PCR反应中Taq酶最适温度为75度，为什么把仪器设为72度？

1.挑取的可能为假阳性：有检测引物么，先做个菌落pcr，再扩大培养。 2.培养基抗性再次确认下 3.可能染杂菌 4.在提取质粒的裂解步骤时，溶液呈液体状态还是凝胶状态，凝胶状态就是没有裂解开。这个可能是菌种摇老了，或者染杂菌，或者裂解液失效。

植物DNA提取方法方法一：1.取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min。2.待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。 3.重复步骤（2）一次。4.取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃，12000rpm离心10min。5.弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。 6.倒置或者37度培养箱烘干。 7.加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。方法二：1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。2. 植物5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。4. 室温下5000rpm离心5分钟。5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。6. 在1.5mleppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。13. 取2μlDNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。方法三：植物DNA的SDS提取法：试验试剂： 1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4·H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9、1mol/LHCl。10、0.2mol/LNaOH。11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13、0.05mol/LNaOH。14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

试剂盒方法是非常方便的实验方法之一，但有时候试剂盒会给我们的实验造成很多的困扰。 遇到这类问题，先不要将问题放在试剂盒上，首先需要确认的是你所培养的菌液上。你可以先用小提试剂盒或者手提（碱裂解方法）的确认一下，你所培养的菌液中1ml中可获得多少的质粒DNA, 然后再根据你大提的体积换算你所得的DNA总量。如果换算的总量差别不大，则需要考虑的是培养大肠杆菌的方法；如果换算的总量远远低于小提获得的量，则建议您联系QIAGEN的客服。如果是你操作的问题，一般通过客服可以解决问题；如果是试剂盒的问题，肯定集中在结合系统（硅胶柱出问题）或者溶液系统（溶液I,II,III），不过一般溶液系统出的问题可能性不大。最终确认是试剂盒的问题可以要求换货或赔偿。另外你需要的量 30mg， 相当大；使用试剂盒也需要选择合适的，像你的情况一般需要使用mega（超大量）或giga（宏量）的试剂盒。如果下游操作不是转染级别的，自己手动配置碱裂解溶液即可节约成本也可解决问题。

北京艾德莱公司填补Qiagen空白植物RNA提取的试剂盒非常好用，而且也卖得比较好！ 我现在提供一些资料给您参考一下，希望能帮助到您好；填补Qiagen空白植物RNA提取试剂盒一般公司多糖多酚植物RNA提取试剂盒失败原因和解决方案很多植物RNA的样品由于含有大量的多糖、多酚、代谢产物、色素等成分，造成RNA提取过程中氧化、褐化、降解、由于植物品种的多样性造成情况更加复杂。手工的CTAB类的方法提取因为时间太长，太繁琐，手工方法不在讨论之列。一直以来没有一款好的试剂盒包括qiagen、promega等进口试剂盒也无法满足科研工作者对植物RNA提取的要求。下面我们来分析一下植物RNA为什么不能提取成功的原因：市面上最常见的RNA提取试剂盒无非是两种：第一种：TRIzol改良类方法（包括溶液型的和离心柱型的）、第二种：直接裂解过柱子的方法（离心柱）第一种试剂盒失败的原因1：RNA市面上面最流行的方法就是TRIzol，或者TRIzol改良，或者TRIzol加离心柱一类的改良方法。TRIzol也就是异硫氰酸胍/苯酚/氯仿原理一步法的方法最适合的对象是动物源性的组织细胞，针对普通多糖多酚低的植物性的材料，TRIzol类原理产品也可以提取。但是多糖、多酚、次级代谢产物丰富的情况下，TRIzol类方法无法防止多糖多酚对于RNA/DNA分相的干扰，要么残留大量DNA，要么残留大量多糖、多酚或者次级代谢产物，氧化破坏RNA，或者残留这些多糖多酚，色素代谢产物等抑制下游的反转录等反应。限于技术水平的限制，市面上绝大多数的国产厂家是使用TRIzol的方法进行改良，无论是不是加了离心柱。但是实践证明，改良不能从根本上解决问题。判断是否试剂盒使用这种改良的方法非常简单：是否裂解液含有苯酚的味道和使用氯仿，如果使用到了氯仿就是TRIzol方法的改良。第二种试剂盒失败的原因：直接裂解过柱子的方法是目前最先进的方法，但是也是技术含量最高的方法。这个方法采用裂解液（不含苯酚，氯仿）直接裂解，RNA/DNA同时过柱子，然后在柱子上面直接分离RNA/DNA，所以，这种方法的优点第一在于，避免了使用trizol在多糖多酚下不能成功分离RNA/DNA的弊端、第二在于，不使用有毒的苯酚氯仿。但是正是因为其技术先进，所以难度很高，国内厂家包括进口公司有两个技术难点一直没有突破。第一，裂解液的成分必须针对去除多糖多酚进行研发添加去多糖多酚，代谢产物成分。否则会同样碰到多糖多酚干扰提取的问题。第二、和TRIzol原理不同，直接过柱法DNA/RNA同时加到吸附柱上去。如何去除DNA是第一个难点。否则会残留大量DNA。两个技术难点的没有掌握导致了国内公司包括的第二种试剂盒失败。国外公司因为没有掌握第一难点，裂解液里面没有去除多糖多酚成分，所以包括Qiagen的RNeasy plant mini kit盒子也常常不能成功提取较复杂植物RNA样品如黑加仑、冬青等植物样品。北京艾德莱生物的研发人员经过3年的不断研发改良，针对多糖多酚植物的特点，和这两种试剂盒失败的原因，开发出了世界领先水平的RN09 EASYspin植物RNA快速提取试剂盒，第一：采用直接过柱子方法，彻底抛弃了TRIzol苯酚，氯仿原理方法，使用无毒原料，并且添加了有自主知识产权的去除多糖多酚成分解决了多糖多酚和代谢产物对于RNA的破坏和干扰分离。第二：突破了直接过柱子的方法DNA去除的技术难点，解决了DNA残留过多问题。

有人用天根的植物RNA提取试剂盒提取过RNA提RNA一般注意：提取前材料的保存（新鲜材料,过夜处理的样品）,提取中对外源性的RNA酶的清除控制（离心管,PCR管,电泳槽,台面等的无RNA酶化处理）,提取后需要-80度保存.其次跑电泳时,注意电泳液最好用新鲜的,核酸染料等诸多因素.细菌总RNA提取试剂盒（ germs islation kit).对于外源性RNA酶的控制外源RNA酶清除剂,避免使用致癌物DEPC的危险方法就可简单操作清除耗材,台面,仪器等的外源RNA酶的降解作用.

在研究某基因的功能时，常常要用到某基因的过表达，或敲除，或敲低。 在敲除方面，常用的就是Crispir/Cas9技术，不过此技术周期比较长，步骤比较麻烦，就我们实验室而言，做的熟练的同学，最快也得需要一个月。如果临时想要研究某基因的功能，例如某个miRNA的靶基因，想要敲低这个靶基因，通常会采用siRNA的方法，这种方法速度比较快，从下订单到实验结束，最快需要两周（公司合成通常是一到两周），但成本比较高，这里总结一下siRNA的实验方法。 转染siRNA有很多方法，有国内公司的转染试剂（例如锐博），也有常规进口的，例如Lipo2000或Lipo3000，这里只介绍一下QIAGEN的HiPerFect（因为我觉得这种最方便）。 HiPerFect转染试剂（QIAGEN，货号：301705） OPTI-MEM（ThermoFisher，货号：31985-062） siRNA储备液（20uM，广州锐博） siRNA是一段寡枋苷酸片段，直接向公司订制即可，周期通常是1到2周。以锐博公司为例，从公司订回来的siRNA通常包括5条，1条装一管，分别是目的基因的3个（公司会保证至少有1条能敲除目的基因），1条是针对Actin的，这是阳性对照，一条是Negative Control（NC），阴性对照。 一管通常是5nmol，需要配置为20μM的储备液，那么5nmol需要加无菌水250μL。配置结束后，需要分装，装到200μL的EP管中，为了避免反复冻融（有的时候反复冻融也有效果，，但不建议这么做）。每管装10μL或5μL，使用的时候，拿出适当的剂量即可，例如我要转染的细胞是铺在6孔板中，siRNA的终浓度是50nM，那么1个孔中就需要加5μL的siRNA储备液，此时拿出一管即可。 这里以转染RAW264.7细胞为便说明一下，以下实验步骤均参考自QIAGEN的说明书，并且本人已经进行了验证。

真菌的细胞成分和植物是有差别的，这种专一性的植物DNA提取试剂盒不一定能提好真菌的DNA。如果有条件你最好是买专一性的真菌DNA提取试剂盒。不过植物DNA提取的CTAB法确实可以适用于真菌的DNA提取，但因为真菌菌丝体含有很多多糖，你需要参考下植物DNA提取中除去多糖的方法。一般的话就是提高CTAB抽提液盐离子含量，还有就是在CTAB抽提液中加入一定比例的PVP或者PVPP，浓度1～10%之间都可以，按照实际情况加。

凯杰(QIAGEN)DNA提取试剂盒可以提取dna 至于rna我就不清楚了 你 可以查看下rna试剂盒说明书 上面针对这块应该有详细解答

很多人在做血液来源样本DNA提取时会对样本类型概念不清楚，所以在做核酸提取、核酸检测类的实验时，对提取试剂的选择比较随意，其实验结果也往往不尽如人意，那么不同血液来源的样本有什么区别，对核酸提取、核酸检测有什么影响呢？ 一、[endif]什么是外周血，什么是全血，什么是血清，什么是血浆？ 新鲜的血液（也叫全血，医学上称为外周血）加入抗凝剂（如柠檬酸钠，EDTA等，一般医院采血都是用抗凝管采集），静置一段时间，会出现分层的现象。上面淡黄色的半透明液体是血浆，约占55%，下面暗红色不透明的是红细胞，约占45%。中间薄薄的一层白色物质是白细胞和血小板，不到1%。红细胞、白细胞、血小板共同组成了血细胞。 特别提示：不加抗凝剂的血液很快就会凝成血块，在凝血块周围出现的淡黄色的透明液体是血清，血清中不含纤维蛋白原。 简单来说，全血包括血浆和血细胞（红细胞、白细胞、血小板），血浆包括血清和纤维蛋白原。 在选择核酸提取试剂盒时，首先要考虑的是样本类型以及提取的核酸种类，选择针对性强，提取效率高的提取试剂盒。如果要提取血细胞中的核酸，需要选择血细胞核酸提取试剂或全血核酸提取试剂；如果要从血清或血浆中提取游离核酸或游离肿瘤核酸则要选择血浆或血清核酸提取试剂；如果需要检测外周血中有无病毒或细菌感染，一般也是选择血浆或血清核酸提取试剂。如果要提取DNA，需要选择DNA提取试剂，要提取RNA，则要选择RNA提取试剂。如果目标基因丰度较低，需要较多的血浆或血清进行富集提取，则需要选择专门的血浆、血清核酸富集提取试剂。还有，如果核酸检测的结果要面向临床出具检验报告，选择的提取试剂盒要通过药监局审查，应有药监局备案号，这一点非常重要。在进行核酸提取实验时，切不可选错了试剂盒，否则会影响实验效果和实验进度。目前，国内应用较多的血液系列核酸提取试剂主要有Qiagen、Biog等，其血液系列核酸提取试剂均比较全面，包括血细胞、血清、血浆、DNA、RNA、小量提取、中量富集提取等，研究者可根据实验需要进行选择。 二、[endif]血清血浆游离DNA提取需要多少样本量？得率多少正常？图1 Qiagen关于cfDNA得率的数据图图2 Biog血浆DNA提取试剂盒做血浆样本DNA提取，Q-bit测浓度无读数，PCR检测结果靶基因（CT 25左右）以及内参（CT 21左右）扩增曲线 血清、血浆样本中游离核酸含量较低，根据Qiagen公司数据，1ml血浆样本DNA提取得率只有7.35ng左右（图1）。这么低的核酸浓度，如果直接用紫外法检测，得出的数值并不准确，而且多次测量的结果会变异很大。有些研究者提取血浆核酸后习惯于先用紫外检测浓度，发现紫外检测不出来或浓度很低时便认为提取失败，放弃后面进一步的实验，其实并不可取。我们可以把紫外读数作为参考，但是不能作为判断得率的唯一标准，最好还是要做个PCR或荧光定量。根据Qiagen公司的实验，血清血浆的量与提取的核酸量成正比。因而，如果要提高核酸得率，可通过增加血清或血浆的量来实现。一般地，做血浆或血清核酸提取，样本量最好在1ml以上。如果1ml或更大量样本得不到满意的检测结果，则应及时考虑更换提取试剂盒。目前国内常用的Qiagen、Biog血浆核酸提取试剂盒核酸提取的得率都很不错，基本上能够满足绝大多数实验的要求。 三、不同检测目标的实验选择什么类型的样本？ 从核酸检测的角度讲，人的基因组更多的存在于白细胞中，而只有少量游离核酸存在于血清、血浆中，如果白细胞大量凋亡，血清血浆中的游离核酸量会有所增加。如果机体患有恶性肿瘤，肿瘤组织坏死，坏死的肿瘤细胞释放出核酸片段或肿瘤细胞发生血液转移，血浆血清中的核酸量也会增加。因而，如果是检测部分目标基因，如筛查地中海贫血症，筛查色盲基因等，应该以全血作为实验样本，因为血清和血浆中所含有的人的核酸数量远远少于全血，检测灵敏度会降低很多。如果要检测肿瘤相关基因，则要选择血浆或血清样本。如果以病原体核酸为检验目标，如检测乙肝感染情况，检测感冒病毒，检测有无败血症等，则以血清或血浆为实验样本，这会天然地剔除血细胞这种杂质，明显降低核酸提取过程中的难度，有利于提高核酸纯度，增加检测反应灵敏性和稳定性。血清和血浆相比，一方面血清中含有更少的纤维蛋白原，另一方面血清中的DNA是循环DNA，主要来源于病变组织，所以使用血清作为实验样本，可以更进一步提高样本纯净度，减少蛋白杂质，提高游离核酸的浓度，获得更为灵敏的检测结果。

样品中RNA的纯度及整体质量对于后续的实验有重要的影响。以下是进行PCR array前RNA质控的推荐标准：定量：NanoDrop/Spectrophotometer（用于检测样本中的核酸浓度，蛋白与核酸的比例及是否存在污染，例如有机物/盐离子等污染）。请记录样品的浓度，230，260及280的吸光值。此方法无法评估RNA的完整性。● 浓度：最佳浓度是100-150ng/uL。如果低于此浓度，可以使用PreAMPsystem或者通过浓缩的方法提高RNA浓度。可以通过配套的QIAGEN 过滤柱，减小洗脱体积来实现样品的浓缩。通过拨打QIAGEN客户服务热线400-880-0325，可以获得样品浓缩方面的帮助。● 260/280比值：这一比值用于反应RNA浓度与蛋白浓度的比值。理想值应当在1.8-2.0，如果比值低于1.8，表明存在蛋白或其他污染。● 260/230比值：这一比值用于反应RNA浓度与共提取污染的比值。理想值应当在1.8-2.2，如果比值低于1.8，表明存在有机物/盐离子等污染。这些污染会影响后续qPCR反应。RNA完整性检测：通过凝胶电泳或bioanalyzer来分析RNA的完整度，从而保证RNA的质量，防止RNA的降解对后续实验的影响。以下内容是RNA完整度的通用标准：● 28S/18S比值：>1.5为高质量，1.3-1.5勉强可用，<1.3为较差质量。● RNA Integrity Number (RIN): > 7为高质量，6-7勉强可用，< 6为较差质量。

北京艾德莱的植物RNA提取试剂盒非常好用!他们有好几款植物RNA提取的试剂盒。现在给您好提供一些资料，希望能帮助到您;(1)首先有两种选择:第一是用他们的RN01TRIpurereagent，这个就是Invitrogen的TRIzol，他们的质量完全和进口一样可以100%替代进口TRIzol。第二是用RN33PLANTpure通用植物总RNA快速提取试剂盒(普通植物组织细胞),这个试剂盒的原理，是TRIzol加离心柱子，在TRIzol的基础上加了离心柱子，速度更快，纯度更高，操作更简单。等于是TRIpure(RN01)加离心柱子。(2)然后根据特殊具体需求比如想速度更快，操作更简单，还不想用TRIzol这种苯酚，氯仿毒性物质还有两种选择:一种选择是RN09EASYspin植物RNA提取试剂盒，这个盒子和Qiagen的74904完全一样，不用苯酚，氯仿，速度最快，操作最简单。但是对部分植物样品来说，可能残留基因组DNA稍多，只有做了试验才知道客户的样品是不是残留DNA稍多，就是Qiagen也不能确保100%的样品没有残留DNA。北京艾德莱能确保的就是和Qiagen的效果一致。实在有DNA残留的，就可能还要用DNA酶消化。具体只能自己权衡选择或者和艾德莱技术人员沟通了再选择。另一种就是RN38EASYspinPlus植物RNA提取试剂盒这个试剂盒是RN09的改进版本(Qiagen也没有这款，是艾德莱在Qiagen基础上改进世界首创的)，它使用基因组清除柱子的技术和配方在保持RN09不用苯酚，氯仿毒性物质，最简单，最快速的基础上消除了基因组DNA残留，一般肉眼不可见DNA残留。注意:目前北京艾德莱测试的几种植物样品中均已经获得成功，使用RN09提取有残留DNA的样品种类使用这款后，均无DNA残留。希望我的回答能帮助到您好。

血液游离DNA（又称血液循环DNA）是指血液中游离于细胞外的DNA，其来源主要有三：白细胞崩解释放的DNA、坏死组织特别是肿瘤组织释放入血液的DNA和感染病毒、细菌的DNA。近几年来，随着基因诊断技术的发展，游离核酸的应用价值越来越大，如优生筛查、肿瘤早期诊断、遗传病检测和病原体感染基因检测等。但血液中游离DNA含量一般较低，片段较小，不易提取，这大大影响了游离核酸的基因检测和各种研究的开展。 游离DNA提取方法一般有TRizol方法、离心柱法、磁珠法。其中，Trizol方法与离心柱相比，提取效果相当，但是因其对操作者带来的毒性，现在越来越被弃用。磁珠法比较适合机器自动化提取，如果没有核酸提取仪，只是使用磁力架配套提取，磁珠法的操作就比较麻烦且容易导致样本交叉污染。另外，根据研究，磁珠法的核酸提取得率不如离心柱法。如果要提取的游离核酸的量比较低，最好选择离心柱法。对于游离DNA含量较低的样本或比较珍贵的样本或样本总数不是很多的实验室，首选的核酸提取方法应是离心柱法。 离心柱法游离DNA提取原理主要是样本裂解后，DNA在高盐条件下与硅胶膜结合，再在低盐、高PH值时将DNA从硅胶膜上洗脱下来。面对各种品牌的离心柱法提取试剂盒，哪种才是最适合的呢？目前国内常用的离心柱法游离DNA提取试剂盒有国内品牌Biog、国际品牌Q、国内品牌T等。我们以下就几种游离DNA提取试剂盒进行比较。 [if !supportLists]一、[endif]有较高的提取得率。核酸提取得率的确定，常用的是使用紫外分光光度计的方法。但是，血清、血浆样本中游离核酸含量较低，如果直接用紫外法检测，得出的数值并不准确，而且多次测量的结果会变异很大。关于提取得率，Qiagen的研究数据是1ml正常血浆样本cfDNA得为7.35ng左右，但如果白细胞大量凋亡，血浆中的游离DNA量会有所增加，肿瘤病人血浆中的DNA会大幅增加。有些研究者提取血浆核酸后习惯于先用紫外检测浓度，发现紫外检测不出来或浓度很低时便认为提取失败，放弃后面进一步的实验，其实并不可取。我们可以把紫外读数作为参考，但是不能作为判断得率的唯一标准，最好还是要做个PCR或荧光定量。根据Qiagen公司的实验，血清血浆的量与提取的核酸量成正比。因而，如果要提高核酸得率，可通过增加血清或血浆的量来实现。一般地，做血浆或血清核酸提取，样本量最好在1ml以上。如果1ml或更大量样本得不到满意的检测结果，则应及时考虑更换提取试剂盒。目前国内常用的血浆核酸提取试剂有国际品牌Q、国内品牌T、国产品牌Biog等，我们实验室使用下来，Biog的核酸提取得率较高，1ml肺癌病人血浆样本DNA得率在85ng左右，Q的得率在72ng左右，T的得率在63ng左右，基本上都能满足下游PCR实验的需求。当然，如此低的浓度直接测OD值不太容易，如果使用Nanodrop2000c，其检测下限为2ng/ul。如洗脱液为30ul，则需要1ml左右的血浆才能检测出来。显然，如果是健康人的血浆，1ml血浆的DNA浓度更低，紫外可能根本就检测不出来。因而，血浆DNA提取完成以后，最好直接做PCR，紫外检测的意义不大。 [if !supportLists]二、[endif]提取的核酸纯度高。核酸纯度一般根据OD260/OD280比值来判断。一般说来，试剂盒提取的DNA 其OD260/OD280比值应在1.6--1.8之间。如果提取的DNA溶液OD260/OD280比值小于1.6，通常说明有蛋白质或酚、多糖等的污染。如果提取的DNA溶液OD260/OD280>1.9,则表明有RNA污染。使用Q公司血浆DNA提取试剂盒提取的血浆DNA, OD260/OD280一般在1.7-1.9之间；使用Biog血浆游离DNA提取试剂盒提取的血浆DNA, OD260/OD280一般在1.6-1.9之间，使用T公司血浆DNA提取试剂盒提取的血浆DNA OD260/OD280比值也在1.6-1.9之间。Q公司提取DNA的纯度似乎优于国产试剂，但我们提取的DNA是用于PCR检测，结果并无明显影响。可能因为B公司血浆游离DNA提取试剂盒提取的血浆DNA量得率较高的原因，同样的DNA加样体积（2ul），Biog试剂盒提取的DNA 荧光定量PCR检测结果CT值要小于Q公司试剂盒提取的DNA。 [if !supportLists]三、[endif]操作简便性。操作简便性也是血浆DNA提取试剂选择的一个重要因素。操作过于复杂，不仅费时费力，还容易导致样本间的交叉污染，也容易损失样本。特别是用于临床检测或样本较多情况下的检测，操作复杂如果导致交叉污染会引起误诊，还会影响出检测报告的时间。因而，选用操作简便、流畅的提取试剂盒非常重要。就我们曾经用过的以上三种提取试剂盒来说，Q公司的血浆DNA提取试剂盒提取过程大约30min，从样本处理开始需要个10步骤；T公司血清/血浆游离DNA提取试剂盒整个提取过程需要约40min，从样本开始处理10个步骤；B公司的Biog血浆游离DNA提取试剂盒提取过程大约25min，从样本开始处理8个步骤，B公司的血浆游离DNA提取试剂盒在操作简便性上具有一定优势，更适合于较多样本的检测。据了解，该产品已通过药监局备案，也更适合临床样本的检测。 综合看来，与国外知名品牌相比，国产试剂盒在血浆DNA提取纯度上稍有不足，但在提取得率和操作简便性上基本没有区别，有些品牌还略有优势，可根据实验需求进行选择。对纯度要求较高的实验，可选择Q等国外知名品牌，如果对提取量要求较高或提取后主要进行PCR或分子杂交之类的实验，可考虑选择Biog等国产品牌。

李彦宏 李彦宏简介 李彦宏，1991年毕业于北京大学信息管理专业，随后赴美国布法罗纽约州立大学完成计算机科学硕士学位。在美国的8年间，李彦宏先生先后担任了道·琼斯公司高级顾问，《华尔街日报》网络版实时金融信息系统设计者，以及在国际知名互联网企业-INFOSEEK资深工程师，是新一代互联网技术领域的权威专家。他为道·琼斯公司设计的实时金融系统，迄今仍被广泛地应用于华尔街各大公司的网站，其中包括《华尔街日报》的网络版。 李彦宏最先创建了ESP技术，并将它成功的应用于INFOSEEK/GO.COM的搜索引擎中。GO.COM的图像搜索引擎是他的另一项极其具有应用价值的技术创新。 1996年，他首先解决了如何将基于网页质量的排序与基于相关性排序完美结合的问题，并因此获得了美国专利； 1998年，李彦宏先生根据在硅谷工作以及生活的经验，在大陆出版了《硅谷商战》一书，获得了各界的好评； 1999年底，携风险投资回国与好友徐勇先生共同创建百度； 2001年被评选为“中国十大创业新锐”之一； 2002年荣获首届“IT十大风云人物”称号； 2003年再次荣获“IT十大风云人物”称号； 2004年1月15日，当选第二届“京城十三新锐”； 2004年4月，百度总裁李彦宏当选第二届“中国软件十大杰出青年”。 李彦宏，1991年毕业于北京大学信息管理专业，随后赴美国布法罗纽约州立大学完成计算机科学硕士学位。在美国的8年间，李彦宏先生先后担任了道·琼斯公司高级顾问，《华尔街日报》网络版实时金融信息系统设计者，以及在国际知名互联网企业-INFOSEEK资深工程师，是新一代互联网技术领域的权威专家。他为道·琼斯公司设计的实时金融系统，迄今仍被广泛地应用于华尔街各大公司的网站，其中包括《华尔街日报》的网络版。 李彦宏最先创建了ESP技术，并将它成功的应用于INFOSEEK/GO.COM的搜索引擎中。GO.COM的图像搜索引擎是他的另一项极其具有应用价值的技术创新。 1996年，他首先解决了如何将基于网页质量的排序与基于相关性排序完美结合的问题，并因此获得了美国专利； 1998年，李彦宏先生根据在硅谷工作以及生活的经验，在大陆出版了《硅谷商战》一书，获得了各界的好评； 1999年底，携风险投资回国与好友徐勇先生共同创建百度； 2001年被评选为“中国十大创业新锐”之一； 2002年荣获首届“IT十大风云人物”称号； 2003年再次荣获“IT十大风云人物”称号； 2004年1月15日，当选第二届“京城十三新锐”； 2004年4月，百度总裁李彦宏当选第二届“中国软件十大杰出青年”。李彦宏经历三重境界终成事业 首谈婚恋故事李彦宏：我的路很顺，是因为总能抓往重要环节的机遇，而且能超常发挥。 古往今来之成大事业者，必经过三种境界。“昨夜西风凋碧树。独上高楼，望尽天涯路”乃第一境。“衣带渐宽终不悔，为伊消得人憔悴”此第二境也。“众里寻他千百度，蓦然回首，那人却在灯火阑珊处”为第三境界。千百劳作，终有所成，这是何等的喜出望外，但又恰恰属于情理之中！在位于北京大学附近的百度总部，李彦宏(英文名Robin)追忆人生点滴———人们只看到百度上市成功后的李彦宏，却很少有人注意到，李彦宏在美国工作最得意之时，毅然放弃外国公司丰厚待遇和期权，回国创立了百度。他是一个一直都很成功、并且能不断否定自己的成功从而获得更大成功的人。 北大骄子 “我心理上比较稳定，越是大的场合发挥就越好。在高考的时候，通过正常发挥我应该是能考上北京大学，但不一定拿第一(他以山西阳泉全市第一名的成绩考上北京大学)。” 1968年，李彦宏出生在山西阳泉一个普通的家庭。“小学的时候，考过戏剧学院，后来放弃了。现在觉得放弃也挺好，技术能带来更大的影响力。”李彦宏回忆。年少时着迷过戏曲，曾被山西阳泉晋剧团录取。但中学时代，李彦宏回归“主业”，全身心投入功课学习中。 1987年，勤奋、刻苦的李彦宏以阳泉市第一名的成绩考上了北京大学图书情报专业。“北大自由的学术氛围，为我形成独立思考能力提供了很大的帮助。”李彦宏说。不过，身处象牙塔，几多欢乐，几多愁。他离开阳泉迈进中国最高学府的激动心情，渐渐被图书情报学的枯燥、乏味消融。规划未来人生道路变得迫切。“那时候，中国的氛围较为沉闷，大学毕业进入机关单位，已经是非常好的选择了。在我看来，选择出国是一条自然而然的道路。” “我是一个非常专注的人，一旦认定方向就不会改变，直到把它做好。”从大三开始，李彦宏心无旁骛，买来托福、GRE等书狂啃，过着“教室-图书馆-宿舍”三点一线的生活，目标是留学美国，方向锁定在计算机专业。 留学美国 “我出国不是一帆风顺。因为换专业，刚到美国学计算机，很多功课一开始都跟不上。有时和教授面谈时，由于较心急，谈一些自己不是很了解的领域，结果那些教授就觉得我不行。” 1991年，李彦宏再一次挤过了独木桥，收到美国布法罗纽约州立大学计算机系的录取通知书。正值圣诞节，23岁的李彦宏背着行囊，穿云破雾，踏上了人生的第二次征程。 美国布法罗纽约州立大学一年有6个月飘着雪。在这里，他忍受过夜晚彻骨的冰冷。白天上课，晚上补习英语，编写程序，经常忙碌到凌晨两点。在这里，他经历过中国留学生初来乍到的所有困苦。“现在回想起来，觉得当时挺苦的，但年轻就应该吃苦。”李彦宏评价这段经历。 “世间总有公道，付出总有回报”。李彦宏骨子里有着勤奋、坚韧、执着的精神，这使得他的专业技能得到飞速进步。在学校呆了一年后，李彦宏顺利进入日本松下实习。“这三个多月的实习，对我后来职业道路的选择起了至关重要的作用。”李彦宏说。 驰骋硅谷 “硅谷给予我最大的感触是，希望通过技术改变世界，改变生活。” 1994年暑假前，李彦宏收到华尔街一家公司———道·琼斯子公司的聘书。“在实习结束后，研究成果得到这一领域最权威人物的赏识，相关论文发表在该行业最权威的刊物上，这对以后的博士论文也很有帮助。”李彦宏说：“但那时候，中国留学生中有一股风气，就是读博士的学生一旦找到工作就放弃学业。起先，我认为自己不会这样。但这家公司老板也是个技术专家，他对我的研究非常赏识。两人大有相见恨晚的感觉。士为知己者死，于是我决心离开学校，接受这家公司高级顾问的职位。” 在华尔街的三年半时间里，李彦宏每天都跟实时更新的金融新闻打交道，先后担任了道·琼斯子公司高级顾问、《华尔街日报》网络版实时金融信息系统设计人员。 1997年，李彦宏离开了华尔街，前往硅谷著名搜索引擎公司Infoseek(搜信)公司。在硅谷，李彦宏亲见了Infoseek在股市上的无限风光以及后来的惨淡。 1998年，李彦宏在自己撰写的《硅谷商战》中分析总结到：“技术本身不是唯一的决定性因素，商战策略才是决胜千里的关键；要允许失败；让好主意有条件孵化；要容忍有创造性的混乱；要有福同享……” 这些典型的硅谷商战经验，后来被他得心应手地运用到了百度的创业中。 “在人生选择道路上，我好像没有很不顺利的过程，只是面临着一些选择。”李彦宏说。从北大到布法罗到华尔街到硅谷，机遇来临时，李彦宏不失时机地把握住了，这些多年的积累给他日后创建百度打下坚实的根基。 归国创业 “不要问现在加入商战是否太晚，按照现在信息经济的发展速度，谁又能够承担不参战的责任呢？” 李彦宏在海外的8年时间里，中国互联网界正发生着翻天覆地的变化。从1995年起，李彦宏每年要回国进行考察。1999年，李彦宏认定环境成熟，到了该参战的时候了，于是启程回国。 不知是巧合，还是机缘。又是一个圣诞节，李彦宏乘飞机从太平洋的东海岸重新回到了太平洋的西海岸，回到了人生的一个重要起点处———北京大学，悄无声息地开始了创业。李彦宏在北大资源宾馆租了两间房，连同1个财会人员5个技术人员，以及合作伙伴徐勇，8人一行，开始了创建百度公司。 接着，李彦宏开始回美国找钱，本不爱开车的他整天开车在旧金山的风险投资商中游说。最后他顺利融到第一笔风险投资金120万美金，比计划的100万美元还多。在百度成立的9个月之后，风险投资商德丰杰联合IDG又向百度投入了1000万美元。 对于百度为何受风险资本青睐，李彦宏说：“投资者有一种信念，相信百度会越来越好。”事实上，在决定创业时，李彦宏在引擎技术方面，已可以排在全世界前三位。而李彦宏的执着、专注和专业又在业内有口皆碑。加之百度耕植的中国市场潜力巨大。三点因素结合，百度自然对投资者充满了无限诱惑。李彦宏说：“那个时候融资相对容易，但是绝大部分企业还是融不到资。我们选到的这些投资人应该说是非常优秀的，非常能够看到长远目标。” 如今，百度已走过5年的时光，其间不乏惊心动魄风云变幻———激烈的董事会争辩，合作伙伴徐勇的退出，商场无情的竞争等重重挑战，都在不时地考验和冲击着李彦宏。但李彦宏一直保持淡定、从容，随着资本不断增加，技术的不断成熟，百度有了一日千里的快速发展。2002年百度搜索引擎技术真正成熟。2003年百度流量比上一年增加了7倍。2004年百度品牌得到网民的广泛认可。2005年百度成功上市。 成功后的道路怎么走？记者问 “用技术改变生活，仍是我不变的信念。上市只是成功刚刚开始，真正的挑战还在后面。”李彦宏回答。 李彦宏背后的女人 “彦宏，我爱你，好想嫁给你。”类似这种也许是开玩笑的话，常会贴在百度的李彦宏贴吧上。有人甚至讨论他的五官哪个部位长得最好：“如非要选一个的话，还是嘴巴，像罗嘉良的。” “英俊、成功、才华出众”，有企业家的气魄，成熟男人的魅力，学者的儒雅、淡定和从容。这样的男人，让一些女士感慨：教人如何不爱他——— 只可惜，他结婚了。 李彦宏属于“闪婚”一族，他与妻子只相识6个月就结了婚，如今已生有一个女儿。李彦宏和妻子马东敏是在一次中国留学生聚会中认识的。马东敏毕业于中国科技大学少年班，两人认识时，她正在美国新泽西州大学生物系攻读博士学位。 李彦宏说：“太太对我影响非常大。她是个急性子，做出决定马上会行动，而我属于慢性子，考虑周到了才去做。我们的性格是互补的。我回国创业前在硅谷当工程师，觉得种种花草也挺开心。但我太太鼓励我去加入公司。而那时候我希望做得更大些，并由自己去控制方向。因此，回国创业是最合适的选择。但这对她是一种挑战，一般出国的女孩子都更喜欢国外的环境。但为了我的事业，她毅然回国支持我，这是很不容易的。” “回国创业的海归中，离婚率是很高的。但是，现在我太太和孩子都回国了。”说到这儿，李彦宏笑了笑，清秀英俊的脸庞流露出无限温馨与幸福。

DNA浓度太高了会出现这样的现象，再有就是可能是某种多糖了，一般电泳回收可以去掉任何杂质。但是，这样的回收效率较低，且不值得，个人建议向提取液（无论试剂盒或者自己配制的）中添加一定量的PVP40k，并使用25：24：1的苯酚氯仿异戊醇反复抽提，会取得较好效果，同时也会使得各种酚类物质较充分去除。

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。 生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。 每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。

2×YT的配方主要包含以下食材和步骤：食材：* 500克面粉* 2克盐* 2克白糖* 100毫升开水* 250毫升温水制作步骤：1. 将面粉、盐和白糖混合在一起，然后逐渐加入100毫升开水，边加边搅拌，直至面粉散开。2. 逐渐加入250毫升温水，边加边搅拌，直至面粉吸收足够的水分，形成一个湿润的面团。3. 在面团表面涂上一层油，然后静置2小时，让面团充分松弛和发酵。4. 将发酵好的面团分成小块，然后搓成细长的条状，再将其拉长，放入开水中煮熟。5. 将煮熟的面条捞出，加入适量的调料和配菜，即可享用。以上就是2×YT的配方的食材和制作步骤，制作过程中需要注意揉面和发酵的时间和温度，以及煮熟的面条要立即捞出，避免过度煮烂影响口感。

百度公司 ( Baidu.com，Inc ) 于1999年底成立于美国硅谷，它的创建者为资深信息检索技术专家、超链分析专利的唯一持有人——百度总裁李彦宏，及其好友——在硅谷有多年商界成功经验的百度执行副总裁徐勇博士。2000 年，百度回国发展超链分析技术，这是新一代搜索引擎的关键技术，已为世界各大搜索引擎普遍采用。百度的起名，来自于"众里寻她千百度"的灵感，它寄托着百度公司对自身技术的信心。百度公司自进入中国互联网及软件市场以来，就一直以开发真正符合中国人习惯的互联网核心技术为使命，依靠自身实力不断研发出拥有自主知识产权的可扩展的网络应用软件。 百度的产品及服务是针对不同企业及各机构网络化的基本需求而设计的，主要产品线有：一、基于全球互联网的中文网页检索。这条产品线主要服务于门户网站。二、企业级的信息检索解决方案，包括网事通系列软件及百度企业竞争情报系统。其中，网事通系列软件包括网站站内检索系统，行业垂直检索系统，新闻监控系统，企业垂直检索系统，实时信息系统及信息采集系统。目前，这些企业级的信息检索解决方案正服务于各个不同领域。此外，百度还利用遍布在全国庞大的CDN网络提供的信息传递技术(即网站加速及网络缓存技术)。 2001年10月百度依据李彦宏先生的第三定律和百度自身庞大的搜索用户群，适时地推出了搜索引擎竞价排名这一全新的商业模式。竞价排名，是指由用户(通常为企业)为自己的网页出资购买关键字排名，按点击计费的一种服务。通过竞价排名，搜索结果的顺序将根据竞价的多少由高到低排列，同时奉行不点击不收费的原则。目前，加入竞价排名推广阵营的网站包括各大中文门户网站、中国各地信息港以及百度提供技术支持的所有网站，来自于不同领域的数千家企业和个人主页参与了竞价排名。

动物细胞mRNA的制备植物细胞mRNA的制备 1、mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为溶胞粗制品翻译系统。无细胞提取物的制备：用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.常见的体外无细胞翻译系统:兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白.缺 点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA 。麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23 ;将S23分装,保存于-20°C冰箱中.利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA。优 点：适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.缺 点：不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止.哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译*SDS-PAGEanalysis of proteins translated by cell-free translation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation products of total mRNA from mammalian cells2、mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力3、mRNA分子的大小哺乳动物mRNA长度为500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.4、总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA*Lane 1: -HindIII-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA;Lane 3: the second chain of cDNA; Lane 4: -HindIII 1)高丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA .2) 低丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下.5,mRNA的富集方法典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝.mRNA的丰度与文库克隆子数的关系ln(1-P)N= ln(1-1/n)N: 所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例1) 按大小对mRNA进行分级分离* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低.* 蔗糖梯度离心:加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.2) cDNA的分级分离* mRNA通过反转录形成cDNA,在插入到克隆载体前,通过琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的cDNA分子分离开来.* 优 点:a)避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解b)增加了获得全长cDNA克隆的概率c)获得更准确的分级分离效果(分子量)3)多聚核糖体免疫学纯化法* 使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱(A蛋白-Sepharose柱)上,随后用EDTA将多聚核糖体解离下来,并通过Oligo(dT)层析分离mRNA, 利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍. 目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝. 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法准备工作：1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。试验步骤：表3：加入试剂量据此表 Total RNA RNase-free Water to: Buffer OBB(ul) OligotexSuspension (ul) Prep size <=0.25mg 250ul 250ul 15 Mini 0.25-0.5mg 500ul 500ul 30 Midi 0.5-0.75mg 500ul 500ul 45 Midi 0.75-1.00mg 500ul 500ul 55 Midi 1. Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water 补足到500ul2. 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension， 轻弹1.5ml离心管彻底混匀3. 置于70℃水浴中3min4. 取出置于室温（20℃－30℃）10min5. 13000rpm室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。6. 用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，离心1min7. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ul OW2，RT， 13000rpm，离心1min9. 取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。10. 测OD,并电泳定量。2.磁珠法分离mRN1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.2. 65&ordm;C加热10分钟。3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10 分钟左右。4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.5. 将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。7. 将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10 分钟。8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。9. 用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。12.将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。14.加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20&ordm;C沉淀过夜。15.4&ordm;C，13000g离心60 分钟。去上清，加入500ul 70%乙醇混匀。16.4&ordm;C，7500g离心10 分钟。17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。18.重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱注意事项：1．所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行2．如果total RNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。3．mRNA的电泳图是smear。

宝生物(Takara)的LA-taq不错。另外，就算你的基因GC不高，最好也试一下他们的GC buffer。

RNeasy Micro Kit from Qiagen is another choice.http://www.qiagen.com/products/rnastabilizationpurification/rneasysystem/rneasymicrokit.aspx

菌株与质粒AH109酵母菌株(MATa，trp1．901，leu2—3，112，ura3-52，his3-200，gal4A，gal8O~X，LYS2：：G地1U^s-GALlT^T^-HIS3， G U^s—GAI2T^T^-ADE2，URA3：：h吐1U^s．h吐1T^T^．1acZ)，YM187酵母菌株(NATQ，um3-52，his3-200，ade2—101，trpl-901，leu2-3，112，g △，met， O△，URA3：：GAL1U^s-GAL1T^T^一laeZ，NE!,1)．I~BKT7-p53是编码鼠p53蛋白(a．a．72—390)和GAL4 DNA BD(a．a．1—147)融合蛋白的阳性对照质粒。pcArrr7．T是编码SV40大T抗原(a．a．87—7O8)和GAL4 DNA．BD(a．a．1—147)融合蛋白的阳性对照质粒，上述菌株与质粒均购自CLONTECH公司。JIVl109大肠杆菌菌株购自promega公司。1．2 试剂鲑鱼精担体DNA，酵母培养用的YPDMedium SD Minimal medium 一 DO Supplement 一LeuDO Supplement、一Leu／一Trp DO Supplement、一Leu／Trp／HisDO Supplement、一Ade／一His／一L~aTrp 130 Supplement等均购自CLONTECH。硫酸腺嘌呤(Adenine hemisul。fate)购自Gibco。PEG 3250购自Sigma。DMSO购自AMRESCO。硝酸纤维素膜购自Phamacia。X-Gal购自BBI。QIAprep Miniprep Kit购自QIAGEN公司，其它常规分子生物学试剂购自北京华美生物公司。1．3 pGBKT7．ps3和t~alrr7．T质粒的制备用2mL LB液体培养基扩增pGBKT7一p53和pGADT7一T质粒。分别用小规模碱裂解法【7 (AIK法)和QtarREPMiniprep Kit试剂盒(QIAGEN法)提取质粒。紫外分光光度法测0D260／280，并计算质粒DNA含量。1．4 酵母双杂交共转化实验按酵母操作手册建议的方法进行转化，取不同量的上述两种方法提取的pGBKT7—053和pGADT7．T质粒共转化到AH109酵母菌株中，将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：10003种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／Trp／一Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目(cfu)。计算共转化效率：转化效率cfu／／．tg DNA=cfu×悬浮细胞体积( )×稀释倍数／[铺板体积( )×DAN‘](*这里的DNA的量指的是所用一份的质粒量而非全部质粒总量)。1．5 酵母双杂交顺序转化实验取不同量的上述两种方法提取的pGBKT7—053转化于AH109酵母菌株，用SD／ TW缺陷培养基筛选得到AH109[pGBKT7—53]，挑取新鲜的直径为2—3 iran的AH109[pGBKT7一p53]酵母单克隆4—8个，接种于1 ml SD／一Trp缺陷液体培养基中，旋涡振荡1 mira，彻底打散菌团。将1IIll菌液转移到5O IIll的sD液体缺陷培养基中。将pGADT7一T转化于AH109[pGBKTT-53]，其余方法同酵母操作手册，将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：1000三种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／一Trp／．Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目(cfu)。按上述公式计算转化效率。1．6 酵母双杂交交配实验 将pGBKT~．p53和pGADTrT质粒分别转化于酵母菌株AH109和YM187中，待在相应SD缺陷培养基平板上生长出克隆后，分别各挑取一个2—3 nl／n酵母单克隆共放置于一个含有0．5 ml YPDA液体培养基的1O IIll离心管中，涡流震荡1 min，彻底打散菌团，3ocI=、200rpm过夜培养(20—24 h)。100 交配培养物铺于SD／一 一Leu培养基平板，200 交配培养物铺于SD／一His／一I~u／Tw(TDO )培养基平板。检测二倍体数目：将交配产物按照1：10、1：100、1：1000三种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／一Trp／．Leu平板。待长出克隆后计数cfu。计算二倍体细胞数目：cfu×悬浮细胞体积(ta)×稀释倍数／铺板体积(ta)。1．7 窖a1分析实验1．7．1 8一半乳糖苷酶的定性分析 检测AH109[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，挑酵母克隆(新鲜直径为2—3 mm)划双斜线于平铺在相应培养基平板上的灭菌的硝酸纤维素膜上，3ocI=倒置培养24小时。将膜于液氮中冷冻，冷冻时间分别为10 s、30 s、1 rain、2 rain，30cI=放置10 mill，置于浸没于Z bufer／X．gal(100 ml Z bufer、0．27 ml f≥I巯基乙醇、1．67 ml 20 mg／m~的X—ga1)溶液的滤纸上(z bufedX．gal溶液以刚刚浸湿滤纸为佳)，放置于3OcI=下进行观察，15 rain记录一次，以后可每隔1 h记录一次。观察不同条件下菌落的颜色变化，划线的酵母菌落颜色在8 h内显色变蓝的即为阳性结果。同时没定液氮冷冻时间为1 min，比较处于不同显色温度(25℃、30℃、37℃)下f；-半乳糖苷酶的活性。1．7．2 8一半乳糖苷酶的定量分析定量分析AH109[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，同时以AH109[pCL1]为阳性对照，AH109[pGBKT7—053+pG~rr7一T]和AH109[pGBKT~+pGADT~一T]为空载体对照，AH109为阴性对照。AH109[pCL1]的稀释倍数为3，其余的稀释倍数为1。具体步骤参照酵母操作手册。计算p半乳糖苷酶的单位：1000×OD∞／(t×V×ODao)，其中t为反应时间，V=0．1 ml×稀释倍数。

高中生物里边用的方法原理：1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。准备工作：制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500 mL烧怀中，注入新鲜的鸡血（约180 mL），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血。静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。（也可以用离心机离心2 min（转速1000转/分）。用吸管吸去上清液。方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。 5 min2．溶解DNA：3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢4．过滤：取黏稠物5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3 min6．过滤：取滤液。7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5 min8．DNA的鉴定：沸水浴5min要是其他用途你就在看看七他人的回答好了。

化学试剂：国药，阿拉丁，百灵威，Sigma-Aldrich，TCI，Alfa等诊断试剂，培养基、耗材这个范围太广了，各大生化公司都有著名的有GE，Thermo Scientific，Takara，Qiagen，Millpore，Invitrogen等

水稻原生质体分离与转化方法（储成才 课题组 2014-01-20）【概述】原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，现在已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。现在已有的基于原生质体的实验技术包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证（如BiFC和蛋白质免疫共沉淀）等。本文主要阐述如何利用原生质体进行亚细胞定位，包括原生质体的制备与转化，定位载体的选择，共定位蛋白参照的介绍，荧光蛋白的性质和波长选择等问题。一、实验的前期准备：1. 水稻材料：将露白的水稻种子(中花11或者日本晴均可)整齐的播种在营养土（最好混有蛭石，营养土与蛭石的比例为1:1）中，放在温室生长14-21天。或者放在96孔PCR板上，萌发两天后，换成1×木村营养液培养7-10天。注意如果采用水培苗必须每天更换营养液，否则水培苗纤维化程度较高，叶鞘部分不够肥厚，且不容易被酶液消化。制备一次原生质体需要50-60棵水稻幼苗，可供转化质粒5-8个。2. 质粒制备：转化原生质体对质粒的质量要求比较高，需要使用试剂盒大量提取。通常大量提取一次需要100 mL菌液，使用Qiagen中量提取试剂盒可获得100-150 μg的高纯度无内毒素的质粒。质粒提取完毕后需要定量，通常将质粒稀释到 2 μg/μL，一次原生质体转化需要5-10μg质粒。二、试剂和耗材：1. 耗材：耗材准备如下表所示。50 mL 蓝口瓶 1 否 用于配制酶液250 mL 三角瓶 2 是 用于盛放酶液和过滤原生质体A4打印纸 4-10 否 暂时盛放刀片切下的叶鞘薄片玻璃板 1 否 避免刀片划伤实验台50 mL Nalgen圆底有机玻璃管 2 是 用于离心收集原生质体2 mL离心管 6-10 是 用于原生质体转化双面刀片 8 否 用于切水稻茎和叶鞘0.22 μm滤膜 2-3 否 用于过滤酶液细胞培养板 1 否 用于培养转化的原生质体2. 试剂准备：(1) Enzyme solution0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 2.74 g 5.47 g 10.93 g10 mM MES (M=195.24, pH=5.7) 0.0487 g 0.0975 g 0.195 g1.5% Cellulase R-10（w/v, Yakult）0.375 g 0.75 g 1.5 g0.75% Macerozyme（w/v, Yakult）0.1875 g 0.375 g 0.75 gD-Mannitol 和MES 在常温储存，Cellulase R-10和Macerozyme R-10在4度冰箱储存。用1M KOH 调pH 至5.7，然后65℃水浴10min ，过0.22μM 滤膜除菌至无菌三角瓶中（注意pH 值一定要准确，否则将极大的影响原生质体的制备效率。Cellulase R-10可以用Cellulase RS 代替，但是Cellulase RS 的最适pH 大约为6.0左右）。待酶液冷却至室温后，加入如下试剂： 0.1% BSA0.025 g 0.05 g 0.1 g 3.4 mM CaCl 2 (M=110.99) 0.0095 g 0.019 g 0.038 g 50 mM β-ME (14.3 M) 8.75 μL 17.5 μL 35 μL50 μg/ml Carbenicillin1.25 mg2.5 mg5 mg(CaCl 2可配制1M CaCl 2，然后加入85 μL/ 25 mL ，Carbenicillin 配制50 mg/ mL 的母液)。 (2) W5 Solution 154 mM NaCl (M=58.44) 0.9 g 1.8 g 3.6 g 125 mM CaCl 2 (M=110.99) 1.39 g 2.78 5.56g 5 mM KCl (M=74.55)0.037 g 0.074 g 0.148 g 2 mM MES (M=195.24, pH=5.7)0.039 g0.078 g0.156 g用1M KOH 调pH 至5.7 , 121℃灭菌20 min 。 (3) MMg Solution 0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 10.93 g 15 mM MgCl 2 (M=95.22) 0.143 g 4 mM MES (M=195.24, pH=5.7)0.078 g用1M KOH 调pH 至5.7 , 121℃灭菌20 min 。 (4) 40% PEG Solution 0.6 M D-Mannitol 0.546 g10.93 g 100 mM CaCl 20.5 mL (1M CaCl 2) 1.11g 40% (v/v) PEG 4000 (Fluka, Sigma-Aldrich )2 g (体积约等于1.75 mL)40 gTips ：由于PEG 吸水后体积会膨胀，所以必须在定容前给PEG 留出一部分体积。配制该溶液时先溶解D-Mannitol 和CaCl 2后，再加入PEG ，65℃水浴加热10min 至完全溶解后，再定容到最终体积。三、实验步骤1. 原生质体制备：(1) 预先配制0.6 M D-Mannitol 溶液100 mL 。(2) 将培养的水稻苗从茎基部截断后，用刀片切成0.5 mm 薄片，每次4-5颗苗/1个刀片(茎部比较好，叶片的细胞比较小，去除衰老的叶鞘)。将切好的水稻细条迅速转移入0.6 M D-Mannitol 溶液中，在常温下60-80 rpm 培养30 min 。(3) 用神奇滤布（Miracloth）过滤后，再药匙将滤布上的水稻薄片转移入含有酶液的250 mL 三角瓶中（三角瓶需用锡箔纸包住，避免见光）。放入28℃摇床，在黑暗条件下60-80 rpm酶解4-5 h。Tips：以上步骤为节省时间，也可以直接将切好的水稻薄片转移入酶液中进行酶解。如果不经过0.6 M Mannitol质壁分离预处理的，则需抽真空半小时（15 mmHg）。(4) 取10 μL在光学显微镜下观察原生体的完整性，健康的原生质体为边缘清晰的圆形游离态。(5) 加入与酶液等体积的W5 Solution，用力摇晃15 s，充分释放原生质体。(6) 用W5 Solution润洗灭菌过的网筛(35 μm, 100目), 将酶解的原生质体通过网筛，过滤到新的250 mL三角瓶中。再用少量W5 Solution冲洗网筛，充分洗脱网筛上的原生质体，并将其全部转入250 mL三角瓶中。(7) 将三角瓶中的原生质体分装到两个50 mL透明离心管中，水平转子450 g（大约1500 rpm）离心3 min（注意调整升降速为3），小心去除上清。(8) 加入15 mL W5 Solution重悬原生质体，并于450 g 离心3 min。小心去除上清后，重悬原生质体于1 mL MMg Solution中，使细胞的终浓度为1-5×106 cell/mL。2. 原生质体转化：(1) 在2 mL离心管中加入5-10 μg 质粒，再加入100 μL制备好的原生质体，并轻柔地吸打混匀。(2) 加入110 μL 40% PEG，并迅速轻柔混匀，勿使原生质体成团。(3) 置于28 ℃水浴15 min，加入1.8 mL W5 Solution重悬，并终止反应。(4) 将2 mL离心管套在10 mL离心管中，水平转子450 g离心3 min。(5) 用移液器小心吸除上清后，重悬原生质体于750 μL W5 Solution中。(6) 转移原生质体到12孔细胞培养板里，用封口膜包好后，于28℃避光培养12-16h。Tips：原生质体的转化体系一定要按比例放大，否则PEG浓度的改变会导致转化效率的降低。用于Co-localization和BiFC等共转化实验需要的质粒要更多更纯。四、亚细胞定位以及BiFC的载体信息1. 用于亚细胞定位的载体有：pCAMBIA2300-35S-EGFP(N)：EGFP融合于目的蛋白N端。可用来做瞬时表达和稳定表达。pCAMBIA2300-35S-EGFP(C)：EGFP 融合于目的蛋白C端。可用来做瞬时表达和稳定表达。(这两个载体可用于稳定转化水稻、拟南芥和烟草，注意农杆菌分别对应AGL1和GV3101。) pUC-35S-EGFP(Modified): eGFP融合于目的蛋白N端。仅可用来瞬时表达。pSAT6-EYFP-C1(35S,CD3-1103)：eGYP融合于目的蛋白N端。仅可用来瞬时表达。pSAT6-EYFP-N1(35S,CD3-1104)：eGYP融合于目的蛋白C端。仅可用来瞬时表达。2. 用于BiFC的载体有（双分子荧光互补的载体是成对的）：pSPYNE173和pSPYCE（M）：分离的EYFP融合于目的蛋白的C端，用于瞬时表达。pSCYNE和pSCYCE：分离的CFP融合于目的蛋白的C端，用于瞬时表达。pVYNE和pVYCE：分离的Venus融合于目的蛋白的C端，用于瞬时表达和稳定表达。pVYNE(R)和pVYCE(R)：分离的Venus融合于目的蛋白的N端，用于瞬时表达和稳定表达。Tips：在转化原生质体时，应当尽量采用 ~4.5 kb的质粒。越小的质粒转化效率越高，蛋白荧光越强。五、共定位蛋白参照我们实验室现有的共定位蛋白参照如下：Endoplasmic reticulum ER-RFP（RFP-HDEL） Unknown Golgi Golgi-RFP（SialT-RFP） UnknownTonoplast Alpha-TIP-RFPGamma-TIP-RFPDelta-TIP-RFP At1g73190 At2g36830 At3g16240Chloroplast RbcS-EGFP Os12g0291100 Nuclear OsbZIP52-mRFP Os06g0662200此外，还有一些共定位蛋白参照可以参考：Chloroplast OsRbcS Os12g0292400 Chloroplast OsRbcA Os11g0707000 Mitochondrion OsRpl6-2 Os08g0484301 Mitochondrion OsAtpC Os07g0513000 Nuclear OsSRT1 Os04g0271000 Golgi Golgi-mCherry（Man49-mCherry）UnknownGolgi OsNST1 Os02g0614100 Endoplasmic reticulum DEP2 Os07g0616000六、荧光蛋白的基本特性目前，常用的一些荧光蛋白的基本性质总结如下：Aequorea FP derivatives (水母来源的荧光蛋白)Cyan (CFP) 433/452 475/505 Monomer/weakdimerCerulean 433 475 Monomer/weakdimer Enhanced green (eGFP) 488 506 Monomer/weakdimer Enhanced yellow (eYFP) 514 527 Monomer/weak dimerVenus 515 528 Monomer/weakdimer Citrine 516 529 Monomer/weakdimer Anthozoa FP derivatives (珊瑚来源的荧光蛋白)mOrange 548 562 MonomerRed (RFP) 555 584 M

联科生物地处素有“天堂”之称的浙江省杭州市，迄今已在上海、北京、广州、南京、苏州和厦门设立了6个常驻办事机构，为全国各地的用户提供最方便和快捷的服务。联科生物已与多家国际著名的生产商签订了独家或区域代理协议，为中国的专家和学者提供种类齐全的高品质产品。主要产品包括：美国Invitrogen公司的细胞生物学和流式细胞术产品、美国eBioscience公司的流式细胞术产品, 美国Peprotech公司的重组细胞因子、奥地利Bender Medsystems公司的细胞因子ELISA公司检测试剂盒、美国CTL公司的ELISPOT分析仪、瑞典Mabtech公司的ELISPOT检测试剂盒、美国Enzo公司 (旗下品牌：Alexis Biochemicals, Biomol, Apotech) 的荧光素和各种检测试剂盒、美国Millipore公司的耗材和细胞生物学产品 (旗下品牌：Chemicon, Upstate, Linco)以及德国Qiagen公司的分子生物学试剂盒等。值得一提的是，联科生物最近与德国美天旎公司(Miltenyi Biotec)达成合作协议，从2009年9月1日起在中国十个省内独家经销美天旎公司的免疫磁珠分选产品和gentleMACSTM全自动组织处理仪，为分选富集干祖细胞、T细胞和B细胞亚群、DC细胞和各种肿瘤细胞提供全球最佳的产品。同时，我们公司时刻跟踪最新科技，密切关注国外的科研动态和新兴公司的发展，力争为中国用户引进更多、更好、更新的技术和产品。

植物材料用最精确的方法,称取不超过100mg的植物材料,置于处理过的研钵,加入液氮进行研磨将研磨得到的粉末,快速转移至无RNase,并经过液氮冷却的2mL离心管(自备),注意材料要保持冷冻状态加入450?L Buffer RLT（1mL 加入10μL β-巯基乙醇）,颠倒混匀,涡旋将溶解物转移至于淡紫色的QIAshredder spin column,最大转速离心2分钟,取上清转移至新的2mL的收集管（自备）加0.5倍体积（约225μL）的无水乙醇,迅速吹打混匀将样品(约650μL )转移至带有2mL回收管的粉色RNeasy spin column（以下简称column）,>=8000g离心15s,将滤出物丢弃加入700?L Buffer RW1至column,>=8000g离心15s清洗柱子上的滤膜,丢弃滤出物和收集管转移column至新的收集管（提供）,加入500 ?L Buffer RPE,>=8000g离心15s清洗柱子上的滤膜,丢弃滤出物再加入500?L Buffer RPE,>=8000g离心2分钟清洗柱子上的滤膜(为了保证除净Buffer RPE,可弃旧的收集管和滤出物,取新收集管(自备)最大转速离心1分钟)转移RNeasy spin column至1.5mL收集管（提供）,加入30-50?l 无RNA酶的水于滤膜上,>=8000g离心1分钟,洗脱RNA（如果预期得到的RNA大于20?g,可重复第十步）或者看说明书最好了

求助QIAGEN试剂盒提取总RNA的步骤样品处理：a. 植物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀。b. 动物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。c. 贴壁细胞：直接在培养板中加入裂解液裂解细胞，每106细胞加1ml 裂解液。用取样器吹打混匀。d. 细胞悬液：离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。e. 血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。

总RNA提取试剂盒步骤：样品处理：a. 植物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀。b. 动物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。c. 贴壁细胞：直接在培养板中加入裂解液裂解细胞，每106细胞加1ml 裂解液。用取样器吹打混匀。d. 细胞悬液：离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。e. 血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟。2-8℃ 12000 rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀。吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul 洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2分钟，2-8℃ 12000rpm离心2min，弃废液。向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即得到RNA。

总RNA提取试剂盒步骤： 样品处理： a. 植物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀。b. 动物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。c. 贴壁细胞：直接在培养板中加入裂解液裂解细胞，每106细胞加1ml 裂解液。用取样器吹打混匀。d. 细胞悬液：离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。e. 血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟。2-8℃ 12000 rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀。吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul 洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2分钟，2-8℃ 12000rpm离心2min，弃废液。向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即得到RNA。

个你是用来提取什么的RNA呀？ 我们之前用过的，

应该是TE，TE较适合保存DNA，且对PCR扩增的影响并不是很大。

55℃水浴保温15分钟~30分钟

北京艾德莱的植物RNA提取试剂盒非常好用！他们有好几款植物RNA提取的试剂盒。现在给您好提供一些资料，希望能帮助到您；(1) 首先有两种选择：第一是用他们的RN01 TRIpure reagent，这个就是Invitrogen的TRIzol，他们的质量完全和进口一样可以100%替代进口TRIzol。 第二是用RN33 PLANTpure 通用植物总RNA快速提取试剂盒 （普通植物组织细胞）,这个试剂盒的原理，是TRIzol加离心柱子，在TRIzol的基础上加了离心柱子，速度更快，纯度更高，操作更简单。等于是TRIpure（RN01）加离心柱子。(2) 然后根据特殊具体需求比如想速度更快，操作更简单，还不想用TRIzol这种苯酚，氯仿毒性物质还有两种选择：一种选择是RN09 EASYspin植物RNA提取试剂盒，这个盒子和Qiagen的74904完全一样，不用苯酚，氯仿，速度最快，操作最简单。但是对部分植物样品来说，可能残留基因组DNA稍多，只有做了试验才知道客户的样品是不是残留DNA稍多，就是Qiagen也不能确保100%的样品没有残留DNA。北京艾德莱能确保的就是和Qiagen的效果一致。实在有DNA残留的，就可能还要用DNA酶消化。具体只能自己权衡选择或者和艾德莱技术人员沟通了再选择。另一种就是RN38 EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒这个试剂盒是RN09的改进版本（Qiagen也没有这款，是艾德莱在Qiagen基础上改进世界首创的），它使用基因组清除柱子的技术和配方在保持RN09不用苯酚，氯仿毒性物质，最简单，最快速的基础上消除了基因组DNA残留，一般肉眼不可见DNA残留。注意：目前北京艾德莱测试的几种植物样品中均已经获得成功，使用RN09提取有残留DNA的样品种类使用这款后，均无DNA残留。希望我的回答能帮助到您好。

最好保存于RNAlater溶液中。37度，24小时，室温一周；4度一个月都没有问题。Qiagen公司http://www.qiagen.com/products/rnastabilizationpurification/rnalaterrnaprotectsystems/rnalaterrnastabilization.aspx#Tabs=t1 如果没有条件，液氮急冻，再保存于-80度。

博凌科为解答：您的情况我们去年也曾遇到过。目前市面上的质粒提取试剂盒林林总总，令人难以取舍。我觉得首先应该根据自己的需要来选取。进口的试剂盒，比如 qiagene，omiga，promega等固然好，但是价格较贵，如果自己的实验要求不是很高的话，用这些试剂盒感觉有浪费的嫌疑（当然经费充足无可 厚非）。但是有些国产的试剂盒不怎么令然放心，象楼主这样做稳定转染的，要花费很多的时间和精力，最后因为试剂盒的问题影响实验的进度有点得不偿失，而且 脂质体都比较贵。因此，性价比是最重要的因素。大部分的质粒提取试剂盒所得产物可分为如下几个级别：1.高级转染级：这是最高纯度的去内毒素的质粒纯化，主要使用于基因治疗，cell显微注射，原代细胞转染等。2.常规转染级：它要优于2次cscl超速离心纯化的质粒。3.分子生物学级，相当于1次cscl超速离心纯化的质粒。4.测序级：主要用于常规酶切与连接用。我们实验室用过qiagene，axgene，omiga和国产天根的。大家对qiagene的评价最好。但是我自己的经验（qiagene的漂洗 液用完了）是用qiagene的吸附柱和天根的漂洗液联合得到的质粒最满意od26/od280为1.8（呵呵，只是个别案例，样本含量不足，仅供参 考）。我只做过原代细胞的顺时转染，稳定转染我没有做过，建议楼主可以考虑大家评价较好（比如天根的）试试看。记得有些公司经常做活动给一些试用装，也可 以尝试。楼主也可以结合其他战友的建议。

一般提取的就是口腔脱落的细胞，需要注意的是提取前要最少半个小时不能喝水，吃东西，不然会影响提取的效果，提取检测的话，是有专门的试剂盒的，我有用过BIOG，QIAGEN的，效果都还不错。

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。4、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）5、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。6、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。7、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。扩展资料：DNA提取原则：1、保证核酸一级结构的完整性；2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。参考资料来源：百度百科——DNA提取

中外医学家联合研制出了一项可在两个半小时左右快速筛查宫颈癌的技术。9月22日出版的最新一期英国《柳叶刀—肿瘤学》（The Lancet Oncology）杂志，发表了这项研究成果。 这项名为HPV快速筛查法（careHPV）的技术与现在普遍使用的两种宫颈癌检测法相比，能够更加快速而准确地捕捉到由人乳头状瘤病毒（HPV）导致的宫颈癌及癌前病变。 该研究项目临床试验的负责人、中国医学科学院肿瘤研究所乔友林教授说：“临床检测结果显示，这项技术的假阴性率为10%，假阳性率为16%，接近发达国家和地区普遍使用的杂交捕获二代（HC2）技术，比较令人满意。” 在美国比尔／梅林达?盖茨基金会的资助下，流行病学家乔友林和他的研究团队与美国卫生科技推广研究所（PATH）和德国凯杰公司（QIAGEN）合作，历经5年，研究成功了这项筛查技术。 与目前通常使用的巴氏涂片和液基细胞学技术相比，HPV快速检测技术实验设施简单，操作容易。乔友林说：“乡村卫生员经过基本训练，就能很好地掌握这个技术，而且，可以在没有水电的情况下操作。”他率领研究团队在山西襄垣县和武乡县，采用三种方法——HPV快速筛查法（careHPV），醋酸染色后观察（VIA）法，以及杂交捕获二代技术检测（HC2）法对2388名30－54岁妇女进行了对比检测。 结果表明，HPV快速筛查技术，识别宫颈癌与高度病变的敏感度和特异度，都大大优于醋酸染色后观察法，并与杂交捕获二代技术的检测准确度相差不大。 这项技术在中国应用获得成功，改写了宫颈癌生化检测技术的历史。“它的准确度与杂交捕获二代（HC2）技术相差甚小，但费用却比它少10倍，”乔友林说。 作为一种面向低收入国家和地区的宫颈癌预防的实用方法，HPV快速筛查技术拥有广阔的前景。 HPV病毒几乎在所有子宫颈癌病例中都存在，是引发子宫颈癌的元凶。在妇科恶性肿瘤中，子宫颈癌是仅次于乳腺癌的威胁妇女健康的第二杀手。全球每年大约有47万妇女罹患宫颈癌，中国约有10万，其中70%是农村妇女。著名艺人梅艳芳和李媛媛，都不幸死于这一疾病。 自巴氏涂片1941年问世以来，宫颈癌早期病变检出率增加，全球宫颈癌发病率下降了80%。但是，在发展中国家广泛推行该技术却比较困难。 乔友林说，“首先，它需要建立高标准的细胞学检查系统，以及培养训练有素、能准确阅读巴氏涂片的细胞学技术人员，这两方面所需的费用都相当可观。”另外，巴氏涂片的敏感度并不令人满意，假阴性率约可高达40%。 从理论上讲，液基细胞学加杂交捕获二代的HPV检测技术是最佳检测方法，其假阴性率为2%，假阳率为15%。“唯一的问题是，做一次这样的检测需要花费500多元人民币，即便是对大城市的工薪阶层妇女也太高了。它只适合深圳等高收入城市，”乔友林说。目前，醋酸染色观察法是贫困地区宫颈癌筛查的主要模式。这个检测只需要10元人民币，但效果不尽如人意。他说，“如果妇科医生不熟练，或没有接受良好的培训，肉眼观察的假阴性和假阳性率可以高达40%和20%。” 尽管国际上研究开发的预防宫颈癌的疫苗已在很多国家和地区获准上市，但是，疫苗只能预防70%左右的宫颈癌，而且对已经感染HPV病毒的妇女不起作用。 因此，HPV病毒的检测对防治宫颈癌仍然至关重要。研究出经济、准确、安全、有效的宫颈癌筛查方法也因此成为学术界和国际社会关注的焦点。“如果妇女一生中能做一次，作到早诊早治疗，那么，宫颈癌的发病率和死亡率可望下降三分之一，”美国卫生科技推广研究所的约翰·瑟拉斯（John Sellors）博士说。

.dna提取的几种方法(1).浓盐法利用rnp和dnp在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1m氯纳提取化钠抽提,得到的dnp粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而dna位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将dna钠盐沉淀出来.也可用0.15mnacl液反复洗涤细胞破碎液除去rnp,再以1mnacl提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取dna时,加入适量去污剂,如sds可有助于蛋白质与dna的分离。在提取过程中为抑制组织中的dnase对dna的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15mnacl,0.015m柠檬钠,并称ssc溶液,提取dna.（2）.阴离子去污剂法:用sds或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取dna.由于细胞中dna与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取dna.（3）.苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了dnase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与dna联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而dna溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含dna的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀dna。此时dna是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的dna保持天然状态.（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去rna，然后将沉淀溶于水中，使dna充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6m.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%u066080%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得dna样品.此法提取的dna中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入sds.

1楼存在错误，因为是组织蜡块在使用Trizol法之前，应该先用二甲苯去除石蜡。用过Trizol法效果不是很好，建议用QIAGEN试剂盒FFPE RNA提取试剂盒。QIAGEN试剂盒毕竟是全世界核酸提取的老大。

冻干的样本，会影响DNA和RNA的提取质量从全血中提取DNA和RNA应该说是最基本的工作了，提取的DNA和RNA质量的好坏直接影响了下游的实验和分析，可供选择的方法非常多，乱花渐欲迷人眼，如何选择最适合的方法，成了很多人实验开始前最难以抉择的事情。我们从两个方面，层层剥茧，分析最佳的实验方法。 1、 全血的采集保存和DNA的提取I. 用含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTA和肝素，EDTA更好一些，不会影响下游的反应，如果没有采血管，也可以自己添加抗凝剂EDTA，提前准备0.04M的EDTA溶液，每5ml的血液中加入0.4ml配好的EDTA溶液，颠倒混匀即可。保存于-20℃至-80℃，一般2-3年内均可以提取，保存时间越短，提取的质量越高，最好在2个月内提取。II. DNA提取方法的选择：全血提取试剂盒一般有离心柱和溶液型两种（比如Qiagen、Promega、Bioteke；摒弃酚氯仿手提的方法，时间长毒性大），原理及步骤基本相同。虽然各公司推出了N多型号，让人不知如何去选择，但从原理和操作步骤看，基本就是离心柱和溶液型两种。一般来说，离心柱（DP1801）的提取纯度高一些，但是处理量小（0.1-1ml）、得率略低；溶液型(DP2101或DP2201)的提取量大（1-10ml）得率也高于离心柱。医院的血液标本一般在2ml以上，一般选择溶液型的方法提取.在说到国产和进口差别的时候，很多人以为进口一定比国产的好，我们觉得没有最好，只有更好！在不断的进行试验优化之后，全血基因组DNA提取试剂盒DP2101或DP2201开创了第三代技术，不需要蛋白酶K消化，进口的都是要借助蛋白酶K的啊！DP2101或DP2201减少了蛋白酶K现配现用的麻烦和消化的时间，而且提取量和稳定性更好。III. 非抗凝血（凝固血）能否提取？答案是肯定的，而且一点都不麻烦，提取效果和抗凝血没有差别！在你找遍了进口的所有品牌都找不到后，回过头来您才发现原来他就在身边，百泰克的凝固血基因组DNA提取试剂盒已经有很多忠实的用户。2、 全血RNA如何提取I. 全血RNA提取过程哪些是RNA降解的因素？全血中RNA酶是非常丰富的，RNA在没有保护的状态下很容易降解！哪些是状态RNA不受保护呢，比如红细胞裂解液裂解红细胞的过程，红细胞裂解液是低浓度的平衡盐溶液，没有抑制RNase的成份，这时候RNA不受保护；DNA酶消化的时候RNA也不受保护，这个时候也没有抑制RNase的成份。II. 什么样的提取方法更好？我们在选择方法的时候要倾向于对RNA全程有保护的方法！一般的方法都是先用红细胞裂解液裂解红细胞，然后从白细胞提取核酸，还要经过DNA酶的消化去除DNA，这种并不是最好的方法，过程中有很多RNA降解的因素。所以直接裂解法是最好的方法，将采集的血液迅速加入3倍体积的裂解液RLS——RP4001血液(液体样本)总RNA快速提取试剂盒(离心柱型)的裂解液，迅速颠倒混匀。裂解液RLS含有强烈的蛋白变性剂，能迅速变性蛋白，是RNase变性，不能对RNA降解。

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理:在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。扩展资料与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。参考资料来源：百度百科-RNA

有好几年没做实验了，不过我对1楼的回答有些疑问，现在有能做23000bp这么长的PCR？似乎我印象中PCR要这么长的长度本身就很难能全长扩增吧。那么如果我的理解没错的话，楼主是不是直接从土壤的细菌里头直接提取DNA。（呵呵，我也忘了细菌DNA大概多长），跑了一次电泳，然后把目的片断割下来，再纯化，再跑电泳，发现纯化之后的片断比目的片断小了。检测回收率，你可以在DNA溶解液过柱之后，柱子洗脱之前在柱子上加试剂盒溶解液，吹打几次吸取一些溶液A，同时吸取一些离心下来的溶液B，再将过柱后的洗脱液C，以及未过柱前的溶液D（如果浓度太低，可相应浓缩）肆个溶液再上一次凝胶电泳，一切都将看得明明白白，究竟你在过柱的这个过程中，DNA到底留在了什么地方。我相信有这个电泳图的话，应该可以很容易理解问题所在了。当然问题有可能象1楼所说的那样，天根的产品不过关（或者是你自己没有选对），那就换柱子！

我有Biorad IQ5 和 Roche LC480个人感觉Roche的好，速度快，精确度高，当然价格要贵得多

方法一：试剂盒 速度快纯度高污染小。可以买回来看说明书。方法二：人工提取 比较复杂污染相对高。但是便宜且随时可以操作。简述如下：1. 接菌。将适量菌体接入含有相同抗性的LB培养基中，37°C摇床培养过夜。2. 将菌液4000r/min离心1min，弃掉上清3. 加150微溶液1悬浮细胞，静置10分钟4. 加200微溶液2（必须新鲜配制），轻轻混匀，至液体清亮。5. 上步操作5min之内加入溶液3，混匀。冰上15min。6. 12000r/min离心10min，小心吸出上清转移到另一个小指管中。弃掉沉淀的蛋白。7. 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），漩涡混匀，12000r/min离心5min，上清转移到另一小指管。8. 加等体积氯仿：异戊醇（24:1），漩涡混匀，12000r/min离心10min，上清转移到另一小指管。9. 上清中加2倍体积无水乙醇，混匀后室温30min。12000r/min离心10min，吸去上清。10. 用1ml的70%乙醇洗涤沉淀2次（每次12000r/min离心5min）。吸去上清后，烘干或者空转，直至沉淀透明11. 加20微的RTE（含有RNA酶的TE缓冲液，没有的话无菌水也可以），溶解质粒DNA，-20℃保存。呼呼手打好累。溶液123的配方网上应该都有的吧。没有我再给你打。另外我们一般不图纯度的话，不用什么酚氯仿异戊醇的，直接用70%乙醇洗两次也可以，感觉没太大影响。

1999年底，百度成立于美国硅谷，它的创建者是在美国硅谷有多年成功经验的李彦宏先生及徐勇先生。2000年百度公司回国发展。百度的起名，来自于"众里寻她千百度"的灵感，它寄托着百度公司对自身技术的信心。 百度搜索引擎由四部分组成：蜘蛛程序、监控程序、索引数据库、检索程序。 门户网站只需将用户查询内容和一些相关参数传递到百度搜索引擎服务器上，后台程序就会自动工作并将最终结果返回给网站。 百度搜索引擎使用了高性能的"网络蜘蛛"程序自动的在互联网中搜索信息，可定制、高扩展性的调度算法使得搜索器能在极短的时间内收集到最大数量的互联网信息。百度在中国各地和美国均设有服务器，搜索范围涵盖了中国大陆、香港、台湾、澳门、新加坡等华语地区以及北美、欧洲的部分站点。百度搜索引擎拥有目前世界上最大的中文信息库，总量达到2亿页以上，并且还在以每天几十万页的速度快速增长。 核心技术：超链分析 超链分析技术，是新一代搜索引擎的关键技术，已为世界各大搜索引擎普遍采用，百度总裁李彦宏就是超链分析专利的唯一持有人。在学术界，一篇论文被引用得越多就说明其越好，学术价值就越高。超链分析就是通过分析链接网站的多少来评价被链接的网站质量，这保证了用户在百度搜索时，越受用户欢迎的内容排名越靠前。 百度创建人 李彦宏简介 李彦宏，1991年毕业于北京大学信息管理专业，随后赴美国布法罗纽约州立大学完成计算机科学硕士学位。在美国的8年间，李彦宏先生先后担任了道·琼斯公司高级顾问，《华尔街日报》网络版实时金融信息系统设计者，以及在国际知名互联网企业-INFOSEEK资深工程师，是新一代互联网技术领域的权威专家。他为道·琼斯公司设计的实时金融系统，迄今仍被广泛地应用于华尔街各大公司的网站，其中包括《华尔街日报》的网络版。 李彦宏最先创建了ESP技术，并将它成功的应用于INFOSEEK/GO.COM的搜索引擎中。GO.COM的图像搜索引擎是他的另一项极其具有应用价值的技术创新。 1996年，他首先解决了如何将基于网页质量的排序与基于相关性排序完美结合的问题，并因此获得了美国专利； 1998年，李彦宏先生根据在硅谷工作以及生活的经验，在大陆出版了《硅谷商战》一书，获得了各界的好评； 1999年底，携风险投资回国与好友徐勇先生共同创建百度； 2001年被评选为“中国十大创业新锐”之一； 2002年荣获首届“IT十大风云人物”称号； 2003年再次荣获“IT十大风云人物”称号； 2004年1月15日，当选第二届“京城十三新锐”； 2004年4月，百度总裁李彦宏当选第二届“中国软件十大杰出青年”。 ----------- 徐勇简介 徐勇，1982年就读北京大学生物系，1989年完成生物硕士学位后，获美国洛克菲勒基金会博士奖学金，赴美留学，于美国德州A&M大学完成博士学位，随后任加州大学伯克利分校博士后。在美国10年期间，徐勇先后任职于两家著名的跨国高新技术公司(QIAGEN, Inc.和Stratagene公司)的高级销售经理，并且获得过杰出销售奖。1998年，徐勇作为制片人之一拍摄了大型专题纪录片《走进硅谷》，客观以及全面的反映硅谷的发展过程，深度探求了硅谷成功背后的种种因素。在硅谷他多次应邀给来自中国大陆的高级政府官员介绍硅谷的风险投资机制和创业文化。1999年，徐勇与他人合作创立Cybercalling.com公司，这个网络电子商务公司在六个月内就实现了赢利。他与硅谷的众多商业团体都保持着密切的联系, 并为许多新兴的高科技企业提供商业咨询。1999年底，徐勇与好友李彦宏回国创建了百度。 2000年 1月 从美国回来的两个年轻人携风险资金从硅谷回到中关村，创建百度。 2000年 5月 百度签署第一个客户硅谷动力（enet.com），百度产品开始为用户提供服务。 2000年 6月 百度正式推出全球最大、最快、最新的中文搜索引擎，并且宣布全面进入中国互联网技术领域。 2000年 8月 百度开始服务搜狐（SOHU.com）提供服务。 2000年 9月 百度正式推出面向企业级用户的网事通信息检索软件。 2000年 9月 DFJ、IDG等国际著名风险投资公司为百度投入巨额资金。 2000年10月 百度开始为新浪（SINA.com）提供服务。 2000年10月 百度深圳分公司成立。 2001年 1月 百度为263 提供全面搜索服务。 2001年 2月 百度为TOM.COM提供全面搜索服务。 2001年 6月 百度在上海成立上海办事处。 2001年10月 百度为上海热线提供全球中文网页检索系统。 2001年10月 中国人民银行金融信息管理中心，采用百度“网事通数据库检索”软件。 2001年10月 百度推出全新商业模式---搜索引擎竞价排名。 2002年 1月 央视国际全套引入了百度“网事通”信息检索软件。 2002年 3月 百度总裁李彦宏获选“中国十大创业新锐”。 2002年 3月 百度全面接管263搜索频道。 2002年 3月 百度启动“闪电计划”，不断保持技术领先优势。 2002年 5月 千龙－百度中文信息检索技术实验室成立。 2002年 6月 百度推出深受网民喜爱的“IE搜索伴侣”。 2002年 7月 百度推出业界首例“竞争情报系统”软件，并举办全国巡展。 2002年 8月 百度网易深度合作，竞价排名全面提升。 2002年 9月 神州数码,中石化签约百度企业竞争情报系统；国务院新闻办签约百度新闻监控系统。 2002年10月 百度竞价排名业务全国代理商大会召开；百度开始为雅虎中文（yahoo.com.cn）提供服务。雅虎同时加入百度竞价排名阵营。 2002年11月 百度正式推出搜索大富翁游戏，广大网民踊跃参与。百度开始为网易（netease.com）提供服务，百度搜索一统中文门户巨头百度发布mp3搜索。 2002年12月 中国移动签约百度企业竞争情报系统；康佳、联想、可口可乐等国际知名企业成为百度竞价排名客户。 2003年 1月 百度总裁李彦宏荣获首届“中国十大IT风云人物”称号。 2003年 3月 百度在北京世纪剧院举行了主题为“活的搜索，改变生活--百度搜索激情夜”的大型活动。 2003年 6月 由第三方赛迪集团下属中国电脑教育报举办的“万人公开评测”公布了评测结果。百度超越Google，成为中国网民首选的搜索引擎。 2003年 6月 据美国第三方权威统计机构Alexa统计，在最受欢迎的中文网站中百度已经位居第四，表明百度成为全球最大的中文搜索引擎。 2003年 7月 百度推出图片、新闻两大技术化搜索引擎，巩固了中文第一搜索引擎的行业地位。 2003年 9月 百度开展“9月营销革命”，在全国近百个城市展开“竞价排名”付费搜索服务的市场推广活动，取得巨大市场反响。 2003年10月 百度总裁李彦宏荣获“中关村科技园区第二届优秀创业者”荣誉称号。 2003年12月 12月1日，百度陆续推出地区搜索、“贴吧”等划时代功能，搜索引擎步入社区化时代。 2004年 1月 百度、胡润联合打造“2003中国百富人气榜”。 2004年 1月 百度总裁李彦宏再次荣获“十大IT风云人物”称号。 2004年 1月 百度总裁李彦宏获得“京城十三新锐”的称号。 2004年 2月 光线、百度联合打造《全球华人明星人气榜》。 2004年 3月 中国搜索引擎调查揭晓，百度垄断中文搜索市场。 2004年 4月 百度规模进一步扩大，迁入理想国际大厦。 2004年 5月 据Alexa最新显示百度已经成为全球第四大网站。 2004年 6月 百度成功融资。 2004年 7月 百度隆重推出“网络营销之道”全国巡讲。 2004年 8月 百度推出超级搜霸。 2004年 9月 百度广告每日每字千金，创下中国网络广告天价。 2004年 9月 中国第一部搜索书籍《巧用百度》正式出版。 2004年10月 李彦宏代表中国网络界出席新加坡工业领袖大会。 2004年11月 手机上能使用百度。 2004年12月 iResearch发布《2004中国搜索引擎研究报告》，百度霸主地位凸显。 2005年 1月 百度开放首页一周救助海啸受难人民。 2005年 1月 百度总裁李彦宏蝉联三界十大IT风云人物。 百度文化 为人们提供最便捷的信息获取方式 这是百度存在的根本根基。 百度狂热的追求更好的搜索技术，追求给网民带来最好的搜索体验，追求为人们提供最便捷的信息获取方式。 百度正是以为互联中国提供及时、丰富的信息，为网友提供最好的上网体验，改变人们的生活方式为使命的。 永远保持创业激情 这是百度的创业文化基础。 百度勤俭的创业作风倡导每个百度人能够最大效用地利用资源，任何事情都专注于目标和结果，而非奢华的形式。 百度力求保持这种简洁的公司文化，无论今后百度如何的发展和壮大，都会以恒久的激情保持创业时期的那种没有繁文缛节的条纹约定、扁平的组织结构、以结果为导向的高效决策方式。 每一天都在进步 这是百度的品质文化基础。 百度公司及员工具有不断追求进步与发展的优秀品质，不断地总结过去，永无止境地提升的追求。过去不等于未来，无论我们的过去多么辉煌，我们仍需百倍努力地为明天更高的目标为奋斗。 我们相信学习是我们提升自我价值的根本途径，百度人都以对自我负责的学习态度面对瞬息万变的竞争危机的挑战。 容忍失败，鼓励创新 这是百度的创新文化基础。 百度人具有积极的创新心态，我们乐于创新，敢于创新。 诚然，尝试中的失败是有责任的，是有责任不断地完善的。但对于创新过程中的挫折和风险，百度人能够从失败中归纳总结经验，从中吸取教训，百折不挠地不断尝试和探索；这也正是基于百度公司能够以包容地态度给予尝试者改进的机会。 充分信任，平等交流 这是百度的沟通文化基础。 百度的沟通方式永远都是开放的、直接的和有效的，从而才会有务实的和坦诚的一致行动。 百度是个充分授权的公司，在百度管理的各个层面上，都以信任、责任和良好的沟通为正确决策的前提的，都以务实的精神而落实每一项决策工作的。 梦想与追求开始的地方 但凡人，都是有追求的！ 我们庆幸可以生在这样一个时代，可以把自己的职业与追求联系起来！ 我们同样庆幸，今天，我们拥有了实现自己的梦想与追求的权力！ 先问问你自己，你的梦想与追求是什么？ 再问问你自己，你是否将永不言放弃？ 你在选择职业的时候，考虑的是什么，薪金？福利？头衔？发展？是不是觉得有点对，但又不是都对？因为你其实要挑选的是一种生活方式，以及一种价值体现，一种真正可以把自己的岁月、自己的热情、自己的才华与其融为一体的生活方式，一种可以从物质得到升华的价值体现！ 你拥有这种权力，如同你拥有生命一样，如果你是具有这样追求的人！ 世界上的工作其实就两种，真的，简单的如同1 1的算式：一种是使你每天清晨当你睁开双眼感觉到沮丧；另一种是可以使你在吃早饭前吹口哨的。 我们拥有后一种感觉的地方，你呢？？？ 也许你已经听腻了如今社会上流行的"以人为本"，也许你遭受到很多次的欺骗，现在的你一如既往的活着，生活的本质并没有发生改变。那么，现在尝试一下改变吧！当你看见这篇文章的时候，你就得到了改变的机会！这不是广告，这只是一个公司、一群年轻的人把自己的诚挚表达出来的方式！ 我们不知道你要加入的原因与理由，但我们知道自己加入的原因： 我们愿意看见自己所在的公司每年以几倍的速度进行增长； 我们愿意从事世界上最酷技术的开发与推广； 我们愿意按照自己的时间安排来工作； 我们愿意与公司的每一个人平等而尊重的进行交流； 我们愿意工作在一个真正具有人性魅力的公司； 我们愿意拥有公司的股票； 我们愿意当工作疲劳时候，可以自由地玩游戏或上BBS，而不用竖着耳朵听老板的动静； 我们愿意用劳动所创造的财富提高生活的质量与乐趣； 我们愿意自己对公司任何方面的建议都可以获得公司领导层的答复； 我们愿意工作在舒适的环境。 如果你有怀疑，没有关系，加入之前我们也有。不如给自己一个机会，尝试着来到这里追求你的理想；也给我们一个机会，欢迎更多的精英加入，因为...上天注定，我们隶属于同一群人，我们会是最棒的团队！ 百度使命 Baidu Mission 百度是为互联网而生的。自古以来，人们就一直在追求更好的信息获取方式，互联网的兴起，极大的推动了信息检索技术的进步，一代代的搜索引擎技术人员不断地研究、发明新的更加满足用户需求的搜索服务，搜索引擎也始终在人们心目中占有极其重要的地位。搜索引擎作为互联网的一项基础应用，已经越来越得到广泛的认同。 2002年12月，华尔街著名的高科技股分析师Mary Meeker把整个互联网现象总结为SFO，就是搜索、发现和获得。雅虎也好，EBAY也罢，任何一个成功的互联网公司，都是通过SFO来体现他们的价值的。而这些公司的成长前景，可能会超过思科、英特尔们。很明显，SFO的基础就是搜索。 今天，美国人把他们的搜索引擎叫作"上帝"，因为大家觉得搜索引擎具有上帝一样的力量，如果你的网站在搜索引擎中找不到，你就象是在这个世界上消失了一样；如果在搜索引擎上查到的网页说你是一只青蛙，那末大家就会以为你就是一只青蛙，即使你是王子。搜索正在从各个层面影响着人们的生活。 大多数的中国人不相信上帝，中国需要自己的搜索技术，自己的搜索引擎。百度就是为此而成立的，百度狂热的追求更好的搜索技术，追求给网民带来最好的搜索体验，追求为人们提供最便捷的信息获取方式。百度是中国的，她愿意随时倾听中国人对互联网的需求，对搜索的需求；她的开发者是中国的，他们和其他所有中国人喝同样的水，呼吸同样的空气，分享同样的文化。百度是"活"的，自从诞生的那一天起，她就从未停止过与爱护她、关心她的用户进行交流。不管是搜索援助中心论坛上的一封封回帖，还是"您要找的是不是：……"这样一次次细致体贴的提示；每一个网友的建议都会得到认真的考虑，每一条发布的信息，都会被传递到网友制定的地域。 百度是年轻的，即使在中国互联网不长的历史中，百度也只是一个后来者，百度求新、求变、求发展；每一个百度人都因为在这个变化莫测，日新月异的产业中工作而感到兴奋和激动，他们既是中文搜索的制作者，又是中文搜索的使用者，他们决定着百度的未来。 互联中国是年轻的，她的发展速度令世界上许多人感到嫉妒，令能够参与到其中的人感到欢欣鼓舞。为互联中国提供及时、丰富的信息，为网友提供最好的上网体验，改变人们的生活方式，这就是百度的使命。

　　给大家指出免疫学检验常用技术有哪些：　　第一：免疫浊度技术　　第二：固相酶免疫测定技术　　第三：免疫荧光标记技术　　第四：流式细胞术　　第五：胶体金技术　　分子诊断是应用分子生物学方法，检测患者体内遗传物质结构或表达水平的变化，继而作出诊断的技术，它为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供了更为准确的信息。　　纵览全球分子诊断市场格局，罗氏诊断为最大的分子诊断公司，其次为诺华、Gen-Probe、Qiagen、BD、Cepheid、雅培和西门子等。根据近日GEN网站公布的《2013年全球分子诊断公司TOP14名单》，罗氏诊断的2012年收入为17.56亿美元，排名第一，其他上榜公司在分子诊断领域的收入也大部分在亿万美元级别。　　由于最早获得了PCR(聚合酶链式反应)技术的专利，并且通过仪器试剂一体化整合，在高效率、高度集成自动化方面具有显著优势，罗氏因此在血液筛查领域具有领先地位。

RNA提取没必要用DNA酶处理主要用途关仅仅扩某基所谓定量RT-PCR则DNA酶处理或者引物需跨exon. 比用QIAGENRNase-freeDNase处理加DNase结束除DNase（蛋白）buffer等能影响期操作素所酶解DNA必须纯化RNA（QIAGEN纯化柱）RNA才用于定量实验即使做real-time PCR都要加管仅加RNA作阴性照（排除DNA污染）

对于多个分子生物学和基因组学应用，从克隆和PCR到基因组测序和芯片分析，DNA纯化都是必经之路。然而，选择最佳的纯化试剂盒却并非易事。例如，在您纯化基因组DNA时，您需要一个试剂盒，能温和地处理核酸，同时又不分离质粒DNA。而且，新一代测序技术对样品的要求颇高，我们也需要一些专门的产品来纯化DNA。在此，我们介绍一些新选择。盐沉淀方法Epicentre（Illumina旗下公司）的MasterPure?CompleteDNAPurificationKit采用一种专利的盐沉淀方法。这一系列试剂盒覆盖各种样品类型，包括血液、固定组织、植物、酵母、昆虫等，在短短30分钟内可带来高产量的核酸，而损失极少。据Epicentre的资深产品经理CristineKinross介绍，有了这些试剂盒，用户在测序或其他分子生物学应用的样品制备之前无需再进行额外的纯化。它们可去除蛋白及其他细胞碎片，而不引入那些必须去除的毒性化合物，从而避免了多次洗涤，并改善核酸产量。Kinross谈道：“利用MasterPure回收核酸的出色纯度让样品可直接进入测序文库的制备。”当然，对于其他应用，包括芯片、qPCR和克隆，它也是适合的。此外，这个试剂盒也能用于RNA的纯化。在获得总的核酸后，经过DNase处理，就能得到总RNA。多种试剂盒Promega提供广泛的核酸纯化试剂盒，采用几种不同的策略。例如，Wizard?GenomicDNAPurificationKit是基于经典的沉淀法，可从全血、组织培养细胞、动物及植物组织、酵母和细菌中提取基因组DNA，灵活高效；而ReliaPrep?系列试剂盒采用柱提法，简单快速。此外，Promega还提供基于磁珠纯化的试剂盒。Promega公司基因组学的全球产品经理EricVincent表示：“尽管溶液的确切组分会有不同，但裂解、结合、洗涤和洗脱的基本过程适用于不同的结合方法（如硅胶或纤维素），不同的纯化形式（纯化柱或磁珠），以及手动和自动纯化操作。”对于一些非常重要的样品类型（如FFPE样品），还需要一些专门的操作或处理。“我们开发了独特的结合/洗涤缓冲液，它们能有效去除抑制下游反应的物质，而优化的系统让研究人员能够捕获少量的核酸并以小体积（不到30μl）洗脱，我们还开发出自动化的解决方案，适合各种试剂和通量，”Vincent说。这些试剂盒提供了完整的解决方案，能够以极小的体积洗脱核酸，同时又避免抑制剂残留在洗脱液中。经过这些试剂盒纯化后，核酸可用于PCR、Sanger测序、新一代测序、芯片等下游分析。经典的硅胶膜QIAGEN的核酸纯化试剂盒依赖DNA与纯化柱上的硅胶膜结合。抑制剂被洗掉，而完整的DNA随后从柱上洗脱，产量高，纯度高，带来更高质量的新一代测序文库。MarcoPolidori-QIAGEN样本制备的全球产品经理-认为，在处理极少量的样品或困难的样品如FFPE时，高产量就变得格外关键。FFPE样品所产生的DNA可能会出现“随机胞嘧啶脱氨”事件，这会导致人为的单核苷酸多态性（SNP）。不过，QIAGEN的GeneReadDNAFFPEKit能够去除脱氨的胞嘧啶，避免在NGS实验中产生错误的结果。此产品尚未正式推出，若有兴趣试用，可填写资料。“我们的大部分试剂盒都已在NGS应用中得以证明，从循环肿瘤DNA的全基因组测序到微生物组，”Polidori谈道。这些试剂盒能让用户从各种样品中获得高质量的DNA，避免FFPE样品出现C-T的假象，并在很短的时间内带来高分子量的DNA。MagAttractHMWDNAkit就能够利用简单的磁珠操作，实现100-200kbDNA的纯化。整个纯化过程温和去除污染物及抑制剂，并具有极高的产量和纯度。离液盐Sigma-Aldrich公司提供GenElute?MammalianGenomicDNAPurificationKit，这是基于离液盐试剂的产品。在含有离液盐的溶液中，样品被裂解，以确保大分子的彻底变性。添加乙醇，让DNA与硅胶膜结合。污染物被洗掉，而DNA被洗脱在Tris缓冲液中。通过专为分离基因组DNA而选择的硅胶膜，此试剂盒让用户能够从各种样品中纯化高质量的DNA，包括培养的细胞、组织（包括鼠尾）、新鲜的全血或白细胞。据介绍，此试剂盒综合了硅胶膜结合和微量离心形式的好处，避免了昂贵的树脂、乙醇沉淀以及有害的有机物，如苯酚、氯仿。更重要的是，它纯化所得的DNA可应用于限制性内切酶消化、PCR、Southernblot、测序等。（作者：JamesNetterwald/生物通编译）

品中RNA的纯度及整体质量对于后续的实验有重要的影响。以下是进行PCR array前RNA质控的推荐标准：定量：NanoDrop/Spectrophotometer（用于检测样本中的核酸浓度，蛋白与核酸的比例及是否存在污染，例如有机物/盐离子等污染）。请记录样品的浓度，230，260及280的吸光值。此方法无法评估RNA的完整性。● 浓度：最佳浓度是100-150ng/uL。如果低于此浓度，可以使用PreAMPsystem或者通过浓缩的方法提高RNA浓度。可以通过配套的QIAGEN 过滤柱，减小洗脱体积来实现样品的浓缩。通过拨打QIAGEN客户服务热线400-880-0325，可以获得样品浓缩方面的帮助。● 260/280比值：这一比值用于反应RNA浓度与蛋白浓度的比值。理想值应当在1.8-2.0，如果比值低于1.8，表明存在蛋白或其他污染。● 260/230比值：这一比值用于反应RNA浓度与共提取污染的比值。理想值应当在1.8-2.2，如果比值低于1.8，表明存在有机物/盐离子等污染。这些污染会影响后续qPCR反应。RNA完整性检测：通过凝胶电泳或bioanalyzer来分析RNA的完整度，从而保证RNA的质量，防止RNA的降解对后续实验的影响。以下内容是RNA完整度的通用标准：● 28S/18S比值：>1.5为高质量，1.3-1.5勉强可用，<1.3为较差质量● RNA Integrity Number (RIN): > 7为高质量，6-7勉强可用，< 6为较差质量