菌株与质粒AH109酵母菌株(MATa，trp1．901，leu2—3，112，ura3-52，his3-200，gal4A，gal8O~X，LYS2：：G地1U^s-GALlT^T^-HIS3， G U^s—GAI2T^T^-ADE2，URA3：：h吐1U^s．h吐1T^T^．1acZ)，YM187酵母菌株(NATQ，um3-52，his3-200，ade2—101，trpl-901，leu2-3，112，g △，met， O△，URA3：：GAL1U^s-GAL1T^T^一laeZ，NE!,1)．I~BKT7-p53是编码鼠p53蛋白(a．a．72—390)和GAL4 DNA BD(a．a．1—147)融合蛋白的阳性对照质粒。pcArrr7．T是编码SV40大T抗原(a．a．87—7O8)和GAL4 DNA．BD(a．a．1—147)融合蛋白的阳性对照质粒，上述菌株与质粒均购自CLONTECH公司。JIVl109大肠杆菌菌株购自promega公司。1．2 试剂鲑鱼精担体DNA，酵母培养用的YPDMedium SD Minimal medium 一 DO Supplement 一LeuDO Supplement、一Leu／一Trp DO Supplement、一Leu／Trp／HisDO Supplement、一Ade／一His／一L~aTrp 130 Supplement等均购自CLONTECH。硫酸腺嘌呤(Adenine hemisul。fate)购自Gibco。PEG 3250购自Sigma。DMSO购自AMRESCO。硝酸纤维素膜购自Phamacia。X-Gal购自BBI。QIAprep Miniprep Kit购自QIAGEN公司，其它常规分子生物学试剂购自北京华美生物公司。1．3 pGBKT7．ps3和t~alrr7．T质粒的制备用2mL LB液体培养基扩增pGBKT7一p53和pGADT7一T质粒。分别用小规模碱裂解法【7 (AIK法)和QtarREPMiniprep Kit试剂盒(QIAGEN法)提取质粒。紫外分光光度法测0D260／280，并计算质粒DNA含量。1．4 酵母双杂交共转化实验按酵母操作手册建议的方法进行转化，取不同量的上述两种方法提取的pGBKT7—053和pGADT7．T质粒共转化到AH109酵母菌株中，将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：10003种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／Trp／一Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目(cfu)。计算共转化效率：转化效率cfu／／．tg DNA=cfu×悬浮细胞体积( )×稀释倍数／[铺板体积( )×DAN‘](*这里的DNA的量指的是所用一份的质粒量而非全部质粒总量)。1．5 酵母双杂交顺序转化实验取不同量的上述两种方法提取的pGBKT7—053转化于AH109酵母菌株，用SD／ TW缺陷培养基筛选得到AH109[pGBKT7—53]，挑取新鲜的直径为2—3 iran的AH109[pGBKT7一p53]酵母单克隆4—8个，接种于1 ml SD／一Trp缺陷液体培养基中，旋涡振荡1 mira，彻底打散菌团。将1IIll菌液转移到5O IIll的sD液体缺陷培养基中。将pGADT7一T转化于AH109[pGBKTT-53]，其余方法同酵母操作手册，将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：1000三种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／一Trp／．Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目(cfu)。按上述公式计算转化效率。1．6 酵母双杂交交配实验 将pGBKT~．p53和pGADTrT质粒分别转化于酵母菌株AH109和YM187中，待在相应SD缺陷培养基平板上生长出克隆后，分别各挑取一个2—3 nl／n酵母单克隆共放置于一个含有0．5 ml YPDA液体培养基的1O IIll离心管中，涡流震荡1 min，彻底打散菌团，3ocI=、200rpm过夜培养(20—24 h)。100 交配培养物铺于SD／一 一Leu培养基平板，200 交配培养物铺于SD／一His／一I~u／Tw(TDO )培养基平板。检测二倍体数目：将交配产物按照1：10、1：100、1：1000三种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／一Trp／．Leu平板。待长出克隆后计数cfu。计算二倍体细胞数目：cfu×悬浮细胞体积(ta)×稀释倍数／铺板体积(ta)。1．7 窖a1分析实验1．7．1 8一半乳糖苷酶的定性分析 检测AH109[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，挑酵母克隆(新鲜直径为2—3 mm)划双斜线于平铺在相应培养基平板上的灭菌的硝酸纤维素膜上，3ocI=倒置培养24小时。将膜于液氮中冷冻，冷冻时间分别为10 s、30 s、1 rain、2 rain，30cI=放置10 mill，置于浸没于Z bufer／X．gal(100 ml Z bufer、0．27 ml f≥I巯基乙醇、1．67 ml 20 mg／m~的X—ga1)溶液的滤纸上(z bufedX．gal溶液以刚刚浸湿滤纸为佳)，放置于3OcI=下进行观察，15 rain记录一次，以后可每隔1 h记录一次。观察不同条件下菌落的颜色变化，划线的酵母菌落颜色在8 h内显色变蓝的即为阳性结果。同时没定液氮冷冻时间为1 min，比较处于不同显色温度(25℃、30℃、37℃)下f；-半乳糖苷酶的活性。1．7．2 8一半乳糖苷酶的定量分析定量分析AH109[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，同时以AH109[pCL1]为阳性对照，AH109[pGBKT7—053+pG~rr7一T]和AH109[pGBKT~+pGADT~一T]为空载体对照，AH109为阴性对照。AH109[pCL1]的稀释倍数为3，其余的稀释倍数为1。具体步骤参照酵母操作手册。计算p半乳糖苷酶的单位：1000×OD∞／(t×V×ODao)，其中t为反应时间，V=0．1 ml×稀释倍数。
