双脱氧核苷酸末端终止法(dideoxynucleotide chain termination method)

【答案】：将双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)加到体外复制体系中，如果能够造成末端终止，则DNA复制的方向是5"→3"，因为当DNA复制是3" →5"时，ddNTP无法参入到DNA链的生长端(无3"-羟基，不能与前一个核苷酸形成3"，5"-磷酸二酯键)，即5"端，因此不可能造成末端终止。

利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP）（图7-4-1），可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样，在4组独立的酶反应体系中，在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。

dNTP是脱一个氧，ddNTP是脱两个氧,又叫双脱氧。DNA的合成是在有四个脱氧核苷三磷酸酯的存在下进行，其中有一个或几个用32p作了标记，四个反应混合物中的每一个都含有一个双脱氧物。当反应结束时，最终反应混合物的每一个反应物中都有一系列新DNA的片段，都有一个相同的5′-端，但长度各不相同，并以碱基-特定3′-端为终止。这些混合物可用电泳法分离，用放射自显影术(射线显迹法)使之可视化，并读出序列。双脱氧测序：整个过程利用了DNA聚合酶的两个性质：(1)它能合成单链DNA模板的互补拷贝。(2)它能以2′,3′-双脱氧核苷三磷酸酯为底物。一旦当这一类似物被结合，其3′-端因缺少羟基而不再是链伸长所需的底物，从而使伸长中的DNA链终止。在实际操作中，使用DNA聚合酶I的克伦诺片段(Klenow fragment)，它缺乏完整酶的5′,3′-核酸外切酶的活性。

原理不同，反应不同，模板链不同。无空格Sanger双脱氧链终止法原理：双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）不会与正常的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）形成磷酸二酯键，从而链的随机终止，建立4个系统，就可得到4个套组（nested无空格sets），在一个胶板上同时电泳，就可读出模板链的互补链的顺序。Maxam-Gilbert化学修饰法将双链或单链DNA经过不同的化学方法降解，得到随机的短的DNA片段，再通过电泳分离读取顺序。每次只能在一个特定的核苷酸处降解：G反应：硫酸二甲脂（DMS）使鸟嘌呤N7甲基化，A+G反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，进而嘌呤环被嘧啶取代，C+T反应：肼能够裂解嘧啶环，进而导致其脱落，C反应：在一定浓度的条件下，肼只对胞嘧啶起作用，无空格相同点：4个反应系统，标记相同，一块凝胶，4个泳道。

双脱氧核苷二磷酸.....由ddNTP是双脱氧核苷三磷酸可推得因为 T 代表 三，而D 代表 二，所以ddNDP是双脱氧核苷二磷酸

因为pcr利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。DNA模板纯度不纯的时候，会对PCR起抑制作用。PCR反应中，模板只要1ng就可以，所以模板浓度不要太高。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。扩展资料：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下。根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。参考资料来源：百度百科-DNA测序

[概念] 　　核苷类逆转录酶抑制剂是最先问世、开发品种较多的一类药物，临床证实对HIV复制具有很强的抑制作用，核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs），是合成HIV的DNA逆转录酶底物脱氧核苷酸的类似物，在体内转化成活性的三磷酸核苷衍生物，与天然的三磷酸脱氧核苷竞争性与HIV逆转录酶（RT）结合，抑制RT的作用，阻碍前病毒的合成。 　　[主要品种] 　　本类药物主要有拉米夫定、司他夫定、地丹诺辛（DDI）和扎西他宾（DDC）。 　　[基本结构] 　　核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）的结构与核苷类似，为双脱氧核苷衍生物，可与细胞内核苷竞争性地结合逆转录酶，从而终止逆转录反应。 　　[作用机制] 　　通过阻断病毒RNA基因的逆转录，即阻断病毒的双股DNA的形成，使病毒失去复制的模板。此类药物首先进入被感染的细胞，然后磷酸化形成具有活性的双脱氧核苷三磷酸化合物，竞争性抑制艾滋病病毒逆转录酶，可导致未成熟的DNA链合成终结，从而病毒复制受到抑制。 　　[临床应用] 　　早期用于治疗AIDS及其相关综合征，对治疗HIV阳性/AIDS有一定的效果，可降低死亡率及机会性感染率，但都不能治愈AIDS。 　　[耐药性] 　　核苷类逆转录酶抑制剂联用，副作用大，易出现交叉耐药。 　　[药物相互作用] 　　核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联用：由于蛋白酶抑制剂作用于蛋白酶，使前病毒不能正常装配。为此这两类药物联用，大大降低了病毒在体内复制水平。

这位是搞分子生物学的吗? DNA测序的方法有很多种. 目前最常见的是双脱氧终止法了. 在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了. 也许这样说你不一定明白. 举一个例子, 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下: 在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT. 所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段: GA, GATCCGA, 同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC, 在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG 在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT, 电泳时按分子量大小排列, A反应的片段长度为2, 7; C反应的为4, 5; G反应的为1, 6; T反应的为3, 8, 四个反应的产物分别电泳, 结果为 8 7 6 5 4 3 2 1 A | | C | | G | | T | | 我们可以从右向左读, 为GATCCGAT, 至此, 测序完成(上面这个图在百度知道中显示不正常, 因为百度知道的网页用的是比例字体, 你如果想看它, 拷贝到记事本中, 用等宽的字体来看).

Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基因，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

ddATP为三磷酸腺嘌呤双脱氧核苷酸，dATP为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸。不一样，腺嘌呤表示碱基，相应的核糖核苷酸为腺苷酸（简称）-腺嘌呤核糖核苷酸。腺苷包括碱基和核糖，腺苷酸包括腺苷和磷酸5种碱基:A(腺嘌呤),T(胸腺嘧啶),C(胞嘧啶),G(鸟嘌呤),U(尿嘧啶)核苷酸的名称:A核糖核苷酸 AMP,C核糖核苷酸 CMP,G核糖核苷酸GMP,U核糖核苷酸 UMP脱氧核苷酸的名称:dAMP脱氧A核糖核苷酸,dTMP脱氧T核糖核苷酸,dCMP脱氧C核糖核苷酸,dGMP脱氧G核糖核苷酸ddTTP是三磷酸水平

C 胞嘧啶脱氧核苷酸 出现在线粒体中 线粒体含有 RNA和DNA 而且是胚细胞 说明该细胞在分裂需要大量复制DNA 和 RNA 复制是需要原料的 需要核苷酸的放射性物质集中于蛙胚细胞的细胞核和线粒体中 说明不是 DNA的原料要是DAN原料的话 在细胞核应该大量出现 说明只能为 RAN 还有就是他是拿来合成RAN的 不是现成的 RNA

测序分为常规测序和高通量测序。1.Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。2.高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序，不同的测序平台，测序原理是不同的。可以参考一下：http://www.majorbio.com/Products/High_Throughput_Sequencing

为什么sanger测序被称为dna序列测定Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

DNA链中核苷酸以3",5"-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2"-脱氧核苷三磷酸。2",3"ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3"位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3"羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置

以双链DNA测序为例，双脱氧末端终止法的基本步骤包括：变性双链模板的制备和延伸和终止反应。1、变性双链模板的制备① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液（含有待测病毒核酸的重组质粒模板），离心除去上清液后，用150ml Tris/葡萄糖缓冲液重悬菌团，在室温下放置5分钟。② 加入300ml的1%SDS，0.2mol/L NaOH，颠倒混合约15次，在室温下放置15分钟，加入225ml 3mol/L醋酸钠（pH4.5），颠倒约15次混合，在冰浴中放置45分钟，离心5分钟。③ 将650ml上清液转移至一支新管中，加入650ml异丙醇，混合后在室温下放置10分钟，离心5分钟后弃去异丙醇，抽真空干燥沉淀。④ 用125ml TE(pH 8.0）重新溶解DNA，加入375ml的4mol/L LiCl，在冰浴中放置20分钟后，于4℃下离心5分钟。⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍体积的异丙醇，在室温下沉淀30分钟，离心5分钟，弃去上清液。⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟，弃去上清液并干燥，用50ml TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。⑦ 取0.2mg质粒DNA，并将体积调至9ml，加入1ml 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室温下放置5分钟，加入2ml 30mol/L醋酸钠（pH 4.5）和8ml水。⑧ 加入6ml冰冷无水乙醇，混合后在干冰/乙醇浴中放置15分钟，在4℃下离心5分钟，小心地弃去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟并小心地弃去上清液，真空抽干沉淀，并用TE缓冲液重新溶解沉淀。2、延伸和终止反应以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。① 取4支0.5ml小离心管，标上G、A、T、C，每管加入7ml变性的双链DNA模板（分别为1和2mg），1ml寡核苷酸引物和2ml 5×测序缓冲液混合，65℃保温2分钟，在室温下冷却30分钟。② 每管加入1ml 0.1mol/L DTT，2ml 1.5mol/L 3种dNTP混合物，0.5ml32P dATP和2ml（2IU）修饰的T7DNA多聚酶混合物，在室温下放置5分钟。③ 按标记每管分别加入3ml 4种ddNTP终止混合物的一种。④ 短促离心后，在37℃下保温5分钟。⑤ 加入5ml甲酰胺上样缓冲液，上样前在80℃下加热2分钟，并迅速置于冰浴上，每个样品取3ml，上样电泳。⑥读取合成链的核苷酸序列。扩展资料延伸和终止反应中测序反应物电泳和序列读取的注意事项：（1） 按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶。（2） 按G、A、T、C次序加入每种样品，在G、A和T各泳道上样1ml，而在C泳道上样1.5ml。（3） 上样完毕加压1700V电泳，根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间。（4） 电泳完毕，在10℃冰醋酸中漂洗30分钟脱去尿素。（5） 在60℃或80℃干燥30分钟后，放射自显影读取序列。参考资料来源：百度百科-双脱氧链终止法

双脱氧终止法，即sanger测序法，是根据DNA在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列DNA片段，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。通俗点说，就是通过电泳的方法将一系列DNA片段从小到大排列起来，由于每条片段末尾都含有荧光标记的碱基，通过放射性自显影，即可读出这些碱基的种类，这些碱基的排列顺序，就是待测DNA的序列。

要看是什么型号的测序仪了现在有好几家生物公司的测序仪都可以达到1000bp了ABI3730XL好像就可以Sanger法测序的原理： 利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物,直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止,终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

dna测序技术，即测定dna序列的技术。在分子生物学研究中，dna的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和maxam和gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生a，t，c，g四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的page胶上电泳进行检测，从而获得dna序列。目前sanger测序法得到了广泛的应用。sanger法测序的原理就是利用一种dna聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dntp)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddntp)。由于ddntp缺乏延伸所需要的3-oh基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在g、a、t或c处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dntps和ddntps的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用x-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

【答案】：AZT易被免疫系统细胞T淋巴细胞吸收，这种细胞特别容易受HIV感染。在T淋巴细胞中，AZT被转变成AZT三磷酸酯(AZT三磷酸酯不能直接作药物，因为它不能通过细胞质膜)。人类获得性免疫缺陷病毒(HIV)的反转录酶对AZT有很高的亲和力，能把AZT加接到生长中的RNA链的3"末端。由于AZT没有3"羟基，RNA合成被中止，病毒RNA的合成迅速被阻止。即AZT是HIV反转录酶的抑制剂。AZT对T淋巴细胞本身无毒，因为细胞DNA聚合酶对AZT三磷酸酯的亲和力比dTTP低。AZT对红血细胞前体箭骨细胞有毒，因此病人常常产生贫血病。已证明AZT能使早期感染AIDS病毒的人晚一年发病，可以延长已患病病人的存活时间。

脱氧核苷酸是组成DNA的材料.而三磷酸脱氧核苷酸则组成一种叫做引物的物质.引物作用于体外进行合成DNA的技术,叫做PCR技术扩增目的基因.DNA解链后引物与其结合然后再进行DNA合成.所以引物也有多种!

　　 第七章　抗病毒药 　　按机理和结构分四类：核苷、非核苷类、蛋白酶抑制剂、其他类 　　第一节　核苷类 　　核苷的基本结构： 　　共同作用机制：在体内转变成三磷酸形式而发挥作用 　　一、非开环核苷类药物 　　1.齐多夫定 　　化学名：3′-叠氮基-2′,3′-双脱氧 胸腺嘧啶核苷 　　第一个可抑制艾滋病病毒 　　机制：抗逆转录酶 　　性质：对光热敏感，低温避光保管 　　毒性：骨髓抑制，原因：代谢物3′-氨基产物 　　2.司他夫定 　　2",3"双键，骨髓抑制毒性低 　　3.拉米夫定 　　①3"S，双脱氧硫代胞嘧啶 　　②β-D-(+)和β-L-(-)两种异构体 　　③抗HIV抗乙肝，骨髓抑制毒性小 　　构效关系： 　　(1)5"位羟基必需; 　　(2)3"位可叠氮、双键、氟取代，或硫替代 　　(3)碱基可以替代 　　二、开环核苷类(无糖环) 　　阿昔洛韦 　　化学名：9-(2-羟乙氧甲基) 鸟嘌呤 　　性质：1位N的H弱酸性，可溶NaOH成Na盐，溶于水 　　作用特点：广谱，抗疱疹首选 　　第二节　非核苷类 　　核苷类机理：需转变成三磷酸形式而发挥作用 　　非核苷类：不需要，不单独用，与核苷类合用 　　化学名：11环丙基-5,11-二氢-4-甲基-6 H二吡啶并[3,2-β：2′,3′-e][1,4]-二氮卓 -6-酮 　　仅可抑制HIV病毒逆转录酶，快速形成耐药性 　　第三节　蛋白酶抑制剂 　　结构特点：含吡啶、哌嗪、茚 　　不能和特非那定、阿斯咪唑、三唑仑、咪达唑仑等合用 　　与酶诱导剂利福平不能合用 　　第四节　其他抗病毒药 　　1.利巴韦林 　　化学名为：1-β-D- 呋喃核糖-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酰胺 　　广谱，包括艾滋病前期 　　2.金钢烷胺 　　对称三环胺 　　抑制病毒吸附及穿入宿主细胞，预防和治疗A型流感病毒 　　3.奥司他韦(新) 　　全碳六元环，乙酯性前药 　　神经氨酸酶抑制剂，对禽流感有效 　　补充基本知识：前药原理 　　(1)什么是前药 　　是指一些无药理活性的化合物，在体内经代谢生物转化或化学途径，被转化为活性的药物 　　(2)设计前药的目的 　　前药修饰是药效潜伏化的一种方法，为克服先导化合物的种种不良特点 2017年执业药师报名时间

就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

Sanger法测序原理：　利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3"-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3"-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脱氧核糖的3"位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5"-引物端和以ddC残基为3"端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。

荧光自动测序技术与Sanger测序方法原理相同。1、用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。2、每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。3、由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。4、它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段进行检测。

Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基因，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基因，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

DNA测序技术 DNA sequencing technology 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。 Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、 A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。[编辑本段]一、概述： Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5"OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。 Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。 SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。 退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。 由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03-- 2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。[编辑本段]二、材料 待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。[编辑本段]三、设备 高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。[编辑本段]四、试剂 （1）SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。 （2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。 （3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。 （4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。 （5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。 （6）TEMED （7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。 （8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。 （9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。 （10）95%乙醇。 （11）0.5%冰乙酸。 （12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。[编辑本段]五、操作步骤 ： 成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点： （1） DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。 （2） 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。 （3） DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。 （一）测序反应： 1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。 2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂： （1） 样品反应： 质粒模板DNA 2.1pmol 5×测序缓冲液 5ml 引物 4.5pmol 无菌ddH2O 至终体积16ml （2）对照反应 pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 4.0ml 5×测序缓冲液 5ml pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml 无菌ddH2 O 至终体积 16 ml 3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。 4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。 5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。 6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。 7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。 [注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入： 模板种类/长度 模板量 200bp (PCR产物) 16ng(120fmol) 3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol) 48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol) 由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。 2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式： 4.5pmol=1.5ng×n,其中n为引物碱基数 计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式： dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数 ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数 3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。 模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50% 95℃ 2分钟。然后： 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)。 模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。 95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。 （二）、 测序凝胶板的制备 1、玻璃板的处理： 银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。 （1）短玻璃板的处理 A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。 B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。 C. 4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。 [注意] 1. 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。 2. 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。 3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。 (2)、长玻璃板的处理 A. 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。 B. 5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。 [注意] 1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。 2、凝胶的制备： （1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。 （2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的 TEMED和过硫酸铵。 凝胶终浓度 3 4 5 6 8 12 16 18 尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0 10×TBE缓冲液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 双蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0 10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40 (3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。 [注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。 2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。 （三）电泳： 1、预电泳 （1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。 （2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。 （3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。 （4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。 （5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。 [注意] （1）. 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。 （2）. 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。 2、样品的制备： 当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4- 6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。 3、上样及电泳 关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、 T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长， 0.2mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。 [注意] 1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。 2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。 （四）、 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 5. 凝胶显影： (1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。 (2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。 (3). 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。 6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。 7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。 8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。 [注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。 1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。 2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。 3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。 4. 如果凝胶厚度超过0.4mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。 5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。

因为pcr利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。DNA模板纯度不纯的时候，会对PCR起抑制作用。PCR反应中，模板只要1ng就可以，所以模板浓度不要太高。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。扩展资料：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下。根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。参考资料来源：百度百科-DNA测序

dNTP指（三磷酸碱基）脱氧核苷酸，而ddNTP是双脱氧核苷酸，就是比dNTP还少一个氧。

你的提问很大，因为核酸包括DNA和RNA，它们的结构各有特点。如果不是生物专业的话比较难解释。下面简单说说DNA测序原理：Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。请结合参考网页的图来理解。

DNA片段应选择哪一种测序方式测序有DNA测序和RNA测序，之前比较早的测序是以芯片为基础，现在常用的是二代测序，全基因组的测序以及RNA-seq，目前比较高级的还有单细胞测序。随之而来的是第三代测序技术， 第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术,这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本。DNA测序的测序原理：DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。其原理是化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

DNA测序技术，即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

DNA测序的测序原理： DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。 其原理是化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。 另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

末端终止法测DNA序列即SANGER双脱氧链终止法,其原理是:DNA链中核苷酸以3",5"-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2"-脱氧核苷三磷酸。2",3"ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3"位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3"羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。

若供能，为什么不可以是dTMP、dCMP、dGMP、dAMP再加上ATP啊？ATP三磷酸腺苷在生物体内普遍存在但含量不高ATP三磷酸腺苷结构式：A—P—P～P(A:腺苷T:三P:磷酸基)“～”表示高能磷酸键在提供能量的过程中实际上是ATP中的～（高能磷酸键）断裂释放能量的而在～断裂后ATP就变成了ADP（二磷酸腺苷A—P—P）当出现ATP缺少的时候就由ADP（A—P“—”P）断开引号里边的硫酸键来提供能量形成AMP（A—P）如果，在ADP提供能量的时候出现能量还是不够用的话它（AMP）再断裂生成能量 在以上化学键断裂的过程中只有～（高能磷酸键）释放的能量最多当出现AMP提供能量的情况时那这个生物就离死不远了。

只有将DNA的双链解开，才能暴露出相应的碱基等形成适合的化学反应接入点，也就是模板。 根据碱基互补原理，这样RNA合成就能最大程度保持DNA的遗传信息。反复的化学反应就是为了起到新陈代谢，你的DNA如果不代谢是很容易枯萎的，人的生命总不能昙花一显吧，新陈代谢不能说是浪费。个人之见，欢迎指正

核糖脱氧核糖都是五碳糖，两者差一个氧。腺嘌呤是碱基。腺苷是腺嘌呤和核糖组成的。腺苷三磷酸是腺苷和三个磷酸组成的。腺嘌呤脱氧核苷酸是由腺嘌呤和脱氧核糖还有磷酸组成的，三者都是一个。由名子类推就知道了。

核酸分脱氧核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）DNA， 基本单位是脱氧核糖核苷酸，一个脱氧核糖核苷酸是由一分子磷酸，一分子脱氧核糖一分子含氮碱基组成，元素含有CHONPRNA，基本单位是核糖核苷酸，一个核糖核酸是有一份子磷酸一分子核糖和一分子含氮碱基组成,元素含有CHONP

DNA测序的方法有很多种. 目前最常见的是双脱氧终止法了. 在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了. 也许这样说你不一定明白. 举一个例子, 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下: 在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT. 所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段: GA, GATCCGA, 同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC, 在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG 在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT, 电泳时按分子量大小排列, A反应的片段长度为2, 7; C反应的为4, 5; G反应的为1, 6; T反应的为3, 8, 四个反应的产物分别电泳, 结果为 8 7 6 5 4 3 2 1 A | | C | | G | | T | | 我们可以从右向左读, 为GATCCGAT, 至此, 测序完成(上面这个图在百度知道中显示不正常, 因为百度知道的网页用的是比例字体, 你如果想看它, 拷贝到记事本中, 用等宽的字体来看).

因为DNA复制的时候，是dNTP的高能磷酸键断裂，释放能量才能合成到DNA新链上去的，直接用脱氧核苷酸是合成不上去的。。。。。。

PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。它的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。 关键词：PCR、发展简史、基本原理、基本操作、主要应用 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。 PCR技术发展简史 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 PCR技术的基本原理和操作 1. PCR的基本原理 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。 2. PCR的基本成分 PCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。 模板DNA：包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。 特异性引物：是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。 热稳定DNA聚合酶：这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。 脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。 二价阳离子：常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。 缓冲液：一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8之间。 一价阳离子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。 PCR的基本操作 PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成： 1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； 2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。 以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 PCR的主要应用 最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。 1. 基础研究方面的应用 目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的： l 扩增目的基因和鉴定重组子； l 克隆基因； l 基因功能和表达调控的研究； l 基因组测序； l 制备单链模板； l 致突变； 2. PCR在临床上的应用 l 在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。 l 在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。 l 检测病原体 l 在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。 3. 在法医学中的应用 例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。 所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。 参考书目：黄留玉，PCR最新技术原理、方法及应用，北京，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心，2005年

1、作用不同E.coliDNA 连接酶是生物体内重要的酶，其所催化的反应在DNA 的复制和修复过程中起着重要的作用。T4-DNA连接酶即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5"-P末端和3"-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。2、连接条件不同用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。扩展资料：粘性末端DNA片段的连接DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。平末端DNA片段的连接常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。同聚物加尾法这种方法的核心部分是，利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。末端脱氧核苷酸转移酶是从动物组织中分离出来的一种异常的DNA聚合酶，它能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。由核酸外切酶处理过的DNA，以及dATP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3′-OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段，称之为poly（dA）尾巴。反过来，如果在反应混合物中加入的是dTTP，那么DNA分子的3′-OH末端将会形成poly（dT）尾巴。因此任何两条DNA分子，只要分别获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。这种连接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴连接法（homopolymertail-joining），简称同聚物加尾法。衔接物连接法所谓衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。衔接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是我们便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。DNA接头连接法DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。参考资料来源：百度百科-DNA连接酶参考资料来源：百度百科-T4DNA连接酶参考资料来源：百度百科-T4-DNA连接酶

DNA中每个脱氧核苷酸在每条单链的大多数含有2个磷酸基团，但在3端位置最后一个脱氧核苷酸只含一个磷酸基团。

基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。 PCR技术是由Cetus公司和加利福尼亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为Kary B mulis和HeneryA、Erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首次报道PCR方法以来，PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人Kary B、mulis获1993年诺贝尔化学奖。 为了使PCR技术在临床上迅速得以普及，我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技术变得简单、微量化、不易发生污染，从而使PCR技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。 一、PCR的基本原理和基本程序 PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5"到3"方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。 PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量，n为PCR的循环次数。E为PCR循环扩增效率。设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次，靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若E=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物—模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。PCR反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和扩增效率，起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量，dNTp 浓度，非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。 二、PCR的特点 （一）特异性高：首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶，在热变性处理时不被灭活，不必在每次循环扩增中再加入新酶，可以在较高温度下连续反应，显著地提高PCR产物的特异性，序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一，足可以提供特异性分析，选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。 （二）高度敏感：理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上，实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。 （三）快速及无放射性：一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增，加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成，不用分离提纯病毒，DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物，可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测，省去费时繁杂的提纯程序，扩增产物用一般电泳分析即可，不一定用同位素，无放射性易于推广。 （四）简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱繁琐的基因方法，可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因，省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点，扩增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相应酶切位点的载体中。 （五）可扩增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA，再将得到的单链cDNA进行PCR扩增，即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段，有些外显子分散在一段很长的DNA中，难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板，则可将外显子集中，用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。 三、PCR方法 （一）试剂 （1）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生 物都有自己特异的引物。 （2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。 （3）10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。 （4）5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。 （5）DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。 （二）操作程序 过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下： （1）向一微量离心管中依次加入 DNA模板 102-105拷贝 引物 各1μmol/L dNTP 各200μmol/L 10×PCR缓冲液 1/10体积 ddH2O 补到终体积（终体积50μl-100μl） 混匀后，离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25μl，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。 （2）加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。 （3）冷至延伸温度时，加入1-5u Taq DNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。 （4）PCR的循环程序为：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。 PCR尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解，就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。他们先从组织标本中提取DNA，再用PCR进行特异性的DNA扩增，应用这种方法，他们成功地从保存30至40年之久的组织标本DNA中扩增了HPV病毒基因片段。但这种方法需要提取DNA，操作比较繁琐。1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。加入400μl二甲苯脱脂，离心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去残余二甲苯。离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应基质，将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法进行DNA扩增。 在应用PCR方法检测RNA病毒时，首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增，因为PCR只能对DNA模板进行扩增，我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR，简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录，反转录需要在反转录酶的作用下完成。 四、PCR反应的基本条件及其对PCR的影响 （一）模板核酸 PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。 （二）引物 PCR结果的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由特异引物限定的。因此，引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高，且需纯化。冻干引物于-20℃至少保存12-24个月，液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。 PCR反应中引物的量也影响PCR扩增效果，当PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.2～1μmol/L为宜，但我们实验发现，最适浓度远远低于此浓度。 （三）缓冲液 PCR反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，△pKa值为-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中，pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。 反应混合液中50mmol/L以内的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+，其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明胶（0.01%）或Tween 20（0.05% ～0.1%）有助于酶的稳定，反应中加入5mmol/l 的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。 （四）Mg2+ Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性，这是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp 的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。因为Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。 （五）三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） 四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入（即所谓的“热力背信”），因此应当避免。一般认为最适的dNTP浓度为50～200μmol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。 （六）耐热DNA聚合酶 PCR之所以能得到广泛应用，主要是因为Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不仅简化了PCR程序，也极大地增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高（79℃），使引物在高温下进行退火和延伸，这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在PCR反应中，每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。 （七）温度循环参数 1．变性温度与时间 PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开，才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高，时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响Taq DNA聚合酶的活性，所以通常选用变性温度为95℃30s为宜。在PCR反应中第一个循环变性最重要，需时间较长，因模板DNA的链比较长。 2．复性温度与时间 变性温度是PCR反应成败的关键，复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但是容易出现引物与靶DNA的错配，增加非特异性结合，温度太高不利于复性，大多数PCR反应的复性温度在55℃左右。确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。 3．延伸温度与时间 引物延伸温度一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性，又考虑到引物和靶基因的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量，72℃时，核苷酸的合成速度为35-100个核苷酸/S，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。 4．循环数： 循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时、要增加循环次数。另外，酶活性不好，或量不足时也要增加循环次数、以便达到有效的扩增量。 五、PCR标本的制备 在将Taq DNA聚合酶引入PCR反应，并使之达到自动化之后，PCR反应已变得十分的简单了。但是PCR样品的采集及制备却并非同样简单，而且，许多PCR的失败都归因于标本的制备不当。用于PCR的标本必须经适当处理后才能使用，因为标本中的许多杂质能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外，处理标本可使待扩增DNA暴露，能与引物复性。关于PCR标本制备各种专业书中介绍了许多，我们实验发现操作复杂、不慎便容易造成污染，且不实用。现介绍一种简单快速的处理方法即3%异硫氰酸胍和待检标本混合100℃，10min，离心取上清作为PCR模板即可。 六、PCR实验中常见问题对策 所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。 （一）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因是：Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。所以在实验中出现假阴性失败时，首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循环，一般都会获得成功。如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确，采集标本是否有问题。为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高质量好的酶。同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补，尤其是要绝对保证引物的3′端与靶基因的互补。对变异较大的扩增对象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。PCR反应的各温度点的设置要合理。 （二）假阳性：PCR结果的假阳性是对被检测标本而言，而反应系统中所扩增的产物是真实的。因为PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增，而造成结果判断上的失误，所以污染是PCR假阳性的主要根源。PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。 七、PCR扩增产物的分析法 PCR扩增DNA片段只是一个重要手段。扩增片段的检测和分析才是目的，根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小，有助于扩增产物的鉴定，点杂交除可鉴定扩增产物外，还有助于产物的分型；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性与敏感性，最近发展的一系列产物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于产物的精确分析。 （一）凝胶电泳分析法 PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以前者最常用，通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中，仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解，稍冷后倒入电泳槽。 电泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去离子水漂洗2次，每次15min，于UV灯下观察结果并拍照。 凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小，检测扩增的情况，还可以用来纯化扩增产物。 （二）点杂交 当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或法医检验，用非放射性物质（生物素、荧光素和地高辛等）标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。非放射性标记物质稳定性高，使用方便、安全、检测速度快。 （三）微孔板夹心杂交法 该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域杂交，漂洗后显色即可判断结果，该法需要两个杂交过程来检测一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV的检测，其敏感度可达5个HBv DNA分子。此法的敏感性和特异性与PCR 32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA,适于临床实验室常规应用。 （四）PCR-ELISA法 本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5"端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列。因此，可以通过修饰一个引物的5′端使其携带便于PCR产物固定的功能基因，而通过另一引物5′-端的修饰使产物便于检测。

这是生物长期进化的结果。所有已知的 DNA聚合酶只能使新合成的 DNA子链从 5′→3′方向延伸 ,这种方向性是其在生物进化中保留的、深刻的、选择与适应性特征 ,有着深刻的化学及生物学功能的根源。 首先 , DNA复制过程中 , DNA双链解螺旋后 ,每一条链上所暴露出来的碱基各自与一个游离于核中的三磷酸脱氧核糖核苷酸 ( dTTP、dGTP、 dATP、dGTP)按碱基配对原则配对。之所以参与反应的是三磷酸脱氧核苷酸 ( dNTP) ,是因为 DNA的聚合反应需要能量 ,在 DNA聚合酶的催化下 , dNTP分解 2个磷酸基团 ,放出能量用于核苷酸顺序连接而成为新链。 其次 , DNA聚合酶只能将游离的核苷酸加到新链的 3′端 (即 -OH)。 再次 ,我们可以利用反证法来说明 “为什么 DNA聚合酶的延伸方向都是 5′→3′,而不是 3′→5′”。假设链的延伸方向为 3′→5′,基于能量的需要 ,其多核苷酸链的 5′端必须带有三磷酸基团 (p～p～p) ,才能与游离的 dNTP起反应 ,而 dNTP也有 p～p～ p,由于磷酸基团之间强的电负性 ,使 dNTP难以聚合到 DNA的 5′端 ,这就需要切除 DNA5′端的 2个磷酸基因以消除这种影响。而这样又难于为进一步的聚合提供所需的能量 ,为使聚合反应得以继续 ,5′端必须重新活化 ,需要额外的能量供应以及别的酶参与反应 ,才能与下一个 dNTP的 3′-OH生成磷酸二酯键。这样既费时又耗能 ,从生物进化与适应角度来讲是不利的。 通过进化 , DNA复制总是在 5′→3′方向添加新核苷酸解决该问题。 DNA复制过程中 ,滞后链的半不连续复制过程虽然复杂 ,但它节省能量 ,且有利于错配核苷酸的校正。因此 , DNA复制方向只能是由 5′到 3′端的方向

核苷酸 Nucleotide 一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物。又称核甙酸。戊糖与有机碱合成核苷,核苷与磷酸合成核苷酸,4种核苷酸组成核酸。核苷酸主要参与构成核酸，许多单核苷酸也具有多种重要的生物学功能,如与能量代谢有关的三磷酸腺苷（ATP）、脱氢辅酶等。某些核苷酸的类似物能干扰核苷酸代谢，可作为抗癌药物。根据糖的不同，核苷酸有核糖核苷酸及脱氧核苷酸两类。根据碱基的不同，又有腺嘌呤核苷酸(腺苷酸，AMP)、鸟嘌呤核苷酸(鸟苷酸，GMP)、胞嘧啶核苷酸(胞苷酸， CMP)、尿嘧啶核苷酸(尿苷酸,UMP)、胸腺嘧啶核苷酸（胸苷酸，TMP）及次黄嘌呤核苷酸(肌苷酸，IMP)等。核苷酸中的磷酸又有一分子、两分子及三分子几种形式。此外，核苷酸分子内部还可脱水缩合成为环核苷酸。 核苷酸是核糖核酸及脱氧核糖核酸的基本组成单位，是体内合成核酸的前身物。核苷酸随着核酸分布于生物体内各器官、组织、细胞的核及胞质中，并作为核酸的组成成分参与生物的遗传、发育、生长等基本生命活动。生物体内还有相当数量以游离形式存在的核苷酸。三磷酸腺苷在细胞能量代谢中起着主要的作用。体内的能量释放及吸收主要是以产生及消耗三磷酸腺苷来体现的。此外，三磷酸尿苷、三磷酸胞苷及三磷酸鸟苷也是有些物质合成代谢中能量的来源。腺苷酸还是某些辅酶，如辅酶Ⅰ、Ⅱ及辅酶A等的组成成分。 在生物体内，核苷酸可由一些简单的化合物合成。这些合成原料有天门冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、一碳单位及 CO2等。嘌呤核苷酸在体内分解代谢可产生尿酸，嘧啶核苷酸分解生成CO2、β－丙氨酸及β-氨基异丁酸等。嘌呤核苷酸及嘧啶核苷酸的代谢紊乱可引起临床症状（见嘌呤代谢紊乱、嘧啶代谢紊乱）。 核苷酸类化合物也有作为药物用于临床治疗者，例如肿瘤化学治疗中常用的5-氟尿嘧啶及6-巯基嘌呤等。 有些核苷酸分子中只有一个磷酸基，所以可称为一磷酸核苷(NMP)。5"-核苷酸的磷酸基还可进一步磷酸化生成二磷酸核苷(NDP)及三磷酸核苷(NTP)，其中磷酸之间是以高能键相连。脱氧核苷酸的情况也是如此。 体内还有一类环化核苷酸，即单核苷酸中磷酸部分与核糖中第三位和第五位碳原子同时脱水缩合形成一个环状二酯、即3"，5"-环化核苷酸，重要的有3"，5"-环腺苷酸(cAMP)和3"，5"-环鸟苷酸(cGMP)。 生物学功能 核苷酸类化合物具有重要的生物学功能，它们参与了生物体内几乎所有的生物化学反应过程。现概括为以下五个方面： ① 核苷酸是合成生物大分子核糖核酸 (RNA)及脱氧核糖核酸(DNA)的前身物，RNA中主要有四种类型的核苷酸：AMP、GMP、CMP和UMP。合成前身物则是相应的三磷酸核苷 ATP、GTP、CTP和UTP。DNA中主要有四种类型脱氧核苷酸：dAMP、dGMP、dCMP和dTMP，合成前身物则是dATP、dGTP、dCTP和dUTP。 ② 三磷酸腺苷 (ATP)在细胞能量代谢上起着极其重要的作用。物质在氧化时产生的能量一部分贮存在ATP分子的高能磷酸键中。 ATP分子分解放能的反应可以与各种需要能量做功的生物学反应互相配合，发挥各种生理功能，如物质的合成代谢、肌肉的收缩、吸收及分泌、体温维持以及生物电活动等。因此可以认为 ATP是能量代谢转化的中心。 ③ ATP还可将高能磷酸键转移给UDP、CDP及GTP生成UTP 、CTP及GTP。它们在有些合成代谢中也是能量的直接来源。而且在某些合成反应中，有些核苷酸衍生物还是活化的中间代谢物。例如,UTP参与糖原合成作用以供给能量，并且 UDP还有携带转运葡萄糖的作用。 ④ 腺苷酸还是几种重要辅酶，如辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，（NAD+）、辅酶Ⅱ（磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADP+）、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及辅酶A（CoA）的组成成分。NAD+及 FAD是生物氧化体系的重要组成成分，在传递氢原子或电子中有着重要作用。CoA作为有些酶的辅酶成分,参与糖有氧氧化及脂肪酸氧化作用。 ⑤ 环核苷酸对于许多基本的生物学过程有一定的调节作用（见第二信使）。 代谢 可从合成代谢、分解代谢及代谢调节三个方面讨论。 ① 合成代谢。嘌呤核苷酸主要由一些简单的化合物合成而来，这些前身物有天门冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、CO2及一碳单位（甲酰基及次甲基,由四氢叶酸携带）等。它们通过11步酶促反应先合成次黄嘌呤核苷酸（又称肌苷酸）。随后，肌苷酸又在不同部位氨基化而转变生成腺苷酸及鸟苷酸。合成途径的第一步是5-磷酸核糖在酶催化下,活化生成1-焦磷酸-5-磷酸核糖(PRPP)，这是一个重要的反应。嘌呤核苷酸的从头合成主要是在肝脏中进行，其次是在小肠粘膜及胸腺中进行。 嘌呤核苷酸降解可产生嘌呤碱，嘌呤碱最终分解为尿酸，其中部分分解产物可被重新利用再合成嘌呤核苷酸，这称为回收合成代谢途径，可在骨髓及脾脏等组织中进行。嘌呤核苷酸降解产生的腺嘌呤、鸟嘌呤及次黄嘌呤在磷酸核糖转移酶的催化下，接受3"-焦磷酸-5-磷酸核糖(PRPP)分子中的磷酸核糖，生成相应的嘌呤核苷酸。此合成途径也具有一定意义。 嘧啶核苷酸的从头合成主要也在肝脏中进行。合成原料为氨基甲酰磷酸及天门冬氨酸等。氨基甲酰磷酸及天门冬氨酸经过数步酶促反应生成尿苷酸，尿苷酸转变为三磷酸尿苷后，从谷氨酰胺接受氨基生成三磷酸胞苷。 上述体内合成的嘌呤及嘧啶核苷酸均系一磷酸核苷。它们均可在磷酸激酶的催化下，接受 ATP提供的磷酸基，进一步转变为二磷酸核苷及三磷酸核苷 体内还有一类脱氧核糖核苷酸。它们是dAMP、dGMP、dCMP及dTMP。它们组成中的脱氧核糖并非先生成而后组合到核苷酸分子中去，而是通过业已合成的核糖核苷酸的还原作用而生成的。此还原作用发生于二磷酸核苷分子水平上，dADP、dGDP、dCDP及dUDP均可由此而来，但dTMP则不同，它是由dUMP经甲基化作用而生成的。 ② 分解代谢。嘌呤核苷酸在体内进行分解代谢，经脱氨基作用生成次黄嘌呤及黄嘌呤，再在黄嘌呤氧代酶催化下，经过氧化作用，最终生成尿酸。尿酸可随尿排出体外，正常人每日尿酸排出量为0.6g。嘧啶核苷酸在体内的分解产物为CO2,β－丙氨酸及β－氨基异丁酸等。 ③ 代谢调节。核苷酸在体内的合成受到反馈性的调节作用。嘌呤核苷酸合成的终产物是AMP及GMP，它们可以反馈性地抑制由 IMP转变为AMP及GMP的反应。它们可与 IMP一齐反馈性地抑制合成途径的起始反应PRPP的生成。嘧啶核苷酸合成的产物 CTP也可反馈性地抑制嘧啶合成的起始反应。 与医学的联系 可从代谢异常所致疾病及作为药物两方面讨论。 ① 核苷酸代谢的异常。GMP及IMP的回收合成需次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）参与。此酶遗传性缺乏则2～3岁时就可出现智力发育障碍、共济失调，敌对性及侵占性及自毁容貌的表现（莱施－尼汉二氏综合征）。患儿嘌呤核苷酸的从头合成仍可正常进行，但回收合成的障碍就可造成严重后果。 嘌呤核苷酸分解代谢的终产物为尿酸。正常人血中尿酸含量约为2～6mg％，血中尿酸水平的升高（高尿酸血症）常见于痛风。血中尿酸含量超过8mg％时,尿酸就以钠盐形式沉积于关节、软组织、软骨及肾脏等处。原发性痛风症是一种先天代谢缺陷性疾病。患者体内的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶部分缺乏,致使IMP及GMP 的回收合成减少，结果造成嘌呤核苷酸的从头合成加快。此外,患者体内的磷酸核糖焦磷酸激酶活性异常增高,以致大量地生成PRPP，促使从头合成加快，这些都造成尿酸的大量产生。原发性痛风症可用别嘌呤醇治疗。别嘌呤醇的结构与次黄嘌呤相似，是黄嘌呤氧化酶的抑制剂，可抑制次黄嘌呤及黄嘌呤转变为尿酸的反应，降低血中尿酸水平。继发性痛风，可见于各种肾脏疾病、血液病及淋巴瘤等。患者细胞中核酸大量分解，因而尿酸生成增多。 cAMP对细胞的一些生理活动有广泛的影响。cAMP的合成不足或作用失调与有些疾病过程有关。例如，支气管喘息及银屑病组织中cAMP量较低，又如糖尿病人各种代谢的异常与肝及脂肪组织中cAMP的生成过多也是有联系的。 嘧啶合成障碍有乳清酸尿症，为乳清酸磷酸核糖转移酶及乳清酸核苷酸脱羧酶缺乏所致。 ② 核苷酸类似物的临床应用。核苷酸类似物6-巯基嘌呤（6MP）及5-氟尿嘧啶（5FU）用于肿瘤的化学治疗。6-巯基嘌呤的结构与次黄嘌呤相似,其一磷酸核苷对于AMP及GMP合成有关的几个酶有抑制作用，从而选择性地阻止肿瘤的生长。5-氟尿嘧啶的结构与胸腺嘧啶相似，它在体内可转变为一磷酸脱氧核糖氟尿嘧啶核苷（5Fd-UMP）及三磷酸氟尿嘧啶(FUMP)。它们对于胸苷酸合成中的甲基化作用有较强的抑制作用，从而造成癌细胞的死亡。 与核苷酸有关的名词 核苷酸 核苷的磷酸酯，磷酸基与糖上的羟基连接。因为核糖有 3个羟基，所以核糖核苷酸如腺嘌呤核苷酸（简称腺苷酸）。脱氧核糖有两个羟基，因而脱氧核糖核苷酸如腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(简称脱氧腺苷酸)只有两种。 核苷多磷酸 含两个以上磷酸基的核苷酸。只带一个磷酸基的核苷酸，叫核苷一磷酸，带两个磷酸基的核苷酸叫核苷二磷酸，依此类推。如腺嘌呤核苷酸有腺苷一磷酸（即腺苷酸，AMP）、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)和脱氧腺苷一磷酸(即脱氧腺苷酸,dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)。天然的核苷多磷酸中,磷酸基多是与戊糖的5′-羟基相连。4 种核苷三磷酸（ATP、GTP、CTP和UTP）、4 种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTP和dTTP）分别是RNA和DNA生物合成的原料。 寡核苷酸与多核苷酸 2 ～20个核苷酸连接而成的化合物叫寡核苷酸。20个以上的核苷酸组成的化合物叫多核苷酸。核酸是一种多核苷酸。 重要的核苷酸衍生物 腺苷酸衍生物 ADP和ATP是体内参与氧化磷酸化的高能化合物,ATP也是细胞内最丰富的游离核苷酸（如哺乳动物细胞中ATP浓度接近1毫克分子），水解1克分子ATP约释放7000卡能量。 腺苷-3′,5′-磷酸即环腺苷酸，主要存在于动物细胞中,生物体内的激素通过引起细胞内cAMP的含量发生变化，从而调节糖原、脂肪代谢、蛋白质和核酸的生物合成，所以cAMP被称为第二信使。 2′,5′-寡聚腺苷酸,通常由3个腺苷酸通过2′,5－磷酸二酯键联接而成,即pppA(2)p(5)A(2)P(5)A，是干扰素发挥作用的一个媒介,具有抗病毒、抑制DNA合成和细胞生长、调节免疫反应等生物功能。 几个重要的辅酶都是腺苷酸衍生物。ATP 就是其中最重要的一个。此外，NA、NAD和FAD，可通过氢原子的得失参与许多氧化还原反应。辅酶 A行使活化脂肪酸功能，与脂肪酸、萜类和类固醇生物合成有关。 腺苷-3′-磷酸-5′-磷酰硫酸是硫酸根的活化形式，蛋白聚糖的糖组分中硫酸根的来源。甲硫氨酸被腺苷活化得到S-腺苷甲硫氨酸，它在生物体内广泛用作甲基供体。 鸟苷酸衍生物 在某些需能反应中，如蛋白质生物合成的起始和延伸，不能使用ADP和ATP，而要GDP和GTP参与反应。鸟苷-3′，5′-磷酸也是一个细胞信号分子，在某些情况下，cGMP与cAMP是一对相互制约的化合物，两者一起调节细胞内许多重要反应。鸟苷-3′-二磷酸-5′-二磷酸 (ppGpp)和鸟苷-3′-二磷酸-5′-三磷酸(pppGpp)则与基因表达的调控有关。 胞苷酸衍生物 CDP和CTP也是一类高能化合物。与磷脂类代谢有关的胞苷酸衍生物有CDP-胆碱、CDP-乙醇胺、CDP-二甘油酯等 尿苷酸衍生物 在糖代谢中起着重要作用,UDP是单糖的活化载体,参与糖与双糖多糖的生物合成,如UDP－半乳糖是乳糖的前体,UDP－葡萄糖是糖原的前体,UDP－N－乙酰葡糖胺与糖蛋白生物合成有关。UDP和 UTP也是一类高能磷酸化合物。

DNA为脱氧核糖核酸，单体为脱氧核糖核苷酸，每个核苷酸由1个脱氧核糖+1个磷酸分子+1个含氮碱基组成（有A，T，G，C四种），所以只要知道DNA分子中含多少个核苷酸，就可以知道有多少个上述组分。核糖核苷二磷酸在核糖核苷酸还原酶催化下生成脱氧核苷二磷酸，后者再经核苷二磷酸激酶的磷酸化，生成脱氧核苷三磷酸。使用预先形成的脱氧核苷酸和一系列的脱氧核苷激酶、脱氧核苷一磷酸激酶和核苷二磷酸激酶，生成脱氧核苷三磷酸。这两个合成途径提供特定脱氧核苷酸用于DNA合成和修复的能力不同。扩展资料：在细胞分裂之前，DNA复制过程复制了遗传信息，这避免了在不同细胞世代之间的转变中遗传信息的丢失。 在真核生物中，DNA存在于细胞核内称为染色体的结构中。在没有细胞核的其它生物中，DNA要么存在于染色体中要么存在于其它组织（细菌有单环双链DNA分子，而病毒有DNA或RNA基因组）。在染色体中，染色质蛋白如组蛋白、共存蛋白和凝聚蛋白将DNA在一个有序的结构中。这些结构指导遗传密码和负责转录的蛋白质之间的相互作用，有助于控制基因的转录。两条核苷酸链沿着中心轴以相反方向相互缠绕在一起，很像一座螺旋形的楼梯，两侧扶手是两条多核苷酸链的糖一磷基因交替结合的骨架，而踏板就是碱基。DAN双螺旋是右旋螺旋。不同磷酸盐基团之间的凹槽仍然暴露在外。参考资料来源：百度百科--脱氧核糖核苷酸参考资料来源：百度百科--脱氧核糖核酸

在1953年以前，基因的物质本性一直是困扰着全世界生物学家的问题。1953年4月25日《自然》杂志发表了沃森（J. Watson）和克里克（F. Crick）的DNA双螺旋结构模型，既反映了DNA分子可能具有的无穷多样性，又能立刻提出DNA分子自我复制的可能机制，使生物学家一下子接受基因的物质本性就是DNA。但是，DNA双螺旋结构模型虽然是以众多的实验结果为依据，但它本身却尚有待于实验证明。尤其是，DNA果真是一种能自我复制的分子吗？? 在DNA双螺旋结构模型发表之后，科恩伯格就以这一模型作为设想基础，用实验方法研究DNA的复制，很快得到成功，于1956年发表了初步结果。他成功的原因之一在于他有一个正确的分析：他觉得构成DNA分子的单体虽然是4种脱氧核苷一磷酸，但是，DNA合成的原料却不是4种脱氧核苷一磷酸，而是4种脱氧核苷三磷酸。4种脱氧核苷三磷酸缺1种都不行，用4种脱氧核苷二磷酸或4种脱氧核苷一磷酸也都不行。他还设想，细胞内必有合成DNA所需的酶。于是他把大肠杆菌磨碎，用其提取液加上4种脱氧核苷三磷酸（其中至少有1种进行放射性同位素标记，以便于检查实验结果），再加一点点微量DNA作为“模板”（如小牛胸腺DNA、大肠杆菌DNA以及大肠杆菌T2噬菌体DNA）。把上述混合液在有镁离子存在的条件下于37℃静置30min，发现放射性标记已进入DNA部分，说明有新合成的DNA分子。新合成的DNA分子即实验产物可以用过氯沉淀法同作为原料的脱氧核苷三磷酸单体分开。科恩伯格测定了产物DNA的碱基组成，发现它们同各自的模板DNA组成惊人地相似, 这就充分证明新合成的DNA的特异性是由所加入的那一点点微量的模板DNA决定的，只不过数量大大增加了而已。DNA果然是一种能自我复制的分子！

原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA,这就得到了需要的目的基因了。扩展资料：PCR的每个循环过程包括高温变性、低温退火、中温延伸三个不同的事件：1、变性：加热使模板DNA在高温下（94℃左右）双链间的氢键断裂而形成两条单链。2、退火：使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。3、延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5"一3"方向复制出互补DNA。参考资料来源：百度百科-PCR技术