质粒提取

抽提方法编辑实验前方法/试剂的选择首选方法是碱裂解法。如果有问题，或者是大质粒 (>15 kb)，则用温和的方法 SDS 裂解法。详细情况见“分子克隆”。试剂盒几乎都使用碱裂解法，所以都有一个通病，抽提大质粒时效果不好。关于碱裂解法质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。关于碱裂解法的原理，复旦大学生化与分子生物学实验室的网站有一篇专论，大家可以去看一下。这是一篇美文，非常有趣。文中提到了一个与几乎所有能查到的资料不同的观点，也是非常有启发的。当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性；不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了 (电泳时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是此变性的质粒。)。所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。 (似乎可以做这么一个推理：在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长，直到完全分开。理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可能是 100%的，而没有完全分开的两条链却完全可能 100% 配对复性。) 碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。现在得问题是，大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中，超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。这个实验我们没有做过，但 QIAGEN 抽提大质粒用的就是碱裂解法。

博凌科为解答：您的情况我们去年也曾遇到过。目前市面上的质粒提取试剂盒林林总总，令人难以取舍。我觉得首先应该根据自己的需要来选取。进口的试剂盒，比如 qiagene，omiga，promega等固然好，但是价格较贵，如果自己的实验要求不是很高的话，用这些试剂盒感觉有浪费的嫌疑（当然经费充足无可 厚非）。但是有些国产的试剂盒不怎么令然放心，象楼主这样做稳定转染的，要花费很多的时间和精力，最后因为试剂盒的问题影响实验的进度有点得不偿失，而且 脂质体都比较贵。因此，性价比是最重要的因素。大部分的质粒提取试剂盒所得产物可分为如下几个级别：1.高级转染级：这是最高纯度的去内毒素的质粒纯化，主要使用于基因治疗，cell显微注射，原代细胞转染等。2.常规转染级：它要优于2次cscl超速离心纯化的质粒。3.分子生物学级，相当于1次cscl超速离心纯化的质粒。4.测序级：主要用于常规酶切与连接用。我们实验室用过qiagene，axgene，omiga和国产天根的。大家对qiagene的评价最好。但是我自己的经验（qiagene的漂洗 液用完了）是用qiagene的吸附柱和天根的漂洗液联合得到的质粒最满意od26/od280为1.8（呵呵，只是个别案例，样本含量不足，仅供参 考）。我只做过原代细胞的顺时转染，稳定转染我没有做过，建议楼主可以考虑大家评价较好（比如天根的）试试看。记得有些公司经常做活动给一些试用装，也可 以尝试。楼主也可以结合其他战友的建议。