转录组学的简介

寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家M.史密斯（1932）发明的。其基本原理如下：应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片段克隆到MI3噬菌体载体中，MI3噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而存留在菌体内的则是双链状态的复制型MI3。受MI3噬菌体感染的细菌生长速度减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。

寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家M·史密斯（Michael Smith，1932—）发明的。其基本原理如下：应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片断段克隆到MI3噬菌体载体中，MI3噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而存留在菌体内的则是双链状态的复制型MI3。受MI3噬菌体感染的细菌长生速度减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。将目的DNA插入到复制型MI3的多克隆位点上，去转染细菌，提取单链DNA作为突变的模板。根据需要设计并合成带有突变核苷酸序列的寡聚核苷酸引物，使与带有目的DNA的单链MI3模板杂交，然后加入DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸，使杂交上的突变引物延伸，并用DNA连接酶使新合成的DNA成环状，再去转染细菌。可用DNA序列分析的方法从所得到的噬菌体中筛选出带有突变DNA序列的突变体。在制备出含有突变体的复制型DNA后，可以用突变的DNA片段置换未突变的DNA相应的区段，从而得到完整的DNA突变体。

是的啊寡核苷酸就是数量较少的几个碱基聚合在一起，这个聚合物就是寡核苷酸。

是有一类RNA有酶的功能，成为核酶（riboenzyme），而不是所有的RNA都具有催化功能。至于这种RNA为什么具有催化功能，这个问题就像“DNA为什么有遗传功能”“生命起源”问题一样，没人知道吧。核酶（ribozyme）主要指一类具有催化功能的RNA，亦称RNA催化剂。核酶是1982年，Cech等研究原生动物四膜虫rRNA时，首次发现RRNA基因转录产物的I型内含子剪切和外显子拼接过程可在无任何蛋白质存在的情况下发生，证明了RNA具有催化功能。为区别于传统的蛋白质催化剂，Cech给这种具有催化活性的RNA定名为核酶。1983年Altman等人在研究细菌RNaseP时发现，当约400个核苷酸的RNA单独存在时，也具有完成切割rRNA前体的功能，并证明了此RNA分子具有全酶的活性。随着研究的深入，Cech发现L-19RNA在一定条件下，能以高度专一性的方式去催化寡聚核苷酸底物的切割与连接。核酶可以识别底物RNA的特定序列，并在专一性位点上进行切割，其特异性接近DNA限制性内切酶，高于RNase，具有很大的潜在的应用价值。核酶的发现，从根本上改变了以往只有蛋白质才具有催化功能的概念，为此，Cech和Altman也因此获得了1989年的诺贝尔奖。自然界中已发现多种核酶，目前主要有四种核酶能用于反式切割靶RNA（图4-23）：四膜虫自身剪接内含子、大肠杆菌RNaseP、锤头状核酶和发夹状核酶。http://www.biox.cn/content/20050519/13412.htm

端粒酶核酶核酶（ribozyme）主要指一类具有催化功能的RNA，亦称RNA催化剂。核酶是1982年，Cech等研究原生动物四膜虫rRNA时，首次发现RRNA基因转录产物的I型内含子剪切和外显子拼接过程可在无任何蛋白质存在的情况下发生，证明了RNA具有催化功能。为区别于传统的蛋白质催化剂，Cech给这种具有催化活性的RNA 定名为核酶。1983年Altman 等人在研究细菌RNase P时发现，当约400个核苷酸的RNA单独存在时，也具有完成切割rRNA前体的功能，并证明了此RNA分子具有全酶的活性。随着研究的深入，Cech发现L -19 RNA 在一定条件下，能以高度专一性的方式去催化寡聚核苷酸底物的切割与连接。核酶可以识别底物RNA的特定序列，并在专一性位点上进行切割，其特异性接近DNA 限制性内切酶，高于RNase，具有很大的潜在的应用价值。

酶催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。核酶（英语：Ribozyme，又译核糖酶）是具有催化功能的RNA分子。核酶又称核酸类酶、酶RNA、类酶RNA。大多数核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程。最早发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度Mg2+存在下，与留下的RNA部分（MIRNA）具有与全酶相同的催化活性。后来发现四膜虫L19RNA在一定条件下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有核糖核酸酶和RNA聚合酶的活性。无机催化剂在生物体内好像很少见

溶酶体中酶来自于高尔基体的转运小泡,现已知各类细胞的溶酶体中约含60种酶,包括蛋白质、糖类、脂类等物质的水解酶类,如酸性磷酸脂酶、组织蛋白酶、核糖核酸酶以及芳香基硫酸脂酶A和B等.各类溶酶体所含水解酶也有所不同,大多数溶酶体里的酶是糖蛋白,但也有例外,如鼠肝细胞和肾细胞溶酶体里的酶大部分是脂蛋白. 核酶（ribozyme）主要指一类具有催化功能的RNA,亦称RNA催化剂.核酶是1982年,Cech等研究原生动物四膜虫rRNA时,首次发现RRNA基因转录产物的I型内含子剪切和外显子拼接过程可在无任何蛋白质存在的情况下发生,证明了RNA具有催化功能.为区别于传统的蛋白质催化剂,Cech给这种具有催化活性的RNA 定名为核酶.1983年Altman 等人在研究细菌RNase P时发现,当约400个核苷酸的RNA单独存在时,也具有完成切割rRNA前体的功能,并证明了此RNA分子具有全酶的活性.随着研究的深入,Cech发现L -19 RNA 在一定条件下,能以高度专一性的方式去催化寡聚核苷酸底物的切割与连接.核酶可以识别底物RNA的特定序列,并在专一性位点上进行切割,其特异性接近DNA 限制性内切酶,高于RNase,具有很大的潜在的应用价值. 核酶的发现,从根本上改变了以往只有蛋白质才具有催化功能的概念,为此,Cech和Altman也因此获得了1989年的诺贝尔奖. 自然界中已发现多种核酶,目前主要有四种核酶能用于反式切割靶RNA：四膜虫自身剪接内含子、大肠杆菌RNase P、锤头状核酶和发夹状核酶.

19901.UCSF和斯坦福大学发布了他们的第100个重组DNA专利的许可证。在1991财务年度以前，两个学校已经从该专利挣得4000万美元。2.Actimmune （干扰素 微克-1b）被批准用于慢性的内芽肿病的治疗。3.Adagen （腺嘌呤核苷脱氨基酶）被批准用于严重免疫缺陷并发症的治疗。4.Calgene 公司成功完成了第一个以基因水平设计的棉花作物野外种植试验，该植物被设计成可抵抗除草剂溴苯晴。5.美国食品和药物管理局准许Chiron公司进行C型肝炎抗体试验，以帮助确保血库产品的纯净。6.植物基因表达中心的分子生物学家迈克尔Fromm报导：高速基因枪可使玉米稳定变换。7.伯克利流行病学家玛丽克莱尔King报导：患有乳癌的家族在45岁前，与乳癌相关的基因有很高的发生率。8.GenPharm International公司制培养出第一头转基因奶牛，该种奶牛为婴儿提供具有人奶蛋白质的的牛奶。9.第一次基因治疗发生在一名患有免疫系统紊乱疾病的4岁女孩身上，治疗显示出效果，但是引起了学术界和媒体对伦理道德规范的激烈讨论。10.人类基因组工程—绘制全部基因的表达谱，在国际上全面开始，预计成本为130亿美元。1990年正式开始人类基因组工程。11.迈克尔克赖顿的出版物新侏罗纪公园中，通过生物工程制造的恐龙漫步在主题公园里，但实验出现了错误，造成致命的结果。19911.著名的参考作品“人类孟德尔遗传法则”可在计算机网络上即时获得，目录中列出被认为很好的验证了孟德尔遗传法则的5600条基因。2.加利弗尼亚大学贝克来分校的玛丽-克莱尔king分析易患基因家族的女性的染色体，发现17号染色体上的基因引起乳癌遗传，而且增加患子房癌的危险。19921.美国陆军开始收集新兵的血和组织样品，作为“基因身份标志”的一部分，目的是更好的辨别在战斗中被杀士兵的身份。2.美国和英国的科学家公开了在试管婴儿中找出遗传性变异的技术，如包囊性纤维症和血友病19931.Kary Mullis因发明聚合酶连锁反应（PCR）的技术而获诺贝尔化学奖。2.在20年中，Chiron Betaseron第一次被批准用于治疗多硬化症。3.美国食品和药物管理局声称以基因水平设计的食物“并非天生危险”，因此不需要特别的规则加以限制。4.在合并2个较小的贸易联盟的基础上建立了生物技术产业组织。5.乔治·华盛顿大学研究人员克隆出人类胚胎，并且在培养皿中生存了几天。6.生物工程激起种族学家、政治家和批评家引起的抗议。7.巴黎人类研究中心由丹尼尔科恩领导的一个研究小组完成人类全部23对染色体的粗略图谱。8.Genentech花费1000万美元在全国范围内开展名为“通向卓越之门”的通信网络计划，该计划的目的是促使高中的生物老师成为与专家同样优秀的人才。19941.第一个基因工程食品—Flavr Savr西红柿—得到了食品和药物管理局的批准。2.Genentech公司的Nutropin被批准用于成长激素缺乏症的治疗。3.第一个乳癌基因被发现。4.BRCA1基因，早前被认为只存在于稀有家族形式的乳癌中，现在看来在许多非遗传性乳癌中也扮演重要角色。5.大批人类基因被识别，并且他们的功能也被确定。这些基因包括：A.Ob，易肥胖基因，B.BCR，乳癌易感基因C.BCL-2，与凋亡相关的基因“刺猬”基因（如此命名是因它的形状，它的蛋白产物可导致老化器官的细胞差异）D.Vpr—控制艾滋病病毒繁殖的基因……。6.基因疾病种类的相关研究：两极紊乱，天蓝白内障，黑素瘤，听力损失，诵读困难，甲状腺癌，幼儿突然死亡综合症，前列腺癌和侏儒症。7.遗传研究人员成功地将CFTR （包囊性纤维症横跨膜调整器）移植到老鼠的肠内。这将是治疗包囊性纤维症的重要一步。研究人员宣称通过脂质体的方法将CFTR移植到人体内，并取得初步成功。8.去年基因工程设计的人类DNA酶被批准使用，该酶可打破肺无载体病人肺中的蛋白质堆积物。它是30年第一个治疗包囊性纤维症的药物。9.另一组研究人员报导：第一次成功使用反义寡聚核苷酸完成系统选择性抑制基因的表达。10.美国食品和药物管理局和欧洲联盟体允许Centocor"s ReoPro在美国及欧洲市场交易，CPMP用于患有极危险的球状血管成行术。11.Genzyme Ceredase Cerezyme （alglucerase/recombinant alglucerase）被批准用于1型不对称疾病。12.虽然粗糙，但人类第一个完整的基因组相关图谱出版）。13.本年在谁拥有基因组问题上的争论大大增加。14.科学家和研究公司设计出进入拥有35,000条详细人类基因数据库，并分享数据库信息的方法。15.在得克萨斯大学的研究人员报导了端粒酶导致人类细胞不可抑制的增长。这一发现可产生很多新的诊断、治疗应用。16.重组体GM-CSF被批准用于化学诱导嗜中型白血球减少症。19951.欧洲一个研究小组识别出一种基因失误是导致耳聋的原因。2.公爵大学医疗中心的研究人员将转基因猪的心脏移植到拂拂身上，证明物种的交叉手术是可行的。随后，第一次成功将拂拂的骨髓移植到一名爱滋病人身上。3.第一个活体器官中的流感嗜血杆菌完成测序，而不再只是对病毒的测序。4.PCR和DNA采指纹技术证明足球选手O.J辛普森在双重谋杀案中无罪，但该结果不具说服力。5.主流宗教又一次新的结合，着手推翻现行的法律,允取得专利的基因可用于医学和研究应用。该组织也包括颇具争议和坦率直言的生物技术产业批评家杰里米Rifkin。6.疾病控制和预防中心的研究者确认了埃博拉病毒在扎伊尔出血性发热爆发后出现。7.研究人员称迄今仍未能认为RNA是生命起源的中心分子。8.动物实验显示，最近识别的肥胖基因蛋白产物Leptin可能是造成体重降低的原因。9.一种新的基因表达谱技术，STS基因表达谱，将大大加快国际人类基因组计划。10.一个单一的基因已经被识别，该基因可能控制所有动物眼睛的成长和发展。11.携带人类阿尔兹莫病的转基因鼠被开发。12.基因疗法，基因调节免疫系统和基因工程抗体已进入抗癌的临床应用。 19961.英国政府声称已经有10人因吃牛肉而感染牛海绵状脑病。2.生命素重组干扰素药物Avonex被批准用于多硬化症的治疗。3.科学家联合报导：已测序完成一个合成器官、啤酒酵母、面包酵母及其他的测序。该工作完成了最大的染色体组的完整测序,测序大于1200万对碱基的DNA。4.到达南极大陆约1500万年以前的小的meteorite的分析已经使真地也许是最非常的科学的发现的发火花了，火星上的生命的可能的证据。5.对海底活火山口深处不适宜气温下发现的太古代有机体进行测序,大大提高我们对地球上生命进化的了解。这些微生物即不是真核生物，也不是原核生物。6.研究人员发现T-细胞免疫系统的临界三维空间结构。7.一种便宜的诊断性生物体传感器可用于检菌株为E0157 ： H7的大肠杆菌，该大肠杆菌引起近几次血中毒的爆发。8.帕金森病相关基因的发现提供了一种新的方法去研究神经衰弱疾病的起因和可能的治疗方法。9.调查显示公众对人类基因组和基因疗法的研究存在恐惧和猜疑。19971.苏格兰Roslin研究所的研究人员报导他们从母羊的细胞中克隆得到第一头克隆羊—多利羊。随后使用核子转移技术从人类基因中克隆出又一个克隆羊—Polly羊。2.第一次生成人工的人类染色体。3.滤泡刺激激素Follistim被批准用于不育症的治疗。4.一群俄勒冈研究人员声称已经克隆到2头猕猴。5.美国专利局宣告允许EST（短DNA序列片段，对基因组表达谱具有作用）申请专利，重要遗传学家对此表示震惊及沮丧。6.Orasure，一种不失血的艾滋病病毒抗体试验被批准。7.Clock基因被识别与哺乳动物的生物钟相关。8.研究人员使用一小段DNA和一些平常的生物学实验室技术，设计了第一个DNA计算机“硬件”：由DNA决定的逻辑思路。9.一种预防泌尿管道感染的新大肠杆菌疫苗被开发。10.莱姆关节炎病原体—疏螺旋体 burgdorferi的基因组被完整测序，同时被测序的还有大肠杆菌和H型幽门。11.食品和药物管理局赞成Rituxan，给癌的第一个抗体根据的（患有非Hodgkin淋巴瘤的患者）疗法。12.新的DNA技术：合成PCR，DNA接头和计算机设计，成为研究疾病起因的新工具。19981.夏威夷大学的科学家从成人子房堆积细胞的核中克隆出三代老鼠。2.美国食品和药物管理局允许治疗Crohn病的单克隆抗体RemicadeTM（infliximab）出口。3.两个研究小组成功使胚胎的茎干细胞生长，这是分子生物学的重要一步。4.日本近畿大学的科学家用从一头母牛中取出的细胞克隆出8头完全一样的小牛。5.HER2neu（Herceptin）可用于治疗乳癌的新抗体，这一结果预言以分子瘤细胞为基础的治疗将跨入新的纪元。6.Fomivirsen成为用反义医学技术开发的第一个被批准的治疗试剂。7.对饥饿瘤生物制品的研究，包括制管张素和内稳定素，被批准用于临床。8.第一个完整的动物线虫基因组测序完成。9.人类基因组粗糙草图完成，显示了30,000以上基因的定位。19991.以唯一抗体外型为基础的一项新技术可替换现行用DNA采指纹的方法。这种方法易于操作，引起了法律机构的广泛关注。2.一种新的医药诊断试剂被批准用于快速检测牛海绵状脑病/CJD病，牛海绵状脑病/CJD病非常稀有，但可从牛转移到人体中，并导致破坏神经系统的疾病。3.研究在不断继续，与此同时，伦理的讨论越来越激烈。在美国有1,274个生物技术公司，至少已有300个以上的生物药物和疫苗正在进行临床实验，并有数以百记的生物药物和疫苗在进行早期开发。这些产品包括药品、诊断试剂、生物杀虫剂和转基因农作物。人类基因组在预算时间内进行，预计将在5年或更短的时间内完成全部人类基因的表达谱。

DNA的一条模板链经过转录、遵循碱基互补配对原则、形成一条mRNA单链mRNA上相邻的三个碱基叫做密码子、一个密码子控制合成一个氨基酸tRNA上的反密码子和mRNA上的密码子经过“翻译”、在核糖体内形成一条多肽链氨基酸经过脱水缩合形成蛋白质

T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：1）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。2）不存在亚精胺一类的多胺。3）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。4）高浓度的平端。1．凝聚剂在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：1）它们可使平端DNA的连接速率加大1－3个数量级，因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。2）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。（1）聚乙二醇（PEG8000）1）用去离子水配制的PEG8000贮存液（40%）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15%PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和T4噬菌体DNA连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于0℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。2）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或MgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。3）浓度为15%的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。4）PEG 8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。（2）氯化六氨合高钴1）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的5倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。2）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状DNA将点尽优势。3）与PEG 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

这两个概念不一样。Oligo或者说是寡聚核苷酸不带有重复的意思。oligo的定义基于20个碱基以下，是说这个核苷酸分子就这么长，而对这个核苷酸的序列没有任何限定。而SSR，即简单重复序列，是说这个序列含有重复相邻排列的核苷酸，这个序列可以存在于一个更长的核苷酸长链之中,SSR不是描述一个单独的分子。如果举个例子，就好比“小布条”与“千鸟纹”都是布料方面的概念，但是它们描述的是完全不同的性质。一个小布条上的花纹可以是千鸟纹，而千鸟纹的布料也可以裁成小步条。呃，这样说不知道明白吗?原位杂交一般需要用到特定序列的oilgos作为探针，而SSR-FISH应是指这个探针识别的是具有SSR特征的序列。

可以和目标基因mRNA互补结合的短链DNA片段。

【答案】：D因RNaseT1的作用位点为鸟嘌呤核苷酸的3"-磷酸基与相邻核苷酸的5"-羟基所形成的磷酸二酯键。产物为鸟嘌呤或鸟嘌呤结尾的寡核苷酸片段。

31、这应该是PCR过程，DNA聚合酶催化在引物的3"端连上脱氧核苷酸，5"一GTTAC一3"起引物作用，与5"—ACCACGTAACGGA—3"从右往左数第第四个碱基处开始配对，所以最后复制得到的片段是3"—TGGTG—3"，即掺入T：G为2：3。19、这对夫妇基因型为MN、MN，子女1/4可能为MM（M血型），1/2可能为MN（MN血型），1/4可能为NN（N血型），六个孩子中有三个M血型，两个MN血型和一个N血型，先不考虑先后顺序，概率是1/4*1/4*1/4*1/2*1/2*1/4，再考虑顺序，可能第一个N型第二三四为M型第五六为MN型，还可能是……用排列组合算共有60种顺序，与前面的数值相乘，即得答案15/256。

各类探针制备如下：①DNA探针。通过随机引物标记法掺入荧光素标记的dUTP制备DNA探针。荧光素标记的dUTP也可通过切口平移法和PCR反应掺入DNA探针。②寡聚核苷酸探针。于寡聚核苷酸3′端加上一段由荧光素标记的dUTP短尾便成探针。反应产生的短尾具有较高灵敏度而又不影响杂交的严格性。③RNA探针。通过使用RNA聚合酶和含有对RNA聚合酶专一性的启动子构建成的质粒（或其他合适的质粒）来制备RNA探针。这一质粒作模板，以双链的形式供应，聚合酶仅能对其中的一条链进行转录产生单链RNA。如果使用的质粒在克隆的模板序列的两条链上均带有启动子，由此产生的反义链探针可与mRNA杂交，而正义链探针不应显示杂交信号，故可作为对照，证明杂交近程的专一性。

虽然这个问题很简单，但我怎么发觉挺难回答的......上游引物就是和要扩增基因片断上游序列结合的引物（引物就是单链寡聚核苷酸，基因扩增需要从引物开始），同理，下游引物指与目的基因片断下游序列结合者。具体示意如下：（上下两条长线代表dna模板）5"------------------------------------3"(无法控制输入格式啊)3"-----5"<----这个是下游引物5"----3"<--这个是上游引物3"------------------------------------5"我不太明白你的补充问题哈，再解释下：普通的pcr反应（就是用来扩增基因片断的反应），都是有且只有一个上游引物和一个下游引物的，也就是一对引物。因为dna有两条链啊，半保留复制方式，细节你可以去看看pcr反应原理或生物体的dna复制等内容。当然也有特殊的时候是单引物或多对引物同时进行扩增反应的。再另外，引物是一个核苷酸一个核苷酸合成的，一般是20个核苷酸左右的长度，不会用引物去扩增引物的。

pcr扩增时在突变位点会出现碱基减少检测基因多态性的方法有很多,包括你所说的PCR方法.以下是介绍.如果有这方面的实验需求的话,可以到我们百替生物来看看哦.我们专业提供生物医学技术服务!1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）：由DNA 的多态性,致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变,用限制酶切割基因组时,所产生的片段数目和每个片段的长度就不同,即所谓的限制性片段长度多态性,导致限制片段长度发生改变的酶切位点,又称为多态性位点.最早是用Southern Blot/RFLP方法检测,后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法.现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性.2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法.相同长度的单链DNA如果顺序不同,甚至单个碱基不同,就会形成不同的构象.在电泳时泳动的速度不同.将PCR产物经变性后,进行单链DNA凝胶电泳时,靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时,就会出现泳动变位（mobility shift）,多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变.3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法.在PCR扩增DNA片段后,直接与相应的寡核苷酸探杂交,即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子.其原理是：用PCR扩增后,产物进行斑点杂交或狭缝杂交,针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针,其中一个具有正常序列,另一个则具有突变碱基.突变碱基及对应的正常碱 基匀位于寡核苷酸片段的中央,严格控制杂交及洗脱条件,使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号,而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号,如果正常和突变探针都可杂交,说明突变基因是杂合子,如只有突变探针可以杂交,说明突变基因为纯合子,若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交,但能与相应的正常的寡核苷探针杂交,则表示受检者不存在这种突变基因.若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交,提示可能为一种新的突变类型.4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）.原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针,通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定.探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性,严格遵循碱基互补的原则.探针可用放射性同位素标记,通过放射自显影的方法检测,也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测.5. PCR-SSP法：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列,设计出一套针对每一等位基因特异性的（allele-specific）、或组特异性 (group-specific)的引物,此即为序列特异性引物（SSP）.SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合,通过PCR特异性地扩增该基因片段,从而达到分析基因多态性的目的.6. PCR-荧光法：用荧光标记PCR引物的5"端,荧光染料FAM和JOE呈绿色荧光,TAMRA呈红色荧光,COUM 呈兰色荧光,不同荧光标记的多种引物同时参加反应,PCR扩增待检测的DNA,合成的产物分别带有引物5"端的染料,很容易发现目的基因存在与否. 7. PCR-DNA测序：是诊断未知突变基因最直接的方法,由于PCR技术的应用,使得DNA 测序技术从过去的分子克隆后测序进入PCR直接测序.PCR产物在自动测序仪上电泳后测序.常用方法有：Sanger双脱氧末端终止法;Maxam-Gilbert化学裂解法；DNA测序的自动化.目前DNA顺序全自动激光测定法是最先进的方法.8. PCR指纹图法（PCR-fingerprints）：实用于快速的同种异型DR/Dw配型.在DR/DW纯合子及杂合子个体中,每种DR单倍型及每种单倍型组合所产生的单链环状结构的大小、数目和位置各异,由于同质双链和异质双链之间的分子构象不同.因此,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,它们的迁移率各不相同,从而获得单倍型特异的电泳带格局即PCR指纹.也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作为探针,同经过酶切的人体DNA作Southern blot,可以得出长度不等的杂交带,杂交带的数目和分子量的大小具有个体特异性,除非同卵双生,几乎没有两个人是完全相同的,就象人的 指纹一样,人们把这种杂交带图形称为基因指纹(gene finger-printing).9. 基因芯片法：又称为DNA 微探针阵列（Micro array）.它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针,通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配,与芯片特定位点上的探针杂交,利用基因芯片杂交图象,确定杂交探针的位置,便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列.这一技术已用于基因多态性的检测.对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光探针杂交技术可以大大提高芯片的准确性、定量及检测范围.应用高密度基因芯片检测单碱基多态性,为分析SNPs提供了便捷的方法.10. AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法AFLP技术是一项新的分子标记技术,是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段,基因组DNA先用限制性内切酶切割,然后将双链接头连接到DNA片段的末端,接头序列和相邻的限制性位点序列,作为引物结合位点.限制性片段用二种酶切割产生,一种是罕见切割酶,一种是常用切割酶.它结合了RFLP和PCR技术特点,具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性.由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带,而在另一品种中可能无此谱带产生,因此,这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记.AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段.以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术.11. DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法变性梯度凝胶电泳法 DGGE法分析PCR产物,如果突变发生在最先解链的DNA区域,检出率可达100％,检测片段可达1kb,最适围为100bp-500bp.基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时,DNA发生部分解链,电泳适移率下降,当解链的DNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离.由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测,需要一套专用的电泳装置,合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹,以利于检测发生于高熔点区的突变.在DGGE的基础上,又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）.DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置,该法一经建立,操作也较简便,适合于大样本的检测筛选.12. RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记.这种方法即为RAPD( Random amplified polymorphic DNA,随机扩增的多态性DNA).尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面.该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性.RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3"端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变.通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性.分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组.因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测.另外,RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析.

基因不是随机排列成的DNA片段！基因的碱基序列是特定的，是具有特异性的，不是随机排列的！如果把碱基随机排列，不一定是具有遗传效应的！遗传效应，必须是特定的碱基排列！

美容院的“漂白技术”对先天的黑皮肤作用不大，看过不少女士去漂，可真正变白的没见着几个，认识一个刚开始还漂得不错的，后没过几个月又黑回去了。原来所谓的“漂白剂”大都含有剧毒，最毒成份的就是汞（水银），而漂白原理就是把表皮层中的黑色素下沉到真皮层，而并非令黑色素消失。所以，变白只是表面现像。但皮肤是不断新陈代谢的，所以不用多久肤色又会变成原来的样子。如果继续漂白，就是再令黑色素下沉，而当黑色素下积压到一定程度，就会返黑，令皮肤比以前更黑。如果长期如此，会令皮肤患“黑皮症”，此时变白不成反毁容。这还不是最严重的后果。如果长期大量使用漂白剂，基中的剧毒会令人的皮肤，骨骼，内脏甚至大脑都会受到损害！黑色素皮肤里的黑色素由黑素细胞合成。在黑素细胞中，酪氨酸酶将酪氨酸合成一种叫“多巴”的物质。“多巴”与半胱氨酸反应生成黑色素。因此酪氨酸酶是合成黑色素的最关键因子。随后，黑色素被运送到表皮细胞中，像砖头一样堆砌起来，保护DNA免受紫外线伤害。而紫外线又能激活酪氨酸酶的活性，促使更多的黑色素合成。所以，皮肤中黑色素的合成是一种人体自我保护机制。酪氨酸酶是合成黑色素的关键，因此目前的大多数皮肤美白产品都是在化妆品中添加了酪氨酸酶抑制剂，破坏酪氨酸酶活性，达到减少黑色素的目的。对苯二酚因为价格便宜、效果好，曾是使用最广泛的美白剂。后来有研究发现，它诱发白血病。自2001年起，欧洲已经禁止在化妆品中添加对苯二酚。此外，还有一些化学物也可以抑制酪氨酸酶，其中一些需要汞做催化剂。化妆品公司还致力寻找各种“纯天然”美白剂。根据它们的研究报告，一些植物提取物也具有抑制酪氨酸酶活性的作用。“高新技术”也被用于美白事业。2007年，法国某公司研制出一种含有反义寡聚核苷酸的美白产品。该公司研究人员的论文称，含反义寡聚核苷酸的美白产品，可以抑制皮肤细胞中酪氨酸酶基因的表达，美白效果达到30%。不过，反义寡聚核苷酸一般不容易进入细胞。这种外敷“基因治疗”法的真实效果不免令人怀疑。

1.1 高变异DNA 序列的发现1980 年，Wyman 和 White 在进行人体DNA 基因文库的研究中，筛选到一个随机DNA 片段，以其为探针进行RFLPs 分析，检测到8 个等位基因，平均杂合率超过75%，因此推测该位点的多态性来源于DNA 重排而非碱基突变，这是人类基因组中发现的第一个高变区（hypervariable regions，简称HVRs）。此后，人们在人类基因组中又陆续发现了其他一些高变区，如α-珠蛋白基因（Higgs 等 1981，1986）、胰岛素基因（Bell 等 1982）、脂蛋白基因（Knott等 1986）、D-Ha-ras 癌基因（Capon 等 1983）、Zata-珠蛋白基因（Goodbourm 等 1983）等基因的侧翼及肌红蛋白基因（Weller 等1984）的第一个内含子区域，都含有这种HVRs。这些高变区的共同特点为：都是由一短序列（即重复单位）首尾相连、多次重复而成，其多态性来源于重复单位的重复次数不同。同一高变区的这些重复单位还具有高度的保守性，但因重复单位的重复数目不同，形成了众多的等位基因。这些高变区后来被叫做小卫星（minisatellite）（Jeffreys 等 1985a），有的人又称其为可变数目串联重复序列（variable number of tandemrepeat，简称VNTR）（Nakmura 等1987）。在小卫星DNA 内，重复单位数目的高度变异是由于不等交换所造成的，换言之，即在有丝分裂时的姊妹染色单体（sister chromatids）或减数分裂时的同源染色体间互换所致。有时候，发现DNA 链架突变的发生频率高于点突变，其频率为每世代每千个核苷酸对在10－ 5～10－ 2。虽然不等互换导致重复单位数目增加或减少，但不同重复的形成却是由于点突变造成的。此外，基因转换（gene conversion）与重组似乎在同源性的维持上扮演着重要的角色。在DNA 复制期间的滑动复制（slippage）是重复单位内简单序列 （1～4 个核苷酸对）演化的机制（Wolf 等 1989）。故有丝分裂或减数分裂时不等互换、基因转换及滑动复制，均足以导致重复单位间同源性的维持及重复单位数目的变化。大多数重复序列单位共有一个约 10～15 个核苷酸对的核心序列（core sequence），此核心序列高度地保留于相关的小卫星DNA 家族中，它是重组信号，可能是真核生物DNA 重组交换的热点，可促进小卫星DNA 的不等交换（Jeffreys 等 1985a；Wyman 等 1990）。核心序列是重复单位间序列相似的基础。在小卫星DNA 区域内，同源染色体可能有不同数目的重复单位，利用限制性内切酶可产生DNA 指纹。由此可见，串联重复序列的高度变异性与其特殊的结构密切相关。然而，基因组中此类串联重复序列的真实生物学功能至今仍不清楚。1.2 DNA 指纹图谱的发现1985 年，英国来斯特大学遗传系的Jeffreys（1985a）及其同事在《Nature》杂志上报道了他们对人体基因组高变区的突破性研究。他们用肌红蛋白基因第一个内含子中的串联重复序列（重复单位长33bp）作探针，从人的基因文库中筛选出8 个含有串联重复序列（小卫星）的重组克隆。经序列分析，发现每个克隆都含有一个长0.2～2.0kb、由重复单位重复3～29 次组成的小卫星DNA。尽管这8 个小卫星的重复单位的长度（16～64bp）和序列不完全相同，但都含有一段相同的核心序列，其碱基顺序为 GGGCAGGAA。他们用 16bp 重复单位（主要为核心序列）重复29 次而成的小卫星33.15做探针，与人基因组酶切片段进行Southern 杂交，在低严谨条件下杂交产生由10 多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置是千差万别的。随后他们用另外一个小卫星探针33.6 进行测试，获得了类似的图谱。这种杂交图谱就像人的指纹一样因人而异，因而Jeffreys（1985b）等人称之为DNA 指纹图谱（DNA finger print），又名遗传指纹图谱（genetic finger print）。产生DNA 指纹图谱的过程就叫做DNA 指纹分析（DNA finger printing）。1.3 DNA 指纹图谱的特点DNA 指纹图谱具有以下3 个基本特点：（1）多位点性：基因组中存在着上千个小卫星位点，某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。一般来说，一个DNA 指纹探针（又称多位点探针）产生的某个个体DNA 指纹图谱由10～20 多条肉眼可分辨的图带组成。由于大部分杂合小卫星位点，仅一个等位基因出现在图谱的可分辨区内（两个等位基因由于重复单位、重复次数不同，在长度上差异很大），因而每条可分辨图带代表一个位点。很多的研究表明，个体DNA 指纹图谱中的带很少成对连锁遗传，所代表的位点广泛地分布于整个基因组中（Burke 等1987；Hiu 等1985）。一个传统的RFLPs 探针一次只能检测一个特异性位点的变异性，所产生的图谱一般由l～2 条带组成，仅代表一个位点。因此两者比较而言，DNA指纹图谱更能全面地反映基因组的变异性。（2）高变异性：DNA 指纹图谱的变异性由两个因素所决定，一是可分辨的图带数，二是每条带在群体中出现的频率。DNA 指纹图谱反映的是基因组中高变区，由多个位点上的等位基因所组成的图谱必然具有很高的变异性。DNA 指纹图谱在个体或群体之间表现出高度的变异性，即不同的个体或群体有不同的DNA 指纹图谱。一般选用任何一种识别4 个碱基的限制性内切酶，这种变异性就能表现出来。Jeffreys 等 （1985b）对人的DNA 指纹图谱的研究表明，DNA 指纹图谱中的大部分谱带都以杂合状态存在，平均杂合率大于70%，某些大片段的杂合率甚至高达100%。用探针33.15 进行DNA 指纹分析时，发现两个无血缘关系的个体具有相同DNA 指纹图谱的概率仅为3× 10－11；而将探针33.15 和33.6 产生的DNA 指纹图谱综合起来分析时，则这种概率为5×10－19，可见DNA 指纹图谱具有高度的个体特异性。但是，同卵双胞胎的DNA 指纹图谱是相同的，因其有完全相同的基因组（Hiu 等1985）。值得注意的是，由于琼脂糖凝胶电泳分辨率的限制，DNA 指纹图谱大片段区域的变异性往往很高，而小片段区域的变异性则很低，因此在实际操作时往往将小于 2kb 的小片段跑出胶外或不作统计。（3）简单而稳定的遗传性：Jeffreys 等（1985a）通过家系分析表明，DNA 指纹图谱中的谱带能够稳定地从上一代遗传给下一代。子代DNA 指纹图谱中的每一条带都能在其双亲之一的图带中找到，而产生新带的概率（由基因突变产生）仅在0.001～0.004 之间。DNA 指纹图谱中的杂合带遵守盂德尔遗传规律，双亲的各图带平均传递给50%的子代。DNA 指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的DNA 做出的DNA 指纹图谱是一致的（Gill 等1985），但组织细胞的病变或组织特异性碱基甲基化可导致个别图带的不同。1.4 DNA 指纹图谱的应用由于DNA 指纹图谱具有多位点性、高变异性、简单而稳定的遗传性，因而自其诞生就引起了人们的重视，表现出巨大的实用价值。DNA 指纹图谱的高变异性和体细胞稳定性可用于鉴定个体，这对法医学上鉴别犯罪分子和确定个体间的血缘关系极有价值（Jeffreys 等1985b，1985c）。如我国公安部利用DNA 指纹图谱已侦破数百例疑难案件。其简单的遗传性可用来鉴定亲子关系，其多位点性可用来检测目标基因组的病变及治疗等过程中的改变情况。1987 年Burke、Jeffreys 和Wetton 等报道了用人源核心序列小卫星探针33.6 和33.15 检测到哺乳动物到鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫等的高变异小卫星，产生具有个体特异性或类群特异性的DNA 指纹图谱。1988 年，Dallas 用人源小卫星探针33.6 获得了水稻的DNA 指纹图谱。随后，美国华盛顿大学生物系Nybom 等人对果树植物的DNA 指纹图谱进行了大量的研究。1989年，Braithwaite 和Manners 首次将人源小卫星探针33.6 和33.15 用作真菌的DNA 指纹分析获得了成功，从而进一步证明DNA 指纹技术具有广泛的适用性。这些发现使DNA 指纹图谱成为研究动植物群体遗传结构、生态与进化、分类等很有价值的遗传标记。1.5 DNA 指纹图谱的研究进展1.5.1 DNA 指纹分析的探针两个最早的DNA 指纹探针是1985 年Jeffreys 及其同事所发现的人源小卫星探针33.6 和33.15（Jeffreys 等 1985a）。1987 年，Vassart 等发现无外源DNA 片段的细菌噬菌体M13 本身就能够作为一个DNA 指纹探针检测出人和动物基因组中的高变异小卫星DNA，其有效序列是蛋白质 Ⅲ 编码区内的两个小卫星序列。从此，M13 便也成为各种动植物重要的DNA 指纹探针（Gatei 等 1991；Kuhnlein 等 1989）。另一个在人和动物上广泛应用的 DNA 指纹探针是3&acute;HVR（Jarman 等 1986），它来源于人α-珠蛋白的3&acute;端的一个高度重复区。以上4 个小卫星探针的重复单位的序列结构如下所示：33.6（AGGGCTGGAGG）333.15（AGAGGTGGGCAGGTGG）M13（GAGGGTGGNGGNTCT）3&acute;HVR（GNGGGGNACAG）从迄今已有的报道来看，在DNA 指纹分析中用得最多的多位点小卫星探针为33.6、33.15、M13 及3&acute;HVR。此外，人们还从某些动物的基因组中分离克隆了一些小卫星DNA 用作DNA 指纹探针。如牛的小卫星探针PSRC-7（ Plante 等 1991）和猪的小卫星探针pS35（Coppieters 等 1990）。人工合成的简单重复序列微卫星探针也广泛地用于DNA 指纹分析，如（GTG）5 、（TG）8、（AT）8、（TCC）5 、（GACA）4。从基因组中分离克隆的微卫星DNA 指纹探针有PGB725 （牛）（Kashi 等 1990）和 R18.1 （猪）（Haberfield 等 1991）。 孟安明（1993）发现，任何一个动物个体的基因组总DNA 可标记作为DNA 指纹探针（基因组探针），在该个体所属物种及其他相关物种上产生具有个体特异性的杂交图谱。以基因组探针进行DNA 指纹分析不需通过复杂的操作来获得探针DNA，有利于DNA 指纹技术的推广。1.5.2 DNA 指纹图谱的重要发展DNA 指纹图谱的重要发展是微卫星DNA 指纹图谱。微卫星（microsatellite）是由2～6 个核苷酸组成的重复单位串联排列而成的DNA 序列。据估计，在真核生物基因组每10kb 的DNA 序列中至少有一个微卫星（Tautz 1989），如人体基因组中仅二核苷酸串联重复的微卫星就多达 50 000～100 000 个。大多数微卫星的长度小于 200bp，但也有更长的微卫星。微卫星不同于小卫星，它们广泛分布于很多结构基因的内含子、基因间隔区甚至调控序列中（Tautz 等 1984；Weising 1989；Ishii 等 1985）。早在1974 年，Skinner 等就在寄居蟹（hermit crab）基因组中发现了微卫星DNA，当时叫做简单串联重复序列（simple tandem repeat）。Singh 等人在1980 年发现蛇的W 性染色体上也存在着这种序列，它是由GATA/GACA 重复单位组成的。以后的研究表明，在真核生物甚至原核生物的基因组中都普遍存在这种序列（Jones 等 1981；Tautz 等 1986）。直到1986 年，Ali 等人首次用合成的GATA/GACA 寡聚核苷酸作探针用于人的DNA 指纹分析，成功地开创了利用微卫星DNA 探针进行DNA 指纹分析这一新的领域。微卫星探针易于合成，可直接与固定在干胶中的DNA 片段杂交，所检测的位点普遍具有高度的变异性。1988 年，Schafer 等人进一步发展了这门技术，使寡聚核苷酸（微卫星）分析技术又一次得到了完善。迄今为止，合成的各种寡聚核苷酸（微卫星）已成功地应用于人和近百种动植物的DNA 指纹分析（Buitkamp 等 1991a，1991b；Schafer 等1988；May 等 1991；Nuraburg 等 1989；Hubert 等 1990；Lonn 等1992；Biermerth 等 1992；Caetano-Anolles 等 1991）。从已有的报道来看，适用范围广、变异性高的微卫星探针主要有（GTG）n、（GT）n、（GATA）n、（GACA）n、（GAG）n 等（Buitkamp 等1991a，1991b）。1.5.3 PCR 在DNA 指纹分析中的应用PCR 是一种在体外大量扩增DNA 的方法。在法医研究上，由于所检验的材料量（如血斑、精斑、发梢）极微，因此很难获得常规Southern 杂交所需的DNA 量，利用PCR 就可以解决这一问题。Jeffreys 等（1988）根据多个小卫星的已知侧翼序列来合成引物（每个小卫星两个引物）。先以极微量（ 甚至单个细胞 ）的人类基因组DNA 为模板进行体外扩增（产物可长达10kb），然后再用这些小卫星的混合探针进行Southern 杂交，得到了可以重复做出的具有高度变异性的DNA 指纹图谱。1.5.4 单位点高变异性小卫星和微卫星探针的开发DNA 指纹图谱虽然具有很多的优点，但并非完整无缺。第一，DNA 指纹图谱中每一个个所含图带数很多，给统计分析带来了许多麻烦。例如，在比较个体之间的DNA 指纹图谱时，如果某两条带的位置相差很小，那么就很难判断它们是否来自同一位点上的同一等位基因，也许是由于实验操作过程中凝胶变形等引起的误差影响了分析结果的准确性。第二，DNA 指纹图带的分辨率很难提高，特别是较小的DNA 片段因难以分开而呈现很低的变异性；长度相差不大的DNA 片段无法通过电泳分开。第三，DNA 指纹图谱不能区分杂合体和纯合体。在进行DNA 指纹图谱统计分析时，人们假定图中每一条带分别代表不同的位点，但实际上，如果某一位点是杂合的，那么此位点在DNA 指纹图谱上会拥有两条带，也就是说在DNA 指纹图谱上应有两条带代表同一个杂合位点上的不同等位基因。因此，有时以DNA 指纹图谱分析得到的结果与真实情况也会有所不同。第四，对于某一个位点来说，往往只有一个等位基因出现在DNA 指纹图谱上，因此无法根据DNA 指纹图谱确定个体在该位点上的基因型。为了克服DNA 指纹图谱的上述缺点，人们已开始重视单位点探针的开发。所谓单位点探针，是指只是特异性与某一位点上的等位基因杂交的探针。由于真核基因组中的小卫星和微卫星位点普遍具有高度的变异性，因此它们是高变异单位点探针的重要来源。基因组中的小卫星位点有数千个，微卫星位点更达数十万个，通过用现有的多位点小卫星和微卫星探针筛选基因文库，可以得到众多的高变异单位点探针。迄今为止，国外一些单位已从猪、马、鸡、牛等的基因组中分离、克隆了数百个小卫星和微卫星探针，这些探针将是构建有关畜禽基因图谱的基础。1.5.5 其他方面的进展双向电泳（two-dimensional electrophoresis）的应用，使 DNA 指纹图谱的容量大大增加（Uitterlinden 等 1989）。变性凝胶电泳可以更有效地分辨等位基因（Uitterlinden 等1989）；电极反转电泳（field inversion gel electrophoresis）提高了 DNA 指纹图谱中大片段的分辨率（Fowler 等 1988）。由于DNA 指纹图谱在实验技术和统计方法上一直处于不断的改进之中，因此我们深信在不远的将来，DNA 指纹分析技术必将在医学、畜牧业、农业乃至整个生物领域得到更加广泛的应用。

Qβ复制酶反应 Kacian等于1972年首次报报Qβ复制酶催化RNA模板的自我复制功能，它能在常温30min，将其天然MDV扩增至109.1986年Chu等报道用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV杂交，经洗脱未被结合的MDV后，再加入Qβ复制酶，扩增复制MDV拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同源性的第二探针杂交. Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点:①不需寡核苷酸引物的引导就可启动RNA的合成.②能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有的RNA折叠结构.③在Qβ复制酶的天然模板MDV的非折叠结构区插入一短的核酸序列不影响该酶的复制.因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被Qβ复制酶扩增. 1988年Lizardi等，将靶基因序列插进MDV质粒里，用T7RNA聚合酶催化转录出MDV探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针，加入Qβ复制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增.其产物按上述两种方法进行检测.现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复制等技术. 其扩增状况，此法可用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等. 反向PCR 反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.不对称PCR 不对称PCR是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1.在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物低浓度引物消耗完后，非限制性引物高浓度引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例.还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键DNA，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA.不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定. 重组PCR 使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR，1986年报道了由PCR扩增的两个DNA片段通过重组合后再经延伸而制备出新的DNA分子.其基本原理为将突变碱基，插入或缺失片段，或一种物质的几个基因片段均设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增.其产物将是一重组合的DNA.重组PCR主要用于位点专一碱基置换，DNA片段的插入或缺失DNA片段的连接(如基因工程抗体多重PCR 一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.免疫PCR 免疫试验的主要步骤有三个:①抗原抗体反应，②与嵌合连接分子结合，③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA一般为质粒DNA该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原. 免疫PCR优点为:①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.②敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测.③操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行. ☆ PCR用于进化分析 进化遗传学具有两个并列的研究方向：系统发育的重建和种群分析。自1962年， Zuckerkandl和Pauling提出蛋白质序列和基因序列的比较可以象分子种一样用于标志现存物种分化的时间以来，各种生化方法被用于系统发育的研究。在最初二十年内，同功酶的电泳分析、免疫学比较和蛋白质序列分析被广泛地应用。而最近，DNA杂交和核糖体RNA序列分析为分类学做出了重要贡献。这些技术大多有局限性，因为它们是估计而不是直接测量序列的差别。 ☆ 反向聚合酶链反应 通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两 侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上 的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体要得到边侧序列的探针一般需要进行一系列费时、费力的工作，首先用内切酶裂解和 用已知边侧序列的探针Southern杂交以确定大小适合于克隆的末端片段;这些片段还 要经过凝胶分离、克隆，得到的物质再与已知边侧区域杂交以确定合适的克隆子。要 测定未吞边侧区序列时，通常需要从克隆中进行各种片段的亚克隆。 为避免这些步骤，我们采用扩展的PCR方法，使相邻边侧区域得以扩增。典型的PCR扩增使用与互补链杂交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向内跨过两个引物之间的区域。一个引物的DNA合成产物作为另一个引物的模板，进行DNA变性、引物退 火，DNA聚合酶管伸反应的多次重复性循环，可使引物规定区域的拷贝数成指数增 加。但用传统PCR方法得不到紧邻引物外侧的DNA序列，因为寡聚核苷酸所引导的既有 目的DNA又有引物外侧区的DNA合成在拷贝过程中只呈线性增长，这种线性增长是因 为，对于每种引物来讲，其不能引导DNA反向合成几乎是同时，有三个实验室分别设计出一种方法，使PCR可以扩增边侧区域。该方法反向PCR的基本点是用适当内切酶裂解核心区外分子，使这些酶切片段自身连接形成环状分子，从而将边侧区域转化为内部区域。反向PCR程序 用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3kb。在许多情况下，首先 需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板依赖于引物的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类 型决定的接点例如，互补突头连接与钝头连接。对于扩增左翼或右翼序列，初试时 最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向 PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入 合适的酶切位点。 用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环 化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理钝化。连接前，需用酚或热变性使内切 酶失活。在我们实验中，不必裂解环状分子核心区也可得到有效的PCR扩增。这显然不同于Silver和Keerikatter[7]的实验结果，他们报道在核心裂解使模板线性化后，PCR扩增率增加100倍，但Triglia等则发现裂解环状分子与加热引起随机缺口效果相同。反向PCR的应用 反向PCR的应用已经证明该方法可以避免不方便的克隆和亚克隆步骤，因此可解决大 量问题。我们最初用反向PCR扩增E.coli天然分离物中转位插入序 列ISL的边侧序列;Triglia等将反向PCR用于编码疟原虫主裂殖子表面抗原前体的基因，在实验中，他们用RsaⅠ酶裂解基因组DNA，连接，得到的环再用HinfⅠ在内部位点酶切，然后进行扩增，得到预期的297bp大小的片段，并用DNA直接测序进行鉴定。他们认为反向PCR由于具有从全长cDNA得到序列信息的优 点，将对步查现转录基因的5端或3端的边侧区域有用。 反向PCR的另一个应用是Silver和Keerikatte进行的。他们将其应用于扩增拉于整合在小鼠细胞中的外生原病毒DNA边侧的细胞DNA。除强调反向PCR在染色体“步查” 或“跳查”中的用途，他们还指出，该技术用于扩增特征性弱的序列，这 些序列在E.Coli或其他宿主载体系统中很骓或不能克隆。

虽然这个问题很简单，但我怎么发觉挺难回答的......上游引物就是和要扩增基因片断上游序列结合的引物（引物就是单链寡聚核苷酸，基因扩增需要从引物开始），同理，下游引物指与目的基因片断下游序列结合者。具体示意如下：（上下两条长线代表dna模板）5"------------------------------------3"(无法控制输入格式啊)3"-----5"<----这个是下游引物5"----3"<--这个是上游引物3"------------------------------------5"我不太明白你的补充问题哈，再解释下：普通的pcr反应（就是用来扩增基因片断的反应），都是有且只有一个上游引物和一个下游引物的，也就是一对引物。因为dna有两条链啊，半保留复制方式，细节你可以去看看pcr反应原理或生物体的dna复制等内容。当然也有特殊的时候是单引物或多对引物同时进行扩增反应的。再另外，引物是一个核苷酸一个核苷酸合成的，一般是20个核苷酸左右的长度，不会用引物去扩增引物的。

一,限制性内切酶(Endonucleosase) (一)限制性内切酶(Endonucleosase)的发现与分类 1) 50年代初发现细菌能将外来 DNA 片段在某些专一位点上切断,从而保证其不为外来噬菌体所感染,而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护,这种现象叫做限制-修饰,它们由三个基因位点所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年后,人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理: hsd R---限制性内切酶 hsd M---限制性甲基化酶 hsd S---控制两个系统的表达 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶,Hind II和Hind III,为基因工程技术的诞生奠定了基础. 截止到目前为止,已经分离出400余种II类酶,搞清识别位点的有300种,商品化的约有一百种,而实验室常用的有二十种 . 2)限制性核酸内切酶可分为三大类: I类 能识别专一的 核苷酸 顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性. II类 识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断 III类 识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部. 因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶. (二)II类限制性内切酶的命名及特性 命名原则:取属名的第一个字母大写,取种名的前两个字母小写,构成基本名称.该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等.如存在变种和品系,取变种或品系的一个字母.若酶存在于质粒上,则需大写字母表示非染色体遗传因子. 如,HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶.EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上. (三)II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4,5,6碱基对,这些碱基对的顺序呈回文结构(Palindromic),而且切点就在其内部,如EcoRI 5"-GAATTC-3" . DNA被限制性内切酶切开之后,呈现两种断口: 钝端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等 粘端(粘性末端)如:EcoR I等 图2-1 限制性内切酶产生的末端 (四)识别位点在DNA分子中的频率 对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸(44)有一个识别位点,而六碱基的酶大约4096(46)个核苷酸有一个识别序列,计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的.实践中这种方法不完全正确,如λ DNA长49kb,对于六碱基的酶应该有12个切割位点,实际上要少一些,如Bgl II只有6个,BamHI只有5个,而SalI只有2个. 二,甲基化酶 在专一位点上甲基化,与限制性内切酶相对应. (一)大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶: 可在5"GATC3"序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,这样可使一些识别顺序中含有5"GATC3"的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)则不会因为N6A的甲基化而失去活性,因为这两种酶对底物的特异性不同. dcm甲基化酶 此酶在序列5"CCAGG3"或5"CCTGG3"中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影响的限制性内切酶是EcoR II. (二) 甲基化酶在基因工程中用途 许多II类限制性内切酶,都存在着相对的甲基化酶,它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上,封闭酶切位点,从而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上,从而使DNA免受EcoRI的切割. 三,T4-DNA连接酶(T4-DNA Ligase) 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,连接修复3"端羟基和5"端磷酸基因,脱水形成3"-5"磷酸二酯键 连接双链DNA上的单链缺口(Nick),因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端 连接RNA模板上的DNA链缺口 连接平头双链DNA速度很慢,在高浓度的底物和酶的作用下方可进行,这属于分子之间的连接. 四,核酸酶 作用: 降解磷酸二酯键 分为:外切酶 内切酶 (一) Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性,双链特异的内切酶活性.依赖于Ca2+ 用途: 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化 (二)E. coli外切酶III 只降解DNA分子的一条链,产生单链的DNA分子. (三)S1核酸酶(来源于米曲霉菌) 特性: 1. 降解单链DNA或RNA,降解DNA的速度大于降解的速度 2. 降解发生的方式为内切和外切 3. 酶切活性需4.0-4.5pH环境,Zn2+激活 4. 酶量过大时会降解双链核酸,因为双链降解活性比单链低75000倍 (四) DNase I: 来自于牛胰腺, 既可以降解单链也可以降解双链,没有特异性,产生单核苷酸或短链 五,聚合酶 (一)DNA聚合酶I 5"-3"聚合酶活性 3"-5"外切酶活性 5"-3"外切酶活性 核酸内切酶活性 可以被枯草杆菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5"-3"外切酶活性的分子. (二) Klenow酶 该酶无5"-3"外切活性,保留了5"-3"聚合活性及3"-5"外切活性,基因工程中利用该酶: 修复限制性内切酶造成的5"突出的粘性末端 标记DNA探针 催化cDNA第二条链的合成 末端终止法测序 图2-4 Klenow 酶的作用方式 (三) T4 DNA聚合酶 与Klenow酶相似,外切酶活性更高.体外诱变反应中效率很高. (四)T7 DNA聚合酶 测序酶 (五) Taq DNA聚合酶 耐高温,主要用于 PCR 反应. (六) 逆转录酶:将mRNA转录成cDNA AMV逆转录酶(鸟类成髓细胞性白血病病毒) DNA聚合酶活性 RNase H活性 DNA内切酶活性 核酸结合活性 M-MLV逆转录酶(Moloney鼠白血病病毒) 两种逆转录酶的区别 肽链的组成 禽酶2条肽链,具聚合酶和很强的RNase H活性 鼠酶1条,较弱的RNase H活性 反应的最适温度 禽酶42°C,二级结构丰富RNA,禽酶效率高 反应的最适pH值 禽酶pH 8.3 鼠酶pH 7.6 六,DNA修饰酶 有大量的修饰酶,主要的有以下几种: 1) 碱性磷酸酯酶(来自于大肠杆菌或小牛肠道)可以去掉DNA分子的5"端的磷酸基团. 2) polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌,在5"端增加磷酸基团. 3) 末端脱氧核苷酸 转移酶 (terminal deoxynucleotidyl tansferase) 来自于小牛胸腺 组织 ,在DNA分子的3"端增加一个或多个脱氧核苷酸. 4) Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构 第二节 DNA的切割反应 一,缓冲系统的组成 II类酶的酶活条件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM 根据不同酶对盐离子要求不同,可将缓冲液分为以下三种情况: 高盐:100-150mM 中盐:50-100mM 低盐:0-50mM 二,酶切操作 DNA量的确定,加入酶量的确定,发应体积的确定(20μl),反应时间的确定,1-1.5hr,一般为37℃,但也有例外,如Taq I在65°C时活性最高. 单位限制性内切酶定义为:在最佳缓冲系统和20μl体积中反应1小时,完全水解1μgDNA所需的酶量. 三,酶切结果分析 (一) 酶切片段的检测 1) 通过凝胶电泳分离,根据分子量分离.根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段,聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子. 2) DNA分子的检测 a. 染色EB,DNA分子小于25ng,很难检测到 b. 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子. (二)估计DNA分子的大小 根据DNA分子的迁移率,可以用公式计算出分子量D=a-b(logM) D是移动的距离,M是分子量,a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变. 也可以根据已知大小的片段进行比较,误差约在5%左右. 四,多酶联合酶解 对于对浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶解; 对于对浓度要求不同的酶,可以: 1. 低盐浓度的酶先切,后补加NaCL 2. 一种酶切后,换缓冲液,加5mM NaAc 0.1体积,2体积乙醇,冰浴5min,4℃离心10min, 干燥 五,定位酶切位点 建立酶切图谱需要一系列的酶. 首先确定每一种酶切后产生的分子量和片段的数目; 然后进行双酶切; 比较酶切和双酶切的结果,绘制酶切图谱; 含糊的位点可以通过部分酶切解决,可以短时间的酶切或者在4°C条件下进行. 六, 限制性内切酶的star活性 在PH不合适,或甘油浓度过高≥10%时,限制性内切酶的切割位点会出现非专一性,因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下. 第三节 DNA片段的连接 重组DNA分子构建的最后一步是连接,通过连接酶完成.相对而言,钝端的连接效率较低,因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会.而粘性末端的连接效率较高,因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对.这种暂时的,碱基配对结构可以提高连接的效率.在分子克隆的连接方式主要有以下几种: 一,连接方式 (一)相同粘性末端的连接 来源: 相同的酶 同尾酶 问题: 极性有两种可能 同尾酶连接后,不能用任何一种酶酶切.称为"焊死". (二)平头末端的连接 粘性末端--分子内部连接,平头末端--分子间的连接. 提高连接效率的方法: 加大酶用量(10倍) 加大平头末端底物的浓度 加入10%PEG(8000),促进分子间的有效作用 加入单价阳离子, 150-200mM NaCl 提高反应温度 平头连接同样存在两种极性 (三)不同粘性末端的连接 突出5"末端 Klenow补平,或S1核酸酶切平,然后平头连接 突出3"末端 T4-DNApol切平,然后平头连接 突出末端不同 Klenow补平,或S1核酸酶切平 连接后,可能恢复限制性位点,甚至还可能产生新的位点.XbaI与HindIII( XbaI恢复), XbaI与EcoRI(均保留),BamHI与Bgl II(产生ClaI位点) (四)人工粘性末端的连接 5"突出的末端 外源片段先用Klenow补平;然后用TdT补加polyC;载体片段也用Klenow补平,加polyG,退火不经连接即可转化.目的是:不使酶切位点遭受破坏. 3"突出的末端 外源片段先用TdT加polyG;载体片段加polyC;然后退火;再用Klenow补齐;连接 平头末端 可直接用TdT补加末端,但以加polyA/T为佳.这样稍微 加热 ,AT区就会出现单链区域,然后用S1核酸酶水解即可回收片段 (五)粘端与平端的连接 linker : 人工合成的,含有限制性内切酶识别序列的,短的双链DNA片段. – 连接的效率较高 – 酶切时可能破坏DNA分子的完整. adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸. (六)粘性末端的更换 在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口 – BamHI酶切片段用Klenow补平,或用S1酶切平;连接一段linker或Adaptor,使之产生EcoRI粘性末端.这样BamHI切口就换成了EcoRI切口 . – 由AluI更换EcoRI:AluI切开,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切开,Klenow补平,连接,原来含有AluI的片段变成含有EcoRI 二,重组率 重组率:连接反应结束后,含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比.较为理想的重组率为25-75% 提高重组率的方法: 连接反应条件 外源片段:载体=2:1-10:1(分子数),增加碰撞机会,减少自身环化. 载体除磷 (磷酸酯酶5"除磷). TdT在3"端增加人工粘性末端,防止载体自我环化 (责任编辑：大汉昆仑王)

发表学术论文40余篇，代表如下：[1] 刘红、魏东芝. 反义核酸药物硫代磷酸酯寡聚核苷酸，药学进展，1997，21（1）：1-7.[2] 刘红、魏东芝. 反义硫代磷酸酯寡聚核苷酸及其及专一性问题，中国药物化学杂志，1997，7（2）：152-156.[3] 刘红、魏东芝. 氧载体对L-天冬酰胺酶发酵过程影响的研究，生物工程学报，1998，3：298-302.[4] D.zh.Wei and H.Liu. Promotion of L-asparaginase production by using n-dodecane，Biotechnology Techniques，1998,12（2）：129-131.[5] 刘红、潘红春. 液膜萃取技术在生物工程领域的应用研究进展，膜科学与技术，1998,18（3）：10-14.[6] 刘红、潘红春、钟世荣. 大肠杆菌L-天冬酰胺酶的分离纯化及其特性，中国生物制品学杂志，2002，15（2）：93-96.[7] 刘红、蔡绍皙、潘红春. 溶氧对L-天冬酰胺酶发酵的影响及其控制，中国生物制品学杂志，2003，16(6)：345-347.[8] 刘红、潘红春、蔡绍皙、杨红涛、朱列文. 大肠杆菌重组人成骨蛋白-1的非诱导表达特性，中国生物制品学杂志，2004，17(6)：354-357.[9] 刘红、潘红春、蔡绍皙、陈真文、郑小峰、杨红涛、肖中元. 发酵条件对毕赤酵母表达重组人干扰素ω糖基化的影响，生物工程学报，2005，21（1）：107-112.[10] 潘红春、刘红、王伯初、杨红涛、陈真文、周玲. 重组人成骨蛋白-1在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达，中国生物制品学杂志，2005，18(2)：104-106.[11] Hong Liu, Hong-chun Pan, Li Peng, Shao-xi Cai. RP-HPLC determination of recombinant human interferon omega in the Pichia pastoris fermentation broth. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 38(4): 734-737.[12] 潘红春、刘红、王伯初、陈真文、郑小峰、杨红涛、肖中元. 重组人干扰素ω在对数生长期毕赤酵母中的高效表达特性. 微生物学报, 2006, 46(3): 418-421.[13] 潘红春、刘红*、程永刚、彭力、徐波、杨红涛. 聚乙二醇修饰重组人干扰素ω的过程优化. 化工学报，2011，62（10）：2876-2884.[14] 刘红、程永刚、潘红春、徐波、彭力、杨红涛、郭伟. 单链聚乙二醇化重组人干扰素ω 的制备及其性质. 药学学报，2012, 47（3）：393-398.[15] 刘红，王芬，刘丽，杨敏，谢增琨，王飞龙，潘红春. 稳态荧光法研究Tween 80/Solutol HS15体系的临界胶束浓度. 西南大学学报（自然科学版），2013，35（12）：170-176.[16] 潘红春，杨琴，苏秋菊，刘丽，刘红*. 单链PEG化重组人干扰素ω的结构和性能表征. 西南大学学报（自然科学版），2014，36（2）：7-13.[17] M. YANG, L. LIU, Q-J. SU, H. LIU*, Z-K. XIE, H-C. PAN. Preparation and characterization of creatine phosphate sodium. Latin American Journal of Pharmacy, 2014, 33 (4): 658-665.[18] 毛凯，杨琴，刘丽，潘红春，魏利华，刘红*. 低聚异麦芽糖铁配合物的制备工艺优化. 食品科学，2014，35（22）：101-106.[19] Zengkun Xie, Lihua Wei, Qin Yang, Min Yang, Hongchun Pan, Hong Liu*. A stability-indicating HPLC method for simultaneous determination of creatine phosphate sodium and its related substances in pharmaceutical formulation. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2014, 已接收.[20] 刘丽，苏秋菊，毛凯，刘红*，魏利华，潘红春. 辅酶Q10-Tween80增溶胶束的制备与稳定性评价. 中国新药杂志，已接受.[21] 毛凯，马怡璇，潘红春，刘红*. 静脉补铁剂的研究进展. 中国新药杂志，已接受.

知道，但是没有悬赏分，不想回答！！^_^算啦locked nucleic acid. 锁核酸 (lockednucleicacid ,LNA)是一种新型的寡核酸衍生物 ,结构中 β D 呋喃核糖的 2" O ,4" C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥 ,呋喃糖的结构锁定在C3"内型的N构型 ,形成了刚性的缩合结构。LNA作为一种新的反义核酸 ,具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好及体内无毒性等优点。LNA在基因诊断和基因治疗上有很多优势 ,如 :单链核酸的多态性基因分型、LNA寡聚体具有高效抑制端粒酶活性及LNA修饰的DNA核酶 (LNAzymes)高效清除高级结构的RNA等 ,有良好的应用研究前景

　　不同的电泳法有不同的原理，下面是其不同的方法和原理。　　（一）一般是通过生化方法吧蛋白提取出来，蛋白质带有电荷么，是将混合样品中的蛋白质，其原理是第一向基于蛋白质 PI 不同用等电聚焦，电泳时的正极与负极都会发生电解反应，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。　　（二）利用溶解度差别　　影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。　　1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。　　5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。　　盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。　　3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。　　有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的吸引力。蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。　　水溶性非离子聚合物如聚乙二醇与蛋白质亲水集团发生相互作用并在空间上阻碍了蛋白质与水相接近。蛋白质在聚乙二醇中的溶解度明显的依赖于聚乙二醇的分子量。　　4、温度对蛋白质溶解度的影响：在一定温度范围内，约0~40℃之间，大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加，在40~50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。　　（三）根据电荷不同　　根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。　　1、电泳：在外电场的作用下，带点颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白质和核苷酸等生物分子的分析分离和制备。　　区带电泳是由于在支持物上电泳蛋白质混合物被分离为若干区带。　　电泳前用缓冲液浸润薄膜或滤纸等支持物或用缓冲液直接配置成凝胶，将待分离的蛋白质样品加在它的一端或中央，支持物的两端与电极连接，通电电泳。电泳完毕，各个组分分布在不同的区域，用显色剂（蛋白质可用考马斯亮蓝或氨基黑等染色）显色后可以显示出各个组分。　　氨基酸混合物特别是寡聚核苷酸混合物一次电泳往往不能完全分开。这种情况可以将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触印迹转移到第二个支持介质上，旋转90°，进行第二次电泳。这种方法称为双向电泳。　　2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的两部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分为分离胶），这两部分凝胶的浓度、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都是不同的，即不连续性。电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。　　电泳有三种物理效应：1、样品的浓度效应；2、凝胶对被分离分子的筛选效应；3、一般电泳分离的电荷效应。　　3、毛细管电泳：高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳、毛细管电泳，可分离氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段和核酸以及多种小分子，也可用于手性化合物的分离。　　毛细管减少了由于热效应产生的许多问题，可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。　　电泳迁移引起溶液中荷电分子向相反电荷的电极移动，虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而电渗作用使溶液向负极流动，而且电渗电流很强，其速度一般比样品的电泳速率答，因此所有的正、负离子和中性分子都被推向负极。对荷正电分子来说，电泳迁移和电渗流效果是一致的，而且移动最快，最先达到负极。随着被分离的分子接近负极，它们都将通过紫外检测器并把信号传递给记录仪。所得结果是被分离组分的紫外吸收对时间的峰谱。　　4、等点聚焦（IEF）分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的梯度处，并形成一个很窄的区带。　　pH梯度制作一般利用两性电解质，它是脂肪族多胺和多羧类的同系物，它们具有相近但不相同的解离常数和等电点。在外电场作用下，自然形成pH梯度。　　5、层析聚焦：根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。　　原理：当用特种缓冲液滴洗填充在柱中的特种多缓冲交换剂时，就会在层析柱中自上而下自动的建立起连续的pH梯度；同时加在柱上端的蛋白质样品也随多缓冲液的展开按各自的等电点聚焦在相应的pH区段。并在展开过程中随pH梯度下移，蛋白质混合物的各组分先后从柱中流出，达到分离纯化的目的。　　6、离子交换层析：　　纤维素离子交换剂：适用于大分子的分离，具有松散的亲水性网状结构。有较大的表面积，大分子可以自由通过。洗脱条件温和，蛋白质回收率高　　交联葡聚糖离子交换剂：即可以根据分子的净电荷数量，又可以根据分子的大小（分子筛效应）进行分离。　　蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋白质的电离程度。盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电荷吸附容量。因此蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH完成，对离子交换剂结合力小的蛋白质先从层析柱中洗脱出来。　　层析洗脱，采用保持洗脱液成分一直不变的方式洗脱，也可以采用改变洗脱的盐浓度或（和）pH的方式洗脱。后一种方式又分为：跳跃式洗脱和渐进式的连续改变。采取前一种方式洗脱称为分段洗脱，后一种方式为梯度洗脱。梯度洗脱一般分离效果好，分辨效率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换机，多采用梯度洗脱。　　洗脱时，必须控制洗脱体积（与柱床体积相比）和洗脱液的盐离子浓度和pH。洗脱液体积和盐浓度变化形式（梯度形式）直接影响层析的分辨率。　　通常采用的梯度形式有线性（形），凸形，凹形和复合型四种。　　7、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳　　原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。　　8、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。　　（四）利用选择性吸附剂的纯化方法　　某些称为吸附剂的固体物质具有吸附能力，能够将其他种类的分子吸附在自己的表面，吸附力的强弱因被吸附物质的性质而异。吸附过程涉及范德华力相互作用和请见氢键非离子吸引。吸附层析就是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的的。典型的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭等。硅胶适用于分离碱性物质，氧化铝适用于分离酸性物质，活性炭是一种非极性吸附剂。一般选择其极性与待分离的混合物中极性最大组分的极性相当的洗脱液。因此，如果待分离物含有羟基，则选择醇类，含羰基则选用丙酮或脂类。烃类如己烷、庚烷和甲苯则用于非极性物质的分离。吸附层析可采用薄层或柱方式进行。　　1、羟磷灰石层析：用于分离蛋白质或核酸。最重要的用途之一就是吧单链DNA和双链DNA分开。羟磷灰石对双链DNA亲和力很大，一直用羟磷灰石层析能从含RNA和蛋白质的细胞提取液中选择性的出去DNA。　　2、疏水作用层析：根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。这种差别也用于盐分级分离。连在支持介质上的疏水集团与蛋白质表面暴露出来的集团结合。　　由于疏水作用层析要求盐析化合物如硫酸铵的存在以促进蛋白质分子表面的疏水区暴露。为使吸附达到最大，可将蛋白质样品的pH调至等电点附近。洗脱方式包括：逐渐降低离子强度或增加pH的洗脱液，或使用对固定相的亲和力以对蛋白质更强的置换剂进行置换洗脱。但是某些洗脱条件可引起蛋白质变性。　　（五）利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法　　亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子进行特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。只需要进行一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。　　基本原理：把待纯化的某一蛋白质的特意配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上。一般在配体和多糖载体之间插入一段长度适当的连接臂或称间隔臂，使配体与凝胶之间保持足够的距离，不致因载体表面的位阻妨碍待分离的分子与配体结合。　　当蛋白质混合物加入填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上而其他的蛋白质因对该配体无特异的结合部位而不被吸附，他们通过洗涤即可除去，被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。　　凝集素亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合层析、染料配体层析和共价层析等属于亲和层析。　　（六）高效液相层析和快速蛋白质液相层析　　高效液相层析（HPLC）：载体的颗粒愈小，则分辨率愈高，但是洗脱液的流速也愈慢。　　反相HPLC广泛用于分离非极性化合物。固定相是非极性的，而流动相是相对极性的。固定相与被分离物只可能有疏水作用，流动相组成的小小变化，例如加入盐、改变pH或有机溶剂量就能成功的影响分离特性。　　快速蛋白质液相层析（FPLC）专门用于蛋白质分离，是基于反相、亲和、排阻、疏水作用、离子交换和等点聚焦层析，能用于分离微量样品。　　蛋白质含量的测定：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin—酚试剂法、紫外吸收法、染料结合法和胶体金测定法。　　Folin—酚试剂能定量的与亚铜离子反应，亚铜离子是由蛋白质的易氧化成分还原铜离子而产生的。　　BCA法，BCA试剂在碱性溶液中与亚铜离子反应生成紫色复合物，该反应比Folin—酚试剂的反应更强。　　紫外吸收法：280nm 芳香族化合物的光学效应　　考马斯亮蓝结合法：灵敏度高，检测为微克　　胶体金测定法：灵敏度最高，胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，呈洋红色，遇蛋白质转变为蓝色，颜色改变与蛋白质有定量关系，因此可用于蛋白质的定量。　　测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量通常要用具有高度特异性的生物学方法。具有酶或激素性质的蛋白质可以利用他们的酶活性或激素活性来测定含量。　　大多数蛋白质在注入适当动物的血流中时，会产生抗体。利用抗体抗原反应，也可以测定某一特定蛋白质的含量。　　蛋白质纯度检测：电泳、沉降、HPLC和溶解度分析　　电泳分析有等点聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带。　　HPLC常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。　　纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖与存在于溶液中未溶解固体的数量。用恒浓度法鉴定蛋白质纯度在理论上是严格的，以加入的固体蛋白质对溶解的蛋白质作图。如果蛋白质制品是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点，在这个折点以前，直线的斜率为1、之后为0。不纯的蛋白质的溶解度曲线常常呈现2个或者2个以上的折点。　　N-末端分析也用于鉴定纯度，因为均一的单链蛋白质样品中，N端残基只可能有一种氨基酸。　　必须指出，采用任何单独一种方法鉴定所得结果只能作为蛋白质均一性的必要条件而不是充分条件。很少几个蛋白质能够全部满足上面的严格要求。

给你一个超标准的答案：蛋白质和核酸是组成生命的两大主角。蛋白质是生命功能的执行者、表演者。人体中有几十万种蛋白质，地球上有150万种生物，蛋白质总数估计有10 ~12 种。一种细胞中有几千种蛋白质。蛋白质是由氨基酸组成的长链，组成人体蛋白质的氨基酸共有20种。 核酸是一种多聚核苷酸，它的基本结构单位是核苷酸，而核苷酸又由碱基、戊糖与磷酸组成。根据核酸中所含戊糖种类的不同，分为核糖核酸RNA和脱氧核糖核酸DNA两大类。 在生命起源时，究竟是先有蛋白质还是先有核酸呢？这个问题也就是著名的"先有鸡还是先有蛋"的悖论。在20世纪50年代，科学界对此众说纷纭。一派认为先有蛋白质，另一派认为先有核酸，再有一派认为蛋白质和核酸同时起源。在核酸派里，有的提出先有脱氧核糖核酸DNA，有的则认为先有核糖核酸RNA。 40年过去了，遗传物质DNA双螺旋结构的阐明以及20世纪60年代出现的中心法则--DNA、RNA、蛋白质三者的关系，揭示了生命遗传、发育和进化的内在联系。遗传信息的保存、、传递和表达是以DNA为出发点的，并且还发现了遗传密码的编码机理。通过比较研究，科学家发现，所有生物，从细菌到人，遗传密码都是通用的，这证明所有生物在分子进化上都有着共同的起源。 关于核酸RNA先发生的学说，早在20世纪60年代，克里克、奥吉尔（Orgel）、伍斯（C.R.Woose）分别在研究早期的遗传系统时，基于RNA在把基因的碱基顺序翻译成为蛋白质的氨基酸顺序时具有多方面的重要作用，曾指出RNA可能出现在DNA之前。进入80年代后，奥吉尔等人在无蛋白质参与情况下，成功地合成出寡聚核苷酸，有力地支持了RNA出现最早的说法。 那么在生命起源的分子过程中，如无蛋白质，仅RNA能否自我复制呢？1983年，艾尔麦恩与佩斯合作，确认大肠杆菌和枯草杆菌RNseP上的RNA部分是价真价实的酶，因为该RNA部分能独自加工tRNA前体，切断其5`端特定位置上的磷酸干二酯键。1986年，塞克确认四膜虫rRNA的内含子也是地地道道的酶。因为该内含子RNA能独自切除自己，并连接两侧的外显子和催化两个以上的内含子寡聚化反应外，更重要的是还能像RNA聚合酶一样，以寡聚核苷酸（不是三磷酸核苷）为底物，在自己携带的分子内模板上，合成出多聚核苷酸。吉伯特指出，RNA酶和蛋白质酶催化反应并无实质性的差别，只是蛋白酶催化反应效率更高、速度更快。并认为进化之初是"RNA的世界"，RNA可以一身二任，既能保存信息，又能提供酶活性，因此仅有RNA也足以把早期的进化引向新的阶段。 由于近几年来对RNA的深入研究，目前生物界大多数学者倾向于核酸最先发生。有理由推测，原始的遗传信息大分子就是RNA，它既能作为转译蛋白质的信使，又能作为传种接代的遗传物质基础。可以设想处于萌芽时期的生命是一种极简单又容易形成的大分子体系，随着物种的进化，由RNA演变为DNA的蛋白质构成的复合体，遗传与性状表达两种功能分别由DNA和蛋白质承担。早期的蛋白质起源说以及福克斯的类蛋白微球体生命模型，由于迄今在自然界尚未发现像类病毒（核酸体）那样有生命的类蛋白体，以及至今尚未发现遗传信息从蛋白质流向核酸的例子而退位。生物遗传物质主体最先起源于RNA分子或RNA与蛋白质构成的复合体，尔后向DNA-蛋白质复合体和蛋白质两个方向演变的学说，已逐渐为人们接受。

目前已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种，即原位合成（ in situ synthesis ）与合成点样两种。支持物有多种如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。原位合成法主要为光引导聚合技术（ Light-directed synthesis ），它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术（ photolithography ）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽阵列提供了一条快捷的途径。以合成寡核苷酸探针为例，该技术主要步骤为：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取择适当的蔽光膜（ mask ）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。例如，合成 48 （ 65536 ） 个探针的 8 聚体寡核苷酸序列仅需 4 × 8=32 步操作， 8 小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到 106/cm2 。不过，尽管该方法看来比较简单，实际上并非如此。主要原因是，合成反应每步产率比较低，不到 95% 。而通常固相合成反应每步的产率在 99% 以上。因此，探针的长度受到了限制。而且由于每步去保护不很彻底，致使杂交信号比较模糊，信噪比降低。为此有人将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到 98% 。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阈值以上保护剂就会解离。所以，该方法同时也解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。另据报导 ，利用波长更短的物质波如电子射线去除保护可使点阵密度达到 1010/cm2 。除了光引导原位合成技术外，有的公司如美国 Incyte Pharmaceuticals 等使用压电打印法 (Piezoelectric printing) 进行原位合成。其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。做法是将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂所替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为 40 到 50 个碱基的探针，每步产率也较前述方法为高，可达到 99% 以上。尽管如此，通常原位合成方法仍然比较复杂，除了在基因芯片研究方面享有盛誉的 Affymetrix 等公司使用该技术合成探针外，其它中小型公司大多使用合成点样法。后一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的 DNA 或多肽固相合成仪以完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷。现在已有比较成型的点样装置出售，如美国 Biodot 公司的点膜产品以及 Cartesian Technologies 公司的 PixSys NQ/PA 系列产品。前者产生的点阵密度可以达到 400/cm2 ，后者则可达到 2500/cm2 。

Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构在热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。核酸Tm值（解链温度）计算评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度，当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量随解体程度而增加，直至完全解体。长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。

RNase A水解C和U；RNase T水解G；RNaseU2在适当条件下水解A； 我认为应该是RNaseA水解一段寡聚核苷酸GGGAG UAAGAUAACGG 它水解的位置是"u

以分子杂交为基础的技术均用探针来检测具有互补序列的核酸序列。探针既可以是克隆的或PCR扩增的DNA分子，也可以是人工合成的寡聚核苷酸或经体外转录的RNA分子。探针必须是纯一的，不含有其他不同的核酸。为了保证通过碱基互补来检测目的基因，探针必须为单链分子。所以双链的DNA探针在应用前必须变为单链，一般采用加热的方法使双链DNA探针变性，原为单链的寡聚核苷酸和RNA探针的RNA分子无需变性处理即可使用。用放射性同位素标记探针，则杂交分子可通过放射自显影技术进行观测。近代，人们发展了非放射性同位素标记系统，常用的探针标记系统是用甾类化合物地高辛配基标记探针。

主羊，马，防牛，狗

景泰蓝的制作通常包括以下几个主要工序：制作底板：先用铜或黄铜片制成底板，然后用金属加工工具对其进行打磨和成型。制作铜丝：将铜片制成不同粗细的铜丝，铜丝也需要进行打磨。填充颜色：用矿物颜料或琉璃颜料在铜板上填充颜色，通常使用的颜色有蓝色、绿色、白色、黄色等。焊接铜丝：将铜丝根据设计图案固定在铜板上，并用锡焊将它们固定好。打磨和抛光：对景泰蓝制品进行打磨和抛光，磨去表面不平整和污点，使其表面光滑、平整，同时增强其亮度和保护层。请点击输入图片描述附着表层装饰，如玻璃、宝石等，以及加工成制品：在景泰蓝制品的表面附着玻璃、宝石等装饰物，美化景泰蓝制品的外观，然后再进行制品整体加工加工成需要的形态。

吃饭是我们生活里面的大事，俗话说人是铁饭是钢一顿不吃饿的慌。可见吃饭对于我们人身体的重要性。为了保障我们更好的吃饭就得有好的灶具。现在的人比较的喜欢用我们的燃气灶做饭，因为它做的饭菜特别的可口。所以就得有好的灶具。下面大家和我们来了解下，什么牌子的燃气灶好?一、什么牌子的燃气灶好1、厨具界的大品牌花燃气灶，樱花始创于1978年台湾，樱花厨卫经过多年来的不懈努力，才有了现在的成绩，获得了高新技术企业、江苏省著名商标、中国名牌、全球知名品牌等多项荣誉，是值得消费者信赖的好品牌。2、口碑很不错的品牌门子燃气灶，西门子(中国)有限公司旗下的燃气灶品牌，质量也是特别的好。始创于1847年德国，是世界500强企业，在国际上是比较知名的品牌。西门子燃气灶无论是外形还是性能都极受消费者青睐，服务始终如一。3、我们都很喜欢的太燃气灶，隶属于宁波方太厨具有限公司旗下，也是大家非常的认可。有着中国驰名商标、中国名牌产品之称，是行业中的领导品牌，也是中国500最具价值品牌之一。让千万家庭享受更幸福的居家生活。二、选购燃气灶有哪些技巧1、首先的了解下燃气灶面板材料，燃气灶面板材料主要有不锈钢、陶瓷，我们的分清具体的材质。还有钢化玻璃的，钢化玻璃材料的面板比较美观和耐磨，不过耐热性能没有不锈钢的好，建议还是选择不锈钢材料的面板，较为安全。2、大家最关注的燃气灶的质量。在选择燃气灶的时候，自己可以看、用手摸，有直接有好的方法，或者亲自试用来判断燃气灶的质量。首先看燃气灶的外观，有无不平整的地方，也可以摸燃气灶是否有粗糙割手的问题，那说明该产品可能存在质量问题。3、还有就是炉头的质量。在购买燃气灶时，还需要查看一下炉头的质量，有助于我们的使用。因为燃气灶在使用过程中，炉头一直都是被火烧烤的，如果质量不好的话，炉头就容易变形，一般情况下，可以依据炉头的重量来判断，炉头越重越好。燃气灶现在是家家户户都在使用的，所以大家在选择的时候的有个具体的了解。这样我们的使用来舒心。所以大家也是可以参考我们的内容来进行我们的选择。

问：燃气灶什么牌子好？答：最值得购买的燃气灶品牌：1、老板燃气灶（ROBAM）在厨电领域，老板电器拥有深厚的技术沉淀和技术积累，是全球众多消费者在选购燃气灶具产品的首选品牌。就产品而言，老板电器燃气灶主打安全和品质，不论是产品质量、制造工艺、火力性能、安全防护以及外观设计等方面都很过硬。2、方太燃气灶（FOTILE）方太业务涉及厨房电器、集成厨房以及海外事业三大领域，致力于为追求高品质生活的用户提供更高品质产品和服务，打造健康环保、有品位、有文化的生活方式。3、安尔瑞燃气灶（C YQ ANNRAY）安尔瑞是国家高新技术企业，企业注重以实业驱动和多元化发展，坚持技术创新，在产品研发设计上做到独具匠心，安尔瑞从诞生至今秉承打造技术与质量兼优的产品宗旨，经过无数次的革新和创造，不断地适应市场的变化以及用户的需求，将安尔瑞壁挂炉及厨卫电器等产品更贴近用户的需求。4、华帝燃气灶（VATTI）华帝一直以以用户需求为驱动，从品牌营销、产品研发、渠道建设等多一维度，不断完善智能产业布局，用人性科技与国际时尚并举的高端厨房生活方式，成就市场号召力，推动行业发展。5、万和燃气灶（Vanward）万和是是中国燃气具发展战略的首倡者和推动者，技术创新是贯穿万和发展的灵魂，多次主导或参与了燃气热水器、燃气灶具、消毒柜国家标准的起草和修订。6、美的燃气灶（Midea）美的集团目前已经是世界级的白色家电制造商和品牌商，颇具规模的白色家电生产基地和出口基地，集消费电器、暖通空调、机器人与自动化系统、物流于一体的上市公司，旗下包括以厨房电器、冰箱、洗衣机及各类小家电等在内的消费电器业务。7、苏泊尔燃气灶（SUPOR）苏泊尔(SUPOR) 液化气钢化玻璃燃气灶，黑晶钢化玻璃面板设计，尽显大气、高贵、优雅轻奢，单灶中的“高颜值”，小巧玲珑的机身设计，更加节省空间，百搭多种厨房，升级版圆形按钮设计，大气自然，秒点火，不烫手。8、帅康燃气灶（sacon）帅康燃气灶采用了全新升级的双层立交引射2.0、精致五环燃烧、四大扇形增氧腔等技术，可加速燃气通入、增大二次补氧，达到5.0KW超猛火力。针对爆炒、快炒、蒸煮、煎炸、煲汤等烹饪方式，帅康燃气灶都设有合适的火候控制挡位，真正做到“大火够猛，小火够小”，无论用户想做何种美食，都能做到多段火力自由调节，给人们以酣畅淋漓的烹饪体验。9、海尔燃气灶Haier　　海尔品牌很多人都知晓，公司发展速度快，规模庞大，已位于亚洲企业200强，是中国最具价值品牌，品牌知名度相当高，一直深受消费者的支持与信任，已是中国驰名商标、世界白色家电第一品牌、燃气灶十大品牌。10、德意Dandy　　德意燃气灶是杭州德意电器控股集团有限公司旗下品牌，成立于1992年，是杭州百强企业，企业实力相当雄厚。在全球很多的国家和地区，德意都都分布有销售点，占据着很大的燃气灶市场。参考资料：百度百科-燃气灶

氯化石蜡42和52是两种常见的氯化石蜡产品，它们的主要区别在于分子量和氯含量。氯化石蜡42的分子量较小，一般在800-1000之间，而氯化石蜡52的分子量则更大，一般在1200-1400之间。另外，氯化石蜡42的氯含量也比氯化石蜡52低，一般在42%左右，而氯化石蜡52的氯含量则在52%左右。由于分子量和氯含量的不同，这两种产品的物理和化学性质也略有不同。一般来说，氯化石蜡52比氯化石蜡42的耐热性更好，而氯化石蜡42则比氯化石蜡52更易于溶解。此外，它们的用途也不尽相同，氯化石蜡42常用于油墨、涂料和塑料等领域，而氯化石蜡52则常用于橡胶、涂料、密封材料等方面。

Ascend D2是华为推出的又一旗舰产品。华为D2屏幕提升至5英寸，使用1.5GHz海思 K3V2(K3V2 + V7R1) 四核处理器。配备1300万像素主摄像头（前置 130万像素像素摄像头），单LED 补光灯，电池容量也增大到3000毫安时。是一款发烧级的手机。联通版/移动版：单卡；电信版：双卡双待双通

正常。氯化石蜡52又称氯代烷烃52、氯代烷烃52、氯蜡-2、52型氯化石蜡，简称CP52，分子式C15H26Cl6。该石蜡则是水白色或者浅黄色黏稠油状液体，是白的属于正常的，出现这两种颜色意外的是不正常的，则需要考虑高黏氯化石蜡纯度或质量真假的问题。该石蜡用于油漆、氯化橡胶和苯乙烯-丁二烯树脂类涂料中，在塑料中，作为阻燃剂、粘结剂、胶结剂和填充剂，另可作为润滑添加剂，同时也具有耐潮和耐化学腐蚀性。

叶圣陶在景泰蓝制作中顺序：制胎、掐丝、点蓝、烧蓝、打磨、镀金。文章严格按照景泰蓝的六大生产工序依次逐项介绍。所以这篇文章的说明顺序完全是说明对象——景泰蓝的制作过程的客观反映。就每个工序来说，也是按制作程序来说明的。在六大工序中，详写掐丝和点蓝，因为这两道工序是决定景泰的独特风格和质量的关键工序。在详写这两道关键工序时，又能突出其中的重点。叶圣陶，男，原名叶绍钧，字秉臣、圣陶，1894年10月28日生于江苏苏州，现代作家、教育家、文学出版家。

-7.9°C。氯化石蜡-52又称氯代烷烃52，简称CP-52，分子式C15H26Cl6。该石蜡的熔点是-7.9°C。氯化石蜡-52用作氯丁橡胶、丁腈橡胶、SBS等胶黏剂和密封剂的增塑剂。

可能是黑白两色是永远的流行色的缘故，所以它的正面选用了耐看的全黑色外观。粗略一看，机身线条少了几分曲线的柔美，更多的是一种硬朗的商务气质。不过当翻过背面来看，却是流线型的白色背部外观。它的边角设计非常圆润，加上表面有一层类似陶瓷一般的涂层，入手感觉顺滑细腻，丝毫没有塑料材料的生涩感。这种前黑后白的“熊猫”机和某款热门国产手机倒是蛮相似的。 其实初次见到华为Ascend P1的第一感觉是小巧。没错，是小巧！虽然它是一台4.3英寸的大屏机，但是因为屏幕比例和纤薄设计的原因，在手感上要比不少的4.0英寸的手机还要小巧一些。虽然长度不短，但机身的宽度仅有64.8mm。可以大胆的说，即便是手掌不大的女士们持握起来也不会太费劲的。现如今Super AMOLED屏幕似乎已经成为高端旗舰手机的标配，像三星的“盖世兔”、摩托罗拉刀锋系列等高端手机都采用了这种屏幕。相比传统的TFT屏幕，这种材质的屏幕色彩还原艳丽，可视角高，还比较省电。华为Ascend P1的4.3英寸Super AMOLED屏幕拥有QHD（960x540）分辨率，显示效果非常细腻。另外这块是康宁大猩猩玻璃屏，具备一定的抗磨划能力。华为Ascend P1是一款很纤薄的手机，即便与2011年的超薄手机代表之作三星i9100相比也毫不逊色。虽然没有能够超越2011年的最薄的摩托罗拉刀锋RAZR，但是也相差不到0.7mm。 听筒附近有一个“engineering sample”（工程样机）的标志，等正式上市后就不会出现了。可以看到它的听筒覆盖了一层金属滤网，金属质感的看上去更上档次。在听筒附近有一个隐藏的呼吸灯，在充电、来电等状态下才会亮起。另外它配备的前置130万像素摄像头可以用于网络视频聊天等。华为Ascend P1采用了虚拟触控三键式设计。去掉搜索键之后，三键的空间与图标都会更大一些，这样误操作几率也会变小，而且那个搜索键在国内的实用性并不是很高。作为主流的旗舰机型，华为Ascend P1在摄像头方面保持了旗舰级手机的配备：800万像素摄像头，并配以双LED补光灯。另外它还专门设计了一个降噪麦克风，可以在录制高清视频时发挥作用。要说这枚摄像头的成像品质还是相当出色的，随后会给大家奉上样张。超薄手机似乎都免不了一个尾部翘起的设计，这样虽然不能保持整机的全部都是超薄设计，但是却能让手机内部很多发热的元件有地方可以安置，还能在底部形成一个贴合手部的曲线，以免这种超薄的手机一个不小心就会飞出去。因为华为Ascend P1是不可以拆卸背盖和电池的，所以它的SIM卡槽设计在了机身的顶部。这是一个标准尺寸的SIM卡，插入时需要将SIM卡有缺口一头朝下，有芯片一面朝向屏幕，轻轻推入即可插好。机身两侧的接口和按键并不多，它提供了电源键、音量键以及一个Micro SD卡槽。像一些多媒体达人们喜爱的HDMI接口就没有了，不过这倒不算是一个缺点，只是对于某些人群来说，少了这类接口未免不够完美。不过它支持USB转HDMI适配，如果正式版配件里能搭配一个转接头就很厚道了。 2D+3D定制桌面（Android 4.0出厂版本）1、解锁界面和通知栏锁屏页面和Android 4.0原生的相似，不过除了可以快速解锁相机和屏幕外，加入了快速解锁来电信息以及短信界面的功能。原生Android的通知栏中一直没有快速开关，华为Ascend P1在任务栏中加入了可以快速开关WiFi、蓝牙等功能的快速开关，非常方便。2、接近原生的2D桌面华为搭载了2D和3D立体桌面两种UI，2D桌面有三套图标样式，而桌面结构和菜单结构和原生Android 4.0基本一模一样。对于喜欢Android 4.0原生界面的朋友应该是个好消息吧。3、具有华为特色的3D立体桌面而3D立体桌面是华为为Ascend P1制作的一个比较炫酷的桌面主题，包括桌面的滑动以及桌面工具都立体感十足，同时切换动态效果也不错。3D桌面下的桌面工具添加方式、程序菜单依旧保持Android 2.3的风格。程序菜单可以添加文件夹、拖拽排列程序图标的位置或者直接卸载程序。 对于普通人来说外出的时候已经很少用mp3、ipod等播放器听音乐了，直接用手机听音乐显得更加方便，且不会错过电话，虽然手机的普遍音质会差些。华为Ascend P1在音乐播放方面做的如何呢？1、音乐播放器华为Ascend P1内置的音乐播放器在界面方面做的还是不错的，支持专辑封面显示、歌词显示、频谱显示等。手机还搭载Dolby Mobile 3.0 Plus，内置Dolby Digital Plus解码器，在连接立体声耳机时可以感受5.1环绕音效，外放时也会有一定效果。杜比音效设置项很简单，只能选择内设的几项。2、支持格式华为Ascend P1，采用了OMAP 4460的处理器，音频播放方面的性能表现不错，比如700多Kbps码率的wma文件都可以流畅播放，而在搭载其他处理器的手机上基本都无法播放的。而在视频方面，手机自带的播放器是无法播放mkv、rmvb等格式的视频的，通过安装Moboplayer仅可软解，1080p码率较高的mkv，avi视频则会有卡顿。不过在手机屏幕上看分辨率过高的视频没什么必要。3、DLNA无线共享华为Ascend P1同样支持DLNA无线共享功能，其原理可以简单解释为通过DLNA实现无线网络互联，将手机中的资料通过流媒体等模式传输在其他设备中进行播放，或者在其他设备中访问手机中的内容。 华为Ascend P1配备了一块1670毫安时的锂聚合物电池，这个规格虽然没有胖子刀锋3300mAh那么霸气，但是还是能够支持1天左右的续航。因为不可以更换电池，所以最好是随用随冲，保持电量充盈，不然就会像流传的那样“好男人每天都要回家——充电”。

唐僧收服小白龙后，鹰愁涧的水神化作一个老渔翁，撑船把师徒三人送过去的。

杨颖和他同居四年，却转身嫁给黄晓明，如今，35岁红遍大江南北，他就是陈伟霆。陈伟霆和杨颖杨颖，陈伟霆以及黄晓明，都曾经是红极一时的明星，没想到三个人之间还有剪不断理还乱的感情纠葛。当年的杨颖，还是一个18线的小模特，当年的陈伟霆，也只是一个名不见经传的主持人。二人在一次活动当中相识，很快便坠入爱河之中。虽然他们都没什么名气，但是年少青涩而又懵懂的恋爱还是十分真挚的。二人曾在一起同居四年的时光，多次在公开场合出双入对，情到浓时，还一起纹了情侣十字架纹身，可见他们对这段感情十分认真。不久后，杨颖为了事业有更好的发展，漂洋过海到日本学习，而陈伟霆则继续留在国内。因为彼此聚少离多，再加上陈伟霆和杨颖在感情方面都不太安分，杨颖在日本时，经常会和男性朋友出去喝酒，陈伟霆在国内也是桃花无数。久而久之，二人之间的感情逐渐有了分歧，谁也无法给对方足够的安全感，这段感情也就不了了之。随后，杨颖在一次活动当中认识了黄晓明，当时的黄晓明已经是娱乐公司的大股东。在黄晓明的帮助之下，杨颖的事业就如同坐了火箭一样直冲而上，资源肉眼可见的好了起来。背靠黄晓明这棵大树，杨颖从一个18线小模特，成为如今的女顶流。不仅事业发展得越来越好，杨颖和黄晓明的感情进展得非常顺利，不久后，便步入了婚姻殿堂之中。当时，黄晓明为杨颖耗资两亿筹备婚礼，请来半个娱乐圈的人参加，声势十分浩大。相比于二人的幸福来说，当时的陈伟霆还稍显寂寥。在黄晓明和杨颖刚刚官宣恋情的时候，不少人都说是黄晓明介入了陈伟霆和杨颖之间，因此才会导致二人分手。而当时的陈伟霆，还是娱乐圈的小透明，被质疑是否是第三者插足的时候，黄晓明直接说了一句，“不知道陈伟霆是谁”。这句话直接成为圈内嘲笑陈伟霆的一个梗，但是陈伟霆并没有做出任何公开回应。他和杨颖属于和平分手，分手之后，谁也不曾在媒体面前公开诋毁过对方。甚至外界传出对杨颖不利的言论，陈伟霆还会主动澄清替杨颖说话，真的是中国最佳前男友。陈伟霆的经历陈伟霆出生于香港一个富裕家庭之中，从小对唱歌跳舞就有非常浓厚的兴趣，还对此参加学校的各种文艺活动，希望日后能够成为一名优秀的歌手。但是家人一直不怎么支持陈伟霆追求自己的梦想，歌手注定要漂泊，他们希望陈伟霆能够过得更加稳妥一些。中学毕业之后，陈伟霆的家人打算将他送往外国留学，并且已经替他在美国找好了一所学校。然而，陈伟霆只希望能够坚持自己的梦想，他和家人约定好，他去参加全球华人新秀选拔比赛，如果拿不到第一名，便接受家人的安排出国留学。在破釜沉舟之下，陈伟霆一往无前的勇气，再加上多年努力，让他一举夺冠。夺冠后，陈伟霆签约了英皇娱乐公司，专心在演艺圈发展。2006年，陈伟霆曾经以男子组合的身份出道，以跳舞歌手的形象进入演艺圈之中。然而，男子组合并没有太高的热度，两年之后，该组合宣布解散。虽说没能在组合当中得到更好的发展，但是陈伟霆优秀的潜质被发掘了出来。2008年九月份，陈伟霆推出个人首张音乐专辑，并因此拿到了最受欢迎男新人金奖。陈伟霆再接再厉，发布了自己的第二张个人音乐专辑，并参演了电影《窃听风云》，主演电影《前度》。陈伟霆迎来事业巅峰2013年，陈伟霆将自己的事业重心转到了内地。先是接拍了《少年四大名捕》，逐渐有了一定的名气。随后又参演了《古剑奇谭》，靠着大师兄陵越这个角色，陈伟霆在内地一炮而红，迎来了自己事业发展的巅峰。最后，陈伟霆又相继主演了《男人不可以穷》，《活色生香》《蜀山战纪之剑侠传奇》《老九门》等影视剧。随着一部又一部热播剧播出，陈伟霆逐渐成为各大热搜榜的话题人物，火遍全国各地。一直以来，陈伟霆的演技虽然多次受人诟病，但是从每一部剧中，我们都能够看到他演技的进步。作为一名偶像，他在粉丝面前始终是非常随和的，努力突破语言的障碍，为人们带来更好的作品。陈伟霆的长相虽然算不上十分优越，但是他身上总是有一种凛冽的气质，酷帅之余又不会给人距离感。陈伟霆的工作态度陈伟霆的敬业在圈内是出了名的，不管拍戏还是参加任何活动，从来都不曾迟到过，更不曾耍过大牌。就算是熬夜拍戏，也会努力呈现出更好的状态，和陈伟霆合作过的制作人，都对他的工作态度赞不绝口。陈伟霆还是一个非常自律的人，不管平时工作多忙，永远都会坚持健身。他的自我身材管理十分严格，才能十年如一日的保持紧绷而又向上的状态。作为一个偶像，他既肯吃苦，又肯努力，给粉丝带来了很多正能量。陈伟霆还是一个热心公益的人，他利用自己的影响力热心公益慈善事业，给粉丝起到了非常良好的引导作用。越是了解陈伟霆，越觉得陈伟霆是一个宝藏男孩，个性谦和有礼，唱跳俱佳，工作勤勉努力，入圈多年很少曝光绯闻和黑料，说明人品也经得起考验。这样一个优秀的人，怪不得能够让杨颖倾心四年。曾经的陈伟霆是一个小透明，但是他一直以来都没有放弃自己，而是默默努力。在陈伟霆的努力之下，终于成为深受全国人民喜欢的偶像。当年他和杨颖以及黄晓明的爱恨情仇，也因为几个人之间对感情处理十分低调，逐渐归于平淡。每个人的人生当中都会遇到很多人，不是每一个遇到的人都有机会共度一生。每一个会和你同行一段路的人，都是我们生命当中的缘分。在一起的时候好好珍惜，哪怕最终不能走到最后，也应当像陈伟霆和杨颖一样好聚好散。现在的杨颖已经有了自己的家庭，还有一个非常可爱的儿子。陈伟霆疑似和超模刘雯在恋爱当中，各自都有新的生活，希望他们都能各自安好，也希望他们的事业都能发展得越来越好。

1、HIONE火王（ 广东省著名商标，蓝火苗和节能环保双资质认证企业，广东）2、 Vatti华帝（ 广东名牌，高新技术企业，中国燃气灶领导品牌）3、 Fotile 方太（ 高端厨房电器行业领导品牌，中国500最具价值品牌之一，浙江）4、 Robam老板（ 亚洲品牌500强，中国厨电行业最具影响力品牌之一，浙江）5、 Sacon帅康（ 中国名牌，浙江名牌，浙江）6、 Sakura樱花（ 中国名牌，江苏名牌，江苏）7、 Midea 美的（ 白色家电制造商和品牌商，中国企业500强，，广东）8、 Vanward 万和（ 国家级高新技术企业，广东省著名商标，广东）9、万家乐（ 国家重点高新技术企业，广东）10、DE&E德意（ 知名（著名）燃气灶品牌，浙江）

采用骁龙处理器的机型有：华为畅享 MAX、华为畅享9、华为畅享8e、华为畅享8、华为畅享7 Plus等。

微店顾名思义微信客户，下载一个微店，注册，点我的微店，右上角有个添加，把产品图片说明放上去就好了，然后就是宣传之类的

是15回，腊月寒天，朔风凛凛，在悬崖峭壁的路上行走，忽闻水声，“涓涓寒水穿去过，湛湛清波映日红”。正观看，涧当中一声响钻出一龙，撺出山崖抢长老，行者忙抱长老便跑，龙追不上，生吞马匹。长老埋怨没马难上路，又恐行者降龙不成反害自己，正在没完没了哭泣时，六丁六甲等众神受观音法指护佑长老，行者独去战恶龙。龙舒利爪，猴举金棒，盘旋良久，龙撺水底，不再出来。行者使翻江搅海的神通，龙化小蛇钻草不见了，念咒拘来山神土地，得知此龙是观音一年前救来专等取经人的。行者至落伽山见观音。观音与揭谛叫了两遍，小龙出来，观音将他项下明珠摘了，杨柳蘸露拂在龙身说声变，龙即变成马。菩萨香风绕绕，彩雾飘飘，径回普陀。行者揪龙马顶鬃来见三藏。

来不及说我爱你

一、景泰蓝的制作：景泰蓝，学名“铜胎掐丝珐琅”，因成熟于明景泰年间，故名“景泰蓝”。二、景泰蓝工艺：其技艺是用铜作胎，将细铜丝轧扁后以手工制成各种图案，图案焊接到铜胎上，再将五彩珐琅釉点填在花纹内，经多次上釉烧制、然后打磨抛光最后镀金而成。三、景泰蓝制作步骤可分为：01 制胎02 掐丝03 点蓝04 烧蓝05 打磨，镀金四、知识扩展：景泰蓝只有蓝色吗？答案是的，景泰蓝的釉色非常多种，但在明代景泰年间，景泰蓝获得史无前例的发展，其制品多以蓝色作主色调，所以后人以年号与颜色来命名这个工艺。

我曾经看过网上一个介绍，好像是钟汉良、李小冉的《来不及说我爱你》里吻戏较多，可惜我并未看全过这部剧。