抗性基因插入失活的筛选原理

蓝白斑筛选的蓝白斑筛选原理

是重组子筛选的一种方法，一些载体带有β-半乳糖苷酶N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点，可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时。α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。扩展资料：蓝白斑筛选原理一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

2023-07-12 06:29:021

蓝白班筛选中,蓝色菌落还是白色菌落最可能含有重组因子,为什么

这个是蓝白斑筛选试验。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

2023-07-12 06:29:202

α-互补与蓝白斑筛选的关系

二者相同。细菌的篮白斑筛选又称α互补法，是根据组织化学的原理来筛选重组体的方法。α互补可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。

2023-07-12 06:29:291

pet28a可以蓝白斑筛选吗

pet28a不可以蓝白斑筛选。pet28a不可以蓝白斑筛选，因为没有lacZ的alpha片段编码基因。

2023-07-12 06:29:361

有没有高人能告诉我蓝白斑筛的步骤，原理。谢谢。 有加分

在这之前先说一下做蓝白斑筛选必备条件（1）首先定义 LacZ：B(beta,打不出来，下同)-半乳糖苷酶 LacZ"：含有B-半乳糖苷酶的启动子和5‘端的编码的a肽链。 那么LacZ"是没有功能的（是指能表达没有功能的蛋白质），只有和失去正常氨基端（5"端）的B-半乳糖苷酶重新互补形成完整的B-半乳糖苷酶后才具有功能，它能将底物Xgal（5-溴-4-氯-3吲哚-B-半乳糖苷）水解，形成一种蓝色化合物，菌落呈蓝色；其靠近5‘端有多克隆位点，当插入外源目的基因后将会影响该基因的功能，导致无法形成完整功能的B-半乳糖苷酶而不能水解IPTG底物，菌落呈白色。 通俗易懂的说法就是LacZ"是左半边，失去正常氨基端（5"端）的B-半乳糖苷酶是右半边，组合在一块形成有功能的酶。（2）明白以上这点，我们再往下说。 1.一般来说，做蓝白斑，质粒载体上有LacZ" 2.Lac I，是LacZ"的抑制基因，表达的阻遏蛋白和LacZ"上的操作子区结合将会阻遏LacZ"基因的表达，当有诱导物，IPTG（异丙基-B-D-硫代半乳糖苷）与阻遏蛋白结合后，将使阻遏蛋白脱离操作子，从而使LacZ"正常表达。 3.抗药基因，如Amp，用于筛除未将载体转入了的宿主细胞，这是前提，否则鉴定是没有意义的 4.而宿主应该具备的条件是具有失去正常氨基端（5"端）的B-半乳糖苷酶的一种突变体，即前文说的右半边（3）步骤如下： 1.将目的基因插入LacZ"靠近5‘端有多克隆位点，是否成功插入有待蓝白斑筛选鉴定。 2.通过一定的方法，如CaCl2诱导法将目的基因转入宿主菌（失去正常氨基端（5"端）的B-半乳糖苷酶的一种突变体） 3.将宿主菌至于含有IPTG，Xgal，以及抗生素Amp固体培养基中培养 4.形成白色菌斑，说明目的基因插入了多克隆位点，导致LacZ"的基因功能受到影响，与失去正常氨基端（5"端）的B-半乳糖苷酶组合后不能水解Xgal，菌落呈白色。形成蓝色菌斑，说明目的基因没有成功插入多克隆位点，LacZ"功能正常，与失去正常氨基端（5"端）的B-半乳糖苷酶组合后能水解Xgal，生成蓝色化合物，菌斑呈蓝色。 5.这里不存在由于质粒未能成功转入宿主而导致的Xgal不水解形成白色菌落的可能，因为未能成功导入质粒的宿主菌将会因为缺乏Amp抗性而被杀死。

2023-07-12 06:29:451

蓝白斑筛选

α-互补 的原理载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, 载体和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在二者融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。 蓝白斑筛选的机理由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。 在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。

2023-07-12 06:29:552

比较蓝白斑筛选法与插入失活法筛选的优缺点

插入失活法在含抗性培养基中培养后并不能直接得到所需的重组体。而是需要进行菌落平板的影印复制, 才能够将所需的重组体挑选出来。蓝白斑筛选可以直接通过颜色判断抗性培养基中的所需重组体，并且两种抗性可以在同一培养基中同时筛选，大大提高了效率。蓝白斑筛选的所需工程菌为β半乳糖苷酶缺陷型菌株。

2023-07-12 06:30:052

蓝白斑筛选过程中，T载体:DNA=1:4,DNA为PCR纯化产物，连接条件4度过夜过更长，643bp的没出现假阳性

--蓝白斑筛选过程中，T载体:DNA=1:4,DNA为PCR纯化产物，--如果是摩尔比没什么问题。其实只要目的片段摩尔数高于载体就会有很好的结果。但是如果产物量太大，则会有不良的效果。根据你的问题1：检测纯化产物。出了问题后纯化产物一定要走电泳查看，确认回收效率。2：连接的产物量不用太大。3000bp的T载体如果用25ng，你的643bp产物用10~30ng足够了，这个量在凝胶上只是明确的条带而已，不会很亮。3：检测感受态：感受态细胞如果是自己做的，也许会有杂菌。买来的也存在一定的几率。做一个空转对照，确认感受态不会有问题。4：休克温度：42度即可，没必要45度。45秒没问题，实际上30~90秒都可以，我一般用45秒。5：连接：4度过夜已经足够，除非你的片段很长。6：蓝白斑筛选：有可能淡蓝色的蓝斑是你需要的克隆，如果你的克隆浅蓝色的斑很多，更可能是这样。一般效率高的话只有少于10%的蓝斑，效率一般则可能超过半数蓝斑甚至更多。7：生长速度：关于生长速度你的概念是错误的，数百道数千bp的插入克隆生长速度不会差太多，不可以此作为依据。即使你转纯化的质粒克隆也会不一样大小。但是有插入的克隆会略略慢一点点。8：再确认一下载体吧。

2023-07-12 06:30:163

蓝白斑筛选中氨苄青霉素的终浓度是多少

终浓度均为100ug/ml。配制的都是100mg/ml的贮存液，按1:1000加入到培养基里。

2023-07-12 06:30:263

简述α互补和蓝白斑筛选的原理

载体pGEMZ在β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码区内具有多克隆区域。在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源α-肽失活。载体pGEMZ或其它含lacZ基因的α-肽互补细菌，具有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体pGEMZ的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶只是部分失活。重组质粒转化到合适的菌株中（JM109， DH5α），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。可将50ul的X-Gal和100 ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。IPTG溶于水中，贮液浓度为100mM，X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml。IPTG和X- Gal需分装后保存在-20 oC，可保存2-4个月　　重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lac Z′基因。Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。Lac Z′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lac Z′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lac Z′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

2023-07-12 06:30:481

蓝白斑筛选中的蓝斑是什么？ 是载体自连产物吗？

载体上的是β-半乳糖苷酶基因（lacZ），他能使细菌表达β-半乳糖苷酶，该酶可以将X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖）降解，产生显色底物，然后我们就能看到蓝色斑。

2023-07-12 06:30:571

蓝白斑筛选问题

那么，那些带一点蓝色的白斑你有没有做菌液PCR呢？或者测序呢？我以前有见过带点蓝色的白斑，其实也是蓝斑。没有白斑的原因，要么是没连上，要么是没转化成功。从连接产物，到菌种都排查一下吧！

2023-07-12 06:31:063

大肠杆菌BL21可用于蓝白斑筛选吗

在进行蓝白斑筛选的时候，出现了两个奇怪现象：一、我的空白载体转的大肠杆菌不但出现了蓝斑而且还有白斑。二、连有目的基因的载体转的大肠杆菌出现了好多蓝色小点点，看起来不像是细菌。不知道是什么原因，我的大肠杆菌是做过氨苄对照测试的，应该没有杂菌的。

2023-07-12 06:31:151

IPTG用来筛选蓝白斑需要搭配什么使用啊，求告知啊，做了几次实验都失败了！

需要搭配X-gal来用，IPTG为安慰型诱导物，可诱导β-半乳糖苷酶的产生，X-gal是β-半乳糖苷酶的作用底物，在β-半乳糖苷酶的作用下X-gal被切割成半乳糖和深蓝色的物质，这样就能看到蓝色，如果lac启动子的质粒中插入了外源基因，则不能产生β-半乳糖苷酶，因此不能分解X-gal产生蓝色底物，所在的菌落呈现白色（相对蓝色），这样就能完美实现蓝白斑的筛选了。根据我们实验的经验IPTG浓度可以控制在50mg/ml；X-gal浓度20mg/ml较好，我们学校做实验是用的武汉双金的，用的很稳定，不过X-gal对光是敏感的，你做好基板之后要尽快的使用。

2023-07-12 06:31:231

TA克隆 蓝白斑筛选

1、可能你的感受态细胞都死亡了，根本就没有活菌，就不长了。2、可能是没连接上，没有就没有完整的载体转入感受态细胞，自然也不会生长。3、可能用的抗生素不对，抗生素与耐药载体不符合，也不会生长。4、抗生素量太大，培养是时间太短，细菌还没有长起来。5、涂布时，玻璃棒太热，把细菌都烧死了。就是上面这些原因，一个一个的排除一下吧。

2023-07-12 06:31:333

如何设计质粒载体进行蓝白斑筛选

先连接T载体是为了提高转化效率一般来说市面上出售的T载体都进行了优化，容易连接片段（也就是效率较高），因此构建表达载体时有时会先连接T载体。同时T载体的测序引物比较明确（商业化的缘故），因此测序也方便一些。更重要的是，T载体往往设计了蓝白斑筛选的功能，插入片段的载体会呈现白色，这样也容易区分验证，不用每个单菌落都拿去做colony PCR或提质粒酶切验证。当然也不是绝对的，我们实验室就经常直接把片段酶切后连接表达载体，不经过T载体这一步，其实影响并不大。如果你的情况比较特殊（比如片段较大，或是对应的表达载体拷贝数较低等），可以考虑连接T载体，不然的话不是非常必要。

2023-07-12 06:31:421

蓝白斑筛选假阴性

此类载体携带lacZ"基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且处于可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下。质粒转化的宿主菌为LacZ△M15 基因型（含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。未重组的质粒转化宿主菌后，在IPTG 的诱导下，质粒与基因组分别表达缺陷但可以相互补偿的两个肽（即α-互补），形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝。然而当外源DNA 插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，因而不能表达出与宿主菌基因组表达的缺陷型β-半乳糖苷酶多肽发生α-互补。由于没有β-半乳糖苷酶的酶解作用，致使重组菌形成白色菌落。由此，可以借助蓝白斑很容易筛选出重组子.不过实际操作中发现当插入小片段时，重组子也有形成浅蓝斑的情况.即蓝色菌斑也有可能含外源基因。据最新报道，大概有30%的假阴性.

2023-07-12 06:31:521

为何蓝白斑筛选后要菌液pcr?

为了确认在白斑里面确实是插入了目标片段。因为有的时候，可能插入的是非特异片段，所以筛完再确认一下。不然其他片段插进去，也是白斑，后续做实验就白做了。当然菌液PCR也不是最准确的，最后还是需要测序的。

2023-07-12 06:32:131

如何提高杆状病毒的重组效率蓝白斑筛选

在重组质粒表达的实验中，蓝白班筛选是要检测重组质粒是否表达，而氨苄的加入主要是为了防止培养过程中染菌。对于半乳糖苷酶活性筛选，首先重组质粒所选的质粒与野生型（感受态）不同，上面有多克隆位点，蛋白标签，和多对操纵子、启动子，其中就包括乳糖操纵子。当培养液中加入IPTG，IPTG可以和乳糖操纵子下游的的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白从DNA上脱离，激活半乳糖苷酶的表达。因而重组质粒可以利用x-gal而感受态不能。这个是蓝白斑筛选的主要原理。结果中白斑表示重组质粒表达的菌体，蓝斑表示未表达。至于氨苄筛选，通常不会利用氨苄抗性进行筛选，因为感受态中是否有氨苄抗性基因很不确定，无法得到准确的结果

2023-07-12 06:32:231

蓝白斑筛选结果相反是为什么

这个好像是分子生物学课后习题嘛！前面那是是假阴性，由于插入目的片段太短，报道称有30%的假阴性，但为什么会有60bp的小片段，多数是实验过程中的污染，也有可能是基因组被酶切的小片段。后者是假阳性，即在载体与插入片段连接前，载体末端被核酸酶酶切掉一点，被轻微降解的载体然后自连接，被轻微降解的lacZ‘基因就足以产生白色菌落了。

2023-07-12 06:32:332

蓝白斑筛选 没有白斑

说明你重组质粒连接效率低或者自连严重。还有可能是你的插入片段太短，并且刚好和lacZ使用同一个读码框，造成半乳糖甘酶具有部分活性。是的。我建议你重做一次连接和转化。注意使用的双酶切，并且内切酶不要是同尾酶。

2023-07-12 06:32:423

关于蓝白斑筛选的遇到的问题

首先X-gal要避光保存，以免失效；其次培养时间确定够吗？我们前两天做的，也全是白斑，又培养了四个小时，总共20h,就有蓝斑出现了（我用的是大肠杆菌）

2023-07-12 06:32:522

改进蓝白斑筛选重组子改进的方法

蓝白斑2次筛选。蓝白斑筛选是基因工程中比较常用的一种细菌重组子的筛选方式，改进蓝白斑筛选重组子改进的方法是蓝白斑2次筛选，在抗生素筛选基础上的第2次筛选，是根据载体的遗传特征筛选重组子。

2023-07-12 06:33:001

pET28b能不能进行蓝白斑筛选

不能，因为没有lacZ的alpha片段编码基因。大多数表达载体为了高效表达目的蛋白，会避免插入其它不是必需的编码序列。

2023-07-12 06:33:082

蓝白斑筛选,但涂板过夜培养后什么都没长,这是什么原因呢？

过敏了 谢谢

2023-07-12 06:33:182

蓝白斑筛选实验,结果都是白斑说明所有的细胞都插入基因成功了吗?

我觉得你更可能是培养基出问题了或者其他的 蓝白斑筛选不可能所有的都是白斑的，连接效率没有那么高 建议你再检查下自己的实验

2023-07-12 06:33:252

蓝白斑筛选中的阳性对照和阴性对照指的是什么？

我们一般做克隆载体的构建是不用蓝白斑筛选的，很麻烦，而且结果不一定正确，其实只要目的片段连入了克隆载体，就可以得到最终的结果，我们做蓝白斑也不做对照的，结果一样可以得到

2023-07-12 06:33:351

蓝白斑筛选重组质粒实验中为什么用IPTG做为诱导物

IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA（或其他带有lacZ 基因载体DNA）以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。乳糖不是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质，半乳糖才是。

2023-07-12 06:33:561

如果经过蓝白斑筛选后选出白色,再怎么确认它就是真正的片段

酶切鉴定或者PCR鉴定，得到与设计相同的目的片段。最好最准确的确认方法还是测序比对。

2023-07-12 06:34:042

看蓝白斑筛选，LacZ基因能编码肽链与β-半乳糖苷酶缺陷型菌株互补，共同生成完整的β-半乳糖苷酶作用于

LacZ是转化的质粒携带的基因，转化到β-半乳糖苷酶缺陷型菌株中，赋予该菌株表达β-半乳糖苷酶（互补），从而作用于底物X-gal生成蓝色物质。如果是β-半乳糖苷酶菌株，则不转化外源质粒，就全部长成蓝斑了。LacZ被插入片段阻断之后，即使该质粒转化β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，也不能表达完整的β-半乳糖苷酶，所以呈白斑。

2023-07-12 06:34:261

空载T19转进感受态中，蓝白斑筛选为什么显示蓝色菌落？

空载就不会有插入片段呀，lacZ基因就没有断开呀，所以肯定是蓝斑

2023-07-12 06:34:342

最近做基因克隆，做蓝白斑筛选时只有白斑，一个蓝斑也没有，而且白斑长的非常密，

你应该先检查一下实验所用的药品、菌体、载体、感受态细胞的活性，有时也会出现失效的时候

2023-07-12 06:34:432

关于连接，转化，蓝白斑筛选的问题

1 SolutionI和你待连接的样品最佳比例是1:1，即各5微升。2 连T的片断最好是新鲜的PCR样品，防止A degradatio。3 你可以考虑调整一下连接温度，查查相关产品的说明。

2023-07-12 06:34:501

为何蓝白斑筛选后要菌液pcr?

因为白斑不一定是阳性克隆，而且你做ta克隆是为了测序，送的样最好是验证过的。当然测不出来是不收费的

2023-07-12 06:34:591

蓝白斑筛选实验,结果都是白斑说明所有的细胞都插入基因成功了吗?

我觉得你更可能是培养基出问题了或者其他的 蓝白斑筛选不可能所有的都是白斑的，连接效率没有那么高 建议你再检查下自己的实验

2023-07-12 06:35:072

蓝白斑筛选的原理是什么？

蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法。野生型大肠杆菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。在经人工插入外源基因后，突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，主要为α-互补与抗生素基因。蓝白斑筛选在指示培养基上，未转化质粒的菌落因无抗生素抗性而不能生长，重组质粒的菌落是白色的，非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法。一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子 。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

2023-07-12 06:35:293

蓝白斑筛选的原理是什么

蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法。野生型大肠杆菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。在经人工插入外源基因后，突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，主要为α-互补与抗生素基因。蓝白斑筛选在指示培养基上，未转化质粒的菌落因无抗生素抗性而不能生长，重组质粒的菌落是白色的，非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法。一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子 。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

2023-07-12 06:36:171

基因工程中蓝白斑筛选的原理是什么

一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。扩展资料：适用方面：设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N端一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz"的基因，lacz"中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz"的质粒后，质粒lacz"基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。参考资料来源：百度百科-蓝白斑筛选

2023-07-12 06:36:372

蓝白斑筛选

　　蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。　　野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。　　设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz"的基因，lacz"中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz"的质粒后，质粒lacz"基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。　　操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz"中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz"的载体连接时，会插入进MCS（即靶基因），使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。　　实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。

2023-07-12 06:36:562

蓝白斑筛选的简介

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如a-互补 、抗生素基因等。蓝白斑筛选是在指示培养基上，重组质粒的菌落是白色的，非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法 。

2023-07-12 06:37:041

蓝白斑筛选的原理是什么?

利用乳糖操纵子系统。野生型埃希氏大肠菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。在经人工插入外源基因后，突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

2023-07-12 06:37:181

蓝白斑筛选的原理是什么?

利用乳糖操纵子系统。野生型埃希氏大肠菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。在经人工插入外源基因后，突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

2023-07-12 06:37:331

酵母双杂交技术与蓝白斑筛选的区别

酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质分别克隆（融合)到酵母表达质粒的转录激活域(如GAL4等)的DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活域(AD)上，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子。蓝白斑筛选主要为基因互补与抗生素基因。蓝白斑筛选在指示培养基上，未转化质粒的菌落因无抗生素抗性而不能生长，重组质粒的菌落是白色的，非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法。

2023-07-12 06:38:131

酵母双杂交技术与蓝白斑筛选的区别

酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质分别克隆（融合)到酵母表达质粒的转录激活域(如GAL4等)的DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活域(AD)上，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子。蓝白斑筛选主要为基因互补与抗生素基因。蓝白斑筛选在指示培养基上，未转化质粒的菌落因无抗生素抗性而不能生长，重组质粒的菌落是白色的，非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法。

2023-07-12 06:38:221

蓝白斑筛选假阳性是怎么回事?

假阳性：由于时间太长，氨苄青霉素被阳性大肠杆菌降解，不抗氨苄青霉素的大肠杆菌就会长出来形成白斑，而这些大肠杆菌不含载体和外源基因，因此是假阳性。

2023-07-12 06:38:323

昆虫细胞蓝白斑原理

野生型埃希氏大肠菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。在经人工插入外源基因后，突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

2023-07-12 06:38:391

为什么在蓝白斑筛选中，在mcs中插入了外源dna，但是在x-gal上菌落仍然呈蓝色

这个是蓝白斑筛选试验。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

2023-07-12 06:38:481

蓝白斑筛选中,为什么白色菌落不一定是重组子

这个是蓝白斑筛选试验。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

2023-07-12 06:38:572

t克隆时蓝白斑筛选实验为什么蓝斑做菌落pcr也能扩出来

--蓝白斑筛选过程中,T载体:DNA=1:4,DNA为PCR纯化产物,--如果是摩尔比没什么问题.其实只要目的片段摩尔数高于载体就会有很好的结果.但是如果产物量太大,则会有不良的效果. 根据你的问题 1：检测纯化产物.出了问题后纯化产物一定要走电泳查看,确认回收效率. 2：连接的产物量不用太大.3000bp的T载体如果用25ng,你的643bp产物用10~30ng足够了,这个量在凝胶上只是明确的条带而已, 3：检测感受态：感受态细胞如果是自己做的,也许会有杂菌.买来的也存在一定的几率.做一个空转对照,确认感受态不会有问题. 4：休克温度：42度即可,没必要45度.45秒没问题,实际上30~90秒都可以,我一般用45秒. 5：连接：4度过夜已经足够,除非你的片段很长. 6：蓝白斑筛选：有可能淡蓝色的蓝斑是你需要的克隆,如果你的克隆浅蓝色的斑很多,更可能是这样.一般效率高的话只有少于10%的蓝斑,效率一般则可能超过半数蓝斑甚至更多. 7：生长速度：关于生长速度你的概念是错误的,数百道数千bp的插入克隆生长速度不会差太多,不可以此作为依据.即使你转纯化的质粒克隆也会不一样大小.但是有插入的克隆会略略慢一点点. 8：再确认一下载体吧.

2023-07-12 06:39:061

l为什么在蓝白斑筛选中加x-gal不加乳糖？

l为什么在蓝白斑筛选中加x-gal不加乳糖？会变化

2023-07-12 06:39:163