遗传作图的DNA分子标记

DNA 分子标记大多是以DNA片段电泳谱带形式表现的。依其遗传特性可分为显性和共显性标记2种；依多态性检测手段可分为以Southern杂交技术为核心的分子标记和以PCR技术为核心的分子标记；根据在基因组中出现的频率，又可分为低拷贝序列和重复序列标记。

限制性片段多态性

RFILP是第—种用于研究的DNA标记。限制性核酸内切酶是一种在特定序列上切割DNA分子的酶，用它处理一个DNA分子时，即产生限制片段。这种序列特异性意味着用一种限制酶处理一种DNA分子总会产生同样的片段。但对于基因组DNA来说，并不总是这样。这是因为有些限制位点具多态性，以两种等位形式存在。一种等位形式有正确的限制位点序列，能被酶切开；另一等位形式的序列有改变，从而该限制位点不能被识别。后者的结果是在核酸内切酶处理后，两个相邻的限制片段仍然连接在一起，从而导致了长度多态性（如图1）。这就是一个RFLP的例子。如同用基因作为标记一样，RFLP在基因组图谱上的位置可以通过追踪其等位基因的遗传而得到。人类基因组中大约有100000个RFLP，但是理所应当的每个RFLP只能有两种等位形式（有或没有这个位点），这就限制了RFLP在人类基因作图上的应用价值，因为一个家庭的所有成员很可能都是某一个RFLP的纯合子。（简单来说，它不能区分纯合子和杂合子）。

随机扩增片段长度多态性标记

（Random Amplified Polymorphic DNA ，RAPD)RAPD技术是由Williams等首先创立的一种DNA分子标记技术，利用单一的10个碱基寡核苷酸作为引物，对基因组DNA进行PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列多态性。

扩增片段长度多态性

（Amplified Fragment Length Polymorphism ，AFLP)AFLP是Zeabeau 等（1993）发明的一项技术，它既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性。其基本原理是通过PCR 扩增基因组DNA片段，扩增产物的变性聚丙烯酰胺电泳显示扩增片段长度多态性，其中引物=接头+酶切位点+2～3个核苷酸。

AFLP技术分析流程：⑴DNA 模板制备；⑵提取样本DNA 经浓度和质量检测后，一般采用双酶（EcoRI和MSEI或PstI或TaqI）酶切， 在基因组DNA上产生低频和高频切口；⑶选择性扩增酶切片段。酶切后，限制性片段在T4连接酶作用下与特定接头连接，形成带有接头的特异性片段；⑷PCR前扩增，一般用带一个选择性引物进行预扩增，反应条件与常规PCR反应基本一致；⑸利用放射性同位素标记或荧光标记PCR 引物；⑹在Taq聚合酶作用下完成94 ℃变性30s ，65 ℃淬火30s，72 ℃延伸60s，PCR扩增36个循环；⑺PCR产物在含尿素聚丙烯酰胺上电泳；⑻将电泳后的凝胶转移到吸附滤纸上，经干胶仪进行干胶处理；⑼在X光片上感光，数日后冲洗胶片并进行结果分析。

AFLP反应起始一般高温复性（一般65 ℃），因此只有那些与3"端严格配对的片段才能得到扩增，选择性很强。实验结果稳定，重复性好，呈典型的孟德尔式遗传，每个AFLP可以获得50～100条谱带信息，多态性强。

微卫星

（Microsatellite）微卫星是指以几个（1～6 bp) 核苷酸为单位，多次串联重复序列，也称之为简单重复序列（single sequence repeats ，SSR） 、短串联重复序列（short tandem repeats ，STR）或简单序列长度多态性（single sequence length polymorphism ，SSL P）。广泛分布于真核生物基因组中，大约每隔10～50bp就有一个微卫星，由于重复次数和重复程度的不完全而造成每一个位点的多态性。

单核苷酸多态性

（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）基因组中存在单个的点突变，且数量极大，有些也对产生RFLP，但许多并个能。这是囱为它们所处的序列不能被限制件内切核酸酶所识别。在人类基因组中，据认为有200000个以上的SNP(single nucleotidc polymorphism）位干基因内．而且有更多的SNP位于非基因的DNA中。

每个SNP只有两个等位基因，所以这些标记在人类绘制遗传图谱方面又与RFLP同样的缺点：对于一个SNP，很可能—个家族的所有成员都是纯合子。SNP的优点是它数目庞大，而且对SNP分型所用的方法不需凝胶电泳。这非常重要，因为已证明凝胶电泳很难实现自动化，所以使用它的检测方法相对缓慢而且费力。由于SNP以寡核苷酸杂交分析（oligonucleotide hybidization analysis）为基础，故其检测更快速。寡核苷酸是在试管中合成的通常小于50个核苷酸的短单链DNA分子。在适当的条件下，一个寡核苷酸与另一个DNA分子仅在可形成完全的碱基配对结构时才能杂交。如果有一个错配，寡核昔酸上就有一个位置不能形成碱基对。则不能杂交（图1）。因此寡核苷酸杂交能区分一个SNP的两个等位基因。筛选策略包括：

DNA芯片（DNA chip）技术

DNA芯片是一块面积为2cm平方或更小的硅片，以高密度排列方式携带有许多不同的寡核苷酸。待测DNA用荧光标记后加到芯片的表面。用荧光显微镜观察杂交情况，显示荧光信号的位置即表示该处的寡核苷酸与待测DNA发生了杂交。因此一个实验中可以量化许多SNP。

动态等位基因特异的杂交（dynamic allele-specific hybridization,DASH) 在这种技术中，杂交在溶液中进行，比如在96孔微量滴定板的一个孔中进行G荧光标记只能与双链DNA结合，因此只有发生了杂交才能检测到信号。开始，杂交在允许有错配的条件下进行。在这个阶段，无论待测DNA含有哪一种SNP等位基因，寡核苷酸都能与之杂交。由于错配的杂交产物不如完全杂交产物稳定，故在较低温度解链．因此可以通过升高温度来区分等位基因。这样就可以从使杂交依赖性荧光信号消失的温度来判定待测DNA中存在哪一种等位基因。