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一种长链烷烃季铵化抗菌剂的制备方法及其产品和应用与流程
文档序号：17186802发布日期：2019-03-22 21:26阅读：387来源：国知局
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本发明属于生物医用材料领域，涉及一种长链烷烃季铵化抗菌剂的制备方法及其产品和应用。
背景技术：
目前随着人们安全健康意识的增强，对高效抗菌剂的需求更加迫切。在目前的抗菌产业化应用当中，主要通过投入小分子抗菌剂如季铵盐类抗菌剂、氧化锌类和氧化银类等。但是小分子抗菌剂存在不易加工、化学稳定性差和较高的毒性等诸多缺点。聚合物抗菌剂可以很好的客服上述缺点，较小分子抗菌剂，聚合物抗菌剂具有良好的稳定性和非溶出性，具有较高的生物安全性。季铵化聚合物普遍接受的抗菌机理为“穿透型抗菌机理”，其中包括4个步骤：1)季铵化聚合物具有较强的正电性，能够通过强烈的静电相互作用将菌体吸附到季铵化聚合物；2)在亲脂性烷基取代链的作用下，穿透细胞壁；3)破坏细胞质膜，影响细菌呼吸过程中的电子传递和氧化磷酸化过程；4)微生物死亡。与细菌相比，哺乳动物细胞膜受季铵化的影响较小，生物相容性也更高。但是，目前广泛使用的聚合物季铵盐抗菌都是小分子季铵盐聚合制备得到，工艺流程复杂，成本昂贵，且抗菌效果不佳。
此外，黄曲霉菌(atcc9643)、单核细胞增生李斯特氏菌(atcc19115)、幽门螺杆菌(atcc43504)和铜绿假单胞菌(atcc27853)也是食品贮藏、医疗卫生用品等评估的菌种。在自然环境中，黄曲霉菌(atcc9643)是一种常见的霉菌，多分布再植物及果实上，在储存的肉类中也会含有。它也是一种人类的病原，会造成肺的曲菌症(aspergillosis)，有时候也会引起角膜、耳与鼻眼框的感染。许多菌种会产生足量的黄曲霉毒素，这是一种有致癌性且有剧烈毒性的化合物。单核细胞增生李斯特氏菌(atcc19115)为革兰氏阳性菌，是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，是食品卫生检验中的特殊菌种。幽门螺杆菌(atcc43504)是一种革兰氏阴性杆菌，传染力很强，可通过手、不洁食物、不洁餐具、粪便等途径传染，在自来水中存活4-10天，在河水中存活长达3年。是传染性胃炎、慢性咽炎、口腔溃疡等消化性溃疡的主要原因。铜绿假单胞菌(atcc27853)，属于革兰阴性杆菌，该菌广泛存在于自然界的土壤和水中，亦可寄生于正常人皮肤和结膜囊，容易引起急性化脓性角膜炎，使大部分角膜将坏死，脱落，导致穿孔，进一步引起眼内炎，甚至全眼球炎。
目前针对上述菌种的有效抗菌方法多为抗生素，而基于季铵化抗菌剂的有效抗菌制备方法还未有公开。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种长链烷烃季铵盐抗菌剂的制备方法及其产品和应用。
本发明具体提供了如下的技术方案：
1、一种长链烷烃季铵化抗菌剂的制备方法，在富含叔胺的聚合物上通过化学修饰引入长链卤代烷，所述长链卤代烷的烷基上的碳原子数不少于7。
进一步，所述富含叔胺的聚合物为聚乙烯亚胺、聚2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯、聚2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯聚合物、聚2-(二乙氨基)甲基丙烯酸乙酯、聚2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯、聚2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯、聚2-(二异丙基氨基)丙烯酸乙酯、聚n-(3-(二甲氨基)丙基甲基丙烯酰胺或聚n-(3-(二甲氨基)丙基丙烯酰胺。
进一步，所述长链卤代烷的烷基上的碳原子数为7～50。
进一步，所述富含叔胺的聚合物的分子量为1000-100000道尔顿。
进一步，所述长链卤代烷包括碘代烷、溴代烷或氯代烷。
进一步，所述长链卤代烷的烷基为庚烷基、辛烷基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、三十烷基或四十烷基。
进一步，所述化学修饰的步骤为将富含叔胺的聚合物和长链卤代烷置于溶剂中，在20℃～30℃下搅拌24～72小时。
进一步，所述富含叔胺的聚合物和长链卤代烷的摩尔比为100：1～1：10000。
进一步，所述溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇、二氧六环、乙酸乙酯、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
2、按照上述方法制备得到的长链烷烃季铵化抗菌剂。
3、按上述制备得到的长链烷烃季铵化抗菌剂的应用，用于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌、幽门螺杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌抑菌。
本发明的有益效果在于：
本发明的富叔氨基的聚合物通过与环境中水的结合电离作用以及季胺化作用因而具有较强的正电性，而细菌的细胞壁和细胞膜内含有很多蛋白质，这些蛋白质的等电点较低，外界中性环境时具有较强的负电性，因此，富氨基的聚合物能够通过强烈的静电相互作用将菌体吸附聚集到聚合物的表面，增强对细菌的杀伤作用。而含氨基的小分子季铵盐由于其分子量小，所以与菌体的静电相互作用较弱。
本发明通过长链卤代烷烃(碳原子数不小于7)的季铵化反应过程制备成季铵化聚合物，所得到的季铵化聚合物的长链烷烃部分能有效破坏细菌细胞膜，具有更好的杀菌效果。在季胺化聚合物破坏细菌膜的过程中，季胺化聚合物的极性头和细菌细胞膜的磷脂双分子层极性头相互作用，季胺化聚合物的烷烃部分被平行固定于磷脂双分子层内。由于双层的横向扩散运动，以及烷烃链端季胺化聚合物的自由体积效应，使得细菌细胞膜磷脂双分子层疏水区的包装密度受到影响。在这个过程中，季胺化聚合物在水相和磷脂双分子层的分配系数随着烷烃链长的增加呈指数幂增加。短链卤代烃所构建的季胺化聚合物由于烷烃链短，和细菌膜磷脂双分子层的相互作用弱，而烷烃链端季胺化聚合物的自由体积效应较大，使得水相和双层的分配系数较小，无法对细菌细胞膜进行有效的破坏，产生杀菌作用。而长链烷烃可以和磷脂双分子层疏水区进行很好的匹配，使得季胺化聚合物的分配系数增加，更好的破坏细菌的磷脂双分子层结构，导致细胞膜的破裂和细胞内容物的渗漏，最终导致细菌的死亡。
本发明制得的抗菌剂，相比于短链烷烃季铵化抗菌剂，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念球菌等常见菌种具有优异的抗菌效果，可满足医疗、工业、日常抗菌消毒应用。该抗菌剂针对作为人体致病菌的幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌具有优良的抗菌效果，可用于特种医疗、水处理等卫生健康领域。该抗菌剂对黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌具有优异的抗菌效果，可以用于生鲜食物及冷藏食物的抗菌保鲜，医疗卫生等领域。
本发明的方法安全简单，室温下即可进行，并且不采用毒性较大的四氢呋喃溶剂，具有简单易控制的生产工艺，可操作性强，也可降低在制备过程中对操作人员的潜在身体危害，可应用于工业化生产，开发应用极具有发展前景。
本发明的抗菌剂的mic浓度远低于其安全细胞毒性浓度，说明在具备抗菌效果的浓度剂量下不会产生细胞毒性，具备生物安全性。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为季铵盐抗菌剂、碘甲烷季铵化聚乙烯亚胺和聚季胺盐-32的细胞毒性。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
在50ml乙腈溶液中加入10g分子量为1800道尔顿的聚乙烯亚胺和0.11g溴代辛烷(聚乙烯亚胺和溴代辛烷的摩尔比为10：1)，室温搅拌24小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂1。
实施例2
在50ml甲醇溶液中加入5g分子量为20000道尔顿的聚2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和0.03g氯代十三烷(聚2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和氯代十三烷的摩尔比为1：1)，室温搅拌72小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂2。
实施例3
在20ml四氢呋喃溶液中加入5g分子量为1000道尔顿的聚2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯和0.02g碘代十六烷(聚2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯和碘代十六烷的摩尔比为100：1)，室温搅拌36小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂3。
实施例4
在5mln,n-二甲基甲酰胺溶液中加入1g分子量为1000000道尔顿的聚2-(二乙氨基)甲基丙烯酸乙酯和1.51g溴代十五烷(聚2-(二乙氨基)甲基丙烯酸乙酯和溴代十五烷的摩尔比为1：10000)，室温搅拌40小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂4。
实施例5
在5ml乙酸乙酯溶液中加入2g分子量为30000道尔顿的聚2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯和7.6g碘代十八烷(聚2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯和碘代十八烷的摩尔比为1：300)，室温搅拌60小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂5。
实施例6
在20ml正己烷溶液中加入1g分子量为2000道尔顿的聚2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯和1.26g溴代三十烷(聚2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯和溴代三十烷的摩尔比为1：5)，室温搅拌60小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂6。
实施例7
在20ml异丙醇溶液中加入1g分子量为500000道尔顿的聚2-(二异丙基氨基)丙烯酸乙酯和0.93g氯代壬烷(聚2-(二异丙基氨基)丙烯酸乙酯和氯代壬烷的摩尔比为1：5000)，室温搅拌72小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂7。
实施例8
在10ml二甲基亚砜溶液中加入1g分子量为20000道尔顿的聚n-(3-(二甲氨基)丙基甲基丙烯酰胺和6.58g溴代十三烷(聚n-(3-(二甲氨基)丙基甲基丙烯酰胺和溴代十三烷的摩尔比为1：500)，室温搅拌70小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂8。
实施例9
在20ml四氢呋喃溶液中加入1g分子量为150000道尔顿的聚n-(3-(二甲氨基)丙基丙烯酰胺和12g碘庚烷(聚n-(3-(二甲氨基)丙基丙烯酰胺和碘庚烷的摩尔比为1：8000)，室温搅拌50小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂9。
实施例10
为了证明本发明的有益效果，对实施例1-8中的季铵化抗菌剂与市售聚季铵盐-32进行了对比测试，具体试验情况如下：
1.抗菌性能试验
抗菌剂的抗菌性能由最低抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，mic)来进行表征，mic是测量抗菌药物的抗菌活性大小的一个指标，指在体外培养细菌24小时后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度。
(1)抗菌剂贮存液制备
将季铵化抗菌剂稀释到无菌水中，制成2560μg/ml的原液。
(2)培养基制备
使用普通营养肉汤培养基、沙堡氏琼脂培养基、lb肉汤培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基，察氏培养基、幽门螺杆菌琼脂培养基
(3)mic板制作
将倍比稀释后不同浓度的季铵化抗菌剂贮存液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加季铵化抗菌剂贮存液，每孔10μl，抗菌剂浓度分别为2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/ml，第12孔不加抗菌剂作为阳性对照。
(4)接种物制备
将浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经lb肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加90μl。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml，密封后置37℃摇床孵育24h后判断结果。
(5)结果判断
在阳性对照孔内细菌明显生长的前提下，通过酶标仪测定od600，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低浓度为mic。
2.细胞毒性实验
根据mtt比色法评价对小鼠成纤维细胞(l929)的细胞毒性。用含10％胎小牛血清的培养液配成细胞悬液，以每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl，并在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育12小时，用培养液将季铵化抗菌剂进行浓度梯度稀释，使加入96孔板的最终浓度梯度为2048、1024、512、256、128、64、32μg/ml，每个浓度重复3次。培养24小时后，用pbs缓冲液洗涤细胞，然后向每孔加入20μl等份的mtt，继续培养4小时。最后每孔加入150μl二甲基亚砜，用酶标仪测定各孔od490，以细胞存活率≥80％为安全细胞毒性。
表1抗菌剂的抗菌性能及安全细胞毒性对比
表2抗菌剂对黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌、幽门螺杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌性能对比
表1对比了实施例1～9得到的抗菌剂与短链卤代烷碘甲烷季铵化的聚乙烯亚胺对于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的mic。mic是令细菌停止发育和分裂的最低抗菌剂浓度，此浓度越低，说明抗菌能力越强。
可以看出：实施例1～9的得到的抗菌剂对于不同菌落的mic均远低于其安全细胞毒性，因此本发明的抗菌剂在其安全细胞毒性的范围内可以产生良好的抗菌效果。而碘甲烷季铵化的聚乙烯亚胺抗菌剂和市售聚季胺盐-32的安全细胞毒性剂量分别为512μg/ml和32μg/m，其能够产生的抗菌mic远高于其安全细胞毒性剂量，说明在其产生抗菌效果的同时也会对正常细胞产生毒性杀伤作用。因此，本发明的用长链卤代烷(至少7个碳原子)季铵化聚合物相比于碘甲烷(碳原子仅为1)季铵化的聚乙烯亚胺抗菌剂和市售聚季胺盐-32具有更好的抗菌效果。这是由于季铵化聚合物的长链烷烃部分能有效作用于细菌细胞膜，增强与细菌亲脂性磷脂双分子层的相容性，细菌细胞膜遭受的破坏更大，胞内物质的释放更明显，从而更好的破坏细胞并杀死细菌。
目前针对黄曲霉菌(atcc9643)、单核细胞增生李斯特氏菌(atcc19115)、幽门螺杆菌(atcc43504)和铜绿假单胞菌(atcc27853)菌种的有效抗菌方法仅有抗生素，而没有季铵化抗菌剂能对它们产生广谱抗菌效果。表2表明，本发明的抗菌剂对黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌、幽门螺杆菌和铜绿假单胞菌均具有非常优异的抗菌效果。而碘甲烷季铵化聚乙烯亚胺的对这四种细菌的mic值远高于本发明的抗菌剂。因此说明，用长链卤代烷季铵盐化的抗菌剂抗菌效果远远好于短链卤代烷(例如碘甲烷)季铵盐化的聚乙烯亚胺抗菌剂，说明本发明抗菌剂具有优异的广谱抗菌效果。
图1对比了几种抗菌剂的细胞毒性，从图1中可以看出：
(1)抗菌剂1、2、9在512μg/ml时细胞存活率为100％，抗菌剂3、4、5、6、7、8在512μg/ml时细胞存活率大于80％，因此抗菌剂1-9在512μg/ml时均不具备细胞毒性。结合表1和表2，抗菌剂1-9对于不同菌落的mic均低于512μg/ml，说明抗菌剂1-9的使用剂量在512μg/ml以下时可完全产生抗菌作用，而不会产生细胞毒性。
(2)碘甲烷季铵化的聚乙烯亚胺在512μg/ml时细胞存活率大于80％，为其安全细胞毒性，而其对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌、幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌的抗菌mic分别为2048、1024、2048、2048、2048、2048、1024μg/ml，其mic均大于其安全细胞毒性浓度，说明碘甲烷季铵化的聚乙烯亚胺在具备抗菌效果的浓度剂量下会产生细胞毒性，不具备生物安全性。
(3)聚季胺盐-32在32μg/ml时细胞存活率大于80％，在512μg/ml时细胞存活率仅40％，和抗菌剂1-9相比具有明显的细胞毒性。同时聚季胺盐-32对大肠埃希菌、白色念球菌、黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌、幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌的抗菌mic分别为64、256、64、256、256、64μg/ml，其mic均大于其安全细胞毒性浓度，在用于这些菌落的抗菌时会产生细胞毒性，不具备生物安全性。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。