的基因，以及扩增出来的产物的长度。 选择：建议使用NCBI-BLAST-primer-blast方法设计引物，也用NCBI-BLAST-primer-blast方法验证你设计出来的引物。 【技术分享】qPCR引物设计有妙招 - 知乎 (zhihu.com) 例如：Syt4（mouse）这个基因设计qPCR引物 step1:进入NCBI-GENE,找到这个基因的mRNA的NM*****号 step2:将这个号输入NCBI-BLAST-primer-blast输入序列框中，勾选相应条件;，且限制了PCR产物长度在70-300之间；由此设计出了10条跨内含子的引物,由Tm条件等选出了第二对引物： 上游： GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT 下游： CCAACCGTCCAATCACCTCA step3:将这对引物重新输入NCBI-BLAST-primer-blast的上下游引物框中，点击Get primers,发现这对引物扩增出来的基因就只有Syt4基因，说明这对引物特异性很好。 step4：进入UCSC-Tools--In-Silico PCR,输入上下游引物，点击提交，即可。如果跳转出来没有产物，则重新返回调整一下参数，比如说target参数，Flip Reverse Primer:是否勾选等。最终产物是Syt4，长度220bp。说明这对引物的PCR产物特异性很高，只有这一个产物。 step5：进一步验证：由于设计引物时跨越了内含子，且已经提醒我是上游引物跨越了内含子，于是我进入NCBI-Nucleotide 输入：Syt4 Mus musculus mRNA,点击搜索，然后点击左边栏目中的mRNA,然后点击第一条........参考以上2.1步骤，寻找这个基因的CDS序列，找到CDS序列后，搜索这两条上下游引物，发现在CDS区域中，且这对引物的PCR产物序列也在CDS区域中，仔细查看发现上游引物所在位置是1203-1224，确实跨越了两个外显子：exon 1098..1218和 exon 1219..3901. 以上我们设计出了Syt4这个基因的qPCR引物序列。可以直接让公司合成了。 以上所讲的都是qPCR的引物设计，一般扩增出来的基因产物都只有100-300bp之间，用于定量或者半定量。但是如果想要扩增全长DNA，则用到Primer5软件。扩增产物的长度可以自己在上面设置。 如何使用Primer Premier 5软件设计PCR引物-百度经验 (baidu.com)

放在目标片段的上下游即可，具体的要看你的后续操作。但有些是要必须考虑的，例如，PCR引物不能放在了同源序列、重复序列等影响扩增特异性的区域。希望能帮到你。

引物设计相关软件！ NoePrimer 2.03 独特的引物设计软件 Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计，非常棒的一个软件。Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件。 Primer D"Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作。 Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具。 Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。 NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件，用IE打开运行。 TGGE-STAR DOS软件，PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件。 e-PCR 2.3.9 电子克隆是一种电脑软件，用来识别DNA序列标签位点（STSs)。 FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物，还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具； OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件，可建立寡核苷酸数据库 PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件。 AmplifX 1.5.4 设计与管理引物的软件。 AutoDimer 1.0 快速筛选二聚体引物软件。 MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件 ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件 Primer Prim"er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件。 PCR Analyzer 1.0 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件 在线工具 DNAWorks 3.0 是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序。 程序仅需要输入一些简单的信息，比如，目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度。程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列。利用DNAWorks的帮助，用两步PCR法，可以成功合成长度达到3000碱基对的基因。原始网站。 The Primer Generator 在线引物设计程序。 Primer 3 比较有名的在线引物设计程序。 Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件。 Web Primer 斯坦福大学提供的在线引物设计软件。 AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 .一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。附上两款软件使用方法！Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能（ ），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。 2. 使用步骤及技巧 “Premier”软件启动界面如下： (转载的时候就没有图) 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。 进行引物设计时，点击按钮，界面如下： 进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交****（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然 后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。 点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示： 该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。 在需要对引物进行修饰编辑时，如在5"端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易 使用，是一个相当不错的软件。 Oligo 6.22 使用技巧简介 1. 功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 2. 使用（以Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo5.0，只是显示更清楚了。 经过Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。u2206G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的u2206G 值在5"端和中间值比较高，而在3"端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5"到3"的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3"端Frq 值相对较低的片段。 当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3"端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。 当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。 除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60/ 已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。

既然要表达该基因的产物，自然要表达完整的基因。所以上下游引物就是在你序列的两端了。序列应该以CDS序列。我们是以RNA为模板反转录后扩增。记得加上酶切位点。

上游引物和下游引物。 分别和DNA的两条链的3"端结合。 想要扩增目的片段就是上游引物和下游引物之间的序列。

1、多杀性巴氏杆菌的Km t 及toxA 基因 T +Pm具有Km t 及toxA 基因 T Pm具有Km t基因 PCR引物：P1: 5′- A TC CGC TA T TTA CCC A GT GG-3′ P2: 5′-GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC-3′ P3: 5′- CTT A GA TGA GCG ACA A GG-3′ P4: 5′- GAA TGC CAC ACC TCT A TA G-3′ 引物P1，P2检测Pm,扩增片段为457bp; 引物P3，P3检测T +Pm，扩增片段为864bp.退火温度56℃，时间30秒2、禽多杀性巴氏杆菌基因序列（U51470） 引物：上游引物：5"-TGC CAA AGT TGC CAA TAC TCC-3" 下游引物：5"-TCC CGT CCT CAT TTC TTG CG-3"退火温度45℃，时间1分钟3、猪巴氏杆菌参考GenBank中猪巴氏杆菌序列设计引物上游PAS1：5"-AgggCACgCAggCggACTTTTA-3" 上游PAS2：5"-ATCgACAgCgTTTACAgCgTggA-3"退火温度56.5℃，时间1分钟4、致病性嗜水气单胞菌（ 嗜水气单胞菌标准株Ah10501）究针对GenBank 中登录的致病性嗜水气单胞菌的溶血素基因( hlyA ) 、气溶素基因( aerA ) 以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA 保守区设计了3 对特异性引，非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA 和aerA ,而致病性分离株则至少含有hlyA 基因