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摘 要:以人表皮生长因子为研究对象,分3段合成了hegf基因片段,运用套叠PCR技术进行连接,形成全长hegf(159 bp)并克隆到酵母表达载体pGAPZα-A中,利用同裂酶技术构建串联体表达载体,获得了分别含2、3、4拷贝的串联体表达载体pGAPZα-2hegf、pGAPZα-3hegf和pGAPZα-4hegf,为下一步进行基因表达及其生物学活性分析奠定了基础。
关键词:hegf基因合成;串联体;载体构建
中图分类号:Q782
文献标识码:A
文章编号:1007-7847(2007)01-0033-05
表皮生长因子最初由Cohen及其同事从小鼠颌下腺分离得到,后在人尿中分离得到,人表皮生长因子(hEGF)是由53个氨基酸组成的小分子多肽,含有3个链内二硫键,结构稳定,研究表明,hEGF具有多种生物学功能,它通过与细胞膜上hEGF受体结合,促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应而发挥生理作用,如它可促进细胞分裂,修复皮肤创伤、胃肠溃疡、角膜损伤等;防止皮肤衰老,起到美白嫩肤的作用;靶向性结合含高密度hEGF受体的肿瘤组织,大剂量的EGF还能抑制某些癌细胞的生长,商品化的hEGF具有很高的市场价值,且市场需求量大,提高其表达量及生物学活性可广泛用于临床,满足市场的需要。
利用基因重组技术是大量制备活性多肽的有效方法,通常将少于100个氨基酸的肽称为小分子多肽,由于其相对分子质量较小,在体内易被迅速水解,半衰期短,因此在克隆、表达等都会碰到不少困难,本研究利用套叠PCR技术合成了hegf基因,在构建酵母分泌型表达载体时,采取多拷贝串联构建,并在各拷贝间引入kex2蛋白酶切位点,以便在毕赤氏酵母中表达时能切割形成单个的hEGF分子,本研究探索了基因合成方法和小分子多肽表达载体构建策略,为实现小分子多肽在体外的高效表达提供了参考依据,并为hEGF在酵母中串联表达奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌株
菌株E.coli DH5α由本室保存,菌株ToplOF"、载体pGAPZα-A购自Invitrogen公司,pMD18-T vector购自TaKaRa公司。
1.1.2 生化试剂
Taq聚合酶、T4-DNA连接酶、Xho I、Xba I购自TaKaRa公司,AvaⅢ、Pst I购自Fermentas公司,DNA Maker购自Tiangen公司,UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司,其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 基因片段与引物
选用毕赤酵母偏爱密码子,根据NCBI上报道的序列(E02089)分3段合成hegf基因:1)hegf基因片段1(hegfl):aac tcc gac tct gaa tgc ccg ctgtcc cac gat ggt tac tgc ctg cac gac ggc gtt tgt atg;2) hegf2:ctg ccg caa aca tac ata tag ctc cgc gac ctg tttata cgc aca ttg aca cat cat ccg atg;3)hegf3:tgt gta gta ggc tac atc ggc gaa cgc tgc cag tac cgt gac ctg aaatgg tgg gaa ctg cgc;4)引物l(P1):g ctcgag atgcataagaga aac tcc gac tct g;5)引物2(P2):t gta gcc tactac aca gtt ac;6)引物3(P3):t tctaga ctgcag gcg cagttc tea cc.hegf2片段划线部分分别与hegf1和hegf3划线部分互补,引物P1和P3分别引入XhoI和Xba I酶切位点,基因片段及引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 套叠PCR连接egf1和egf2基因片段
利用egf1和ear2部分互补及引物P1和P2,在同一个PCR反应中,采用不同的退火温度,先使egf1和egf2延伸,再用P1和P2进行扩增,得到egf1-ear2片段,PCR程序如下:94℃5min;94℃30s,41℃30s,72℃30s,10个循环;94℃30s,53℃30s,72℃30s,25个循环;72℃7min;4℃+∞。
1.2.2 egf3互补链的产生
在P3引物存在下,利用Klenow Fragment在37℃延伸3h,使egf3形成互补链。
1.2.3套叠PCR连接egf1-egf2和egf3片段
利用两个片段的互补及引物P1、P3,如1.2.1采用不同的退火温度扩增得到hegf全长,PCR程序如下:94℃5 min;94℃30s,39℃30s,72℃30s,10个循环;94℃30s,53℃30s,72℃30s,25个循环;72℃7min;4℃+∞。
1.2.4 pGAPZα-hegf的获得
先将hegf克隆到pMD18-T vector并转化DH5α,大量提取质粒后,利用Xho I和Xba I将hegf克隆到pGAPZα-A,并转化Top1OF"。
1.2.5 串联表达载体的构建
利用同裂酶AvaⅢ(ATGCA↓T)和Pst I(cTGCA ↓ G)酶切重新连接后形成ATGCA l G而不再被AvaⅢ和Pst I识别的特点,利用Xho I和AvaⅢ酶切pGAPZα-hEGF回收大片段,用Xho I和Pst I酶切pGAPZα-hegf回收小片段,再用T4-DNA连接酶连接大小片段,构建二拷贝载体pGAPZα-2hegf,同样原理,利用Xho I/AvaⅢ和Xho I/Pst I酶切pGAPZα-2hegf,再用连接酶连接可得到pGAPZα-3hegf和pGAPZα-4hegf。
2 结果
2.1 套叠PCR扩增结果
hegf基因片段在引物P1和P2作用下,采用不同的退火温度,得到egf1-egf2片段(如图3,泳道1),回收产物与egf3延伸产物在P1和P3扩增
2.2 克隆载体构建结果
将hegf基因克隆到pMD18-T vector中,并转化大肠杆菌DH5α,经过菌液PCR鉴定和Xho I、Xba I双酶切鉴定(如图4),得到阳性克隆,并选择一个阳性克隆送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序分析,结果显示序列与预定序列一致,
2.3 hegr表达载体构建结果 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 将hegf基因克隆到pGAPZet-A,并转化大肠杆菌Top10F",如2.2进行PCR、酶切鉴定及测序分析,结果显示已经成功构建了pGAPZα.hegf。
2.4 多拷贝表达载体构建结果
分别用Xho I/AvaⅢ和Xho I/Pst I双酶切pGAPZα-hegf,分别回收大片段和小片段,连接大、小片段,可获得pGAPZα-2 hegf;再用Xho I/AvaⅢ和Xho I/Pst I双酶切pGAPZet-2hegf,分别回收大片段和小片段,连接大、小片段,可获得pGAPZα-4hegf,连接第一次回收的大片段和第2次回收的小片段,或第一次回收的小片段和第2次回收的大片段,可得到pGAPZα-3hegf,经过双酶切鉴定(如图5)和表达载体测序分析,结果表明本研究已成功构建了pGAPZα-2begf(324 bp)、pGAPZα-3 hegf(483 bp)和pGAPZα-4 hegf(642bp),为进一步进行基因表达及其生物学活性分析奠定了基础。
3 讨论
本研究运用套叠PCR合成hegf基因时,首先合成了3个片段,正链hegf1和hegf3、负链hegf2.hegf1和hegf2进行套叠PCR后形成hegf1-hegf2,但此回收产物不能直接与hegf3进行第2次套叠PCR,而是需要先用Klenow Frag-ment片段延伸hegt3后才能进行基因的连接,但如在合成片段时,合成正链hegf1、负链begf2和hegt3,则在进行首次套叠PCR后,回收产物可直接与hegf3在引物作用下进行第2次套叠PCR,此外,还可分成偶数段合成,如分成正链hegf1和hegf3、负链hegf2和hegf4四段合成,其中hegf1和hegf2部分互补、hegf2和hegf3部分互补、hegf3和hegf4部分互补,这样分别在两对引物的作用下,可套叠PCR产生hegf1-hegf2、hegf3-begf4片段,回收产物可进行再次PCR,从而得到全长hegf基因,如刘凤华等在合成突变型大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DHFR)基因时就采用了四段合成法,在进行套叠PCR时,片段间的互补设计极为重要,一般互补区不宜少于15bp,引物对两条引物尽可能设计成相同的Tm值,采用高保真酶和减少循环次数可减少突变的产生,摸索反应体系也是套叠PCR成功的保证。
对于许多分子较小的多肽,用基因工程方法进行体外表达时,常出现表达量很低的状况,因为小分子多肽相对分子质量小,在细胞中不稳定,易被宿主蛋白酶降解,因此,我们采用多拷贝串联基因的方法,以期提高小分子多肽在宿主菌中的含量,在进行单拷贝酵母表达载体构建时,我们在目的基因的两端分别引入同裂酶AvaⅢ和pstI,同时引入Xho I和Xba I,并在基因5"端前引入kex2蛋白酶切割位点,pGAPZα-A是一组成型分泌表达载体,含有α-factor信号肽,它可使重组蛋白分泌到细胞外,在α-factor信号肽3"端含kex2酶切位点(742-747),在分泌表达时能被kex2酶切割,在其前方含有Xho I限制性酶切位点(736-741),将外源基因引入此Xho I位点,并引入kex2位点,这样在蛋白分泌表达时,信号肽可被切除从而形成天然N端的蛋白,运用AvaⅢ和Xho I、Pst I和Xho 1分别切割载体,回收大、小片段并在T4-DNA连接酶作用下连接形成pGAPZα-2hegf,由于在pGAPZα-hegf表达载体中引入了kex2,从而在pGAPZα-2hegf两hegf基因间也含有kex2,当分泌表达时,在kex2位点处被切割,可形成含天然N端的单体蛋白,同理,运用AvaⅢ和Xho I、Pst I和Xho 1分别切割载体,回收大、小片段并连接可形成pGAPZα-3hegf、pGAPZα-4hegf在分泌表达时自动切割形成单体蛋白,从而增加了蛋白表达量。
多拷贝载体构建有许多方法,如Hartley等采用识别非对称序列的内切酶Ava I,构建了一个含有34个重复123bp鼠DNA片段的载体,但构建过程复杂,对使用的载体有限制,操作成本也比较高,故使用比较少,龚杰万等采用同向串连构建了抗菌肽基因misgurin多拷贝表达载体,将基因分成4个接头和两个片段进行合成,并分别退火前接头(两个)、后接头(两个)和两个基因片段,随后将前接头和基因片段、后接头和基因片段在两个体系中分别进行连接,并在反应中补充基因片段和连接酶,最后将两反应产物混合进行连接反应,从而得到了多拷贝的misgurin基因,栗学清等也用此法构建了抗菌肽Aurein1.2基因多拷贝串联体,杨涛等利用Nhe I、SnaB I和XhoI构建了锯鳞蝰血抑环肽(Ecs)多拷贝表达载体,并利用甲硫氨酸(Met)作为溴化氰的切割位点,将表达的串联产物裂解为单体。
本研究利用同裂酶策略构建了表皮生长因子多拷贝表达载体,有利于其在酵母中表达,引入的kex2切割位点,使表达的蛋白具天然的N端,并可切割形成单体,将有助于提高蛋白表达量,这为进一步研究奠定了基础,同时也为小肽的体外高效表达提供了新思路。
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