基因芯片技术的发展历史有哪些

基因组印迹（Genomic imprinting）又称基因组印记、遗传印迹、亲代印迹（Parental Imprinting ）或配子印迹，是指在配子或合子发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性的加工修饰 ，导致双亲中某一方的等位基因被沉默,从而使后代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性的现象。相应地，具有这种差异的基因就被称为印迹基因（imprinted genes）。

基因组印记 是指基因组在传递遗传信息的过程中,对基因或DNA片段打下标识、烙印的过程。基因组印记(Genomic imprinting):又称遗传印记

基因印迹（也称作基因组印迹或配子印迹 或亲源印迹）是近年来发现的一种不遵从孟德尔定律的依靠单亲传递某些遗传学性状的现象，也就是某些基因呈亲源依赖性的单等位基因表达，其另一等位基因不表达或表达极弱，仿佛这些基因的不同亲本来源的一对等位基因上带有某种可供识别的印迹，因此得名。具有这种现象的基因被称为印迹基因。基因印迹在体细胞的分裂中是传承的, 但在配子形成的过程中可以擦除和重新建立。基因印迹在人类遗传性疾病尤其是肿瘤发生中的作用正引起越来越多的注意。

印记基因是指仅一方亲本来源的同源基因表达,而来自另一亲本的不表达。 遗传印记技术不仅是一种生物学技术，而且是在涉及血缘分析和刑侦分析的民事领域也同样被采用的分析技术，因而是牵涉到社会演化问题的一个关键领域。从生物学研究的角度看，由于人们对基因组织的发展，使我们对DNA多态性的解释越来越完善，并使我们从中确认了每个生物具有的这种极端的独特性。 基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性，这种修饰常为DNA甲基化修饰，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。在生殖细胞形成早期，来自父方和母方的印记将全部被消除，父方等位基因在精母细胞形成精子时产生新的甲基化模式，但在受精时这种甲基化模式还将发生改变；母方等位基因甲基化模式在卵子发生时形成，因此在受精前来自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式。目前发现的印记基因大约80%成簇，这些成簇的基因被位于同一条链上的顺式作用位点所调控，该位点被称做印记中心(imprinting center, IC)。印记基因的存在反映了性别的竞争，从目前发现的印记基因来看，父方对胚胎的贡献是加速其发育，而母方则是限制胚胎发育速度，亲代通过印记基因来影响其下一代，使它们具有性别行为特异性以保证本方基因在遗传中的优势。 印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病。研究发现许多印记基因对胚胎和胎儿出生后的生长发育有重要的调节作用，对行为和大脑的功能也有很大的影响，印记基因的异常同样可诱发癌症

印迹基因在生长发育中尤其是胎儿和胎盘的生长发育中有重要作用，它还与细胞增殖有关，正常基因组印迹模式改变会引起一系列人类遗传性疾病，包括神经和精神发育异常的遗传性疾病以及儿童和成人的一些肿瘤。印迹基因还能帮助人们认识生物进化的本质。基因印迹在进化论意义上的优势可能就是有效地防止了单性生殖, 维持了遗传多样性, 但也增加了隐性突变转为显性的危险性。

研究发现，基因组印迹的分子机理与印迹基因DNA中胞嘧啶甲基化尤其是CpG岛的甲基化密切相关，胞嘧啶甲基化是DNA的一种共价修饰。另外还有特殊的染色质结构和反义转录产物等可能都是基因印迹产生和维持的重要因素。基因印迹中，卵子和精子中对同一基因的不同程度的甲基化，几乎所有的印迹基因都有一些序列成份在两个不同亲本来源的等位基因中仅有一方是甲基化。这些序列被称为“差异甲基化区域“（Differentially Methylated Regions）。它指基因组在传递信息的过程中，对基因或DNA片段打下标记或烙印的过程。

印迹的抑癌基因的杂合性丢失（LOH）、UPD或突变失活可能会导致某个抑癌基因的唯一有功能拷贝的丢失或不表达。印迹的癌基因的LOI或UPD则可能导致双等位基因表达，表达量成倍增加。印迹控制中心（指理论上可能会存在的某些对印迹现象有关键性影响的基因或顺式元件）的突变性失活, 可能会导致某个染色体印迹区域的多个印迹的癌基因的不正常表达。

印迹技术就是将在凝胶中分离的生物大分子，转移（印迹）或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。印迹技术目前有：1、DNA印迹技术（Southern blotting）；2、RNA印迹技术（Northern blotting）；3、蛋白质的印迹分析（Western blotting）等三种类型。原理1、DNA印迹技术（Southern blotting）硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。主要用于基因组 DNA的定性和定量分析，亦可分析重组质粒和噬菌体。2、RNA印迹技术（Northern blotting）RNA 印迹技术又称Northern blotting，其基本原理与Southern blotting相同，主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA 的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。3、蛋白质的印迹分析（Western blotting）又称蛋白质印迹术或免疫印迹技术，指蛋白质在经聚丙烯酰胺电泳分离之后转移到膜上，再与溶液中的其它抗体探针相互结合的技术。用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白分子间的相互作用研究等。区别1、操作方法上的区别（一）DNA印迹技术（Southern blotting）基因组经限制性内切酶消化后，进行凝胶电泳，将含有DNA片断的凝胶放入变性溶液变性后，将硝酸纤维膜(NC)膜放在胶上，上面放吸水纸巾，利用毛吸作用使胶DNA转移质NC膜上，然后利用杂交技术检测NC膜上的DNA片断。（二）RNA印迹技术（Northern blotting）操作方法与Southern blotting相似，但不需要限制性内切酶切割。（三）蛋白质的印迹分析（Western blotting）与Southern或 Northern杂交方法类似，但Western采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色"用标记的二抗，该检测技术往往需要抗体。2、应用方面的区别DNA印迹技术主要用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。RNA印迹技术则是用于基因RNA表达的特异性分析和定量分析。蛋白质的印迹分析技术广泛应用于检测蛋白水平的表达，作用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

【答案】：Southern blotting：又称为DNA印迹术。是将基因组DNA经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，再利用毛细作用将凝胶中的DNA分子转移到NC膜上，然后进行杂交反应的技术。主要用于基因组DNA的定性和定量分析，亦可分析重组质粒和噬茵体。

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量 。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。

中学生物的教科书上就会讲，基因有所谓的显性隐性之分，然后就会据此出一大堆豌豆题和族谱题。然而，教科书上却从来没有讲到底为什么会有这样的区别。要理解这个问题，还真的谈及大学生物学专业才会学到的内容。不过，这个答案会尽量写得比较科普一些，希望高中生也能看得懂。1、一对等位基因并不是同时表达的。我们的核基因组，一半来自父亲，一半来自母亲。因此，常染色体和部分性染色体上的基因，至少都是双拷贝的，也因而有了“等位基因”一说。但是，并不是所有的基因，都能平等地表达这两份拷贝。换句话说，有些基因，只表达一份拷贝，而另外一份拷贝则被关掉了。这类基因叫做“印迹基因”（imprinted genes）。所以，由印迹基因控制的性状，就看哪一份拷贝能够正常工作了。而至于基因的印迹（gene imprinting）如何实现，就涉及表观遗传学的内容，大致上是DNA的甲基化和组蛋白的修饰，就不展开说了。2、其中一个等位基因显示出了减弱的或新的功能。印记基因在人类基因组中，仅占了很小一部分，大概只有100来个吧。因此，基因印迹仅仅解释了一小部分。当两份基因拷贝都能同时表达时，所谓的显隐性差异，就在于两份基因拷贝的DNA序列上的差异了。有的时候，某个DNA序列的变化，会导致它的蛋白质产物功能降低，从而影响性状。至于能够从多大程度上影响，就得看另外一份正常的基因拷贝能不能挽救这个局面。举个例子，以黄老板Ed Sheeran为代表的红发性状，是由一个叫MC1R基因的变异引起的。我们的肤色、发色，是由黑色素的类型和比例来决定的。黑色素有两种，一种叫黑色的真黑素（eumelanin，真的很黑的黑色素），一种是褐黑素（pheomelanin，红褐色的）。当真黑素多，褐黑素少时，发色就是偏黑色系的。反之，则是红发系。MC1R蛋白能够决定黑素细胞合成哪一种黑色素。当这个蛋白活性较高的时候，黑素细胞倾向于合成真黑素，而活性低的时候，就倾向于褐黑素。当MC1R基因突变成某些特定形式时，会导致MC1R蛋白活性降低。但是，在一般情况下，只有一份MC1R的突变还不足以产生红发性状，因为另外一份拷贝还会控制真黑素的合成，黑和红搅一起了嘛。而像黄老板这种，八九不离十，是两份MC1R基因都突变了。因此，我们就能明白，黄老板的红发性状，是由隐性突变的MC1R基因来控制的。

葡萄胎分为两种，一种是完全性葡萄胎，另一种是部分性葡萄胎，这种葡萄胎的形成原因不同。35岁和40岁以上的女性患病率是年轻女性的两倍。相反，20岁以下女性的患病率明显较高。同时，饮食中缺乏维生素A、胡萝卜素和动物脂肪的人患葡萄胎的风险更高。目前认为，完全性葡萄胎中男性染色体的起源是滋养细胞增生的主要原因，这可能与基因组印迹的紊乱有关。部分葡萄胎的形成与年龄和饮食无关。经常使用口服避孕药的妇女患葡萄胎的风险增加。而女性月经异常，如月经紊乱，那么患葡萄胎的概率也非常大，所以女性朋友一定要少吃避孕药，还要调节自己的月经。例如，一个完整的汗状痣可以分为两种类型：一种是染色体缺失的空卵，另一种是没有染色体受精的空卵，精子为单倍体，并复制成二倍体；它是由一个空卵或一个丢失的卵与两个精子受精而引起的，包虫疣分为完全性和部分性两种，其实质是精子和卵子的异常结合，导致“胚胎”的假种子。专业的解释是，汗腺状疣是指妊娠后绒毛状胎盘滋养细胞增生，间质高度水肿，并形成大小不等的水泡。小泡是连成一条链的，像葡萄，也叫杜邦小泡团；汗状疣的病因与正常受精有关。这是一种疾病，不是正常妊娠。胚胎在胎儿中不生长，s o汗状的软体动物不能出生。如果汗状的迹象不及时，可能会有大出血或恶性转化的危险。这是一个残疾的孩子。但是汗状的疣不同，她根本就没有出生！汗腺疣的最终结果很大一部分是自然流产，妊娠不能继续生育，继而发展为侵袭性汗腺疣、绒毛膜癌。棘球蚴是卵子和精子的结合体，有一种基因突变，受精卵会异常发育，形成大小囊泡相连的链状物。因其透明形态类似葡萄，又称汗痣。

分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：(1) Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。(2) Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。根据杂交所用的方法,另外还有斑点(dot)杂交、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交等。有3种固相支持体可用于杂交:硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541滤纸。不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在DNA固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。Whatman 541滤纸有很高的湿强度,最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化DNA的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。Whatman 541滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优点:它更便宜,杂交中更耐用,干燥过程中不易变形和碎裂等。然而若变性过程不小心,杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维素滤膜时所得到的信号强度。因此,常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。 Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下,放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的高比活性探针的(>109 cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:(1)毛细管转移。本方法由Southern发明,故又称为Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。(3) 真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。1、材料： 待检测的DNA，已标记好的探针。2、设备： 电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，滤纸。3、试剂：(1)10mg/ml 溴化乙锭（EB）。(2)50×Denhardt"s溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,过滤除菌后于-20℃储存。(3)1×BLOTTO:5g脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，储于4℃。(4)预杂交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鲑鱼精子DNA, 50%甲酰胺。(5)杂交溶液:预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。(6)0.2mol/L HCl。(7)0.1% SDS。(8)0.4mol/L NaOH。(9)变性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至1000ml。(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris·Cl, 加水至1000ml。(11)硝酸纤维素滤膜。(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L柠檬酸钠,用1mol/L HCl调节pH至7.0;(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀释。4、操作步骤：(1) 约50μl体积中酶切10pg-10μg的DNA, 然后在琼脂糖凝胶中电泳12-24小时(包括DNA分子量标准物)。(2) 500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙锭,将凝胶放置其中染色30分钟, 然后照相。(3) 依次用下列溶液处理凝胶,并轻微摇动: 500ml 0.2mol/L HCl 10分钟, 倾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸处理时间为20分钟)，用水清洗数次,倾去溶液; 500ml变性溶液两次,每次15分钟,倾去溶液; 500ml中和溶液30分钟。如果使用尼龙膜杂交，本步可以省略。(4) 戴上手套,在盘中加20×SSC液,将硝酸纤维素滤膜先用无菌水完全湿透,再用20×SSC浸泡。将硝酸纤维素滤膜一次准确地盖在凝胶上,去除气泡。用浸过20×SSC液的3滤纸盖住滤膜,然后加上干的3滤纸和干纸巾,根据DNA复杂程度转移2-12小时。当使用尼龙膜杂交时，该膜用水浸润一次即可，转移时用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。简单的印迹转移2-3小时,对于基因组印迹,一般需要较长时间的转移。(5) 去除纸巾等,用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期,做好记号,取出滤膜,在2×SSC中洗5分钟,凉干后在80℃中烘烤2小时。注意在使用尼龙膜杂交时，只能空气干燥，不得烘烤。(6) 将滤膜放入含6-10ml预杂交液的密封小塑料袋中,将预杂交液加在袋的底部,前后挤压小袋,使滤膜湿透。在一定温度下(一般为37-42℃)预杂交3-12小时，弃去预杂交液。(7) 制备同位素标记探针（参见第一节），探针煮沸变性5分钟。(8) 在杂交液中加入探针,混匀。如步骤（6）将混合液注入密封塑料袋中,在与预杂交相同温度下杂交6-12小时。(9) 取出滤膜,依次用下列溶液处理,并轻轻摇动: 在室温下, 1×SSC/0.1% SDS, 15分钟, 两次。 在杂交温度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15分钟, 两次。(10) 空气干燥硝酸纤维素滤膜,然后在X光片上曝光。通常曝光1-2天后可见DNA谱带。对于≥108 cpm/μg从缺口平移所得探针,可很容易地从10μg哺乳DNA中检测到10pg的单拷贝基因。 Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。1、材料：待检测的RNA及制备好的探针。2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。3、试剂：(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH调pH至7.4，定溶到1L。(2)其他试剂：与Southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC处理。4、操作步骤：(1)RNA经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。(2)转移完毕后 ,以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5分钟,以除去琼脂糖碎片。(3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小时。(4) 用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2小时。若于42℃进行,应采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt"s试剂，0.1% SDS；若于68℃进行,应采用:6×SSC，2×Denhardt"s试剂，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern杂交）。(5) 在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108 cpm/分·μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24小时。(6) 用1×SSC、0.1% SDS于室温洗膜20分钟,随后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次,每次20分钟。(7) 用X光片(Kodak XAR-2或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。[注意](1)如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝胶20分钟,部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经DEPC处理的水淋洗凝胶,并用20×SSC浸泡凝胶45分钟。然后再转移到滤膜上。(2)在步骤(3)的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰RNA,杂交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。(3)RNA自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与RNA转移至硝酸纤维素滤膜所用方法类似。(4)含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处理的水淋洗数次,以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA，同时可部分水解RNA，并提高较长RNA分子(>2.3kb)转移的速度和效率。此外，碱可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA转移的方法进行，但转移缓冲液为7.5mmol/LNaOH，转移结束后(4.5-6.0小时)，尼龙膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、于室温晾干。(5)尼龙膜的不足之处是背景较高,用RNA探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中,会导致杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。(6)如用中性缓冲液进行RNA转移,转移结束后,将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间,80℃干烤0.5-2小时,或者254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,而过度照射却使RNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。 对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。1、材料：待检测的细菌平皿，已标记好的探针，硝酸纤维素滤膜等。2、设备：恒温烤箱，恒温水浴，台式高速离心机等。3、试剂：(1)LB固体培养基。(2)0.5mol/L NaOH。(3)1mol/L Tris·Cl。(4)1.5mol/L NaCl。(5)0.5mol/L Tris·Cl。(6)预洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。(7)预杂交液：50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。(8)其余试剂：与Southern杂交相同。4、操作步骤：1. 将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上：(1) 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。(4) 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。(6) 裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。2. 菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜(1) 在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,将滤膜放到小洼上,展平保鲜膜,使滤膜均匀湿润,让滤膜留于原处2-3分钟。(2) 用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜,用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH重复步骤(1)。(3) 吸干滤膜,将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鲜膜洼上。5分钟后吸干滤膜, 再重复一次该步骤。(4) 吸干滤膜,把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜,转移到一张干的滤纸上,置于室温20-30分钟,使滤膜干燥。(5) 将滤膜夹在两张干的滤纸之间,在真空烤箱中于80℃干烤2小时,固定DNA。(6) 将固定在膜上的DNA与32 P标记的探针杂交。5.杂交(1) 盛有2×SSC的塑料盘同，将干烤的滤膜飘浮在液面上,彻底浸湿5分钟。(2) 将滤膜转到200ml预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起,放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿,放到位于培养箱内的旋转平台上。于50℃处理30分钟。在这一步及以后的所有步骤中,应缓缓摇动滤膜,防止它们粘在一起。(3) 用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片,以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。(4) 将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃中,在适宜温度(即在水溶液中杂交时用68℃，而在50%甲酰胺中杂交时用42℃)下,预杂交1-2小时。(5) 将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟,迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。(6) 杂交结束后,去除杂交液,立即于室温把滤膜放入大体积(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗 一次，同时应避免膜干涸。(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次,每次1-1.5小时。此时已可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。(8) 把滤膜放在纸巾上于室温晾干后,把滤膜(编号面朝上)放在一张保鲜膜上,并在保鲜膜上作几个不对称的标记,以使滤膜与放射性自显影片位置对应。(9) 用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小时。(10) 底片显影后,在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置,同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸,通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。 斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。1、材料：待分析的DNA或RNA样品，已标记的探针。2、设备：狭槽点样器，真空泵，恒温水浴，真空烤箱等。3、试剂：（1）100% 甲酰胺。（2）甲醛(37%)。（3） 20×SSC。（4）0.1mol/L NaOH。（5）硝酸纤维素滤膜。（6）滤纸。4、操作步骤：(1) 10μl样品与20μl 100%甲酰胺、 7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC混合。混合置于68℃，15分钟后置冰浴中。(2) 用0.1mol/L NaOH清洗点样器,再用无菌水充分冲洗。将一张经20×SSC浸润的滤纸铺在点样器上,上面再铺上一张经20×SSC浸润1小时的硝酸纤维素滤膜，加盖并夹紧，接通真空泵。(3) 用10×SSC清洗各样孔。在每一样品中加两倍体积的2×SSC,混合后加样于孔中。外围几个孔中加2μl染料定位,缓慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗两次。继续抽吸5分钟,吸干滤膜。(4) 取出滤膜,夹在两张滤纸中间, 80℃真空烘干2小时。按上述Southern或Norhtern杂交所述的方法与放射性标记探针杂交。[注意]1、在放射自显影时应注意滤膜必须干燥，并覆盖上保鲜膜，否则，滤膜将与X-光片粘在一起，使以后的操作困难。2、在杂交过程中，整个滤膜应一直是湿润的，不得干涸。第三节 杂交反应的条件及参数的优化不同的反应条件对杂交结果的影响如下：(1) 根据杂交液的体积确定杂交的时间：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。(2) 根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时,则在68℃杂交,而在50%甲酰胺溶液中时,则在42℃下杂交。(3) 选用不同的封闭试剂：如Denhardt"s试剂、肝素或一种由5%脱脂奶粉组成的BLOTTO, 这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。与Denhardt"s试剂相比, BLOTTO价格便宜,使用方便,同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA杂交。一般而言,尼龙膜用Denhardt"s试剂比用BLOTTO能得到更高的信噪比。对硝酸纤维素滤膜而言,通常在预杂交溶液和杂交溶液中都含有封闭剂。但是对尼龙膜，经常从杂交溶液中省去封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和目的基因的退火。(4)根据需要在杂交过程中选用不同的振荡方法和程度,许多杂交膜一起反应时,连续的轻微振荡可获得较好的杂交结果。(5) 在杂交过程中加入其他化合物, 如反应体系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 杂交速度可增加约10倍。检测稀有序列时常用该方法，但它们有时会导致本底较高，并由于溶液的粘稠性而使操作困难。因此，除非在滤膜上含有的目的DNA量很少,或放射性探针的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。(6) 根据探针与被检测目标之间的同源程度选择清洗的程度,如具有很高的同源性可选用严紧型洗脱方式（高浓度SSC）, 反之则选用非严紧型洗脱方式（低浓度SSC）。洗脱通常在低于杂交体解链温度12-20℃的条件下进行。解链温度(melting temperature, Tm )是指在双链DNA或RNA分子变性形成分开的单链时光吸收度增加的中点处温度。通常富含G·C碱基对的序列比富含A·T碱基对序列的Tm 温度高。有关Tm的计算方法，请参考第八章。(7) 根据标记探针的浓度及其比活性,选择不同的杂交条件及检测方法。一般使用新的同位素可获得较强的信号。(8) 在水溶液中杂交时,用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一样。但在甲酰胺溶液中杂交时,应该用具有更强缓冲能力的6×SSPE。上述这些条件的改变，对杂交的结果有不同的影响，应根据研究的具体情况，选用适当的方法。

环境对基因的改变目前研究主要集中在表观遗传的领域,现在普遍认为环境并不会改变基因的序列,但是会影响基因的修饰,一部分的修饰可能能够通过基因组印迹的方式遗传给下一代,.关于环境改变基因,生物学里叫做获得性遗传,这个假设是拉马赫提出来的,感兴趣的话你可以去看一下获得性遗传的有关介绍.但是目前一直没有找到支持这一理论的证据,反而丑闻和笑话到出了不少.而关于黑人为什么黑,这是按照自然选择解释的.也就是较黑的人在非洲的环境下生存下来的几率更高,所以通过自然选择的一代代筛选,非洲人就越来越黑了.不过确实也可能是本来就黑,黑人从非洲走出来之后通过自然选择才变白的,要知道按照现在的关于线粒体基因研究里有个“夏娃”理论,所有人类都起源自非洲.

（一）、解释名词概念（每题3分，共24分） 1.基因座：基因处在染色体上的固定位置，称基因座。2.测交：与隐性纯合子交配称测交。3.抗原决定簇：抗原物质表面具有的某些特定的化学基团，抗原依此与相应的抗体或效应T细胞发生特异性结合，即抗原决定簇。4.冈崎片段：DNA复制时，随从链的合成是不连续进行的，先合成许多片段，即冈崎片段。5.密码子：在mRNA中，每3个相互邻接的核苷酸，其特定排列顺序，在蛋白质生物合成中可被体现为某种氨基酸或合成的终止信号者称为密码子，统称遗传密码。 6.转座：转座因子改变自身位置的行为，叫作转座。7.近交：近亲繁殖，简称近交，是指血统成亲缘关系相近的两个个体间的交配，也就是指基因型相同或相近的两个个体间的交配。8.同义突变：由于密码子的简并性，碱基替换没有导致编码氨基酸的改变。（二）填空题（每空1分，共16分）1.核酸是生物的遗传物质，其包括（ DNA ）和（ RNA） 两种，其中前者为遗传物质的主要形式，大量存在于细胞核的（染色体） 上，也少量存在于个别细胞器中，如动物的（线粒体） 。 2. 经典遗传学的三大基本定律分别为：孟德尔的（基因分离）和（自由组合）／（独立分配） 定律，以及摩尔根的（ 连锁与互换）定律。 3.根据免疫能力的来源，免疫可分为（天然）／（先天性）免疫 和（获得性）／（或特异性）免疫；根据介导免疫应答的成分不同，获得性免疫可分为（体液免疫）和（细胞免疫）。 4.染色体数量具有物种特异性，如人的染色体有（23）对，猪的染色体有（19）对，鸡的染色体有（39）对。 5.人的基因组大小约为（3.2×109）个碱基，鸡的基因组大小约为（1.1×109）个碱基。 （三）、简答题（每题8分，共16分） 1.比较有丝分裂和减数分裂的不同。答案：（1）每个细胞经过有丝分裂和减数分裂形成的细胞数量不同，分别为2和4；（2）染色体变化不一样，有丝分裂后染色体数量不变，减数分裂后减半；（3）分裂过程不同，减数分裂经历两个阶段，第一阶段同源染色体分离，后一阶段出现染色单体分离，而有丝分裂仅相当于减数分裂的后一阶段；（4）发生分裂的细胞不同，有丝分裂出现于所有细胞，而减数分裂仅发生于性（生殖）细胞；2.请回答非孟德尔遗传的几种类型及其基本含义。答案：（1）非孟德尔遗传包括母体效应、剂量补偿效应、基因组印迹和核外遗传等四种；（2）母体效应是母体基因型决定后代表型的现象，其遗传机制是母体基因的延迟表达，如椎实螺外壳旋转方向的遗传；（3）在哺乳动物中，雌性个体两条X染色体中的一条出现异染色质化，失去转录活性，使得雌雄动物间X染色体的数量虽然不同，但X染色体上的基因产物的剂量是平衡的，整个过程称为剂量补偿效应。（4）与传统的孟德尔遗传方式不同，分别来自父母方的两个等位基因中只有一方呈现表达，另一方被印迹，即不表达或表达甚微，这种遗传方式称为印迹遗传。（5）核外遗传主要指细胞质遗传，即细胞质基因所决定的遗传现象和遗传规律，如动物线粒体遗传。 （四）、计算题（每题10分，共20分） 1. 为检测三对基因间的连锁关系，进行以下杂交试验：AaBbCc×aabbcc↓Aabbcc aaBbCc aabbCc aaBbcc0.36 0.36 0.09 0.09AabbCc aaBbcc AaBbCc aabbcc0.04 0.04 0.01 0.01试计算三对基因两两间的交换率及双交换率，并作出连锁图； 答案： （1）B/b与a/A的交换率为20%； （2）a/A与C/c的交换率为10%； （3）B/b与C/c的交换率为26%； （4）双交换率为2%； （5）连锁图形： 2. 一个群体中个体的血型比例是：血型 A B O AB 比例 0.45 0.13 0.36 0.06计算各等位基因的频率。答案： （1）I%=0.6；（2分） （2）A%=0.3；（4分） （3）B%=0.1；（4分） （五）、问答题（每题12分，共24分）1.请说出人类ABO血型系统的确定原则、遗传机制及如何利用标准血清检测血型。 答案：（1）人类ABO血型系统是根据人红细胞表面具有的抗原类型来确定的，人红细胞表面有两种抗原A和B，若红细胞表面含A抗原，则血清中含B抗体，该个体类型为A型血；若红细胞表面含B抗原，则血清中含A抗体，该个体类型为B型血；若红细胞表面含A、B两种抗原，则血清中A、B抗体都缺乏，该个体类型为AB型血；若红细胞表面A、B抗原都没有，则血清中含A、B两种抗体，该个体类型为O型血；（2）人类ABO血型系统的遗传机制是由常染色体复等位基因控制的，IA、IB、i分别控制A、B、O血型，其中IA、IB对i均为显性，IA、IB间为共显性；（3）利用标准抗A、抗B血清可以检测个体血型：采集个体的两滴血分别与两抗A、抗B血清混合，若只与标准抗A血清发生凝集反应，则为A型血；若只与标准抗B血清发生凝集反应，则为B型血；若与标准抗A、抗B血清均发生凝集反应，则为AB型血；若与标准抗A、抗B血清均不发生凝集反应，则为O型血。2.比较原核生物和真核生物基因表达调控的异同。 答案： （1）原核生物和真核生物基因表达调控的共同点： a 结构基因均有调控序列； b 表达过程都具有复杂性，表现为多环节； c 表达的时空性，表现为不同发育阶段和不同组织器官上的表达的复杂性； （2）与原核生物比较，真核生物基因表达调控具有自己的特点： a 真核生物基因表达调控过程更复杂； b 基因及基因组的结构特点不同，如真核生物基因具有内含子结构等； c 转录与翻译的间断性，原核生物转录与翻译同时进行，而真核生物该两过程发生在不同区域，具有间断性； d 转录后加工过程； e 正负调控机制； f RNA聚合酶种类多。

我在病理学学过女性生殖系统疾病，里面就有叙述到葡萄胎，葡萄胎可以分为2种，一种是完全性葡萄胎，还有一种是部分性葡萄胎。完全性葡萄胎可能与地域、种族、营养、社会经济因素及妊娠年龄等因素有关。饮食中缺乏维生素A及其前体胡萝卜素和动物脂肪者发生葡萄胎的几率显著升高。另外年龄也是高危因素，大于35岁和40岁的妇女妊娠时葡萄胎发生率分别是年轻妇女的2倍和7.5倍。前次妊娠有葡萄胎史也是高危因素。完全性葡萄胎的染色体核型90%为46XX，系由一个细胞核基因物质缺失或失活的空卵与一个单倍体精子受精，经自身复制为二倍体。另有10%核型为46XY，系一个空卵在受精时和两个单倍体精子（23X和23Y）结合而成。目前认为，完全性葡萄胎染色体孤雄来源是导致滋养细胞过度增生的主要原因，并可能与基因组印迹紊乱有关。而部分性葡萄胎可能与使用口服避孕药及月经失调有关。和年龄及饮食因素无关。90%以上为三倍体，多余的一套染色体通常来自父方，系由一正常单倍体卵子和两个正常单倍体精子受精。或由一正常单倍体卵子（精子）和一个减数分裂失败的双倍体精子（卵子）受精而成。不论是完全性还是部分性葡萄胎，多余的父源基因物质是造成滋养细胞增生的主要原因，极少数部分性葡萄胎的核型为四倍体，但其形成机制尚不清楚。

转基因动物与克隆动物的区别为：使用技术不同、性质不同、用途不同。一、使用技术不同1、转基因动物：转基因动物使用的是将重组基因转染整合到动物受体的技术。2、克隆动物：克隆动物使用的是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。二、性质不同1、转基因动物：转基因动物是通过基因调控网络设计乃至人工基因组转移进行全基因合成。2、克隆动物：克隆动物是通过载体构建与基因转移方法进行单基因克隆。三、用途不同1、转基因动物：用于识别动物发育过程中的基因及其活动，也可测出与动物发育相关的未知基因的表达特性。研究导人的异常基因的表型效应，可以了解基因结构和功能的关系，还可用于基因组印迹分析、遗传缺陷的矫正等。2、克隆动物：培育优良畜种和生产实验动物；生产转基因动物；生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。参考资料来源：百度百科——转基因动物百度百科——动物克隆

基因诊断（gene diagnosis）是以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。它是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断技术，它的诞生与发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展。常用基因诊断技术：一、Southern印迹法（Southern blot）基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。当含有特定基因片段已原位转移到膜上后，即可与同位素标记了的探针进行杂交，并将杂交的信号显示出来。杂交通常在塑料袋中进行，袋内放置上述杂交滤膜，加入含有变性后探针的杂交溶液后，在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针。杂交后，洗去膜上的未组合的探针，将Ⅹ线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。二、聚合酶链反应近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。三、扩增片段长度多态性小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析.四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。五、单链构象多态性诊断法单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。

包含生物大分子制备和分析常用技术、蛋白质与核酸的提取与分离、PCR技术、分子杂交与印迹技术、分子克隆技术、外源基因转移技术、蛋白质表达技术、分子标记技术、分子改造技术、测序及人工合成技术、基因组学技术、蛋白质组学技术、生物芯片技术、生物信息学技术、RNA研究技术等。 作为一本实验技术类专著，此书不仅较详细地阐述了有关技术的具体操作和程序，更着力于对各种技术的基本原理及其相关理论基础进行深层次的剖析。故此书不仅可作为从事生命科学，特别是分子生物学相关领域工作者的实验室必备参考工具书，同时也可供高校相关专业师生及科学工作者对分子生物学实验技术的理论做深入探讨时参考。

免疫学的实验基本是仪抗原和抗体的特异性反应为基础的，很少用到和基因组学有关的技术。只有在涉及免疫的分子生物学、HLA分型、基因工程的疫苗时，才会用到基因组技术，如PCR、RNA印迹、核酸酶保护分析法、原位杂交、DNA重组技术、DNA杂交等等。

本文介绍的方法都是基于Extended Haplotype Homozygosity (EHH)概念，由SABETI 等人在 2002年提出。简单来说，根据selective sweep的概念，一个位点周围的位点如果多样性越低，就越有可能是因为selective sweep留下的选择印迹。 这里有三篇介绍selective sweep的文章，讲得很好： https://www.icode9.com/content-4-803828.html https://www.plob.org/article/2345.html https://www.jianshu.com/p/82719840ec4a rehh tutorial： https://cran.r-project.org/web/packages/rehh/vignettes/rehh.html#computing-ihs-rsb-and-xp-ehh 有很多衍生的统计量：EHH（Extended Haplotype Homozygosity）、iHS（Integrated Haplotype Score） 、XP-EHH（Cross Population Extended Haplotype Homozogysity）、RSB rehh、selscan和hapbin都是基于EHH及其衍生概念的 Hapbin可以看这篇（但是hapbin无法处理缺失位点，不建议用）： 使用Hapbin基于EHH、iHS、XP-EHH方法检测基因组中的选择信号 前提：染色体要有重组！Y和W染色体不能用这种方法 本文只写两个群体之间的单倍型选择信号检测，单个群体内部的不写，但是rehh也可以做，很方便 rehh是一个R包 第一列个体名，后面每一列一个SNP。跟reference一样的就是0，第一种不一样的就是1，第二种不一样的就是2，以此类推。比如ref是G，那假设SNPs中还有T和A两个等位基因，就分别标为1和2。缺失值可以用[NA]或者[.]。每个群体一个文件。 第一列SNP名称，随便起。第二列染色体名称。第三列染色体上的位点。第四列是major allele，一般就是0。第五列是minor allele，有一个1就填1，有1和2就填1,2。如图。两个群体用同一个文件就行。 注意，如果有好几条染色体，每条染色体要分别产生这两个文件，每条染色体分别跑。

RNA（核糖核酸）的分析是研究RNA的结构、功能以及表达水平等方面的方法。以下是一些常用的RNA分析方法：原位杂交（In Situ Hybridization）：原位杂交可以检测RNA在细胞或组织中的位置和分布情况。通过利用与目标RNA互补的探针，可以使探针与目标RNA发生特异性结合，并通过特定的探测方法（如荧光或酶标记）来可视化目标RNA的位置。逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）：RT-PCR用于从RNA样本中合成相应的DNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标DNA片段。这种方法可以定量分析RNA的表达水平，并检测特定的RNA序列。Northern印迹分析（Northern Blotting）：Northern印迹分析通过电泳分离RNA样品，并将其转移到膜上，然后使用与目标RNA互补的DNA或RNA探针进行杂交。这种方法可以确定RNA的大小、数量和分子量，并检测特定的RNA序列。RNA测序（RNA Sequencing，RNA-Seq）：RNA测序是通过高通量测序技术对RNA样本进行全基因组水平的测序。它可以提供关于转录组的全面信息，包括检测新的转录本、估计基因的表达水平等。阵列杂交（Microarray Hybridization）：阵列杂交使用含有大量特定DNA或RNA探针的芯片来检测RNA样本中的多个目标序列。这种方法可以同时分析大量基因的表达水平，并比较不同样本之间的差异。环境沉淀浓缩测序（CLIP-seq）：CLIP-seq是一种用于研究RNA结合蛋白质与RNA相互作用的方法。它通过将RNA上的结合位点与蛋白质共价连接，然后通过测序技术鉴定和分析结合位点。

【答案】：D探针是带有特殊可检测标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用于检测核酸样品中的特定基因。人工合成的寡核苷酸片段、克隆的基因组DNA、cDNA均可在DNA印迹和RNA印迹中作探针，为了提高RNA印迹的敏感性，亦可选用RNA片段作为探针，而蛋白质不符合探针的定义。

1.对的。Aa⊕Aa，由于Aa的基因组在减数分裂的时候随机分配分别产生有A基因组和a基因组的单倍体，自交重新恢复多倍体时随机组合，产生AA、Aa、aa基因型的子代，这个过程就是基因重组导致的子代性状分离。2.错的。同卵双生子从孟德尔理论上而言应当是完全一致的，造成差异的主要原因不在于基因重组——基因重组只体现在多个生殖细胞随机组合的情况下，而同卵双生至始至终只有一对生殖细胞的融合。只是在受精卵有丝分裂产生胚胎的过程中由于一些原因，在前期的某次分裂后两个细胞完全分开一段距离，由于细胞的全能性进而分别发育成为单独个体。那么同卵双生子的差异主要来源是，有丝分裂中严格分开的只有姐妹染色单体，而来自母体卵子中的部分细胞质遗传物质并不会严格等量分开，这就造成了些微的遗传物质差异，但这差异通常不会体现。另外一个产生同卵双生子的差异的来源是，随着生长，不同个体的发育总是会存在差异，由于各种后天因素的影响，同卵双生子也会有细微的形状差异。

　　转基因技术是通过有性生殖过程实现的，作为生命科学的前沿技术，转基因技术已经逐渐走入了人们的生活。面是我整理的关于转基因技术论文，希望能对大家有所帮助!　　转基因技术论文篇一：《试谈转基因技术》 　　【摘要】 　　作为生命科学的前沿技术，转基因技术已经逐渐走入了人们的生活，应用领域不断开拓，在解决人类所面临的粮食短缺、环境污染、资源匮乏、效益衰减等重大问题上显示出日益重要的作用, 逐渐发展成为强大的现代生物技术产业。然而，由于转基因生物及其产品是否存在潜在风险尚无定论，故转基因生物及其产品的安全性成为全球的 热点 问题，并引起世界各国政府和许多国际组织的高度重视。 　　【关键词】转基因技术;发展现状;争议;生物安全管理 　　1 转基因技术简介 　　转基因技术(Transgene technology)是指根据人们的意愿，利用分子生物学 方法 ， 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。人们常说的"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"均为转基因的 同义词 。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为"遗传修饰过的生物体"(Genetically modified organism，简称GMO)。 　　转基因技术的优越性体现在：首先，转基因技术突破了传统技术的某些局限，其所转移的基因不受生物体间亲缘关系的限制，比如将人类的胰岛素基因导入到细菌体内，跨越了物种之间的界限。其次，转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期。因此，转基因技术对传统的育种技术进行了广泛的发展和比较完美的补充。 　　2 转基因技术方法 　　2.1 植物转基因方法。 　　转基因植物是指利用重组DNA技术将克隆的优良目的基因整合到植物的基因组中，并使其得以表达，从而获得的具有新的遗传性状的植物。方法有如下几种： 　　农杆菌介导法：农杆菌中有一种致瘤的环型DNA，称为Ti质粒。被农杆菌感染的植物之所以长瘤正是由于T―DNA插入了植物染色体。从此，人们便利用这种天然的转化体系向植物转基因。 　　基因枪：利用火药爆炸或高压气体加速(这一加速设备被称为基因枪)，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。 　　花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 　　2.2 动物转基因方法。 　　转基因动物是通过人工实验方法，将别的基因导入动物细胞，与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而繁殖，并且能够将别的基因信息遗传给后代，严格意义上说，转基因动物是人工创造的新动物。 　　转基因动物接受外来基因的细胞一般是受精卵。主要的转基因动物技术包括有： 　　核显微注射法：是动物转基因技术中最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。它可以直接获得纯系，实验周期短。 　　逆转录病毒载体法：指将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。此法优点在于无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝;将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。 　　胚胎干细胞介导法：是将基因导入胚胎于细胞;然后将转基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。其优点是：在将胚胎干细胞植入胚胎前，可以在体外选择一个特殊的基因型，用外源DNA转染以后，胚胎干细胞可以被克隆，继而可以筛选含有整合外源DNA的细胞用于细胞融合，由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。 　　3 转基因技术发展现状 　　目前，国际上获得的转基因植物已达100种以上。转基因作物已在美国、阿根廷及加拿大等国大面积 种植 ，在所有转基因作物中，转基因的大豆、玉米、棉花和油菜的种植面积占99%以上。中国政府十分重视生物技术的研究，中国正在研发的转基因作物和林木有47种，涉及的基因种类超过100种。以转基因山羊、奶牛生产LAt-PA，以转基因猪生产人血红蛋白等，这些基因产品具有高效、优质、廉价与相应的人体蛋白具有同样的生物活性，且多随乳汁分泌，便于分离纯化。 　　4 转基因技术的争议 　　随着转基因问题日益成为热点，越来越多的人开始关注转基因。科学家发明转基因技术的初衷是想利用该技术造福人类，既可加快农作物和家畜品种的改良速度，提高人类食物的品质，又可以生产珍贵的药用蛋白，为患病者带来福音。 　　但是，人类对自然界的干预是否会造成潜在的尚不可能预知的危险?由于一系列的争论，联合国也公开言论试图说明转基因产品是无害安全的，国际经合组织1993年提出了食品安全性评价的实质等同性原则，如果转基因动植物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。然而各国政府对于转基因的态度却转向两个方向。一方是以美国为代表的宽松政策，认为只要在科学上无法证明转基因产品的危害性都不应该限制。另一方以欧盟为代表的则认为只要不能否定其危害性就应该限定。 　　我国政府十分重视转基因生物安全管理问题，2001年5月，国务院颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，我国越来越重视转基因生物及其产品的安全性，并且密切关注国际上有关管理法规的动向。 　　转基因技术论文篇二：《试论转基因食品检测技术》 　　摘要：在基因工程技术开展的影响下，各国对转基因食品的研发也在不时放慢，而转基因食品的呈现随同着食品平安成绩，人们对转基因食品的信任度并不高，为了使人们可以对转基因食品停止自主选择，各个国度与组织机构要求企业对消费的转基因产品停止标识，这也对转基因食品剖析检测技术提出了更高的要求。本文引见了转基因食品剖析检测技术的内容，讨论其研讨进程，并对转基因食品剖析检测技术的将来开展停止了瞻望。 　　关键词：转基因食品;剖析检测技术;基因工程 　　20世纪70年代重组DNA技术的问世将生物技术带进基因工程时代，农业生物技术在世界范围内迅速崛起，转基因动物在全球范围内失掉普遍种植，随之而来的转基因食品也迅猛开展。由于转基因生物技术的普遍使用和转基因作物的大规模种植，转基因食品的平安性成绩也已惹起人们越来越多的关注。 　　一、转基因食品标识制度与剖析检测技术 　　我国在2015年对叶食品平安法曳的修订中有明白的指示，企业对转基因食品必需依照规则停止标识。目前国际中关于转基因食品标识制度次要分为强迫性标识与自愿性标识2种。在我国关于转基因食品的标识有着较为严厉的法律制度，关于企业消费与运营的产品直达基因食品含量超越阈值必需停止标识。而在一些欧美国度对转基因食品标识没有严厉的要求，只关于存有过敏要素的转基因食品停止标志。而在我国产品出口时需求停止严厉的剖析检测，关于合格的转基因食品同意出口并停止转基因标识，其也是产品流通的关键。由此可见标识的重要性[1]。而对转基因产品的标识需求经过剖析检测来完成，故转基因食品标识制度是转基因食品的重要标签。实践检测才能决议标识制度的树立，定性和定量剖析检测技术所到达的检测限为标识制度提供迷信根据;但是在实践检验检疫任务中标识制度是经过检测技术来完成的。因而，标识制度与剖析检测技术的关系非常亲密，二者互相影响，互相作用[2]。 　　二、、转基因食品成绩现状 　　2.1转基因食品概述 　　在基因工程中，应用DNA重组技术将外源性基因转移到其他生物体中，使生物体显现出特殊的遗传特征与生物性状，失掉新的基因重组的生物体就是转基因的内容。而所谓转基因食品则是使用这些特殊的生物体停止加工而成的食品。转基因在某种水平上只是应用外源性基因放慢生物体的生出息程，在基因工程中，转基因食品次要是为了延长作物生长周期尧添加作物产量尧添加抗病虫害才能，从而无效降低消费本钱，进步作物的消费效益。在目前的转基因研讨中，并没有发现食品中含有少量的毒素。但是由于转基因食品属于人工制造的外来生物体而非自然选择生成的物种，在基因漂流的进程中发生的基因序列的改动无法完全地停止掌握，外源性基因在与DNA停止重组时存在着不可控制的性状，因此对转基因食品的平安性也无法停止确切的定论[3]。 　　2.2转基因食品存在的成绩 　　转基因食品自呈现开端便成了一种十分具有争议的食品，越来越多的转基因食品流入市场与媒体的发酵使人们对转基因食品的平安性有了很大的质疑。而在转基因食品平安的成绩上，目前还没有严谨的迷信结论与研讨 报告 对其平安性给出确切的证据结论，其存在的成绩次要有以下几个方面。第一，转基因食品是由基因植入及基因重组构成的新的生物体，其本来具有的构造与成分能否发作了变化;第二，转基因食品不是自然界生成的产物，食用转基因食品能否会对人体发生负面影响，临时食用能否会有毒素的积聚，对人体的发育生长有什麼影响;第三，转基因作物不是在自然选择下呈现的产物，其能否会对生物链有影响，能否会毁坏生态均衡;第四，转基因作物是基因活动下的产物，这种状况下能否会呈现基因净化的状况，涉及到其他自然界的作物，使其基因发作改动[4]。由于上述这些成绩并没有失掉无效的处理，因此才迫切需求完好尧精确尧严谨的转基因食品剖析检测技术对其平安性停止保证，从而进一步完善我国转基因食品监管方面的迷信标准。 　　2.3转基因食品检测技术的内容和分类 　　目前，关于转基因食品的平安性次要依托转基因食品剖析检测来停止测定。而在转基因食品的剖析检测进程中，次要是对DNA尧蛋白质及核酸这3类物质停止测定，可以依据这3类物质分红3个品种的检测办法，在实践状况中可以依据需求停止检测办法的联用。由于蛋白质程度检测办法仅适用于未停止加工的食品检测和新颖食品范围，具有较大的局限性，因此现阶段外源基因测定办法的运用范围较为普遍[5]。 　　三、转基因食品检测技术的研讨 　　3.1蛋白质印迹检测技术 　　蛋白质印迹检测次要是应用聚丙烯酰氨凝胶电泳对转基因食品外源蛋白质停止别离，并与显色酶反响停止结合，从而使外源蛋白质可以无效地停止别离检测。这种检测办法次要是对转基因食品中不可溶蛋白质停止剖析，检测在转基因食品中的蛋白质含量，并与蛋白质预定限值停止比对。 　　3.2复合扩增PCR检测技术 　　目前在转基因食品检测中多重PCR检测技术是一种被普遍运用的检测手腕。PCR渊聚合酶链式反响冤普通只能对1个DNA片段停止缩小扩增检测。为了能在转基因食品检测中取得更片面的基因序列信息，在停止基因检测时应用PCR反响原理停止多重检测，由此构成了复合扩增PCR转基因食品检测技术。这种检测技术的使用可以无效提升检测效率，并且可以对基因序列多个靶位点同时停止检测，完成转基因食品检测的精确性与牢靠性[6]。 　　3.3外源DNA检测技术 　　转基因食品次要是将外源DNA导入生物体中，而对外源DNA的检测次要是对植入的DNA片段停止转基因食品基因序列特征的检测，以转基因食品DNA序列作为检测目的，转基因食品核酸程度检测作为最次要的转基因产品检测技术，其次要检测启动子尧基因和终止子，便于检测转基因食品。 　　3.4基因芯片检测技术 　　基因芯片是对转基因生物体的基因组序列停止测定，经过将转基因食品的DNA有规律排布在硅片或是玻片上构成微距阵。经过对基因芯片上的基因序列停止计算机软件的计算处置，从而取得转基因食品的基因特征与生物信息，这种办法可以精确无效地对转基因生物体的基因表达特征停止检测[7-9]。 　　3.5LAMP检测技术 　　LAMP渊环介导等温扩增冤技术是众多核苷酸扩增技术中的一种，这种技术在运用时没有特定的环境条件要求，只需求在恒温形态下就可以停止检测实验，操作技术较为复杂。LAMP检测技术次要是应用显色反响对转基因生物体停止察看，并且应用浊度仪对其在反响进程中发生的沉淀物停止检测判别，是一种较为复杂的检测技术。 　　3.6联用检测技术 　　联用检测技术次要是集合多种检测技术的优点对转基因食品停止无效的剖析检测，这样可以起到扬长避短的作用。在基因检测中，现有的联用检测技术有PCR技术与酶联免疫吸附法的结合运用等办法[10-11]。 　　四、结语 　　转基因食品剖析检测技术次要是对转基因食品的平安停止评价。目前，转基因食品剖析检测技术有多种，由于转基因食品的基因片段不同，因此采用的检测技术也需求根据实践需求停止选择，确保检测技术的无效性。在将来市场上会呈现越来越多的转基因食品，剖析检测技术作为其中重要的检测手腕也肯定会有新的开展。 　　转基因技术论文篇三：《浅议转基因食品消费者知情权保护制度》 　　[摘 要]转基因食品消费中存在的信息不对称及食品安全的不确定性引发了消费者的普遍关注，切实保障消费者的知情权有助于转基因食品的理性消费和转基因技术的健康发展。 　　因此，应借鉴美国和欧盟保障消费者知情权的主要制度，从标识制度、安全评价和检测制度以及公众参与制度等方面构建和完善我国转基因食品消费者知情权的保障体系。 　　[关键词]转基因食品;消费者;知情权。 　　二十世纪末以来，转基因食品在生活中得到了广泛的推广。 　　所谓转基因，就是利用分子生物学手段，将某些生物的基因转移到其他生物物种中去，使其出现原物种不具有的性状或产物，以转基因生物为原料加工生产的食品就是转基因食品。但另一方面，随着转基因技术日益普遍的运用，这一技术对人类健康可能带来的安全隐患也逐渐受到社会各界的关注。在转基因食品已经生产并上市的情况下，消费者的知情权具有正当性，应当予以保护。 　　一、消费者知情权的内涵。 　　消费者有权要求经营者按照法律规定的方式标明转基因食品及其相关服务的真实成份、所用原料、来源。如果食品含有转基因成份、所用原料为转基因产品、直接来自于转基因方法培育的作物、所提供的餐饮服务中涉及转基因食品等等，则消费者有权要求经营者在出售转基因食品或提供转基因食品相关的服务时，予以标明。消费者有权在交易过程中，就所售食品或所提供服务进行询问和了解，经营者应该耐心、细致地予以回答和说明。经营者在提供转基因食品或与转基因食品相关的服务时，无论食品或服务的优、缺点均应向消费者如实介绍。 　　二、消费者知情权保护制度的意义。 　　(一)转基因食品消费者知情权保护，是食品安全保障的重要方面。 　　由于转基因作物能更好地防治病虫害，抵御干旱，提高产量，营养成分高，因此发展前景十分广阔。但专家们也强调，发展转基因食品必须有严格监督、科学检验、加强立法和管理，以避免它对人类健康和环境造成损害。[1]而转基因食品消费者知情权保护法律制度，有助于通过消费者监督，促使食品生产者在转基因技术的运用上更加慎重，避免有害健康的食品进入消费领域，因而是食品安全保障的重要途径和手段。 　　(二)转基因食品消费者知情权保护，是消费者权益的重要体现。 　　知情权作为政治民主化的一种必要和结果，是公民依法享有的基本人身权利。消费者作为特定的民事主体，其享有知情权是政治领域的民主原则扩展到经济生活的必然要求，我国相关法律法规做出了明确规定。特别是消费者的知情权，还是其行使选择权的前提条件，消费者有权决定是否购买转基因食品。因而知情权对食品消费者的基本权益的全面实现有着至关重要的作用。然而，就目前我国转基因食品研发、生产、加工、销售等方面而言，消费者所应享有的知情权与社会现实有着极大差距，现行法律对此方面规定亦不完善。这种情况不利于对消费者基本权益的保护，也对转基因食品的规范管理造成负面影响。 　　三、国外转基因食品消费者知情权保护现状。 　　转基因食品信息公开，保障消费者充分享有知情权，是目前世界各国自转基因生物技术研发到转基因食品商业化生产销售过程中所需解决的重要课题。欧美等发达国家对于此有着较为完善的立法和管理体系。国外先进的信息透明化管理模式以及消费者知情权保护法律制度的研究与实践对我国有着重大的借鉴意义。其主要可归纳为三大模式： 　　(一)以欧盟为代表的严格限制型模式。 　　欧盟对转基因食品的认定根据过程而非最终产品。为保证消费者对食品拥有充分知情权，欧盟设立了专门机构，即欧盟食品安全管理局(EFSA)，负责评估与整个食物链相关的风险，不受其他机构管辖，独立开展工作。[2]并建立专门网站向公众提示食品风险问题，充分公开转基因食品自研发到销售的各环节信息。 　　在对消费者知情权法律保护方面，欧盟以《通用食品法》为主体，辅以大量食品标签法令和 广告 法令，构成高低有序，结构严谨的转基因食品信息公开制度。2003 年第 1829 号法令和1830 号法令规定：无论源自转基因生物的 DNA或蛋白质是否存在，只要食品包含转基因生物或由转基因生物制成，都要有特别标签加以标明。法令细化到标签规格制式，转基因含量限制等，种类扩展到数十类百余种。 　　(二)以美国为代表的宽松鼓励型模式。 　　美国对于转基因食品管理遵循的是“可靠性科学原则”，采取宽松式管理模式，奉行自律管制。但其仍十分注重公众知情权的法律保护，强调转基因技术研发、实践、生产、推广的透明性，并建立了有效的食品安全信息系统，定时发布转基因食品检测信息，在网络发布转基因食品名录、食品安全资源信息等，使食品安全信息最大限度予以公开。[3]美国《转基因食品安全管理草案》、《公共健康卫生法》、《联邦食品及药物管理现代化法》规定了转基因食品商业化申请流程，并将对公众公开相关技术资料等，作为取得食品和药物管理局(FDA)合法执照的必要条件。 　　(三)以日本为代表的折中模式日本对转基因食品采取的是在严格管制的同时加以鼓励的原则。为保护消费者知情权，日本政府颁布《转基因食品标识法》，对主要原料为已通过安全评价的转基因农产品，加工后仍残留重组 DNA或其编码的蛋白质食品，制定具体的标识办法。同时，由日本科学技术厅、农林水产省和厚生省共同管理转基因技术事项，定期公布转基因食品研发资料以及市场流通转基因食品名录。 　　国外转基因食品管理模式，不管其对转基因技术产品是否持谨慎态度，都将信息透明化、保证消费者充分知情权置于立法及管理优先考虑的方面，值得我国相关立法执法机构借鉴。 　　四、我国转基因食品消费者知情权保护现状。 　　我国政府高度关注现代生物技术，支持和鼓励转基因生物和转基因食品的研究。我国于 2000 年 8 月 8 日签署《卡塔赫纳生物安全议定书》的第 23 条规定：各缔约方应按其各自的法律规章，在关于改性活生物体的决策过程中征求公众的意见，并在不违反关于机密资料的情况下，向公众通报;缔约方应力求使公众知悉可通过何种方式公开获得生物安全资料。[4]2001 年 5月 23 日，国务院发布《农业转基因生物安全管理条例》，明确规定农业转基因生物实行安全评价制度，标志管理制度，生产许可制度，经营许可制度和安全审批制度。作为迄今为止我国级别最高、最全面的转基因技术管理条例，信息公开制度和知情权保护制度均未列入其中。 　　我国在转基因食品消费者知情权的保护方面在立法上取得重大成就的同时，也存在着一些弊端。如缺少专门生物技术安全立法，立法层次不高，研究、生产、销售等转基因技术重要阶段信息公开出现“真空管理”，[5]造成信息公开制度和知情同意制度严重缺失。转基因食品强制标识是保护消费者知情权最重要的手段，但随着转基因技术迅速发展，《农业转基因生物标识管理办法》所规定标识种类未进行更新补充，标识管理未向烟酒等进行细化规范，造成标识混乱，透露信息极为有限，对消费者充分行使知情权造成巨大阻碍。 　　五、完善我国转基因食品消费者知情权保护制度 措施 。 　　我国学术界在转基因食品消费者知情权法律保护方面，也做了较多的研究。具体来说，完善我国转基因食品消费者知情权保护制度，应加强以下三个工作重点： 　　第一，加强对转基因食品的标识管理。虽然转基因标识制度已经实施多年， 但在转基因食品标识上还存在诸多问题。一方面， 还有众多转基因食品没有进行标识;另一方面， 现有的进行了标识的转基因食品，其所作的标识多数不符合规范。因此，国家相关部门应在今后加强对转基因食品标识的监管工作。 　　第二，强调公众对转基因食品的知情权和选择权。公众对所消费的食品应拥有知情权和选择权， 公众只有充分地获得知情权， 才能享有选择权， 并最大限度地保护自己的权益。在目前转基因食品的风险和危害尚不明确的情况下， 消费者对其选择有些茫然难以避免。因此， 政府相关主管部门应提高转基因相关信息透明性和安全管理的公众可参与性， 比如在批准转基因生物环境释放和商业化生产时增加公众听证的程序。 　　第三，健全转基因食品检测、评估体系。首先， 建立独立的权威检测机构， 对转基因食品进行严格的检测， 保证其质量和安全性， 并逐渐形成一个覆盖全国的农业生物技术管理监督与监测网络体系。定时发布转基因食品名录供消费者参考。其次，严格控制转基因食品的生产、加工、贮运、销售直到进出口各环节， 使安全风险降至最低。[6]结合我国实际， 研制出一套切实可行的转基因食品安全评估体系， 将转基因食品置于规范化的管理和监控之中， 使消费者能放心地消费转基因食品。第三， 要加大执法力度。对未经申报审批而进行商业化生产的， 对不执行转基因食品标识制度的单位和个人， 应承担相应的法律责任，以保证转基因食品市场健康发展。 　　六、结语。

并介绍了点杂交的基本概念及实验原理、方法。02几种核酸杂交技术的比较02 点杂交实验原理、步骤（1）几种核酸杂交的异同点核酸杂交是分子生物学的基本技术，也是遗传学研究和基因诊断的常用方法。核酸杂交的形式有多种，其中最常用的是Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、点杂交等。虽然形式多样，但都是基于核酸分子的碱基互补原理。从杂交材料来看，杂交分为DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。从杂交分子状态来看，杂交分为液相-固相杂交和液相-液相杂交。上述几种杂交都属于液相-固相杂交，即将参与杂交的一方分子固定在固相的支持载体上，另一方分子以液相形式参与杂交。参与杂交的双方分子必有一方被标记，以便产生能够被检出的杂交信号;在液相-固相杂交中往往液相分子被标记，这样才能产生有意义的差别信号。在杂交在中，被标记的分子称为探针，而与探针进行杂交的分子称为被检测样品(被检分子)。大多数液相-固相杂交中被检样品往往是混合分子，如提取的基因组DNA或某种组织的RNA，并且将被检样品固定在载体上，而探针往往是单一分子，如某一基因的片断。杂交结果是根据信号的强弱和位置进行判断，如被检分子的分子量(或长度)，被检分子的表达强度等。这种杂交适用于相同基因片断对不同样品的检测。若进行一种样品被不同基因片断的检测时，就必须采取反向的方式，即将不同的基因片断固定在载体上，而将被检样品制成液相并进行标记。这种反向的方式称为反向杂交，反向杂交中被标记的样品也可以称为探针。在液相-固相杂交中固相载体往往采用尼龙膜或醋酸纤维膜，这些经过特殊处理的材料对核酸分子具有强大的吸附力，在操作中不易脱落。探针标记往往采用放射性标记，如32P、35S等，由于放射性物质的危害性，现在非放射性标记也在广泛使用，如生物素标记、地高辛标记等。一般来说，放射性标记适用于Southern杂交、Northern杂交和点杂交，非放射性标记适用于原位杂交。放射性标记灵敏度高，线形范围宽，非放射性标记定位性强，没有衰变，危害小。（2）点杂交的概念点杂交(dot blot)是杂交信号呈现斑点样的杂交方法，在操作上是把参与杂交的一方分子点样到膜上。由于杂交分子预先没有进行像Southern杂交和Northern杂交之前的电泳分离，也没有像原位杂交那样，杂交一方的分子已经表现出组织细胞分布的位置特异性，所以点杂交的结果判断完全视杂交信号的强弱，其信息量没有其它杂交形式的信息量丰富。但点杂交的操作比较简单、结果直观、适用于大批样品的检测，因此它在许多方面也得到了广泛的应用。一、实验目的理解核酸杂交原理;熟悉核酸杂交的一般方法，掌握膜斑点杂交技术和结果分析。二、实验原理点杂交是核酸杂交中比较简单的一种技术，本质上也是单链核酸分子通过碱基互补而形成双链核酸的过程，当某单链分子被标记后，就可以检测与其互补的分子。(一)印迹印迹(blot)就是将杂交一方的分子固定在膜上，对于Southern杂交和Northern杂交，往往采用毛细转移，真空转移或电转移等方法，使电泳分离的核酸分子“原位印迹”到膜上去，而点杂交则可采取人工点样的方法，将核酸分子固定到膜上去。在点膜时还要借助其它使核酸分子固定的方法(如点膜器、真空抽气装置)使分子更紧密地结合在膜上，并且不扩散。点杂交的印迹过程提供了一个固化平台和阵列，使杂交在已知位置上进行。(二)标记标记(labeling)就是使参与杂交的一方分子带有可识别的物质，使杂交后显示信号。常用标记物有放射性同位素和非放射性物质，标记方法有随机引物标记法、缺口平移法和末端标记法等。在液相-固相杂交中，标记往往在液相分子上，使探针成为流动相。标记效率是影响杂交的重要因素，在一定范围内，比活性(可以理解为单位分子中的标记物数量与活性)越高越好。在杂交中，探针往往是过量的(杂交信号的强弱反映的是被检样品的量和基因丰度)，所以依靠增加探针量来提高杂交灵敏度的做法很有限的，应该提高探针的比活性。

分类: 理工学科 解析: 基因芯片，也叫DNA芯片，是在90年代中期发展出来的高科技产物。基因芯片大小如指甲盖一般，其基质一般是经过处理后的玻璃片。每个芯片的基面上都可划分出数万至数百万个小区。在指定的小区内，可固定大量具有特定功能、长约20个碱基序列的核酸分子（也叫分子探针）。 由于被固定的分子探针在基质上形成不同的探针阵列，利用分子杂交及平行处理原理，基因芯片可对遗传物质进行分子检测，因此可用于进行基因研究、法医鉴定、疾病检测和药物筛选等。基因芯片技术具有无可比拟的高效、快速和多参量特点，是在传统的生物技术如检测、杂交、分型和DNA测序技术等方面的一次重大创新和飞跃。 基因芯片在生命科学、医药研究、环境保护和农业等领域有极其重要的应用价值。在基因芯片的驱动下，人类正进入一个崭新的生物信息时代。 基因破译目前，由多国科学家参与的“人类基因组计划”，正力图在21世纪初绘制出完整的人类染色体排列图。众所周知，染色体是DNA的载体，基因是DNA上有遗传效应的片段，构成DNA的基本单位是四种碱基。由于每个人拥有30亿对碱基，破译所有DNA的碱基排列顺序无疑是一项巨型工程。与传统基因序列测定技术相比，基因芯片破译人类基因组和检测基因突变的速度要快数千倍。 基因芯片的检测速度之所以这么快，主要是因为基因芯片上有成千上万个微凝胶，可进行并行检测；同时，由于微凝胶是三维立体的，它相当于提供了一个三维检测平台，能固定住蛋白质和DNA并进行分析。 美国正在对基因芯片进行研究，已开发出能快速解读基因密码的“基因芯片”，使解读人类基因的速度比目前高1000倍。图1所示为一种内嵌基因芯片的基因检测装置。 图1 内嵌基因芯片的基因检测装置 基因诊断 通过使用基因芯片分析人类基因组，可找出致病的遗传基因。癌症、糖尿病等，都是遗传基因缺陷引起的疾病。医学和生物学研究人员将能在数秒钟内鉴定出最终会导致癌症等的突变基因。借助一小滴测试液，医生们能预测药物对病人的功效，可诊断出药物在治疗过程中的不良反应，还能当场鉴别出病人受到了何种细菌、病毒或其他微生物的感染。利用基因芯片分析遗传基因，将使10年后对糖尿病的确诊率达到50％以上。 未来人们在体检时，由搭载基因芯片的诊断机器人对受检者取血，转瞬间体检结果便可以显示在计算机屏幕上。利用基因诊断，医疗将从千篇一律的“大众医疗”的时代，进步到依据个人遗传基因而异的“定制医疗”的时代。 基因环保 基因芯片在环保方面也大有可为。基因芯片可高效地探测到由微生物或有机物引起的污染，还能帮助研究人员找到并合成具有解毒和消化污染物功能的天然酶基因。这种对环境友好的基因一旦被发现，研究人员将把它们转入普通的细菌中，然后用这种转基因细菌清理被污染的河流或土壤。 基因计算 DNA分子类似“计算机磁盘”，拥有信息的保存、复制、改写等功能。将螺旋状的DNA的分子拉直，其长度将超过人的身高，但若把它折叠起来，又可以缩小为直径只有几微米的小球。因此，DNA分子被视为超高密度、大容量的分子存储器。 基因芯片经过改进，利用不同生物状态表达不同的数字后还可用于制造生物计算机。基于基因芯片和基因算法，未来的生物信息学领域，将有望出现能与当今的计算机业硬件巨头――英特尔公司、软件巨头――微软公司相匹敌的生物信息企业。 基因芯片（Gene Chip）准确的讲（或者说是狭义的基因芯片）是指DNA芯片（DNA Chip），其原理是指利用现代探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术等微电子技术把大量分子生物学技术（包括南北印迹技术、探针杂交技术、PCR等）具体而微的固定在一定狭小的空间内，以实现高速度、高通量、集约化和低成本的分析技术。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片（biochip）、微阵列（Microarray）、DNA芯片（DNA chip），甚至蛋白芯片。 由于基因芯片高速度、高通量、集约化和低成本的特点，基诞生以来就受到科学界的广泛关注，正如晶体管电路向集成电路发展的经历一样，分子生物学技术的集成化正在使生命科学的研究和应用发生一场革命。

　　复习资料很多，下面的只是一部分　　第一章 绪论　　细胞生物学从显微水平、超微水平和分子水平等不同层次研究细胞结构、功能及生活史。　　细胞生物学由细胞学Cytology发展而来，Cytology是指对细胞形态（特别是染色体形态）的观察。　　在我国的基础学科发展规划中，细胞生物学与分子生物学，神经生物学和生态学并列为生命科学的四大基础学科。　　第一章 绪论　　本章内容提要:　　第一节 细胞生物学研究的内容与现状　　一、 细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科　　二、细胞生物学的主要研究内容　　三、当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域　　第二节 细胞学与细胞生物学发展简史　　附录 细胞生物学参考书:　　第一节 细胞生物学研究的内容与现状　　一、 细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科　　生命体是多层次、非线性、多侧面的复杂结构体系，而细胞是生命体的结构与生命活动的基本单位，有了细胞才有完整的生命活动。　　细胞生物学 是研究细胞基本生命活动规律的科学，它是在不同层次（显微、亚显微与分子水平）上以研究细胞结构与功能、细胞增殖、分化、衰老与凋亡、细 胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主要内容。核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。　　二、细胞生物学的主要研究内容　　1、细胞核、染色体以及基因表达的研究　　2、生物膜与细胞器的研究　　3、细胞骨架体系的研究　　4、细胞增殖及其调控　　5、细胞分化及其调控　　6、细胞的衰老与凋亡　　7、细胞的起源与进化　　8、细胞工程　　三、当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域　　1、细胞生物学研究的总趋势　　细胞生物学与分子生物学(包括分子遗传学与生物化学) 相互渗透与交融是总的发展趋势；　　当前细胞生物学研究中的三大基本问题:　　（1）、细胞内基因组是如何在时间和空间上有序表达的？　　（2）、基因表达产物----主要是结构蛋白、核酸、脂质、多糖及其复合物，他们如何逐级装备成能行使生命活动的基本结构体系及各种细胞器？　　（3）、基因表达产物----主要是大量活性因子与信号分子，他们是如何调节细胞最重要的生命活动过程的？　　2 、当前细胞基本生命活动研究中的重要领域:　　（1）、染色体DNA与蛋白质相互作用关系-----主要是非组蛋白对基因组的作用；　　（2）、细胞增值、分化、凋亡的相互关系及其调控；　　（3）、细胞信号转导的研究；　　（4）、细胞结构体系的装配。　　3、细胞重大生命活动的相互关系　　第二节 细胞学与细胞生物学发展简史　　一、生物科学发展的三个阶段:　　1.形态描述生物学时期，19世纪以前；　　2.实验生物学时期，20世纪前半世纪；　　3.分子生物学时期，20世纪50-60年代至今。　　二、细胞生物学发展简史　　1. 细胞的发现　　2. 细胞学说的建立其意义　　细胞学说内容:1） 认为细胞是有机体，一切动植物都是由细胞发育而来,并由细胞和细胞产物所构成；　　2） 每个细胞作为一个相对独立的单位，既有它“自己的”生命,又对与其它细胞共同组成的整体的生命有所助益；3） 新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。　　3. 细胞学的经典时期　　1）原生质理论的提出2）细胞分裂的研究3）重要细胞器的发现　　4. 实验细胞学与细胞学的分支及其发展　　1）细胞遗传学的发展　　2）细胞生理学的研究　　3）细胞化学　　5. 细胞生物学学科的形成与发展　　三、细胞学说　　Jean-Baptiste de Lamark （1744~1829)，获得性遗传理论的创始人，法国退伍陆军中尉，50岁成为巴黎动物学教授，1809年他认为只有具有细胞的机体，才有生命。Charles Brisseau Milbel（1776~1854)，法国植物学家，1802年认为植物的每一部分都有细胞存在， Henri Dutrochet （1776~1847），法国生理学家，1824年进一步描述了细胞的原理，　　Matthias Jacob Schleiden（1804~1881)，德国植物学教授，1838年发表“植物发生论”(Beitr?ge zur Phytogenesis)，认为无论怎样复杂的植物都有形形色色的细胞构成。　　Theodor Schwann（1810~1882)，德国解剖学教授，一开始就研究Schleiden的细胞形成学说，并于1838年提出了“细胞学说”（Cell Theory)这个术语；1939年发表了“关于动植物结构和生长一致性的显微研究”　　Schwann提出:有机体是由细胞构成的；细胞是构成有机体的基本单位。　　1855 德国人R. Virchow 提出“一切细胞来源于细胞”（omnis cellula e cellula）的著名论断；进一步完善了细胞学说。　　把细胞作为生命的一般单位，以及作为动植物界生命现象的共同基础的这种概念立即受到了普遍的接受。　　恩格斯将细胞学说誉为19世纪的三大发现之一　　第二章 细胞基本知识概要　　本章内容提要:　　第一节 细胞的基本概念　　第二节 非细胞形态的生命体-------病毒及其与细胞的关系　　第三节 原核细胞与古核细胞　　第四节 真核细胞基本知识概要　　第一节 细胞的基本概念　　一、细胞是生命活动的基本单位　　1、一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位；　　2、细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位　　3、细胞是有机体生长与发育的基础　　4、细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性　　5、没有细胞就没有完整的生命　　二、细胞的基本共性　　1.所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。　　2.所有的细胞都含有两种核酸:即DNA与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。　　3.作为蛋白质合成的机器—核糖体，毫无例外地存在于一切细胞内。　　4.所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。　　第二节 非细胞形态的生命体 —病毒及其与细胞的关系　　一、病毒与细胞在起源与进化中的关系　　病毒是非细胞形态的生命体，它的主要生命活动必须要在细胞内实现。病毒与细胞在起源上的关系，目前存在3种主要观点:　　1.生物大分子→病毒→细胞 病毒　　2.生物大分子 细胞　　3.生物大分子→细胞→病毒　　现在来说，第二种观点和第三种观点比较容易接受，而且第三种观点越来越有说服力。　　认为病毒是细胞演化的产物的观点主要依据如下:　　彻底的寄生性；　　病毒核酸与哺乳动物细胞DNA某些片断的相似性；　　病毒可以看成是核酸与蛋白质形成的复合大分子。　　第三节 原核细胞与古核细胞　　一、Basic characteristics of Prokaryotic cell　　1. 遗传的信息量小，遗传信息载体仅由一个环状DNA或RNA构成；　　2. 细胞内没有分化为以膜为基础的具有专门结构与功能的细胞器和细胞核膜。　　二、原核细胞的主要代表　　1、支原体　　为什么说支原体是一个细胞　　（1）能在培养基上生长，具有典型的细胞膜；　　（2）具有环状的双螺旋DNA作为遗传信息量的载体；　　（3）mRNA与核糖体结合形成多聚核糖体，指导蛋白质的合成；　　（4）以一分为二的方式分裂繁殖。　　支原体是最小、最简单的细胞。　　2、细菌　　1）、细菌的三种形态:球状、杆状和螺旋状　　2)、细菌细胞的核区与基因组:细菌的核区实际主要由一个环状的DNA分子组成；现在也可以把细菌的环状DNA理解为细菌基因组。　　3）、细菌细胞的表面结构:　　A. 细胞膜:主要功能是选择性的交换物质----吸收营养物质，排出代谢废物，并且有分泌与运输蛋白的作用。　　B. 细胞壁: 所有细菌的细胞壁的共同成分是肽聚糖，由乙酰氨基葡萄糖、乙酰胞壁酸与四五个氨基酸短肽聚合而成的多层网状大分子结构。　　C. 细胞壁特化结构:a. 中膜体-----细胞膜内陷而形成的；b. 荚膜-----是一层松散的粘液物质，有一定程度的保护作用；c. 鞭毛-----细菌的运动器官，与真核生物的鞭毛不同，它是由一种称为鞭毛蛋白的弹性蛋白所构成。　　4）、细菌细胞的核糖体——部分附着在细胞膜内侧，大部分游离于细胞质中，与蛋白质的合成密切相关。　　5）、细菌细胞核外DNA------质粒，是裸露环状DNA，在遗传工程研究中很重要。　　6）、细菌细胞的内生孢子，即芽孢，是细菌对不良环境或营养耗尽时的反应。　　3. 蓝藻细胞:是最简单的自养植物类型之一。　　基本特征:1）中心质------相当于细菌的核区，是遗传物质DNA所在部位。　　2）光合片层-----位于细胞质部分，是同心环状的膜片层结构，上边附着有藻胆蛋白体（包括藻蓝蛋白，一藻蓝蛋白和藻红蛋白），能够把光能传递给叶绿素a，进行原始光和作用。　　3）细胞质内含物　　4）细胞表面结构　　5）细胞分裂　　四、原核细胞与真核细胞的比较　　1、原核细胞与真核细胞最根本的区别 :　　（1）、细胞膜系统的分化和演变。 细胞内部结构和职能的分工是真核细胞区别于原核细胞的重要标志。　　（2）、遗传信息量与遗传装置的扩增与复杂化。 遗传信息重复序列与染色体多倍性的出现是真核细胞区别于原核细胞的另一重要标志。　　（3）、真核细胞内，遗传信息的转录与翻译有严格的阶段性和区域性，而在原核细胞内则是转录与翻译可以同时发生　　五、原核细胞与真核细胞基本特征的比较（p36)　　六、原核细胞与真核细胞的遗传结构装置和基因表达的比较(p37)　　七、古细菌　　古细菌（archaebacteria）与真核细胞曾在进化上有过共同历程　　主要证据　　（1）细胞壁的成分与真核细胞一样，而非由含壁酸的肽聚糖构成，因此抑制壁酸合成的链霉素， 抑制肽聚糖前体合成的环丝氨酸，抑制肽聚糖合成的青霉素与万古霉素等对真细菌类有强的抑制生长作用，而对古细菌与真核细胞却无作用。　　（2）DNA与基因结构:古细菌DNA中有重复序列的存在。此外，多数古核细胞的基因组中存在内含子。　　（3）有类核小体结构:古细菌具有组蛋白，而且能与DNA构建成类似核小体结构。　　（4）有类似真核细胞的核糖体:多数古细菌类的核糖体较真细菌有增大趋势，含有60种以上蛋白，介于真核细胞（70～84）与真细菌（55）之间。抗生素同样不能抑制古核细胞类的核糖体的蛋白质合成。　　（5）5S rRNA:根据对5S rRNA的分子进化分析，认为古细菌与真核生物同属一类，而真细菌却与之差距甚远。5S rRNA二级结构的研究也说明很多古细菌与真核生物相似。　　第四节 真核细胞基本知识概要　　一、真核细胞的基本结构体系　　1.生物膜系统:以脂质及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统；　　2.遗传信息表达结构系统:以核酸（DNA或RNA）与蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统　　3.细胞骨架系统:由特异蛋白分子装配构成的细胞骨架系统。　　二、细胞的大小及其分析　　各类细胞直径的比较　　三、植物细胞与动物细胞的比较　　植物细胞特有的结构: 1. 细胞壁 2. 液泡 3. 叶绿体　　第三章 细胞生物学研究方法　　本章内容提要：　　第一节 细胞形态结构的观察方法　　第二节 细胞组分的分析方法　　第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术　　第一节 细胞形态结构的观察方法　　一、光学显微镜技术　　（一）普通光学显微镜　　? 1. 构成：　　? ①照明系统　　? ②光学放大系统　　? ③机械装置　　? 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。　　? 3. 分辨率：指分辨物体最小间隔的能力。　　（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope　　特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；　　有两个特殊的滤光片；　　照明方式通常为落射式。　　用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。　　（三）激光共聚焦扫描显微境　　Laser confocal scanning microscope, LCSM　　用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。　　能显示细胞样品的立体结构。　　分辨力是普通光学显微镜的3倍。　　用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。　　（四）相差显微镜　　? 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。　　? 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。　　? 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。　　原理　　用途：观察未经染色的玻片标本　　（五）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）　　? 1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。　　二、电子显微镜　　1、电子显微镜的基本知识　　电镜与光镜的比较　　显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理　　LM 200nm 可见光（400-700） 玻璃透镜 不要求真空 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化　　100nm 紫外光（约200nm) 玻璃透镜 不要求真空　　TEM 0.1nm 电子束（0.01-0.9） 电磁透镜 要求真空 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差　　2、 原理　　? 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。　　? 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。　　? 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。　　? 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。　　3、主要电镜制样技术　　? 1）超薄切片　　? 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。　　? 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。　　? 2）负染技术　　用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。　　3）冰冻蚀刻 freeze-etching　　? 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。　　三、扫描隧道显微镜　　scanning tunneling microscope，STM　　? 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。　　? 分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。　　? 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。　　第二节 细胞组分的分析方法　　一、离心分离技术　　用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物　　转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。　　转速>25kr/min，离心力>89Kg者称为超速离心机。　　目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。　　（一）差速离心 Differential centrifugation　　? 特点：　　– 介质密度均一；　　– 速度由低向高，逐级离心。　　? 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。　　? 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。　　? 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。　　（二）密度梯度离心　　? 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。　　? 类型：速度沉降（velocity sedimentation）、等密度沉降（isopycnic sedimentation）。　　? 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。　　? 分离活细胞的介质要求：　　– 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；　　– 2）PH中性或易调为中性；　　– 3）浓度大时渗透压不大；　　– 4）对细胞无毒。　　二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法　　?原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。　　Feulgen Staining　　三、特异蛋白抗原的定位与定性　　1、免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限　　2、蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot)　　3、免疫电镜技术：　　?免疫铁蛋白技术　　?免疫酶标技术　　应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等　　四、细胞内特异核酸的定位与定性　　?光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针）　　?电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）　　?PCR技术　　五、放射自显影技术　　1、原理及应用：　　?利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；　　?实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。　　2、步骤：　　?前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）　　———放射自显影　　六、定量细胞化学分析技术　　1、显微分光光度术（Microspectrophotometry）　　?利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。　　包括： 紫外光显微分光光度测定法　　可见光显微分光光度测定法　　? 流式细胞仪（Flow Cytometry）　　?主要应用：　　用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；　　测定细胞群体中不同时相细胞的数量；　　从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；　　分离DNA含量不同的中期染色体。　　第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术　　一、细胞的培养　　1、动物细胞培养　　（1） 类型：A 原代培养细胞（primary culture cell)---从机体取出后立即 培养的细胞。1-10代以内的细胞培养称为原代培养细胞。　　B 继代培养细胞（sub-culture cell）---适宜在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代培养细胞　　(2) 细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制.10~50代　　(3) 细胞系（cell line） 亚二倍体或非整倍体，接触抑制丧失，容易传代培养。50代以后。　　2、植物细胞　　（1）、 原生质体培养 （体细胞培养）　　（2）、单倍体细胞培养（花药培养）　　3、非细胞体系（cell-free system）：　　只来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质组成体系。　　二、细胞工程　　1、细胞工程：　　在细胞水平上有计划的保存、改变和创造细胞遗传物质，以产生新的物种和品系，或大规模培养组织细胞以获得生物产品。　　其所使用的技术主要是：细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合与显微注射。　　2、细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术　　? 用人工方法把同种或不同种的两个或两个以上的细胞，通过介导物作用，融合成一个细胞的技术。亦称细胞杂交（cell hybridization）　　? 同核融合细胞　　? 异核融合细胞　　3、单克隆抗体（monoclone antibody）技术　　单克隆抗体技术　　? 正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。　　第四章 细胞质膜与细胞表面　　第一节 细胞质膜与细胞表面特化结构　　第二节 细胞连接　　第三节 细胞外被与细胞外基质　　第一节 细胞质膜与细胞表面特化结构　　? 细胞膜(cell membrane)又称质膜（plasma membrane），是指围绕在细胞最外层，由脂质和蛋白质组成的生物膜。细胞膜只是真核细胞生物膜的一部分，真核细胞的生物膜（biomembrane）包括细胞的内膜系统（细胞器膜和核膜）和细胞膜（cell membrane）。　　一、细胞膜的结构模型　　1、结构模型　　1） 三明治质膜结构模型: E.Gorter和F．Grendel（1925）, 提出 “protein-lipid-protein”三夹板或三明治质膜结构模型，这一模型影响20年之久。　　2） 单位膜模型(unit membrane model)：J.D.Robertson（1959年），提出单位膜模型，大胆的推断所有的生物膜都是由蛋白质-脂类-蛋白质单位膜构成，在电镜下观察，细胞膜显示出 暗---亮----暗三条带，两侧的暗带的厚度约2nm, 推测是蛋白质，中间的亮带厚度约3.5nm，推测是脂双层分子。整个膜的厚度约是7.5nm。　　3） 流动镶嵌模型(fluid mosaic model)： S.J.Singer和G.Nicolson（1972），提出生物膜的流动镶嵌模型(fluid mosaic model)，这种模型认为细胞膜是由脂质双分子层组成，蛋白质以不同的方式，镶嵌，覆盖或横跨双分子层。流动镶嵌模型强调了，a 膜的流动性，b 膜蛋白分布的不对称性。　　4） 脂筏模型（lipid rafts model）： K.Simons et al(1997)，提出了脂筏模型（lipid rafts model）Functional rafts in Cell membranes. Nature 387:569-572。　　2、生物膜结构　　目前对生物膜结构的认识可以归纳如下:　　1）磷脂双分子层是组成生物膜的基本结构成分,尚未发现膜结构中起组织作用的蛋白；　　2）蛋白分子以不同方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面, 膜蛋白是赋予生物膜功能的主要决定者；　　3）生物膜可以看成是蛋白质在双层脂分子的二维溶液。　　二、生物膜的组成成分　　（一）、膜脂成分：膜脂主要包括磷脂、糖脂和胆固醇三种类型。　　? 1、磷脂：1）膜脂的基本成分（50％以上）　　? 2）分为二类: a 甘油磷脂（磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇）　　? b 鞘磷脂　　? 3) 主要特征：①具有一个极性头和两个非极性的尾(脂肪酸链) （心磷脂除外）；　　? ②脂肪酸碳链为偶数,多数碳链由16,18或20个组成；　　? ③既具有饱和脂肪酸(如软脂酸)又有不饱和脂肪酸(如油酸)；　　? 2、糖脂：糖脂普遍存在于原核和真核细胞的质膜上（5％以下）,神经细胞糖脂含量较高；　　? 3、胆固醇： 1）胆固醇存在于真核细胞膜上（30%以下），细菌质膜不含有胆固醇，但某些细菌的膜脂中含有甘油脂等中性脂类。　　? 2）胆固醇的作用：　　? ① 调节膜的流动性；　　? ② 增加膜的稳定性；　　? ③ 降低水溶性物质的通透性。　　（二）、膜脂的运动方式　　? 1、侧向运动： 沿膜平面的侧向运动（基本运动方式）　　? 2、自旋运动： 脂分子围绕轴心的自旋运动；　　? 3、 摆 动： 脂分子尾部的摆动；　　? 4、 翻转运动：双层脂分子之间的翻转运动，发生频率还不到脂分子侧向交换频率的　　? 10－10。但在内质网膜上,新合成的磷脂分子翻转运动发生频率很高。�　　? 1、定义：脂质体是根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的人工膜。　　三、膜蛋白　　（二）、膜内在蛋白与膜脂结合的方式　　1、膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子的疏水核心的相互作用。　　2、跨膜结构域两端携带正电荷的氨基酸残基与磷脂分子带　　负电的极性头形成离子键，或带负电的氨基酸残基通过Ca2+、Mg2+等阳离子与带负电的磷脂极性头相互作用。　　3、某些膜蛋白在细胞质基质一侧的半胱氨酸残基上共价结合脂肪酸分子,插入脂双层之间,进一步加强膜蛋白与脂双层的结合力,还有少数蛋白与糖脂共价结合。　　（三）、去垢剂　　1、定义：去垢剂是一端亲水、另一端疏水的两性小分子,是分离与研究膜蛋白的常用试剂。　　四、膜的流动性(sk)　　（一）、膜脂的流动性　　膜脂的流动性主要由　　1 脂分子本身的性质决定的,脂肪酸链越短, 不饱和程度越高,膜脂的流动性越大。　　2 温度对膜脂的运动有明显的影响。　　3 在细菌和动物细胞中常通过增加不饱和脂肪酸的含量来调节膜脂的相变温度以维持膜脂的流动性。　　4 在动物细胞中，胆固醇对膜的流动性起重要的双向调节作用。　　（二）、 膜蛋白的流动�　　荧光抗体免疫标记实验�成斑现象(patching)或成帽现象(capping) �　　（三）、膜的流动性受多种因素影响；细胞骨架不但影响膜蛋白的运动，也影响其周围的膜脂的流动。膜蛋白与膜脂分子的相互作用也是影响膜流动性的重要因素　　荧光抗体免疫标记实验　　（二）、膜脂与糖脂的不对称性�　　? 膜脂的不对称性：指同一种膜脂分子在膜的脂双层中呈不均匀分布；　　? 糖脂的不对称性：糖脂分子仅存在于质膜的ES面，是完成其生理功能的结构基础

目录 1 拼音 2 英文参考 3 人类免疫缺陷病毒生物学诊断 3.1 形态结构 3.2 基因结构及编码蛋白的功能 3.3 培养特性 3.4 抵抗力 4 病毒性与免疫性 4.1 传染源和传播途径 4.2 致病机制 4.3 免疫性 5 微生物学诊断 5.1 抗体检测 5.2 抗原检测 5.3 核酸检测 5.4 病毒分离 1 拼音 rén lèi miǎn yì quē xiàn bìng dú 2 英文参考 HIV 3 人类免疫缺陷病毒生物学诊断 3.1 形态结构 病毒呈球形，直径100～120nm，电镜下可见一致密的圆锥状核心，内含病毒RNA分子和酶（逆转录酶、整合酶、蛋白酶），病毒外层囊膜系双层脂质蛋白膜，其中嵌有gp120和gp41，分别组成刺突和跨膜蛋白。囊膜内面为P17蛋白构成的衣壳，其内有核心蛋白（P24）包裹RNA。 3.2 基因结构及编码蛋白的功能 HIV基因组长约9.2～9.7kb，含gag、Pol、env、3个结构基因，及至少6个调控基因（Tat Rev、Nef、Vif、VPU、Vpr）并在基因组的5′端和3′端各含长末端序列（图302）。HIV LTR含顺式调控序列，它们控制前病毒基因的表达。已证明在LTR有启动子和增强子并含负调控区。 1．gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白（P55），经蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。 2．Pol基因编码聚合酶前体蛋白（P34），经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。 3．env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原决定簇，已证明HIV中和抗原表位，在gp120 V3环上，V3环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明gp41亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。 4．TaT 基因编码蛋白（P14）可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译。 5．Rev基因产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序(CisActing repression sequance,Crs) 去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白。 6．Nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于HIv cDNA的LTR，抑制整合的病毒转录。可能是HIV在体内维持持续感集体所必需。 7．Vif基因对HIV并非必不可少，但可能影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播。 8．VPU基因为HIV1所特有，对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。 9．Vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。 HIV2基因结构与HIV1有差别：它不含VPU基因，但有一功能不明VPX基因。核酸杂交法检查HIV1与HIV2的核苷酸序列，仅40%相同。env基因表达产物激发机体产生的抗体无交叉反应。 3.3 培养特性 将病人自身外周或骨髓中淋巴细胞经PHA *** 48～72小时作体外培养（培养液中加IL2）1～2周后，病毒增殖可释放至细胞外，并使细胞融合成多核巨细胞，最后细胞破溃死亡。亦可用传代淋巴细胞系如HTH9、Molt4细胞作分离及传代。 HIV动物感染范围窄，仅黑猩猩和长劈猿，一般多用黑猩猩做实验。用感染HIV细胞或无细胞的HIV滤液感染黑猩猩，或将感染HIV黑猩猩血液输给正常黑猩猩都感染成功，边续8个月在血液和淋巴液中可持续分离到HIV，在3～5周后查出HIV特异性抗体，并继续维持一定水平。但无论黑猩猩或长臂猿感染后都不发生疾病。 3.4 抵抗力 HIV对热敏感。56℃30min灭活，但在室温保存7天，仍保持活性。不加稳定剂病毒70℃冰冻失去活性，而35%山梨醇或50%胎牛血清中70℃冰冻3个月仍保持活性。对消毒剂和去污剂亦敏感，0.2%次氯酸钠0.1%漂白粉，70%乙醇，35%异丙醇、50%乙醚、0.3%H2O20.5%来苏尔处理5′能灭活病毒，1%NP40和0.5%tritonX100能灭活病毒而保留抗原性。外紫外线、γ射线有较强抵抗力。 4 病毒性与免疫性 4.1 传染源和传播途径 HIV感染者是传染源，曾从血液、 *** 、 *** 分泌液、眼泪、乳汁等分离得HIV。传播途径有： 1．性传播：通过男性同性恋之间及异性间的性接触感染。 2．血液传播：通过输血、血液制品或没有消毒好的注射器传播，静脉嗜毒者共用不经消毒的注射器和针头造成严重感染，据我国云南边镜静脉嗜毒者感染率达60%。 3．母婴传播：包括经胎盘、产道和哺乳方式传播。 4.2 致病机制 HIV选择性地侵犯带有CD4分子的，主要有T4淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等。细胞表面CD4分子是HIV受体，通过HIV囊膜蛋白gp120与细胞膜上CD4结合后由gp41介导使毒穿入易感细胞内，造成细胞破坏。其机制尚未完全清楚，可能通过以下方式起作用： 1．由于HIV包膜蛋白插入细胞或病毒出芽释放导致细胞膜通透性增加，产生渗透性溶解。 2．受染细胞内CDgp120复合物与细胞器（如高尔基氏体等）的膜融合，使之溶解，导致感染细胞迅速死亡。 3．HIV感染时未整合的DNA积累，或对细胞蛋白的抑制，导致HIV杀伤细胞作用。 4．HIV感染细胞表达的gp120能与未感染细胞膜上的CD4结合，在gp41作用下融合形成多核巨细胞而溶解死亡。 5．HIV感染细胞膜病毒抗原与特异性抗体结合，通过激活补体或介导ADCC效应将细胞裂解。 6．HIV诱导自身免疫，如gp41与T4细胞膜上MHCⅡ类分子有一同源区，由抗gp41抗体可与这类淋巴细胞起交叉反应，导致细胞破坏。 7．细胞程序化死亡（programmed cell death ）：在爱滋病发病时可激活细胞凋亡 (Apoptosis) 。如HIV的gp120与CD4受体结合；直接激活受感染的细胞凋亡。甚至感染HIV的T细胞表达的囊膜抗原也可启动正常T细胞，通过细胞表面CD4分子交联间接地引起凋亡CD 4细胞的大量破坏，结果造成以T4细胞缺损为中心的严重免疫缺陷，患者主要表现：外周淋巴细胞减少，T4/T8比例配置，对植物血凝素和某些抗原的反应消失，迟发型变态反应下降，NK细胞、巨噬细胞活性减弱，IL2、γ干扰素等细胞因子合成减少。病程早期由于B细胞处于多克隆活化状态，患者血清中lg水平往往增高，随着疾病的进展，B细胞对各种抗原产生抗体的功能也直接和间接地受到影响。 爱滋病人由于免疫功能严重缺损，常合并严重的机会感染，常见的有细胞（鸟分枝杆菌）、原虫（卡氏肺囊虫、弓形体）、真菌（白色念珠菌、新型隐球菌）、病毒（巨细胞病毒、单纯疱疹病毒，乙型肝炎病毒），最后导致无法控制而死亡，另一些病例可发生Kaposis肉瘤或恶性淋巴瘤。此外，感染单核巨噬细胞中HIV呈低度增殖，不引起病变，但损害其免疫功能，可将病毒传播全身，引起间质肺炎和亚急性脑炎。 HIV感染人体后，往往经历很长潜伏期（3～5年或更长至8年）才发病，表明HIV在感染机体中，以潜伏或低水平的慢性感染方式持续存在。当HIV潜伏细胞受到某些因素 *** ，使潜伏的HIV激活大量增殖而致病，多数患者于13年内为死亡。 4.3 免疫性 HIV感染后可 *** 机体生产囊膜蛋白（Gp120,Gp41）抗体和核心蛋白（P24）抗体。在HIV携带者、爱滋病病人血清中测出低水平的抗病毒中和抗体，其中爱滋病病人水平最低，健康同性恋者最高，说明该抗体在体内有保护作用。但抗体不能与单核巨噬细胞内存留的病毒接触，且HIV囊膜蛋白易发生抗原性变异，原有抗体失去作用，使中和抗体不能发的应有的作用。在潜伏感染阶段，HIV前病毒整合入宿主细胞基因组中，不被免疫系统识别，逃避免疫清除。这些都与HIV引起持续感染有关。 5 微生物学诊断 检测HIV感染者体液中病毒抗原和抗体的方法，操作方便，易于普及应用，其中抗体检测尤普通。但HIv P24抗原和病毒基因的测定，在HIV感染检测中的地位和重要性也日益受到重视。 5.1 抗体检测 主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验（IFA）。ELISA用去污剂裂解HIV或感染细胞液提取物作抗原，IFA用感染细胞涂片作抗原进行抗体检测，如果发现阳性标本应重复一次。为防止假阳性，可做Western blot （WB，蛋白印迹法）进一步确证。 WB法是用聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV蛋白进行分离，再经传移电泳将不同蛋白条带转移于硝酸纤维膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶标抗体染色，就能测出针对不同结构蛋白抗体，如抗gp120、gp41、P24抗体，特异性较高。 5.2 抗原检测 用ELISA检测P24抗原,在HIV感染早期尚未出现抗体时,血中就有该抗原存在.由于P24量太少,阳性率通常较低。现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原，来提高敏感性。 5.3 核酸检测 用PCR法检测HIV基因，具有快速、高效、敏感和特异等优点，目前该法已被应用于HIV感染早期诊断及艾滋病的研究中。 5.4 病毒分离 常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA *** 并培养后，加入病人单个核细胞诊断及艾滋病的研究中。

生物与环境当然紧密联系。环境好了，地球更适合人类生存。给你看一篇我比较感兴趣的，生物与地球的关系学习吧地球与生物学 一、地球生物学（Geobiology）形成背景 Geobiology是伴随着新技术的发展和一些大型计划如大洋钻探计划（ODP）和人类基因组计划（HGP）等一系列新发现而产生的新领域，人们开始重新审视传统的理论模式，提出新的理论框架，在新的理论框架下，提出了新的单一学科难以解决的科学问题。这要求科学家拓宽思路，从新的视角—既地球科学和生命科学交叉、整合来进行研究。二、地球生物学（Geobiology）的研究方向 Geobiology运用新技术和新方法，从新的理论、新的视角给一些传统学科注入了生机与活力。Geobiology研究方向包括以下9个方面： 1.生命的起源和演化（Origins and evolution of life）；2.大气圈、水圈和生物圈的演化（Evolution of the atmosphere, hydrosphere and biosphere）；3.地球演化关键转折期沉积岩石记录和生物（The sedimentary rock record and geobiology of critical intervals）；4.古生物学和演化生态学（Paleobiology and evolutionary ecology）；5.环境地微生物学（Environmental microbiology）；6.生物地球化学和全球元素循环（Biogeochemistry and global elemental cycles）；7.微生物－矿物相互作用（Microbe-mineral interactions）；8.生物标志物（Biomarkers）；9.分子生态学和谱系演化（Molecular ecology and phylogenetics）。三、地球生物学（Geobiology）主要研究领域（一）地生理学（Geophysiology）1.生物和大气的相互作用，如由生物活动产生的气体；2.生物水圈和冰圈的相互作用，如海洋营养机制、极端环境、生物矿化作用；3.生物－土壤/沉积物相互作用，如生物侵蚀、深部生物圈、地微生物学等。（二）生命演化与环境（Evolution of Life and Environment） 1.生物圈的形成，如生命的起源、生物圈的建立1）实验模拟――聚合物复制、有机化合物分馏、能量来源、代谢演化路径；2）寻找简单的有机复制聚合体；3）从原始的有机溶液向以RNA为基础的生命形式的转变；4）陨石中的证据；光合作用产生氧气引起的大气圈的改变；5）厌氧状态中微生物呼吸所利用和建立的条件；上述过程中的化石记录证据，有机化合物（生物标记物）和同位素的地球化学记录。2.生物圈的演化，如大气氧的富集、雪球地球的形成、生物环境效应。主要研究由光合作用引起的氧化作用；由碳分馏造成的同位素印迹；晚新元古代冰川作用对早期后生动物辐射的影响；雪球事件；由微生物起始，继而是后生植物的陆生生物；生物建立起适合自身的反馈环。3.突变事件，如生物绝灭及辐射，极端环境事件。对经典剖面进行高分辨率研究，探索生物演化历史上这些重大事件的起因和结果；以中－美化石记录的优势展示生命演化的五个关键转折时期：新元古代、二叠纪－三叠纪，中生代现代陆地生态系的起源；新生代哺乳动物的演化；更新世气候的变化（三）全球变化的地球生物学（Geobiology of Global Change） 主要研究全球碳循环、化石燃料；全球变化和生物与环境的相互作用，生物对全球变化的反馈，生物对地表过程（包括大气）的影响，了解地球过程为解释其他星球上可能的生命证据提供科学基础，地生物学用于寻找地外生命。四、分子水平上的地球生物学 在分子水平上研究地球生物学的意义在于能为宏体生物和地质分析提供补充、对传统的假设提供独立的验证、提供遗传学、生理学和生态学信息、有利于进行定量的高分辨率的研究及富含有大量机制和过程的信息。应用于分子水平地学生物学研究的材料主要来源于1.古代材料：富含有机质的沉积物；特异埋藏的化石；2.现代生物：具有地质意义的现代生物及分子，如分子生物钟、活化石、微生物。研究对象为起结构支撑作用的高分子聚合物、新陈代谢的脂类分子、氨基酸、蛋白质和核酸(DNA和RNA)。研究技术与方法：1.有机地球化学的方法，采用GC-PY, NMR, GC-MS的方法萃取、分离和甄别有机化合物；2.同位素地质学，利用GC-C-IRMS检测单分子有机化合物的同位素；3.分子生物学，利用独立培养的方法对DNA进行萃取、分离和PCR扩增；通过克隆进行分子测序。 通过现代生命科学的技术和手段，我们可以获得遗传学鉴定、系统关系、遗传机制和基因组信息；通过地球科学的方法和手段，可以研究古生物的种类、其生物化学途径及稳定分子和同位素的信息。古DNA研究是联系古代和现代生物的纽带，并提供绝灭生物独一无二的古代生物遗传学信息。古DNA是理解谱系演化和遗传学的关键，既可达到地球科学与生命科学间信息互补。五、目前该领域科学家共同关注的科学问题 1.不同环境微生物的丰度、分异度和分布；2.微生物和它们的生物化学过程是如何影响生物侵蚀、生物修复、生物矿化及有机分子和同位素信息的保存；3.微生物以什么方式改变着不同圈层的环境化学特性，这些信息如何以分子和同位素的方式保存在地质记录中；4.基因是以什么方式影响着生物合成和代谢途径，在地质历史时期，我们如何检测这种影响；5.这些基因和蛋白质水平的生化功能如何影响地球演化进程、改变环境从而有利于资源富集。

水是生命的源泉。人对水的需要仅次于氧气。人如果不摄入某一种维生素或矿物质，也许还能继续活几周或带病活上若干年，但人如果没有水，却只能活几天。 　　人体细胞的重要成分是水，水占成人体重的60~70%，占儿童体重的80%以上。水份有什么作用呢？ 　　1.人的各种生理活动都需要水，如水可溶解各种营养物质，脂肪和蛋白质等要成为悬浮于水中的胶体状态才能被吸收；水在血管、细胞之间川流不息，把氧气和营养物质运送到组织细胞，再把代谢废物排出体外，总之人的各种代谢和生理活动都离不开水。 　　2.水在体温调节上有一定的作用。当人呼吸和出汗时都会排出一些水分。比如炎热季节，环境温度往往高于体温，人就靠出汗，使水分蒸发带走一部分热量，来降低体温，使人免于中暑。而在天冷时，由于水贮备热量的潜力很大，人体不致因外界温度低而使体温发生明显的波动。 　　3.水还是体内的润滑剂。它能滋润皮肤。皮肤缺水，就会变得干燥失去弹性，显得面容苍老。体内一些关节囊液、浆膜液可使器官之间免于摩擦受损，且能转动灵活。眼泪、唾液也都是相应器官的润滑剂。 　　4.水是世界上最廉价最有治疗力量的奇药。矿泉水和电解质水的保健和防病作用是众所周知的。主要是因为水中含有对人体有益的成分。当感冒、发热时，多喝开水能帮助发汗、退热、冲淡血液里细菌所产生的毒素；同时，小便增多，有利于加速毒素的排出。 　　5.大面积烧伤以及发生剧烈呕吐和腹泻等症状，体内大量流失水分时，都需要及时补充液体，以防止严重脱水，加重病情。　 　　6.睡前喝一杯水有助于美容．上床之前，你无论如何都要喝一杯水，这杯水的美容功效非常大。当你睡着后，那杯水就能渗透到每个细胞里。细胞吸收水分后，皮肤就更娇柔细嫩。 　　7.入浴前喝一杯水常葆肌肤青春活力．沐浴前一定要先喝一杯水。沐浴时的汗量为平常的两倍，体内的新陈代谢加速，喝了水，可使全身每一个细胞都能吸收到水分，创造出光润细柔的肌肤。 　　8 需要指出的是，对老人和儿童来说，自来水煮沸后饮用是最利于健康的，目前市场上出售的净水器，净化后会降低水内的矿物质，长期饮用效果并不如天然水源。 　　9水在生物体中存在形式关于地球上的生命究竟是如何诞生的，至今没有一个公认的令人信服的说法，这就给生命的源头蒙上了一层神秘的色彩。 当然，要弄清楚地球生命的起源，就非常有必要知道地球是如何演化的，其中与生命尤为相关的便是大气，因为是它为生命的出现创造了必要的条件。 地球大气的演进可以分为三个阶段：第一代大气即原始大气在地球演化的初期就消失了；第二代大气是被地球内部物理化学反应挤压出来的，称为还原大气。还原大气的显著特征便是缺氧，只是由于后来出现了植物，植物的光合作用提供了大量的氧气，才使得还原大气变成了以氮、氧为主的现代大气，即氧化大气。据此，科学家们推测，在35亿年之前，地球上就已经出现了生命。 推测终归是推测，地球生命起源依然是一个悬而未决的问题。现在，可以肯定地认为，大约在40亿年前，地球上只有岩五和水，地表温度很高，缺氧的大气使来自太阳的紫外线可以畅通无阻地射到地表，而紫外线具有相当强的化学活性，它是生命形成的催化物。诸多关于生命起源的假说就是从这里开始的。 1924年，被誉为世界研究生命起源的先驱。苏联生物学家奥巴林在他的《生命起源》一书中把生命起源的历史分为三个阶段：有机物产生；氨基酸、高分子聚合物形成；具有新陈代谢机能的蛋白质产生。奥巴林认为，生命发生的可能过程应为蛋白质分子一分子团团聚体，团聚体内部结构的完善可以导致原始生命的出现，并最终产生结构、功能复杂的生命单体。先是原始单细胞生物，然后向两个方向进化：一是自养能力强化而运动功能退化，进化至单细胞菌藻类植物，成为植物界进化的源头；另一方向则是运动功能强化而自养功能退化，进化至单细胞原生动物，成为动物界进化的源头。 奥巴林的生命起源假说拥有很大一批追随者，其中不乏闻名于世的身体力行者。20世纪50年代，美国人米勒开创了生命起源模拟实验的先河。1953年，米勒依据奥巴林的假说，着手开始了原始大气模拟实验。他把甲烷、水蒸汽、氨、氧气的混合物装在一个完全密闭的装置内，让它们循环流经一个模拟太阳紫外线辐射的电弧。在历经一周的连续放电之后，密闭装置内产生了甘氨酸、丙氨酸等11种氨基酸，其中有4种氨基酸存在于天然蛋白质中。米勒实验的成功给了后来者极大的鼓舞，此后，世界各国科学家纷纷投身于寻找生命源头的研究中。1959年，德国科学家格罗特和维斯霍夫设计了一个用紫外线代替放电的实验，同样得到了氨基酸；1961年，美国的生物化学家奥洛把氰化物加入实验混合物中，得到了很多种氨基酸及一些短链的肽，还制成了一种重要的生命物质一瞟吟；1962年，奥洛又制成了核糖和脱氧核糖；1963年，美国人波南佩鲁马做了同米勒相似的实验，他用电子作能源，制成了腺瞟吟；接着，他又和同事们一起在紫外线的作用下，制成了腺膘吟校普。到了周世纪70年代，组成蛋白质的20种氨基酸已能够全部通过人工模拟自然条件的方法合成。奥巴林假说中关于生命起源的有机物产生阶段已多次为实验所证实，大的分歧出现在蛋白质与生命物质产生阶段。在奥巴林生命起源假说中，海水是不可或缺的，它被认为是生命的摇篮。奥巴林派坚持认为，如果没有原始海洋，有机物质难以储存聚集，最终形成有自我复制功能的生命单体。 但是，美国生物化学家福克斯却不这样认为，1960年，他提出了另一种生命起源的假说一类蛋白微球体假说。福克斯认为，早期的地球温度很高，依靠热能就足以使简单的化合物形成复杂的化合物。为了证明自己的假说，早在1955年，福克斯就开始进行实验。他把各种氨基酸的混合物加热到200℃，3小时后，它们形成了形似蛋白质的分子链，被称为类蛋白。1960年，福克斯又把酸性类蛋白放人稀酸中加热溶解，冷却后缩结成团，形成微球体。在光学显微镜下，福克斯发现这种微球体很像细菌，并且在特定处理后还能出芽，芽长大后能脱落下来；小球还能分裂，一分为二或者彼此连成长串。 福克斯的类蛋白微球体假说否定了生命发生对原始海洋的依赖，因而被称为“陆相起源派”。科学历来具有极大的包容性，多年以来，奥巴林派与福克斯派长期致力于发展完善各自的理论，其间并无多少争论。在数十亿年前，什么样的事情都有可能发生，而今天的人类只能在想象中追寻昔日的印迹，追寻原始生命发生的轰轰烈烈的景象。奥巴林派与福克斯派的学术价值都得到了同样的认可，团聚体和微球体都被看成是生命发生过程中的原始细胞模型。 在“海纳百川，有容乃大”的科学精神的鼓舞下，近年来，关于地球生命起源的假说纷起林立，比较著名的有“火山学派”与“外来生命学派”。福克斯的“类蛋白微球体”迄今在自然界尚未被发现，而有生命的类病毒却可以在自然界发现。类病毒的前导物质为单质磷酸，科学家在研究火山气体时发现其中含有单质磷酸复合形成的大分子磷酸。据此，“火山学派”认为，由于火山爆发生成了大量大分子磷酸，这种物质溶入海水，成为地球生命之源。有一件事可以佐证“火山学派”的结论。1977年，海洋学专家柯利斯在太平洋底考察海底火山时无意中发现，在沸腾的火山岩浆喷口周围活跃着形形色色的生命形态，有鞋底大小的蛤，也有肝达近两米的大管虫。这时，一个奇思妙想在他的脑海中产生：地球上的生命很可能就是在这样的条件下催生的，因为在地球形成生命的初期，地球的环境也是相当恶劣的，许多地方都很类似于海底火山四周围的环境。柯利斯的发现及假设并未引起足够的重视，从未有过科学家真正去认真地加以验证。绝大多数探索生命源头的人都不会相信，生命是在滚烫有毒的环境中诞生的。直到最近几年，才有一些科学家开始挽起袖口验证热液出口是否有发生生化反应的可能性。试验结果表明，那些炙热的、甚至含有大量有毒物质的热液喷口处果真有早期生命产生所必需的化学变化。1996年8月，美国基因组研究所的科学家宣称，他们解开了当初由柯利斯提出的作为生命第三分支（另两种为细菌与真核细胞）而存在的一种原始生物杨氏产甲烷球菌的1700个基因密码。杨氏产甲烷球菌生活在太平洋洋底2623米水深的一座火山口的边沿上，其生活不受阳光的影响，而且不以有机碳作为食物源。它靠火山口排放出的二氧化碳、氮和氢为生，释放甲烷。研究人员从这种微生物中抽取了生命体中最重要的生命物质DNA。科学家认为，这种微生物可能是原始生命最早的形式，还可能是外星上最有可能存在的生命形式。行不?

随着后基因组计划的进行，近年来已衍生出许多新的名词和概念，对它们的领会有助于我们更好地理解今后该领域的进展。1、功能基因组学是基因组时代的核心和焦点。其所要解决的问题包括如何识别基因组组成元素及注释重要元素的功能。已经知道，蛋白质是生命状态的直接体现。与低等生物不同的是，人类基因序列中只有约5%的序列是编码区（指导合成蛋白质），这部分基因组元素被称为"开放阅读框架（ORF）"，预测所有ORF并研究其产物功能是当前功能基因组学的首要任务；另95%以上的序列是基因的调控序列，这部分元素被称作非编码区，其中有很多是具有生物学功能意义的片段，对于了解各相关基因之间的调控关系非常重要，因此，对非编码区的功能研究将是功能基因组学的下一步研究热点。以下一些概念有的是在进行功能基因组学研究的过程中所运用的方法和技术。2、生物信息学人类和各种模式生物的基因组序列汇成如潮水般的DNA信息量。利用这些生物学数据和计算机技术，对这些基因组资料进行大规模比较，寻找其最大相似性（同源性），或搜索序列上的局部特征，或研究由同一个祖先基因特化而来的对应基因，或用进化分析方法，从而能够鉴定和预测未知的ORF或非编码区各元件的生物学功能。方法包括最大序列相似性搜索和序列摸体搜索、进化印迹搜索等。3、比较基因组学基因组的各个基因及其产物之间互相关联，互相作用。对同一物种不同个体的基因组进行比较，以及对不同物种的基因组进行比较，不仅可以揭示生命的起源、进化等重大生物学问题，还具有潜在的实用价值。例如通过细菌和人类的基因组比较研究，有可能筛选出只在细菌中存在的基因，成为新的抗菌素的药靶。4、结构基因组学即借助计算机技术，模拟出未知基因的蛋白质产物的立体结构，从而根据结构与功能的关系进行预测，还可以深入探求蛋白质为何具有特定的生物学功能。结构类识别的方法包括晶体衍射法、"穿线"法、三维模体搜索法等。目前蛋白质数据库每年可得到2000-3000个蛋白质的数据。5、蛋白质组学蛋白质随发育阶段、特定组织甚至所处环境的变迁而变化，反映了蛋白质后加工等作用，蕴藏着巨大的动态的生命活动信息量。基因序列分析难以处理的没有任何可比较序列的"孤儿"基因，有望从蛋白质组的表达变化规律中找到其生物学功能的线索，进而揭示出其在整个功能网络中的地位。蛋白质组的核心技术包括质谱分析技术。6、整体生物学是后基因组学研究的高层次发展。孤立研究某个基因组成分或其产物的功能常常难以说明问题，必须确定其在生物学功能网络上的地位，例如将其纳入生化途径中才能体现其完整的生物学功能。在这方面，国外已经建立了大肠杆菌等5种基因组全序列已测定的微生物的20种氨基酸的代谢图谱。7、DNA芯片这里是指包被在固相载体上的用于DNA高密度微点阵杂交技术。它是微电子学和分子生物学结合产生的新技术。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。可用于DNA序列测定、基因表达分析、基因分型、基因多态性分析、疾病的诊断、突变分析、药物筛选和微生物的鉴定等（祥见下文）。8、基因敲除利用小鼠胚胎干细胞，在体外改变其基因后再生出来带某个突变基因的小鼠，比较突变小鼠与正常小鼠的表型差别，从而鉴定该基因的功能。目前利用带抗性基因标记的载体插入小鼠染色体的方法，可提供大量的各种基因突变的小鼠胚胎干细胞。9、药物基因组学这是后基因组提出的一项重要课题。研究的主要内容是人的基因多型性或变异性是如何影响药物效果和安全性的。人们早已发现，同一种药物以同一剂量标准用药，不同个体会产生不同的效果和副作用，这与个体间基因的差别密切相关。目前已开始鉴定那些与药物分布、活化、作用、代谢以及消失有关的基因及其变异的情况。这些研究将使病人治疗前的基因检测成为现实，根据检测结果因人施药，提供不同的既安全又有效的药物，这潜藏着巨大的社会效益。

基因组（GENOME）一词是1920年Winkles从GENes和chromosOEs铸成的，用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念（解涛等，2000）。1953年Watson和Crick发现DNA 双螺旋结构，标志分子生物学的诞生，随着各学科的发展，当前生物学研究进入新的时代，在生物大分子水平上将不同的研究技术和手段有机的结合以攻克生物学难题。基因组可以理解为：一，基因表达概况研究，即比较不同组织和不同发育阶段、正常状态与疾病状态，以及体外培养的细胞中基因表达模式的差异，技术包括传统的RT-PCR，Rnase保护试验，RNA印迹杂交。但是其不足是一次只能做一个，新的高通量表达分析方法包括微点阵（Microarrary），基因表达序列分析（serial analysis of gene expression, SAGE），DNA芯片（DNA chip）等；二，基因产物-蛋白质功能研究，包括单个基因的蛋白质体外表达方法，主要是利用DNA 重组技术，以及蛋白质组研究；三，蛋白质与蛋白质相互作用的研究，利用酵母双杂交系统，单杂交系统（one-hybrid system），三杂交系统(three-hybrid system)以及反向杂交系统(reverse hybrid system). 1986年美国科学家Thomas Roderick提出了基因组学（Genomics），指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学（李伟等，2000）。因此，基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学（structural genomics）和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学（functional genomics)，又被称为后基因组（postgenome）研究（李子银等，2000）。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息相同地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法及统计计算机分析为特征。（参考资料：http://www.newcorn.com.cn/lunwen/jiyinzuxue-duan.htm

1、原理：Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。2、应用：（1）遗传病诊断；（2）DNA图谱分析；（3）检测样品中的DNA及其含量：先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片段长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。（4）PCR产物分析。扩展资料Southern印迹杂交技术的过程：Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。参考资料来源：百度百科-Southern印迹杂交技术

DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 Northern印迹杂交（Northern blot），是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2"-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。 Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 （不知道这个是不是你所提到的亲和鉴定？）将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 双脱氧末端终止测序法：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5"端，以双脱氧碱基为3"端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3"端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序

　　李宝键教授在“展望21世纪的生命科学”一文中谈到基因组研究计划研究重要性时，引用《Scinence》上“第三次技术命革”中的一句话：“下一个传大时代将是基因组革命时代，它正处于初期阶段。”在当前的研究水平上，只要涉及生命体重要现象的课题，几乎离不开对基因及其作用的分析。2000年6月26日，英美两国首脑会同公私两大人基因组测序集团向世人正式宣告，人基因组的工作草图已绘制完成。科学家把这作为生命科学进入新时代的标志，即后基因组时代(post-genome era)。因此有必要对基因组及其研究内容和进展作一个了解。　　1基因组学及其研究内容ue004　　基因组(GENOME)一词是1920年Winkles从GENes和chromosOMEs组成的，用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构，标志分子生物学的诞生，随着各学科的发展，当前生物学研究进入新的进代，在生物大分子水平上将不同的研究技术和手段有机的结合以攻克生物学难题。ue004　　基因组研究可以理解为：(1)基因表达概况研究，即比较不同组织和不同发育阶段、正常状态与疾病状态，以及体外培养的细胞中基因表达模式的差异，技术包括传统的RTPCR，RNase保护试验，RNA印迹杂交，但是其不足是一次只能做一个。新的高通量表达分析方法包括微点阵(microarrary)，基因表达序列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)，DNA芯片(DNA chip)等；(2)基因产物-蛋白质功能研究，包括单个基因的蛋白质体外表达方法，以及蛋白质组研究；(3)蛋白质与蛋白质相互作用的研究，利用酵母双杂交系统，单杂交系统(one-hybrid sys　tem)，三杂交系统(thrdee-hybrid system)以及反向杂交系统(reverse hybrid system)等。　　1986年美国科学家Thomas Roderick提出了基因组学(Genomics)，指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱)，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。因此，基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc　tural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。随着1990年人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的实施并取得巨大成就，同时模式生物(model organisms)基因组计划也在进行，并先后完成了几个物种的序列分析，研究重心从开始揭示生命的所有遗传信息转移到从分子整体水平对功能的研究上。第一个标志是功能基因组学的产生，第二个标志是蛋白质组学(proteome)的兴起。　　2 结构基因组学研究内容ue004　　结构基因组学(structural genomics)是基因组学的一个重要组成部分和研究领域，它是一门通过基因作图、核苷酸序列分析确定基因组成、基因定位的科学。遗传信息在染色体上，但染色体不能直接用来测序，必须将基因组这一巨大的研究对象进行分解，使之成为较易操作的小的结构区域，这个过程就是基因作图。根据使用的标志和手段不同，作图有三种类型，即构建生物体基因组高分辨率的遗传图谱、物理图谱、转录图谱。　　2.1遗传图谱　　通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。绘制遗传连锁图的方法有很多，但是在DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)；80年代后出现的有STR(短串联重复序列，又称微卫星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷酸的多态性)分析。　　2.2物理图谱　　物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离［碱基对(bp)或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)的图谱。以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂交，使每隔100kb就有一个标志；二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：首先是构建数百kb的YAC(酵母人工染色体)，对YAC进行作图，得到重叠的YAC连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个kb的DNA片段水平上进行，将YAC随机切割后装入粘粒的作图称为高精度物理作图.　　2.3转录图谱ue004　　利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱被称为转录图谱。通过从cDNA文库中随机条区的克隆进行测序所获得的部分 cDNA的5＇或3＇端序列称为表达序列标签(EST)　，一般长300～500bp左右。一般说，mRNA的3＇ 端非翻译区(3＇-UTR)是代表每个基因的比较特异的序列，将对应于3＇-UTR的EST序列进行RH定位，即可构成由基因组成的STS图。截止到1998年12月底，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中分布的植物EST的数目总和已达几万条，所测定的人基因组的EST达180万条以上。这些EST不仅为基因组遗传图谱的构建提供了大量的分子标记，而且来自不同组织和器官的EST也为基因的功能研究提供了有价值的信息。此外，EST计划还为基因的鉴定提供了候选基因(cand　idantes)。其不足之处在于通过随机测序有时难以获得那些低丰度表达的基因和那些在特殊环境条件下(如生物胁迫和非生物胁迫)诱导表达的基因。因此，为了弥补EST计划的不足，必须开展基因组测序。通过分析基因组序列能够获得基因组结构的完整信息，如基因在染色体上的排列顺序，基因间的间隔区结构，启动子的结构以及内含子的分布等。　　3功能基因组学研究ue004　　功能基因组学(functional genomics)又往往被称为后基因组学(postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析，cDNA微阵列，DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异，因此需要建立模式生物体。　　比较基因组学(Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。目前从模式生物基因组研究中得出一些规律：模式生物基因组一般比较小，但编码基因的比例较高，重复顺序和非编码顺序较少；其G+C%比较高；内含子和外显子的结构组织比较保守，剪切位点在多种生物中一致；DNA 冗余，即重复；绝大多数的核心生物功能由相当数量的orthologous蛋白承担；Synteny连锁的同源基因在不同的基因组中有相同的连锁关系等。模式生物基因组研究揭示了人类疾病基因的功能，利用基因顺序上的同源性克隆人类疾病基因，利用模式生物实验系统上的优越性，在人类基因组研究中的应用比较作图分析复杂性状，加深对基因组结构的认识。 此外，可利用诱变技术测定未知基因，基因组多样性以及生物信息学（Bioinformatics）的应用。　　4蛋白质组学研究　　基因是遗传信息的携带者，而全部生物功能的执行者却是蛋白质，它有自身的活动规律，因而仅仅从基因的角度来研究是远远不够的，必须研究由基因转录和翻译出蛋白质的过程，才能真正揭示生命的活动规律，由此产生了研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科—　—蛋白质组学（proteomics）。蛋白质组（proteome）是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams于1994首先提出，并见于1995年7月的“Electrophonesis”上，指全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式，是一个基因、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分，蛋白质组学是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。它从蛋白质水平上探索蛋白质作用模式、功能机理、调节控制以及蛋白质群体内相互作用，为临床诊断、病理研究、药物筛选、药物开发、新陈代谢途径等提供理论依据和基础。ue004 蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，内容包括鉴定蛋白质表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作用方式等。它不同于传统的蛋白质学科，是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动来揭示生命规律。但由于蛋白质具有多样性和可变性，复杂性，低表达蛋白质难以检测等，应该明确其研究的艰难性。总体上研究可以分为两个方面：对蛋白质表达模式（或蛋白质组成）研究，对蛋白质功能模式（目前集中在蛋白质相互作用网络关系）研究。对蛋白质组研究可以提供如下信息：从基因序列预测的基因产物是否以及何时被翻译；基因产物的相对浓度；翻译后被修饰的程度等。由于蛋白质数目小于基因组中开放阅读框（ORF, open reading frame）数目，因此提出功能蛋白质组学（functional proteomics），功能蛋白质指在特定时间、特定环境和试验条件下基因组活跃表达的蛋白质，只是总蛋白质组的一部分。功能蛋白质组学研究是位于对个别蛋白质的传统蛋白质研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质研究之间的层次，是细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质。ue004　　对蛋白质组成分析鉴定，要求对蛋白质进行表征化，即分离、鉴定图谱化，包括两个步骤：蛋白质分离和鉴定。双向凝胶电泳（2-DGE）和质谱（MS）是主要的技术。近年来，有关技术和生物信息学在不断并迅速开发和发展中。蛋白质组研究技术体系包括：样品制备；双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-D PAGE）；蛋白质的染色；凝胶图像分析；蛋白质分析；蛋白质组数据库。其中三大关键是：双向凝胶电泳技术、质谱鉴定、计算机图像数据处理与蛋白质数据库。　　5与基因组学相关学科诞生ue004　　随着基因组学研究的不断深入，人类有望揭示生命物质世界的各种前所未知的规律，完全揭开生命之谜，进而驾驶生命，使之为人类的社会经济服务。基因组研究和其它学科研究交叉，促进一些学科诞生，如营养基因组学（nutritional genomics），环境基因组学（environmental genomics），药物基因组学（phamarcogenomics），病理基因组学（pathogenomics），生殖基因组学(reproductive genomics)，群体基因组学(population genomics)等。其中，生物信息学正成为备受关注的新型产业的支撑点。ue004　　生物信息学是以生物大分子为研究，以计算机为工具，运用数学和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象、组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门科学。研究重点体现在基因组学和蛋白质两个方面。首先是研究遗传物质的载体DNA及其编码的大分子量物质，以计算机为工具，研究各种学科交叉的生物信息学的方法，找出其规律性，进而发展出适合它的各种软件，对逐步增长的DNA 和蛋白质的序列和结构进行收集、整理、发布、提取、加工、分析和发现。由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。其关注的研究热点包括：序列对比，基因识别和DNA序列分析，蛋白质结构预测，分子进化，数据库中知识发现（Knowledge Discovery in Database, KDD）。这一领域的重大科学问题有：继续进行数据库的建立和优化；研究数据库的新理论、新技术、新软件；进行若干重要算法的比较分析；进行人类基因组的信息结构分析；从生物信息数据出发开展遗传密码起源和生物进化研究；培养生物信息专业人员，建立国家生物医学数据库和服务系统［5］。20世纪末生物学数据的大量积累将导致新的理论发现或重大科学发现。生物信息学是基于数据库与知识发现的研究，对生命科学带来革命性的变化，对医药、卫生、食品、农业等产业产生巨大的影响。　　邹承鲁教授在谈论21世纪的生命科学时讲到，生物学在20世纪已取得巨大的发展，数理科学广泛而又深刻地深入生物学的结果在新的高度上揭示了生命的奥妙，全面改变了生物学的面貌。生物学不仅是当前自然科学发展的热点，进入21世纪后将仍然如此。科学家称21世纪是信息时代。生物科学和信息科学结合，无疑是多个学科发展的必然结果。

人类基因组：指人体dna分子所携带的全部遗传信息。由24条双链的dna分子组成（包括1~22号染色体dna与x、y染色体dna），上边有30亿个碱基对，30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。30亿个碱基对，太庞大了，无法精确的告知你序列是什么样的。但可以告诉你：人类基因组计划：1、概念：是指分析测定人类基因组的核苷酸序列。2、主要内容：绘制人类基因组的四张图，即遗传图、物理图、序列图和转录图。绘制这四张图好比是建立一个“人体地图”，沿着地图中一个个路标，如“遗传标记”、“物理标记”等，可以一步步地找到每一个基因，搞清楚每一个基因的核苷酸序列。3、进展：2000年6月26日，6国科学家向世界宣布：“人类基因组草图”的绘制工作已经全部完成。预计到2003年，“人类基因组精图”的绘制工作也将全部完成。4、意义：（1）对于各种疾病，尤其是各种遗传病的诊断、治疗具有划时代的意义；（有利于疾病的诊断和治疗。）（2）对于进一步了解基因表达的调控机制、细胞的生长、分化和个体发育的机制，以及生物的进化等也具有重要的意义；（有利于研究基因的表达和调控机制）；（有利于研究生物的进化。）（3）将推动生物高新技术的发展，并产生巨大的经济效益。（有利于培育优良的动植物品种）。另外，美国奎格u2022文特研究所和多伦多儿童医院以及加州大学的研究者日前公布了奎格u2022文特本人的基因组序列，这是世界上第一次公布单个个体二倍体的基因组序列，初步分析报告发表在最新一期的《plos生物学》上。

需要按照实际需求去选择，没有哪个最好的说法，合适的就是最好的常用基因诊断技术：一、Southern印迹法（Southern blot）基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。当含有特定基因片段已原位转移到膜上后，即可与同位素标记了的探针进行杂交，并将杂交的信号显示出来。杂交通常在塑料袋中进行，袋内放置上述杂交滤膜，加入含有变性后探针的杂交溶液后，在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针。杂交后，洗去膜上的未组合的探针，将Ⅹ线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。二、聚合酶链反应近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。三、扩增片段长度多态性小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析.四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。五、单链构象多态性诊断法单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。

大多数烈性噬菌体(virulentphage)在感染敏感细菌细胞后，经过一个潜伏期(eclipseperiod)，即细胞内营养生长和繁殖循环后，便可引起宿主细胞裂解，并释放出成百上千的噬菌体粒子，这就是所谓的噬菌体裂解反应(lyticresponse)然而有一些温和噬菌体除了能产生裂解繁殖外，它的基因组还可以被整合到宿主染色体DNA上，并且长期存在于宿主细胞中。整合后的噬菌体基因组能随宿主DNA一起复制，当细菌分裂产生子代细胞时，其子代染色体DNA中都带有整合的噬菌体基因组，这种噬菌体基因组的整合作用就称为噬菌体的溶原化(lysogenization)。染色体DNA上整合有噬菌体基因组的宿主细胞，不会因为噬菌体感染而发生裂解的这种现象称为溶原现象(lysogenesis)，整合有噬菌体基因组的宿主细胞叫做溶原菌(lysogen)，而被整合的噬菌体基因组叫做原噬菌体(prophage)。

DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 Northern印迹杂交（Northern blot），是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2"-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。 Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 （不知道这个是不是你所提到的亲和鉴定？）将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 双脱氧末端终止测序法：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5"端，以双脱氧碱基为3"端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3"端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。记得采纳啊

基因诊断（gene diagnosis）是以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。它是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断技术，它的诞生与发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展。　　常用基因诊断技术：　　一、Southern印迹法（Southern blot）　　基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。　　当含有特定基因片段已原位转移到膜上后，即可与同位素标记了的探针进行杂交，并将杂交的信号显示出来。杂交通常在塑料袋中进行，袋内放置上述杂交滤膜，加入含有变性后探针的杂交溶液后，在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针。杂交后，洗去膜上的未组合的探针，将Ⅹ线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。　　二、聚合酶链反应　　近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。　　三、扩增片段长度多态性　　小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析.　　四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法　　当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.　　PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。　　五、单链构象多态性诊断法　　单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。

主要用于分析RNA，包括正向杂交、反向杂交、斑点杂交。正向Northern杂交是将待测RNA固定在纤维膜上，用特异序列DNA探针与其杂交，再显影观察。反向Northern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上，用待测RNA做成探针与其杂交，再显影观察。 主要用于分析DNA，也包括正向杂交、反向杂交、斑点杂交。正向Southern杂交是将待测DNA固定在纤维膜上，用特异序列DNA探针与其杂交，再显影观察。反向Southern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上，用待测DNA做成探针与其杂交，再显影观察。 主要用于分析蛋白质，利用了抗原抗体特异性结合的原理。分为抗原法、夹心法、竞争法。抗原法是将待测抗原固定在膜上，加特异抗体与其结合、洗膜、显色、观察。夹心法是将一抗固定在膜上，加待测抗原、洗膜、加特异二抗、洗膜、显色、观察。竞争法是分对照和试验两组，对照组将特异抗原固定在膜上，实验组将待测抗原固定在膜上，都加入特异抗体，显色、观察。用于比较抗原的特异性。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern印迹杂交由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 Southern印迹杂交（Southern blot）1975年由英国southern创建。英文解释：use a DNA or a RNA probe to hybridize with DNA from a genome to detect whether there is/are the homologue DNA.Southern印迹杂交是由凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行杂交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/L EDTA pH8.0。5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝。甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。20×SSC；去离子甲酰胺；50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)；0.1mol/L Tris，pH7.5。 [1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。[2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。[3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。[4]55℃加热15min，冰浴冷却。[5]加2ml5×载样缓冲液。[6]上样、同时加RNA标记物。[7]60伏电泳过夜。[8]取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。[9]室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。[11]20×SSC洗胶1h。[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。[13]取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。

楼上答的挺多一看就是网上摘的，但有点错误，我更正和补充一下。主观填空题1.干系2.基因组DNA3.遗传物质4.染色体（或DNA）复制一次5.交叉遗传6.细胞癌基因7.点突变8.完全显性遗传9.罗伯逊易位10.重排四、名词解释聚合酶链式反应(PCR) :Mullis K. 1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。 具体即为在模板DNA、引物、4种dNTP存在条件下，依赖Taq DNA 聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。 假基因：真核生物多基因家族中，与有功能的基因由同一个祖先基因进化而来，但不能表达功能产物的基因。其结构与正常基因非常相似，同源性较高，但不表达基因产物，是祖先基因经过多次突变、重复积累而成的。复等位基因：是指群体中在某一个基因位点上,不只有两个基因(如A和a),而是有两个以上,甚至有几十个基因。如人的ABO血型就是由一组复等位基因决定的,这一组复等位基因是IA、IB、i三个基因。但是,对每个人来说,只可能具有其中的两个基因。血红蛋白病：由于基因的突变等原因，导致珠蛋白的结构异常（异常血红蛋白病）或者是珠蛋白合成数量的异常（地中海贫血），最终所引起的一系列遗传性血液病。遗传度：与单基因遗传病相比,多基因遗传不只是由遗传因素决定,而是由遗传因素与环境因素共同起作用。与环境因素相比,遗传因素所起的作用大小叫遗传度,或者说在多基因形状或疾病病症的获得中，遗传因素所起的贡献的大小。 用百分数表示。 动态突变：在某个特定基因的编码序列或者是侧翼序列中，存在许多短的串联重复序列，大多为三核苷酸串联重复序列（如(CGG)n,(CAG)n等）。在体细胞或生殖细胞的世代传递中，这些三核苷酸串联重复序列的重复次数不稳定而在一代一代传递中发生明显的增加，最终引发某些遗传病的发生，这种突变即动态突变。疾病类型有Hutington舞蹈病，强直性肌营养不良，脆性X染色体综合症等。X染色质：在正常的雌性动物体细胞间期的细胞核中，紧贴核膜内侧，有一个染色较深的，大小为1微米的椭圆形小体成为X染色质，或称X小体、巴士小体（Barr）。它是细胞人X染色体异固缩而形成的。五、论述题3.真核生物基因组的结构特点：由染色体DNA和线粒体DNA组成。基因组DNA为线性结构，以染色体形态存在，末段序列特殊，由寡核苷酸短串联重复序列组成，成为端粒。真核生物基因组庞大，结构复杂，DNA有多个复制起点，染色体数目一定，除配子为单倍体，体细胞一般都是二倍体。 真核基因组存在大量非编码序列，编码序列不到10%。 还含有大量重复序列（高度重复、中度重复、单拷贝序列）。 真核生物的结构基因是断裂基因，不连续的，由外显子和内含子（插入序列）交替构成。 真核生物基因的转录产物为单顺反子mRNA。 真核生物基因组中存在各种基因家族，基因家族可以串联在一起，也可以相聚很远，但都是分别表达的。4.细胞癌基因在正常情况下，编码一些列维持人体正常生长、分化、发育的蛋白，并起调节作用。异常情况下，被激活，导致细胞过度生长、无限增殖、异常分化，最终引发肿瘤。 癌基因的编码产物可分为以下几类：（1）生长因子以及生长因子类似物类；（2）生长因子受体类；（3）与信号传导有关的传递蛋白类；（4）转录因子类（核内DNA结合蛋白）：如myc,myb,fos,jun等基因 （5）细胞凋亡相关因子： 如bcl-2基因 癌基因激活的机理有四：（1）获得激动子与增强子：即楼上所说的癌基因的诱导，插入突变。（2）染色体易位和重排：在此过程中，某些基因发生了易位和重排导致其在染色体上的位置改变，使原来无活性或低活性的原癌基因移至强启动子或增强子的附近而被活化 或者由于 易位使原癌基因与附近高表达的某个基因形成融合基因而被激活， 最后原癌基因表达增强，导致细胞的恶性转化，肿瘤的发生。（3）原癌基因的扩增：细胞周期中DNA复制数次，导致原癌基因的拷贝数增加，其表达产物也大大增多，肿瘤发生。（4）点突变：在射线或化学致癌剂作用下，原癌基因发生单个碱基的替换，从而改变了表达的蛋白的氨基酸组成，造成蛋白质结构的变异。5. 简述Southern Blot杂交的原理、步骤及应用。 这个还是看书吧，书上写的简单清楚具体。 楼上的太啰嗦了，而且很多步骤也没必要。虹吸转移也一般不用了，太传统复杂，实验室现在一般都是电转移的印记法。其他都是我按当年背的遗传、分生资料一个字一个字打上来的，也算回忆了一遍。。 希望对你有用。应该还算全面了

PCR扩增产物的分析方法微孔板夹心杂交法颜色互补分析法PCR-ELISA法PCR-OLA法PCR-打点杂交法微孔板夹心杂交法：该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简 便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常 规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。另一种微孔板杂交法不 是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素 标记的PCR产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点： ①前者易操作；②固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为 膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需 要时间较长；③本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封 闭过程。另外，微孔板固定的DNA不需再加热或UV照射。微孔板杂交的基本过程包括L：DNA的固定，探针的杂交和酶联显色。DNA的固定在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上。不同来源 的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固 定浓度的标记探针杂交。显色后，判断合适的固定盐浓度。固定方 法的选择必须使DNA最大量的固定，且不影响杂交。用合适浓度的 NaCl或(NH4)2SO4可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。盐浓度合 适时，DNA应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使 DNA“平躺”固定在孔内而影响杂交。Mg2+虽有促进DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA应大于300bp， 否则影响杂交结果。每孔可固定高达200ng(624bp)的DNA。合适的盐 浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA。待固定DNA100℃加热5min变性并立即冷却。与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内。固定液：10mmol/L磷 酸钠-10mmol/LEDTA，pH7.0，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合后， 终浓度为最适固定浓度）。用胶布封好，浸于37℃水浴2h。用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存。杂交可采用标准的杂交系统杂交。夹心杂交时，是将变性的PCR产物与检 测探针一并加。杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。显色根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波 长。颜色互补分析法(A)颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩增时，用引 物5"端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧 光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有 一种颜色（红色或绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫 外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一 条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引 物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见 一条红绿互补的黄色条带。该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。这种情 况下，只需判断产物的有无。另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型 时，可用复合PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM 等）。PCR-ELISA法：(A)本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5"端修饰后仍 可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5"端使其携带 便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5"端的修饰使产物便于检测。链霉亲和素的包被：不同厂家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差异并不显著。亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1μg/ml。向微孔板的每孔内加入100μl，封好，室温过夜。 用PBS液漂洗。扩增产物与包被板的结合：PCR产物1μl用50μ1PBS-Tween液稀释后加入包被孔内。室温下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未掺入的荧光引物。 ELISA：向结合有PCR产物的孔内加入50μlPBS-Tween液稀释的HRP-抗FITC抗体，室温下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。将1mgTMB溶于1ml二甲基亚砜中，用50mmol/L醋酸钠-柠檬酸液（Ph4.9）稀释10倍， 向每孔内加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反应在室温下进行2～5min ，再加入80μl2mol/L硫酸终止反应。于ELISA计数仪上450nm测定OD值。另外，引物的修饰除用图2-3所示的生物素和FITC外，还可用DNA结合蛋白质的结合位 点和生物素修饰，将DNA结合蛋白质（GCN5或TyrR）包被在微孔板内，与PCR产物结合 后，可加入酶标亲和素进行ELISA检测。PCR-ELISA法可用于PCR产物定量分析。需注 意的是，定量分析时，PCR要在对数期内终止，并需设立已知标准对照。PCR-OLA法(A)研究表明、不同个体中同源DNA片段序列间的差异大部分是限定于单个核苷酸的位 置。已弄清的人遗传病的40个基因结构变异中，绝大部分属碱基替换，同样，作为遗 传连锁分析标记的大部分序列变异主要是位于基因组的非编码区的点突变。所以，一 般基因检测技术的一个重要要求是能很容易地检出单一核苷酸变异。寡核苷酸连接试 验（OLA）就是为此目的而设计的。它可以单独或结合PCR快速确定紧密相关的DNA序 列。OLA是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸完成的。寡核酸杂交 后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节 连接酶和NaCl浓度防止其连接，连接产物可通过凝胶电泳观察其大小，或通过5"端 修饰技术使一个寡核苷酸5"端带有一个配基。连接后，通过固相化的亲和配基使其 固定，漂洗后，检测另一寡核苷酸3"端携带的适当标记分子。这一过程如重复进行 多个循环，则连接产物会呈线性增加，故称这循环进行的OLA为连接检测反应（LDR）。 此反应中若再加入两种与上述寡核苷酸互补的寡核苷酸互补的寡核苷酸进行循环的连 接反应，则称之为连接酶链反应。两寡核苷酸在无靶序列的情况下，在非常接近的位 置发生杂交的可能性极小，因此，OLA技术的假阳性极少。另外，连接酶所形成的键 是连接产物。该法适于简单、标准化的基因组样品处理法，或直接用表面活性剂和蛋 白酶初步处理有核细胞作为检测样品。需指出的是，这里是以放射性标记检测分子为 例的。如图2-6中的地高辛标记分子可避免放射性同位素的缺点，且敏感性相当，更 易于自动化。寡核苷酸的设计与标记：用于OLA的寡核苷酸一般为20mer，使被检变异核苷酸位于 即将连接的两个寡核苷酸接头的5"端。即位于图2-6中第2步左侧寡核苷酸的3"端。 左侧寡核苷酸是5"标记生物素。右侧寡核苷酸5"端需磷酸化才能与左侧寡核苷酸的 3"-OH相连接。用PNK酶处理很易使其5"或3"标记可以选择其它标记物（如荧光素 等）。OLA反应：向一软质圆底微滴定板内依次加入：3μlPCR扩增DNA产物；1μl剪切的鲑精DNA(10μg /μl);1μl0.5mol/LNaCl混匀室温作用10min。加入1μl0.5mol/LHCl，混匀。加入1μl生物素标记探针水溶液（140fmol）和1μl32P探针（1.4fmol），2μlT4连 接(约0.1WeiSS单位，用5×连接缓冲液稀释)。5X连接缓冲液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。 不同寡核苷酸与底物反应的连接所需酶液度不同，OLA试验时，一定要小心滴定最适 酶浓度，提高连接温度（50℃）可扩加OLA的特异性。混匀，在100%湿度下于37℃作用1h。加入1μl1mol/LNaOH，混匀，室温下作用10min。加入1μl1mol/LHCl中和。加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）链霉亲和素包被的琼脂糖悬液，混匀后室温作用 10min。将一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮过的Whatman4号滤膜置于点样器 上，然后，将微孔板内混合液加入点样孔内，真空抽滤点膜。再用数毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分别依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鲜包好进行放射自显影。打点杂交当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过 程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再 用放射性或非放射性标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变 DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同 位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性 均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作 用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或 法医检验。因而用非放射性物质（生物素、和地高辛等）标记的寡 核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的 方法。非放射性标记物质稳定性高、使用方便、安全、检测速度 快。因此，本节仅叙述非放射性标记探针的点杂交与检测情况。膜的制备：点杂交膜的制备有两种方法，一是将扩增产物直接固定于膜上，每 一个探针制备1张膜。然后，用不同的等位基因特异或某一微生物特 异探针在严格条件下杂交来检测扩增产物的突变类型或鉴定病原 菌；另一种方法是将不同的探针固定到尼龙膜上，然后，用标记的 PCR产物作探针去杂交。这样，根据杂交点的位置即可判断产物序列 变异的种类。显然，前一方法较后一方法繁琐，费时，费力；而后 一方法仅需一次杂交即可判断结果。产物的固定：⑴取1张带正电荷的尼龙膜，按点样器的 大小裁剪膜，并做好标记。⑵将膜浸入水中湿透至少 1min。⑶变性PCR产物：此步可在圆底微孔板或微量离 心管内操作。每点的变性方法为；5～20μl(50～100ng)PCR 产物与100μl变性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT） 混匀，室温作用5min即可。⑷小心将预湿的膜装在点 样器上，注意膜与点样器接触表面不能有任何气泡。 因气泡会使点样点呈环形或月牙形或样品间弥散融 合。膜固定后，每孔内加100μl变性混合液，打开真空泵。⑸抽干变性液后，每孔内再加100μlTE缓冲 液，真空抽滤“洗涤”样品。⑹取下膜，置于厚3mm滤 纸上渍干。重复制备用于其它基因探针的膜时，一定要认真清洗点样器，以免样品间的交叉污染。⑺渍干 的膜于80℃真空干烤1h或于254nmUV光源下以60～120mJ/cm2 的强度下照射使DNA固定在膜上。此时，的膜可直接用 于杂交，也可以用滤纸包好存于塑料袋或干燥缸内。探针的固定：因寡核苷酸的探针太短，在膜上固定较 困难，即使固定上，也会影响杂交。这就是需要将寡 核苷酸探针用末端转移酶加polydT尾后，UV线照射固 定。因为UV可激活胸腺嘧啶，使其与尼龙膜上的氨基共价结合，使探针间接地牢固地固定在尼龙膜上。这 种加尾固定的探针不影响杂交。但这种杂交对固定探针的要求是，在同一条件下与PCR产物的杂交必须是特 异的。通过选择探针的合适长度，G+C含量或通过改变 探针的固定可达到特异性的要求。这种固定的探针可 用于检测人类基因的突变，也可用来检测病原微生 物。(1)加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3"端，在四种脱氧 核苷中，以dT加尾效果最好。通过改变dT浓度和TdT量 可调节加尾长度，在下述反应条件下，加尾长度可达 400个dT。①向一微量离心管中依次加入：寡核苷酸探 针，100～200pmol;10×TdT缓冲液(1mol/L二甲胂酸钾; 250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT) 10μl;dTTP80～110nmol；TdT，60～80U；补水至100μl。 ②混匀后，稍加离心，置37℃水浴60～90min。③加入 100μl10mmol/LEDTA终止反应。加尾长度可通过10%聚 丙烯酰胺凝胶电泳监测。(2)点膜：①加尾探针6pmol，用0.3mol/LNaOH室温处理5min，然后，用2.5mol/LNH4Oac中和。②加入等体 积6×SSC(1×SSC:0.15mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸三 钠pH7.0)。③将6×SSC预湿的尼龙膜（zeta-probe）或 hybond-N固定在点样器上。④点样方法同上。(3)固定：①小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的4～6 滤纸上，DNA面朝上。②将滤纸和膜一起置于254nmUV 灯下照射固定，poly(dT)400尾的探针在40mJ/cm2r的 剂下固定效果最好。辐射剂与给定光源对给定面积的 能量释放率（辐照度）和辐照时间有关。一般对一个 固定光源而言，辐照剂量为：辐照剂量（J/cm2）=辐照度（w/m2）×辐照时间(s)其中，J为辐照能量单位；w为辐照通量单位。辐照度 与照射角度有关，与入射角度θ的余弦（cosθ）呈正 相关。③固定后，在100ml6×SSC-0.5%SDS液中于42～55℃ 漂洗30min左右。漂洗后可立即用于杂交，也可以在蒸溜水中浸洗，晾干后室温保存。探针的固定量与加尾长度均影响杂交结果。如用poly (dT)400尾的不同固定量的探针与等PCR产物（2.33fmol） 杂交，固定6pmol苷酸杂交时，有29.2%的PCR产物与 1.1%的寡核而固定的探针600fmol杂交时，仅有2.2%的产 物与0.8%。用不同加尾长度的等量产物6pmol固定寡核苷酸与（时，仅0.33%233fmol）杂交结果表明， poly(dT)300探针与产物杂交；而有1.3%的探针poly (dT)400时，则与产物杂交。因此，固定的探针加最好 在400个以dT尾上，固定量也至少6pmol。杂交寡核苷酸探针的杂交：每一寡核苷酸探针均有自己的杂交温度和漂 洗条件，主要取决于探针的Tm值。Tm值则受探针长度，G+C含量和杂 交液的盐渡影响。一般要由如下公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)来计算Tm 值。在1mol/L盐浓时，杂交温度可比预测的寡核苷酸Tm值低5～20℃。 提高杂交温度和降低盐浓度可提高杂交的严格性。漂洗液一般不含 盐，漂洗温度比杂交温度低5℃。一旦确定了探针的杂交与漂洗条 件，可按下述方法进行杂交。⑴在（2×SSPE3.6mol/LNaCl：; 200mmol/LNaH2PO4;20mmol/LEDTA，Ph7.4）液中预湿点样膜。⑵置 膜于塑料封口袋中，并加入适量杂交液（SSPE，5×Denhardt液， 0.5%TritonX-100），封口。袋内不要有气泡。⑶置于水浴加热摇 动，在杂交温度下预杂交5min。⑷取出塑料袋，剪开一角。加入非 放射性标记物（如生物素-补骨脂素）标记的探针。每毫升杂交中加 入1pmol探针。封口后摇育20～60min。杂交时间不能太长，否则会 引起探针与膜的不可逆结合。⑸从袋中取出膜，室温下在漂洗液 （SSPE-0.1%TritonX-100）中洗1～2次。⑹漂洗温度下预热的漂洗 液在合适温度下洗10min。漂洗后的膜可用于显色检测。反向点杂交：反向点杂交即扩增产物作为相中的探针与固定到膜上 的寡核苷酸杂交。如前述，这种杂交最基本的要求就是在同一条件 下，所有固定探针均与扩增产物特异杂较。为此，主要是认真选择 与设计寡核苷酸探针，使各探针在同一条件下Tm值相近。在同一杂 交特异。一旦确定了合适的杂交和漂洗条件，即可按上述基本程度杂交。只是杂交探针（产物）在加入前应加热变性或用等体积的 400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA变性。杂交时间（2～4h）要长些。PCR 产物的标记可以用标记引物扩增或在扩增时掺入标记物。杂交的检测不同非放射性标记物的检测原则上基本相同。若为酶标探针则可直接进行显色检测。下面以生物素标记物为例加以说明。酶标亲和素的结合 ⑴漂洗后的膜在缓冲液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100） 中与一定浓度的HRP-标记链霉亲和素在室温作用10min，并轻轻振 荡。⑵用缓冲液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室温下漂 洗5min，并轻轻振荡，将膜上非特异吸附的HRP-链霉亲和素洗掉。显色　不同酶标亲和素的显色条件与底物均不同，下面以HRP的显色加以说 明。⑴将上述膜于缓冲液C（100mmol/L柠檬酸钠，pH5.0）中在室温下作 用5min，并轻轻振荡。⑵在缓冲液D中室温下，轻轻振荡10min。此步应避强光。缓冲液D： 1份底物（TMB：2mg/ml，用无水乙醇配制）和19份缓冲液C。⑶在缓冲液E中显色，该液应现用现配。应避强光。缓冲液E：2000 份缓冲液D和1份3%H2O2。显色时间取决于杂交体中含标记物的量； 一般为1～15min即可。杂交阳性呈深蓝紫色。⑷当膜色（信/噪比）合适时，在液C中洗膜1h终止反应，在此过程 中应更换2～3次液体。⑸杂交膜可拍照记录结果，也可封于缓冲液C避光条件下贮存。膜的再利用　⑴脱色：将膜置于0.18%Na2SO4液中即可脱掉膜上的颜色。 ⑵去杂交的探针：将膜置于水-0.5%SDS中，65℃加热1h。 ⑶这种处理的膜可再与另一种探针杂交。问题与对策信号弱：①点膜的产物少-增加点膜量；②杂交时探针浓度低-加大 探针浓度；③杂交漂洗过于严格-增加盐浓度或降低杂交温度；④TMB 液贮存时间过长（TMB液4℃可存2个月）-重新配制。本底信号强：①杂交时探针浓度高-降低探针浓度；②杂交时间长- 缩短杂交时间；③杂交漂洗不严格-降低盐浓度和提高杂交温度；④ 显色时间长-缩短显色时间。杂交膜的高本底着色：①同②；②在缓冲液C中洗膜时间短-延长漂 洗时间（过多的硫酸葡聚糖也能增加膜的本底着色；③同2④；④避 光不严格-显色过程中及显色后要确保杂交膜的避光。阴性对照出现阳性信号：①点样混淆，即把阳性标本点于阴性对照 的位置，重复实验即可纠正；②PCR较物的残留污染，用新配的试剂 重复全部扩增反应。（我自己加进的：Hybond—N+：Hybond-N+是带正电尼龙膜，对在碱性条件下杂交和普通的Southern杂交均有很好的灵敏性，故核酸样品可通过简单的碱处理固定在膜上，而不必在紫外灯下固定，尽管紫外固定的重复性最好。）￥5.9百度文库VIP限时优惠现在开通,立享6亿+VIP内容立即获取PCR扩增产物的分析方法资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载PCR扩增产物的分析方法地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容第 1 页PCR扩增产物的分析方法微孔板夹心杂交法颜色互补分析法PCR-ELISA法PCR-OLA法PCR-打点杂交法微孔板夹心杂交法：该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的

（Dot-blot）　将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样后的膜进行80℃真空烘烤2h。应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进行多个样品的检测，操作简便、快速，在临床诊断中应用较广。适合进行特定基因的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因的分子量。 （Southern blot）　这是指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程。常规处理如下，先用限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离，接着对凝胶进行变性处理，使双链DNA解离成单链，并将其转移到NC膜或其它固相支持物上，转移后各DNA片段的相对位置保持不变。用探针与经Southern印迹处理的DNA样品杂交，可鉴定待测DNA的大小、进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析（RFLP）等。Southern印迹的操作方法有三种： 这是近年来发展起来的一种简单、快速、高效的DNA和RNA印迹法。其基本原理是利用真空作用将转膜缓冲液从凝胶上层的容器抽到下层，凝胶中的核酸片段将随缓冲液移置到凝胶下面的固相支持物上。这一方法的最大优点是快速高效，可在转膜的同时进行DNA的变性与中和，30分钟至1小时可完成，适合检疫工作的要求。已有商业化的真空转移仪提供，可按商品使用说明进行操作。Southern印迹后的滤膜仍需进行固定处理，对NC膜可用80℃真空烘烤2小时，对尼龙膜还可用短波紫外线（波长254nm）照射几分钟。 （Northern blot）　Northern印迹是指将RNA片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上的过程。RNA样品经Northern印迹后进行杂交反应可鉴定其中特异 mRNA分子的量与大小。Northern印迹的方法与Southern印迹基本相同，可参照进行。但RNA的变性方法与 DNA不同。DNA样品可先通过凝胶电泳进行分离，再用碱处理凝胶使DNA变性。而RNA不能用碱变性，因为碱会导致RNA水解。因此，在Northern印迹前，须进行RNA变性电泳，在电泳过程中使RNA解离形成单链分布在凝胶上，再进行印迹转移。RNA变性电泳的原理，是用一定剂量的乙二醛-二甲基亚矾，或甲醛和甲基氢氧化汞等处理RNA样品和凝胶，使双链RNA在电泳过程中变性而完全解离形成单链。

蛋白质印记就是western印记法，跟Southern或Northern杂交方法类似，但采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，也就是你问的一抗，“显色”用带标记的抗抗体（也就是抗一抗的抗体）也就是你问的二抗。二抗跟一抗是对应的，一抗跟你检测的蛋白质是对应的单拷贝基因是说 编码一个蛋白质或者RNA，只有一份基因编码，并不是说只有1bp,编码一个蛋白质不可能只有1bp,这样连一个密码子都不够呢。多拷贝基因是说这个蛋白质的编码对应在DNA上有很多份，就像是备份一样。

【答案】：印迹技术的定义是：将在凝胶中分离的生物大分子转移(印迹)或直接将其放在固定化介质上并加以检测分析的技术。目前常用的生物大分子印迹技术包括以下几种。(1) DNA印迹技术：它主要用于基因组DNA的分析，尤其是用于某种基因在基因组中的定位研究，也可以用于分析重组质粒和噬菌体。(2) RNA印迹技术：主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。(3) 蛋白质印迹技术：主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异性蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。(4) 斑点印迹、原位杂交也是常用的分子杂交方法。在此基础上发展起来的DNA芯片，可以在小面积的表面固定数千甚至上万个探针，用于细胞样品中基因表达谱及基因突变的分析。

1.Northern印迹杂交（Northernblot）。 2.这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 3.DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好和DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，和此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblot。 4.Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。 5.一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再和相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 6.简言之，一个RNA。

Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 简言之，一个RNA；一个DNA

Northern印迹杂交是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。简单来说northern杂交和southern杂交的区别就是，Northern杂交用于分析RNA，Southern杂交用于分析DNA