用限制性内切酶制备T载体
陆哲明,柯 杨△[北京大学临床肿瘤学院(北京市肿瘤防治研究所)遗传室,北京 100034]
[关键词]T载体;DNA限制酶类;遗传载体;基因扩增[摘 要]
目的:介绍一种制备T载体的方法。方法:用限制性内切酶XcmⅠ酶切,在两端产生T末端,制备的T载体可直接用来克隆用TaqDNA聚合酶产生带A末端的PCR产物。结果:PCR产物直接和T载体连接,用常规氯化钙法制备的感受态菌转化,对转化子提取质粒进行酶切鉴定,证明阳性率达80%。结论:制备T载体过程简单,质量稳定,产量高,并可扩增等优点。
[中图分类号]Q342 [文献标识码]A [文章编号]1671 167X(2002)06 0726 03
PCR是目前体外DNA扩增最常用的方法,对PCR产物进行快速有效的克隆是开展下游许多实验所要求的。目前TA克隆是一种快速的,一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的方法。而商品化的TA克隆系统由于售价高,质量批次间不稳定且无法进行循环使用等缺点,在实际应用中,限制了T载体的广泛使用。本文介绍了一种简单、高效,可在普通实验室中制备并可反复扩增的T载体制备方法,并经PCR产物克隆,酶切鉴定,得到了非常理想的结果。
1 材料与方法1
.1 制备SuperpGEM Teasy载体(简称pSP Teasy载体)1
.1.1 制备pSP Teasy环化载体 以线性化的pGEM Teasy载体(Promega为模板,两边设计引物:
F:GAATAAGCTTGTTCCCAGGTCAAGACTGGATCACTAGT
HindⅢ XcmⅠG
AATTCGCG
R:GAACAAGCTTATTCCCAGTCTAGACCTGGATCGAATTC
HindⅢ XcmⅠC
CGCGGCCGCCA
引物的5′端各插入HindⅢ和XcmⅠ位点,3′端与模板互补,在PfuDNA聚合酶的作用下扩增,扩增产物经HindⅢ酶切后,自身环化,挑选能被HindⅢ酶切的克隆即为阳性克隆,经测序进一步证实。
1.1.2 制备pSP Teasy线性化载体 按照标准酶切体系,用XcmⅠ(NEB)酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,玻璃奶回收,测量吸光度值(D260),调整质量浓度至50mg·L-1,此载体可直接用于克隆。
3 讨论PCR技术是目前体外扩增DNA最常用的方法。有时需得到克隆化的DNA以便于杂交分析、高质量测序及从复杂PCR产物中分离目的片段。常用的方法有非定向克隆和定向克隆。定向克隆需在引物5′端引入限制性内切酶位点,PCR产物经适当内切酶酶切后产生粘端,连接到相应载体。非定向克隆有两种策略,一种是平末端克隆,在klenow和T4DNA聚合酶作用下修平PCR产物末端,但连接效率仅为粘端连接的1/50,且自身环化率高[1];另一种是TA克隆。TA克隆是一种快速的,一步到位的非定向克隆法,可以把PCR产物直接插入到质粒载体。TA克隆系统利用TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性,在扩增DNA3′末端非模板依赖地加上一个核苷酸,通常为腺苷酸[2]。这个3′A突出端被用于把PCR产物插入到插入位点有一个3′T突出端的载体。制备好的载体,其关键部分是带有3′T突出端的线性分子。目前制备3′T载体的方法是先用平末端限制性内切酶(如EcoRⅤ)酶切载体,再用TaqDNA聚合酶在仅有dTTP的情况下,72～75℃反应,在3′末端添加一个T[1,3]。但是,实际反应过程中,由于3′末端加T为非优先聚合核苷酸,仅部分的3′端可添加T,或者有少量可能添加一个以上T,造成载体在克隆过程中自身环化高,必然增加筛选阳性克隆的难度。另外,每次生产T载体产量有限(一般为1μg),不适于大规模生产,造成批次间质量差异大。即使商品化TA克隆试剂盒也存在阳性率低和质量不稳定的缺点。因其价格昂贵,并且无法进行循环使用,在普及上存在一定困难。利用限制性内切酶制备T载体利用限制性内切酶特异性强,一次酶切产量高,质量稳定,易于操作等特点。在内切酶家族中,有一类称可变酶,它们的识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的,如本文采用的XcmⅠ,它识别序列见图3a,在构建pSP Teasy载体时,利用其中间序列可变,在靠近T7启动子端,设计了XcmⅠ的识别序列见图3b,而在靠近SP6启动子端XcmⅠ的识别序列见图3c,这样在XcmⅠ酶切后,其剩余的序列如图1,在3′端分别产生T。经查NewEnglandBiolabs公司的目录,符合上述特征的酶列于表1。
我们在两个XcmⅠ之间引入HindⅢ位点有下列优点:(1)在构建pSP Teasy时提供方便;(2)经HindⅢ酶切后,可以防止载体中的XcmⅠ位点不完全酶切造成的自身环化;(3)两个XcmⅠ位点之间,提供保护的碱基,便于XcmⅠ酶切。用于克隆的PCR产物在连接前需经琼脂糖凝胶电泳,如条带锐利,则一般无需纯化即可直接用于连接;如产物有非特异扩增或引物二聚体浓度较高,最好先用低熔点胶或玻璃奶法纯化。如果扩增用具有保真功能的聚合酶,如PfuDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶或TliDNA聚合酶,由于它们有3′～5′的外切酶活性,则PCR产物为平末端,需经纯化后用TaqDNA聚合酶在dATP存在下72℃加腺苷酸尾15～30min,即可达到相同效果。插入片段(PCR产物)与载体摩尔比一般要求在3∶1～1∶3之间,但按笔者经验,摩尔比不经优化亦可产生较好克隆效果,可能与pSP Teasy在原理上无法自身环化有关。pSP T是在Promega公司pGEM Teasy载体基础上构建而成的,它具有原载体的优点[4]:(1)用T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶可正反两方向体外转录RNA;(2)载体克隆位置的两侧各有EcoRⅠ、NotⅠ和BstZⅠ等酶切位点,便于用单一酶切鉴定;(3)T7、SP6和M13等通用序列,便于测序。新的pSP Teasy不仅保留原载体所有的优点外,还具有(1)末端加有T的载体含量高,因为以往所加T为合成反应添加,不能保证每个末端均有T。而用内切酶法,利用其特异性识别酶切位点的特点,并经HindⅢ处理XcmⅠ酶切不完全的载体,则在原理上保证自身无法环化且均能产生T末端;(2)由于采用内切酶法,保证了质量的稳定性;(3)产量大,每次可产生10～20μg,而经典方法仅1～5μg;(4)方法简单,成本低廉,适合普通实验室制备。只需一步酶切,纯化后即制备完毕,步骤简单且耗时少。而传统方法需经酶切,纯化,加T,再纯化等步骤;(5)环化T载体可以扩增后循环使用。以上特有优点保证了克隆效果稳定,阳性率高。
(a)CCANNNNN NNNNTGGGGTNNNN▲NNNNNACC
(b)CCAGGTCT AGACTGGGGTCCAGATCTGACC
(c)CCAGGTCA AGACTGGGGTCCAG▲TTCTGACC
(a)RecognitionsiteofXcmⅠ;
(b)5′ endrecognitionsiteofXcmⅠ;
(c)3′ endrecognitionsiteofXcmⅠ.
图3 在不同部位XcmⅠ识别序列Figure3 RecognitionsequenceofXcmⅠatdifferentsite
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