克隆

含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子 。氨苄霉素简称为氨苄，具有杀灭细菌的作用，如常见的大肠杆菌、DH5α这一类的感受态细胞。在未重组的情况下，他们是不具备抗氨苄的能力，一起培养会被氨苄杀死。如果在感受态细胞里重组加入像PUC18一类的具有抗氨苄性质的基因片段，在与氨苄一起培养生存下来的只有重组的这一种，其他的杂菌会被氨苄杀死，因此得到纯净的重组细菌。氨苄的作用就是筛选出来目的菌种即为重组的细菌。

你这种插法，阳性克隆子会失去抗性，死于四环素，正常情况没有这么筛选的。非要这么设计实验的话，那就先用不含四环素的培养基培养单菌落，然后每个单菌落进行扩增，逐个去涂含有四环素的培养基，无法存活的就是阳性克隆子。

1 菌落PCR。设计引物扩增质粒特有的目的片段，如果阳性克隆里面有改片段，则说明转化成功。2 快抽质粒。将阳性菌落划平板，几个小时后，富集菌，然后快速抽提。看质粒大小有没有插入目的片段。3 提质粒，酶切鉴定。4 提质粒测序。1,2 都是早期的快速鉴定，假阳性高；3,4慢，但是比较确信。一般组合来用。

质粒被切以后，和目的基因放在一个体系中，加入dna连接酶，有可能质粒在切口处重新接上。这样的质粒上面有标记基因，但没有目的基因。因此，这样的质粒导入受体细胞后也有抗性。这就是假阳性。还有一种假阳性，就是目的基因和质粒在连接时，方向接反了。如何防止假阳性，方法有三种。第一，用同尾酶去切，可防止质粒自身环化；第二、用双标记基因法，如抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因两个标记基因，这个方法一句话给你说不清楚，先简单了解一点；第三、用基因探针去检测，这个方法是最可靠的。

原因可能是多方面的：1.你所说的阳性克隆仅仅是在抗性平板上生长的菌落吗？如果是，或许它是假阳性。因为抗性平板上抗生素的分布不均匀，部分降解等会造成抗生素的失效，从而出现没有转进质粒的假阳性菌落，这时当然提不出质粒来。2.如果能保证阳性菌落是正确的（确实转进质粒），那么质粒提不出来很可能是你所用的质粒快提试剂盒或者试剂有问题，这就需要重新配试剂或购买新试剂盒。

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

克隆技术的应用克隆技术已展示出广阔的应用前景,概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种,保存和传播动物物种资源.以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明. 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一,转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器,以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等.但目前转基因动物的实际应用并不多,除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外,转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长,已进行了10多年,但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验,6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生.转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵,以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状,是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因. 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命,动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能.采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移,可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率.同时,采用转基因体细胞系,可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选.在核移植前,先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中,再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆,然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中,最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物.采用此法,Schnieke等（Bio Report,1997）已成功获得6只转基因绵羊,其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因）,3只带有标记基因,目的外源基因整合率高达50％.Cibelli（Science,1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛,证实了该法的有效性.由此可以看出,当今动物克隆技术最重要的应用方向之一,就是高附加值转基因克隆动物的研究开发. 胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞.科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型,来替代那些受损的体内组织,比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内.科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞,使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞.这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路.目前,科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998,Science）,而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能.把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚,把重组胚体外培养到囊胚,然后从囊胚内分离出ES细胞,获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞,肌肉细胞和血细胞）,用于替代疗法.这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗,而非得到克隆个体,科学家们称之为“治疗克隆”. 克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的,它为研究配子和胚胎发生,细胞和组织分化,基因表达调控,核质互作等机理提供了工具. 就医学界而言,现今全世界有成千上万的人因为失去自身的器官而十分痛苦,克隆技术对于这些人来说,无疑是一大福音.试想,一个从小失明的人能在成年后重见光明,一个因交通事故失去双手的人能重新“长”出一双手来……如果克隆的研究获得成功,白血病、帕金森病②、心脏病和癌症等疾病患者带来生的希望.而且这种治疗方法会最大程度地减少副作用的产生. 克隆技术的发展对生物学界也是有很大益处的.目前人类对自然界的各种生物乃至人类本身的了解还是十分有限的.如果能运用先进的克隆技术对某些生物进行研究,那么将大大提高研究的效率,从而加快生物界乃至人类社会发展的进程. 刀,可以用来杀人,也可以用来救人,关键看它掌握在什么人手中.“科学是一柄双刃剑”,善良的人们可以利用它来为人类服务,为人类造福,而邪恶的人们却能用它来危害人类的生存.任何科学技术的发展,都有利有弊,只要人类正确运用克隆技术,那么它一定会有益于人类.如果我们只看到它的弊端,而畏缩不前,那么人类社会就不会有发展,也不会有进步.我们不能因噎废食,因为那样只能使人类固步自封,这就是我们想看到的结果吗?我坚信,只要能正确对待克隆技术,那么人类一定会从中受益匪浅.

最常见的就是蓝白斑筛选，详细的楼主可参考这个http://baike.baidu.com/view/161221.htm方法很多，除蓝白斑筛选外，像菌落PCR验证：详见http://baike.baidu.com/view/4118663.htm从细菌里提取质粒后双酶切验证：用构建重组质粒时的两种限制性酶进行酶切，电泳，观察条带是否和重组之前，目的基因电泳时条带所处的位置一致。测序验证：送测序公司

GFP本身是绿色荧光蛋白(Green Fluorecent protein)的缩写，至于你说的大肠杆菌GFP是个菌，要么是可以表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌重组菌，要么是你把蛋白和菌搞混了。筛选氨苄青霉素抗性的阳性克隆很简单，将氨苄青霉素加到所用培养基中，终浓度100ug/ml，把要筛选的菌液涂布其上，能长出的就是氨苄青霉素阳性菌株。要注意的是生长时间不可太长，因为水解氨苄青霉素的beta-内酰胺酶能分泌到细菌外，导致阳性菌周围的阴性菌也能生长，即所谓的卫星菌落。

在单克隆抗体中，为何需要多次检测细胞阳性，检测阳性，就是能产生特定抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程叫基因克隆。 基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。 体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰，如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。导入受体细胞载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化（transformation），转染（transfection），转导（transduction）。重组质粒通过转化技术可以导入到宿主细胞中，同样重组噬菌体DNA可以通过转染技术导入。转染效率不高，因此将重组噬菌体 DNA或柯斯质粒体外包装成有浸染性的噬菌体颗粒，借助这些噬菌体颗粒将重组DNA分子导入到宿主细胞转导技术，这种转导技术的导入效率要比转染的导入效率高。 从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：（一）插入失活法外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。（二）PCR筛选和限制酶酶切法提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。（三）核酸分子杂交法制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。（四）免疫学筛选法获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。

BamH 1 的酶切位点在tet上，所以酶切重组后，质粒就不会再表达四环素抗性抗性了，筛选阳性克隆要挑选在Amp平板上生长的菌株，而在Tet平板上生长的菌株是插入失败的。

将载体转入大肠杆菌，在含有Amp的培养基上培养，蓝白斑筛选阳性克隆，再提取质粒DNA，PCR检测就可以了。

不知对不对。第一， TA克隆的自身环化是造成这种现象的最主要原因，根据我的经验，不同公司提供的TA载体的自身环化率在20%到50%之间。这个比例可以通过优化连接反应的条件进行改善。无非就是提高反应体系中目的基因片段的含量，通常DNA:TA载体大概应在1：3左右，加入更多片段可以显著提高链接的效率。再就是提高DNA片段的纯度，减少其中的杂质，这需要通过改进DNA凝胶纯化的方法来实现。QIAGEN的凝胶纯化试剂盒非常好。常量高纯度也好。 第二， 除了自身环化之外就是在PCR产物不纯，里面还有引物等小片段，这些东西更容易与TA载体链接，最后进行酶切鉴定时又看不到插入片段。这一般不容易发生，有的人喜欢用柱子纯化PCR产物，我则习惯跑胶后纯化，这样PCR产物和引物等已经完全分离，则不会发生这种情况。 第一点是最主要的，改善链接反应后可以将假阳性的比例降至极低，前段时间我克隆了10个基因，每板挑取4个克隆，其中8个基因的片段插入率都能达到100%。另2两也能达到75%。选用高质量的TA和凝胶纯化试剂盒是关键。推荐QIAGEN的凝胶纯化和PROMEGA的TA克隆。作为常规的TA克隆法,所需连接时间较长,因载体自连而造成较多的假阳性，这句摘自http://www.bio-toyobo.cn/origin/protocol/TAK.pdf你再看看http://www.takara.com.cn/bbs/showtopic.asp?TOPIC_ID=2399&Forum_ID=1能不能有什么收获。

首先，要了解重组DNA的大小；然后选择引物进行PCR；最后跑电泳，看在相应位置是否存在DNA带。

目的基因的克隆是利用一个单一的基因副本的行为。有pcr方法，凝胶电泳方法，色谱法，琼脂糖凝胶电泳法，质粒法等。具体方法可分别检索文献。 常用的植物目的基因克隆技术1、通过已知基因产物的分析和鉴定 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。 （2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共』虮嗦氲氖芴逯浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担圆≡し⒆拥鞍孜咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共』颍绶延胛薅净騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。 3、以图谱为基础的定位克隆技术 以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。

挑出几个菌落直接培养测序是不适当的.菌落中有很大一部分比例转进去的是空载体,没有成功连入目的基因片段.所以要多挑一些单菌落,培养后用菌液PCR或者提质粒后双酶切鉴定是否连入目的基因,选择成功连入目的基因（阳性克隆）的再拿去测序.你现在的测序结果,很有可能只是载体本身的序列.质粒如果需要测序，说明你们实验室对这个质粒中插入的基因序列不清楚，需要通过测序知道其中到底是什么基因，绝大多数情况下是做了克隆之后需要去确认插入到目的载体中的序列是不是正确，这样才能进行下一步的实验。PCR产物测序一般是为了确认PCR产物序列的正确，因为PCR过程中有可能会发生突变或者其他导致序列改变的情况，只有确认之后才能进行后续实验。

克隆是英文 clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条、扦插或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。科学家把人工遗传操作动、植物的繁殖过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。 克隆技术的设想是由德国胚胎学家于1938年首次提 出的，1952年，科学家首先用青蛙开展克隆实验，之后不断有人利用各种动物进行克隆技术研究。由于该项技术几乎没有取得进展，研究工作在80年代初期一度进入低谷。 后来，有人用哺乳动物胚胎细胞进行克隆取得成功。 1996年7月5日，英国科学家伊恩·维尔穆特博士用成年羊体细胞克隆出一只活产羊，给克隆技术研究带来了重大突破，它突破了以往只能用胚胎细胞进行动物克隆的技术难 关，首次实现了用体细胞进行动物克隆的目标，实现了更高意义上的动物复制。研究克隆技术的目标是找到更好的办法改变家畜的基因构成，培育出成群的能够为消费者提供可能需要的更好的食品或任何化学物质的动物。 克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移 植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后（罗斯林研究所克隆羊采用的时间约为 6天）再被植入动物子宫中使动物怀孕使可产下与提供细胞 者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。培育成功三代克隆鼠的“火奴鲁鲁技术”与克隆多利羊技术的主要区别在于克隆过程中的遗传物质不经过培养液的培养，而是直接用物理方法注入卵细胞。这一过程中采用化学刺激法代替电刺激法来重新对卵细胞进行控制。1998年7月 5日，日本石川县畜产综合中心与近畿大学畜产学研究室的科学家宣布，他们利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生。这两头克隆牛的诞生表明克隆成年动物的技术是可重复的。 当苏格兰的罗斯林研究所1996年利用克隆技术克隆出小羊多利后，这一成果立即被誉为本世纪最重大的也是最有争论的科技突破之一。这一突破带来的好处是显而易见的。 利用这一技术可以在抢救珍奇濒危动物、复制优良家畜个体、 扩大良种动物群体、提高畜群遗传素质和生产性能、提供足量试验动物、推进转基因动物研究、攻克遗传性疾病、研制 高水平新药、生产可供人移植的内脏器官等研究中发挥作用。 在肯定了这种技术的正面作用的同时，人们更大程度上表示了对这种技术的担忧，他侨衔绻褂貌坏保庵旨际蹩赡芏陨肪巢て诘牟涣加跋欤恍┛蒲Ъ胰衔? 果在畜牧业中大量推广这种无性繁殖技术，很可能破坏生态平衡，导致一些疾病的大规模传播；如果将其应用在人类自身的繁殖上，将产生巨大的伦理危机。 克隆羊多莉的身份被披露后，美国俄勒冈科学家也证实他们于1996年8月已经利用克隆胚胎培育出猴子；又有传说，比利时一医生已无意中克隆出一个男孩。尽管比利时科学家否认克隆人的报道，但是各国政府对克隆技术在法律 和伦理方面可能造成的影响非常重视，美、德、法、英、加 等国纷纷成立专家小组研究这一问题，科学家们也要求对这 一领域的研究加以限制。世界卫生组织总干事中岛宏和欧盟委员会负责科研的委员1997年3月11日分别发表声明 和谈话，表示反对进行人体克隆试验。目前各国对这项技术较为一致的看法是制定法律加强对这种技术的管理，并严禁用它复制人类。克隆出小羊多利的英国科学家维尔穆特也说， 用来克隆多利的那种技术效率极低，在他成功克隆出多利之前该技术曾导致先天缺损动物的出生。将这种技术用于人类 是“非常不人道的”。 中国政府也十分重视克隆技术及其提出的相关问题，国家科委和农业部等部门已多次召开有各方面专家参加的研讨、 座谈会，并就有关问题达成共识。专家们认为，动物克隆技术的成功是科学研究上的一个重大事件，它既有有益的一面， 又有不利的可能，必须采取措施加以规范，严格控制住有害的一面，使这项技术造福于人类。 1997年11月11日，联合国教科文组织第29届 大会在巴黎通过一项题为《世界人类基因组与人权宣言》的文件，明确反对用克隆技术繁殖人。文件指出，应当利用生物学、遗传学和医学在人类基因组研究方面的成果，但是， 这咱研究必须以维护和改善公众的健康状况为目的，违背人 的尊严的作法，如用克隆技术繁殖人的作法，是不能允许的。 1998年1月12日，欧洲19个国家在法国巴黎签署了一项严格禁止克隆人的协议(european protocol on banning human cloning)。这是国际上第一个禁止克隆人的 法律文件，是对《欧洲生物医学条约》的补充。这项禁止克 隆人协议规定，禁止各签约国的研究机构或个人使用任何技术创造与一活人或死人基因相似的人，否则予以重罚。违反协议的研究人员和医生将被禁止从事研究和行医，有关研究 所或医院的执照将被吊销。如果签约国研究机构或个人在欧洲以外地区进行这类活动也将追究法律责任。在协议上签字的国家有法国、丹麦、立陶宛、芬兰、希腊、爱尔兰、意大 利、拉脱维亚、卢森堡、摩尔多瓦、挪威、葡萄牙、罗马尼 亚、斯洛文尼亚、西班牙、瑞典、马其顿、土耳其和圣马力诺。克隆技术的发展 克隆，是Clone的译音，意为无性繁殖，克隆技术即无性繁殖技术。前不久报道的英国罗斯林研究所试验成功的克隆羊多利，是首次利用体细胞克隆成功的，它在生物工程史上揭开了新的一页。 克隆技术已经历了三个发展时期： 第一个时期是微生物克隆，即由一个细菌复制出成千上万个和它一模一样的细菌而变成一个细菌群。 第二个时期是生物技术克隆，如DNA克隆。 第三个时期就是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。 在自然界，有不少植物具有先天的克隆本能，如番薯、马铃薯、玫瑰等插枝繁殖的植物。而动物的克隆技术，则经历了由胚胎细胞到体细胞的发展过程。早在本世纪50年代，美国的科学家以两栖动物和鱼类作研究对象，首创了细胞核移植技术，他们研究细胞发育分化的潜能问题，细胞质和细胞核的相互作用问题。1986年英国科学家魏拉德森首次把胚胎细胞利用细胞核移植法克隆出一只羊，以后又有人相继克隆出牛、羊、鼠、兔、猴等动物。我国的克隆技术也颇有成就，80年代末，我国克隆出一只兔，1991年西北农业大学发育研究所与江苏农学院克隆羊成功，1993年中科院发育生物研究所与扬州大学农学院共同克隆出一批山羊，1995年华南师大和广西农大合作克隆出牛，接着中国农科院畜牧研究所于1996年克隆牛获得成功。而美国最近克隆猴取得成功，日本科学家也声称他们繁殖出200多头“克隆牛”。以上所述的克隆动物，都是用胚胎细胞作为供体细胞进行细胞核移植而获得成功的。 1997年2月英国罗斯林研究所宣布克隆成功的小羊多利，是用乳腺上皮细胞作为供体细胞进行细胞核移植的，它翻开了生物克隆史上崭新的一页，突破了利用胚胎细胞进行核移植的传统方式，使克隆技术有了长足的进展。整个克隆过程如下：科学家选取了三只母羊，先将一只母羊的卵细胞中所有遗传物质吸出，然后将另一只6岁母羊的乳腺细胞与之融合，形成一个含有新遗传物质的卵细胞，并促使它分裂发育成胚胎，当这一胚胎生长到一定程度时再将它植入第三只母羊的子宫中，由它孕育并产下克隆羊多利。多利酷像提供乳腺细胞的6岁母羊。 小羊多利是世界上第一个利用体细胞克隆成功的动物。克隆多利的成功，从理论上说明了高度分化细胞，经过一定手段处理之后，也可回复到受精卵时期的合子功能；说明了在发育过程中，细胞质对异源的细胞核的发育有调控作用。它对生物遗传疾病的治疗、优良品种的培育和扩群等提供了重要途径，对物种的优化、濒危动物的种质保存，对转基因动物的扩群均有一定作用。 自克隆小羊多利成功后，世界各国引起强烈的反响，有的看作福音，有的则视为祸水，笔者以为对新技术应采取支持态度，生物克隆取得突破，最大的好处是培养大量品质优良的家畜，丰富人们的物质生活，使畜牧业的成本降低，效率提高，还可提供某些药物原料以提高人类免疫功能等等。在小羊多利之前，罗斯林研究所曾培育出一只奶中含治疗血友病药物原料的转基因羊，一家公司以50万英镑的高价买去。如果利用体细胞大批“复制”这只羊，就可挽救更多患者的生命。另外，利用克隆技术可以大量复制珍稀动物，挽救濒危物种，调节大自然的生态平衡，为人类造福，何来忧患呢?当然，克隆技术也可能带来负面影响，一些克隆动物在遗传上是全等的，一种特定病毒或其它疾病的感染，将会带来灾难，如果无计划克隆动物，会扰乱物种的进化规律，干扰性别比例，这种对生物界的人为控制会带来许多意想不到的危害。但只要采取相应的研究对策，制订科学的克隆计划，这种负效应就可以避免。 至于克隆人，这是一个没有意义的研究课题，当代生物史证明，克隆技术只能复制出外貌特征相同的生物，不能克隆出被复制者原有的才能。人的思想才能受后天的制约。所以，即使有人能克隆出酷似历史上的伟大领袖、伟大科学家那样的人物，也仅在外貌上相同，却缺乏伟大领袖、伟大科学家那样的思想、气质、才能，试问这样的克隆具有什么意义?至于有人主张克隆人以取得人体器官，用于医学上人体器官的移植，这也是不可行的。因为克隆出来的人首先是一个公民，他享有人权，如果克隆人不肯捐赠器官，你发明者也不能侵犯人权。 至于克隆无头的人，那也是不现实的，因为克隆人要生存，首先要吃饭，要思维，没有头颅是不可能的，我们总不能培植一个无头的植物人吧?而且，最重要的是克隆人不符合世情国情，当今世界人口急剧膨胀，不少国家已实行计划生育，控制人口增长，在这种情况下怎么拆巨资做违背社会发展规律的事呢?正如德国研究技术部长吕特格斯所说：“复制人类将不被允许，也一定不会发生。” 目前，克隆技术在英国又有了新的进展，他们把这一技术应用于人类造血事业。英国的PPL公司是克隆技术的经济后台，它的主管罗思詹姆斯博士说：“从研究多利中我们知道，我们可以用一个细胞制造出一只转基因动物。我们现在正利用这一技术生产人类血液中最重要的组成部分，也就是血浆。”他们与罗斯林研究所合作研究一种带有人类基因的牛和羊。他们先把动物体内的血浆取出，再取代人类的血浆，这种改变了基因的牛和羊体内就含有人类血浆的重要成分，通过对这些动物的饲养、再克隆或繁殖，就可以得到稳定可靠而且相对便宜的血资源，据统计在英国每年价值可达150英镑。可谓效益匪浅。 克隆技术的前景不可估量。

克隆简介 自从 1997 年 2 月 23 日国外新闻媒介报导 ( 正式科学论文发表在 1997 年 2 月 27 日出版的《自然》杂志上 ) 苏格兰科学家利用体细胞培养克隆羊成功的消息后，在全世界引起了一阵冲击波，我国著名遗传学家吴昊教授称之为“克隆风暴”。对于一项科学成果，反响如此之广泛和强烈，从新闻界、科学界，到哲学、伦理界，再到政府部门和立法机构，一直到广大公众，无不对克隆技术表示关注。究竟何谓克隆，该项技术有何价值和意义，以及如何面对“克隆时代”，都成为人们讨论的焦点。 一、克隆的概念 众所周知，生物的繁衍是通过生殖完成的。生物的繁殖有两种方式：一种叫有性生殖，一种叫无性生殖。 有性生殖是通过两性生殖细胞 ( 精子和卵子 ) 的融合，并发育形成后代的生殖方式。无性生殖则不经过两性生殖细胞的结合，而是由生物体自身的分裂生殖或其体细胞生长发育形成个体。无性生殖多见于植物与某些动物 ( 如单细胞动物与低等动物 ) 。 克隆是英文“ clone ”的音译，来自希腊文 klon ， 原意为苗或嫩枝，指以无性生殖或营养生殖的一些植物。随着时间的推移和科学的发展，它的含义增加了许多内容，如一个细胞在体外培养下产生的一群细胞；由“亲本”序列产生的 DNA 序列等等。概言之， 克隆是指由一个细胞或个体，通过无性繁殖手段，获得遗传上相同的细胞群或个体群。 我国古典名著《西游记》里的孙悟空，只要拔撮毫毛吹口仙气，就能“变”出许多孙悟空。因为拔一撮毫毛必须带下一群细胞，这一群细胞就能培养出一群相同的孙大圣。这也归属于无性生殖。只不过孙大圣本领高强，能在瞬间“克隆”出千百个自己而已。简而言之，克隆就是无性生殖，就是“复制”、“翻版”。 二、植物的克隆 无性生殖 ( 克隆 ) 本来是一种低级的生殖方式。生物进化的层次越低，越有可能采取这种生殖方式，进化层次越高，则越不可能采取这种生殖方式。由于低级生物，如微生物，采取自行分裂的方法繁殖，分裂后子代与亲代的遗传物质完全一样，因此在这个意义上微生物没有“个体”，它们也没有死亡。虽然在严格的意义上，微生物的亲代与子代仍然会有若干差异，因为它们的外界营养环境仍然会有差异，但从高等动物的角度看，这种差异似乎太微不足道了。在这种差异可以不计的条件下，人们可以说，对微生物来说，它们是不死的。死亡是生物进化到较高阶段的产物。现在生物医学研究中用克隆技术在体外培养的正常细胞或癌细胞，也称为“永生细胞株”，意思也是说这些细胞是“不死的”。 生物医学研究进入微观层次，运用克隆技术来培养正常或异常细胞的永生细胞株，虽然是一件难度很大的工作，但已经在各国的科学界和医学界越来越得到重视。在农业上，人们早已用插枝、压条等方法，来繁殖适合于人类需要的植物。在畜牧业上，各国都在进行用克隆技术产生更多良种动物的研究。但从高等生物成体的体细胞中发育出一个成体，这是克隆技术的一个重大发展。 早在许多年前，美国康奈尔大学研究人员将成熟的胡萝卜高速搅拌，获得单个胡萝卜细胞，然后将这些单个细胞置于生长培养基中，培养出遗传上完全一样的胡萝卜。这个试验证实了植物细胞全能性学说。所谓植物细胞全能性学说是指植物体的每一个细胞，包括体细胞，都具有发育成完整个体的潜能。 植物细胞全能性学说在植物界已经得到广泛的证明。现在我们可以植物体的任何一种活的细胞、组织、器官，经过体外人工培养获得它的完整植株，并产生许多植物。这种技术被称为组织培养。它已用于工厂化生产花卉、作物 ( 如甘蔗 ) 的试管苗。 三、动物克隆的历程 关于动物的无性生殖研究，一直是科学家探索的课题。因为人类通过有性生殖的方法，选育家畜品种已有上千年的历史，结果是产生了一些优良的个体或群体。它们比一般的个体更能满足人们的需要和愿望。譬如，一头产奶量特别高的奶牛，一群毛产量多的绵羊，一匹得奖的赛马或一只优秀的警犬。可是，有性生殖的后代，其性能不一定都同亲代一样，有的甚至不如亲代。究其原因，因为卵子或精子只携带构成亲代的、任意一半的等位基因，而等位基因几乎可以有无限的组合，因而会产生不同的后代。兄弟、姊妹、兄妹、姊弟之间都有很大的差异，便是因为极难有完全相同的基因型。 所以通过有性生殖保持一种表现型是非常困难的。如果获得一种理想的表现型如产奶量高的奶牛，再通过无性生殖保持、扩大和繁殖这种表现型，即生产许多遗传上相同的个体，从经济角度讲显然是很有价值的。

1.有可能是在PCR扩增目的片段时，由于未采用高保真DNA聚合酶，导致的碱基突变。2.也可能是PCR扩增目的片段时，设计的引物特异性不高，或反应体系及参数对特异性控制的不好，获得的是非目的条带。3.使用通用引物PCR时（如细菌的16s rDNA），模板DNA不纯。

连接T-vector之前进行PCR得到带A的PCR产物，然后进行转化，对expression vector和质粒进行相同酶切，连接，转化。在整个clone中有时会用PCR来鉴定，如目的基因是否转入进感受态细胞。

一个是RT-pcr，reverse transcription pcr的简写 一个是real-time，一般不会简化为“rt-pcr”，又称实时定量pcr，Q-pcr，应该就是你说得荧光定量 而你要测mRNA的量，就是先反转录成cDNA，再作定量pcr，就是前两者的合，常称为qRT-PCR 有很多real-t。real time PCR是会作样品cDNA的稀释，可以是10的倍数，5的或者2的倍数稀释。通常需要做三到四个浓度。 如果操作完全没有问题，理论上，稀释之后的样品由于起始量少，目的基因也相应减少，qPCR后达到相应量需要的ct数会增加。

克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。

克隆技术——划时代的震撼 1997年2月22日，英国罗斯林研究所的科学家维尔穆特等人宣布用体细胞克隆绵羊获得成功，在世界上引起巨大震动。一时间，克隆绵羊“多利”成为动物界最耀眼的“明星”，其“咩咩”的叫声迅速响遍全球。 “克隆”是英文单词“Clone”的音译，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。 克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 在自然界，有不少植物具有先天的克隆本能，如番薯、马铃薯、玫瑰等的插枝繁殖的植物。而动物的克隆技术，则经历了由胚胎细胞到体细胞的发展过程。 早在20世纪50年代，美国的科学家以两栖动物和鱼类作研究对象，首创了细胞核移植技术。1986年，英国科学家魏拉德森用胚胎细胞克隆出一只羊，以后又有人相继克隆出牛、鼠、兔、猴等动物。这些克隆动物的诞生，均是利用胚胎细胞作为供体细胞进行细胞核移植而获得成功的。 而克隆绵羊“多利”是用乳腺上皮细胞（体细胞）作为供体细胞进行细胞核移植的，它翻开了生物克隆史上崭新的一页，突破了利用胚胎细胞进行核移植的传统方式，使克隆技术有了长足的进展。 克隆绵羊“多利”没有父亲，却有三位母亲。整个克隆过程如下： 首先，科学家从一只产自芬兰的6岁成年多塞特母绵羊A（“多利”的亲生母亲）的乳腺中取出一个本身并没有繁殖能力的普通细胞，将这个细胞的基因分离出来备用。 然后，科学家在取出另一只母绵羊B（“多利”的借卵母亲）的未受精的卵细胞，将这个卵细胞中的基因取出，换上母绵羊B的乳腺细胞的基因，形成一个含有新遗传物质的卵细胞，再将这个基因已被“调包”的卵细胞放电激活，促使它分裂发育成胚胎。 最后，当胚胎生长到一定程度时，将它植入第三只母绵羊C（“多利”的代孕母亲）的子宫中，经过正常的妊娠产下“多利”。 多利完全继承了其亲生母亲――多塞特母绵羊的全部DNA基因特征，是多塞特母绵羊百分之百的“复制品”。 无性繁殖现象在低等植物中是存在的，而按照哺乳动物界的规律，动物的繁衍要由两性生殖细胞来完成，由于父体和母体的遗传物质在后代体内各占一半，因此后代绝对不是父母的复制品。而克隆绵羊的诞生，意味着人类可以利用哺乳动物的一个细胞大量生产出完全相同的生命体，完全打破了亘古不变的自然规律。这是生物工程技术发展史中的一个里程碑，也是人类历史上的一项重大科学突破。 克隆技术被誉为“一座挖掘不尽的金矿”，它在生产实践上具有重要的意义，潜在的经济价值十分巨大。首先，在动物杂种优势利用方面，较常规方法而言，哺乳动物克隆技术费时少、选育的种畜性状稳定；其次，克隆技术在抢救濒危珍稀物种、保护生物多样性方面可发挥重要作用，即使在自然交配成功率很低的情况下，科研人员也可以从濒危珍稀动物个体身上选择适当的体细胞进行无性繁殖，达到有效保护这些物种的目的。 动物克隆技术的重大突破，也带来了广泛的争议。克隆技术对人类来说，是一把“双刃剑”。一方面，它能给人类带来许多益处――诸如保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等；另一方面，它将对生物多样性提出挑战――生物多样性是自然进化的结果，也是进化的动力，有性繁殖是形成生物多样性的重要基础，而“克隆动物”则会导致生物品系减少，个体生存能力下降。 更让人不寒而栗的是，克隆技术一旦被滥用于克隆人类自身，将不可避免地失去控制，带来空前的生态混乱，并引发一系列严重的伦理道德冲突。世界各国政府和科学界已对此高度关注，采取立法等措施明令禁止用克隆技术制造“克隆人”，以保证克隆只用于造福人类，而绝非复制人类。（来源：internet

“克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 参考资料：http://zhidao.baidu.com/question/2003221.html

什么叫克隆？ 克隆（clone）是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的生物群，即具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是“小树枝叶”的意思，用以指无性增殖物。现在则指个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物。（1）个体水平：在植物的无性增殖中，植物的发芽、插条等由同一个体通过无性生殖而增长的个体群均被视为克隆。采用组织培养方法可使植物细胞培养发育成完全的个体（愈伤组织），采用这种方法得到的具有相同基因型的个体群，也被称为克隆；在动物的无性增殖中，典型的例子是采用核移植实验方法，把分化细胞的核移植到一个事先去核的蛙卵中，让其发育并得到克隆蛙。克隆动物具有均一遗传性质，在研究环境条件对发育、分化的影响以及药物的检测方面都是重要的实验材料。在哺乳动物中，由于细胞分化，核异质化的程度加剧，因此核移植尚无成功的例子。（2）细胞水平：由一个细胞经过有丝分裂生成的细胞群叫克隆。但如果培养细胞发生转化，则很容易引起染色体变异。（3）基因水平：利用基因重组操作技术，使特定的基因与载体结合，在细菌等宿主中进行增殖，有可能得到均匀的基因群。克隆基因在基因功能与精细结构的关系等基础研究及在有用物质的生产方面，均已得到应用。 在上述3种水平上，增殖并分离获得单一的克隆群称为克隆化。此时，克隆一词也可作为动词理解。克隆是重组DNA技术的核心部分。事实上，克隆技术现已被人们用来通过营养方式繁殖病毒等微生物和植物的纯种，从而保证了这些生物基因组的准确连续性。现在，克隆这个词还包括单个自主遗传因子的分离与保存。细胞生物的克隆只需要营养培养基，而基因的克隆则需要某种载体复制子、特定的寄主细胞和营养培养基。各种类型生物的克隆技术在生物工程中均有其重要作用。 -------------------------------------------------------------------------------------------------- http://www.njenet.net.cn/zw/user/tg/mode5.asp?id=12799 我真想克隆智慧 ——让人类有更多的时间去发掘世界 秦艺雯 六（2）班 42号 一听到“克隆”这个词，许多人可能都会感到无比振奋人心，它能够完成人类上千万年来未能完成的梦想。 假如我会克隆，我多么希望能把世上对人类有益的一切克隆出来，为人类造福。克隆器官，解除病患者的痛苦；克隆时间，让人类拥有更多时间创造世界；克隆地球，为人类创造一个更美好的空间。可我最想克隆的，也是世上最需要克隆的，是克隆人类无穷的智慧。 这个世界多奇妙。古老的秦陵兵马俑，为人类解开了中国悠久神奇的历史之谜。屹立在沙漠之上的金字塔，为人类揭开了古埃及法老神秘的面纱。宇宙飞船，告诉我们遥远太空的一切。这么多的千古秘密被解开，都归功于人类多年研究的科学仪器，也少不了人类无穷无尽的智慧。可是，世界上到底有没有外星人？专门“吞食”飞机的百慕大三角区到底是怎么回事？美洲大陆到底是谁发现的，是哥伦布，还是我们中国人？这些世界历史之谜，由谁去解开呢？还得由我们人类。我很想让人类在地球灭亡之前解开所有有关于这个世界的迷题。可是，地球正一天一天地衰老，按照人类现在科学发展的速度与效果，恐怕，我的愿望是难以实现的。人的一生，有将近三十年的时间用于学习基本知识，剩下的三四十年才用于更深一步的去研究，发掘世界。可是，对于许多科学家来说，这短短的三四十年是完全不够的。就因为这一点，人类科学技术的进步才这么慢。要是，人类能把一个知识渊博的人的智慧克隆到一个刚出生的婴儿的头脑中去，那该是一件多么不可思议的事，它将改变人类的命运。 这天，某医院产房中发出一阵不平凡的声音：“妈妈!”这声音充满了志气，充满了吸引力。“成功了!时间上第一个智慧克隆婴儿诞生了！”这是一则多么震惊世界，振奋人心的消息啊！全世界人民为此而欢呼，人类又有了新的突破，这是一件多么了不起的事啊！智慧克隆婴儿掌握了小学至大学，甚至更高学位的所有知识。在平时的生活处事方面中，智慧克隆婴儿与成年人没什么区别。可智慧克隆婴儿却少不了那股稚气，对身边的现象都怀有好奇之心。智慧克隆婴儿在玩耍的时候，比其他同龄人要聪明灵敏得多，不管做什么游戏都占有优势。但小朋友们都十分愿意与智慧克隆儿童玩，因为从他身上，可以学到许多东西。看,刚刚和小朋友们一起开心玩耍完的智慧克隆婴儿，又来到了科学研究室里，只见他小小的身躯，坐在凳子上，不停地察看着资料，然后在电脑上计算着什么，好像又有什么科学新发现。小小年纪，就能为人类做如此大的贡献，真是太了不起了。智慧克隆婴儿比普通的科学家要多足足三十年的研究时间，可以更好更充分的去发掘这个世界，为人类更好地做贡献。要是，这个世界再过一两百年，智慧克隆婴儿已是一个普通的科学技术，那时的人类都是经过智慧克隆婴儿成长而成的，他们每一个人都是从小就从事自己的事业，从多方面为人类造福。到那时，人类科学技术的发展速度将会比以前快得多，人类在地球灭绝之前解开所有世界迷题，将是一件十分容易的事。 可是，在现实生活中，智慧克隆人会不会真的出现，它又会在什么时候出现呢？这个问题很难讲，凭人类现在的科学技术，智慧克隆人暂时还未能出现。 我真希望世界上能有智慧克隆人的出现。然而，我认为如果我的这一奇想能得到世界人民的认同，将会有许多科学家为此而去努力研究。到那时，我相信，我的这一梦想可能很快就会实现的。

基因克隆和PCR重要：克隆的目的就是增加DNA的量，保证成功率。分子克隆和传统克隆完全不是一个意思。PCR主要是针对目的DNA进行扩增，然后把其转化到克隆载体(可以理解成某种工程微生物)中，这个载体相当于复制了很多份，保存的每一份都称为一个克隆。一般来说基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。

可以用实验的方法来验证。通过离心收集细菌，经碱裂解细菌，使质粒和细菌染色体DNA变性，然后再加中和液，使溶液PH值恢复到中性，这样质粒DNA又可以复性至天然双链构象状态，而细菌染色体DNA不能或很难复性所以仍处在变性状态，这些变性的染色体DNA与变性蛋白质缠绕在一起，易被离心去处，而质粒DNA仍存在于水相中，再用无水乙醇沉质粒DNA，最后经离心即可得到质粒DNA。克隆是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆（Molecular Cloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群，发生在基因水平上的分子克隆称基因克隆（DNA克隆）。其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。由于质粒具有不相容性，即同一类群的不同质粒常不能在同一菌株内稳定共存，当细胞分裂时就会分别进入到不同的子代细胞中，所以来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。

操纵子模型在分子克隆实验中的应用有为治疗半乳糖血症。用带有大肠杆菌乳糖操纵子的噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。

什么是克隆？克隆是英语单词clone的音译，clone源于希腊文klone，原意是指幼苗或嫩枝，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如杆插和嫁接。如今，克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。克隆也可以理解为复制、拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同。1997年2月，绵羊“多利”诞生的消息披露，立即引起全世界的关注，这头由英国生物学家通过克隆技术培育的克隆绵羊，意味着人类可以利用动物身上的一个体细胞，产生出与这个动物完全相同的生命体，打破了千古不变的自然规律。什么东西可以克隆？应该说有生命的都可以克隆。现在已经克隆什么？蛙:1962年，未成功。鲤鱼:1963年，中国科学家童第周早在1963年就通过将一只雄性鲤鱼的遗传物质注入雌性鲤鱼的卵中从而成功克隆了一只雌性鲤鱼，比多利羊的克隆早了33年。但由于相关论文是发表在一本中文科学期刊，并没有翻译成英文，所以并不为国际上所知晓。（源自：PBS）古代神话里孙悟空用自己的汗毛变成无数个小孙悟空的离奇故事，表达了人类对复制自身的幻想。1938 年，德国科学家首次提出了哺乳动物克隆的思想，1996年，体细胞克隆羊“多利”出世后，克隆迅速成为世人关注的焦点，人们不禁疑问：我们会不会跟在羊的后面？这种疑问让所有人惶惑不安。然而，反对克隆的喧嚣声没有抵过科学家的执着追求，伴随着牛、鼠、猪乃至猴这种与人类生物特征最为相近的灵长类动物陆续被克隆成功，人们已经相信，总有一天，科学家会用人类的一个细胞复制出与提供细胞者一模一样的人来，克隆人已经不是科幻小说里的梦想，而是呼之欲出的现实。目前，已有三个国外组织正式宣布他们将进行克隆人的实验，美国肯塔基大学的扎沃斯教授正在与一位名叫安提诺利的意大利专家合作，计划在两年内克隆出一个人来。由于克隆人可能带来复杂的后果，一些生物技术发达的国家，现在大都对此采取明令禁止或者严加限制的态度。克林顿说：“通过这种技术来复制人类，是危险的，应该被杜绝！”全国政协委员、中国科学院国家基因研究中心主任洪国藩也明确表示反对进行克隆人的研究，而主张把克隆技术和克隆人区别开来。克隆人，真的如潘多拉盒子里的魔鬼一样可怕吗？实际上，人们不能接受克隆人实验的最主要原因，在于传统伦理道德观念的阻碍。千百年来，人类一直遵循着有性繁殖方式，而克隆人却是实验室里的产物，是在人为操纵下制造出来的生命。尤其在西方，“抛弃了上帝，拆离了亚当与夏娃”的克隆，更是遭到了许多宗教组织的反对。而且，克隆人与被克隆人之间的关系也有悖于传统的由血缘确定亲缘的伦理方式。所有这些，都使得克隆人无法在人类传统伦理道德里找到合适的安身之地。但是，正如中科院院士何祚庥所言：“克隆人出现的伦理问题应该正视，但没有理由因此而反对科技的进步”。人类社会自身的发展告诉我们，科技带动人们的观念更新是历史的进步，而以陈旧的观念来束缚科技发展，则是僵化。历史上输血技术、器官移植等，都曾经带来极大的伦理争论，而当首位试管婴儿于1978年出生时，更是掀起了轩然大波，但现在，人们已经能够正确地对待这一切了。这表明，在科技发展面前不断更新的思想观念并没有给人类带来灾难，相反地，它造福了人类。就克隆技术而言，“治疗性克隆”将会在生产移植器官和攻克疾病等方面获得突破，给生物技术和医学技术带来革命性的变化。比如，当你的女儿需要骨髓移植而没有人能为她提供；当你不幸失去5岁的孩子而无法摆脱痛苦；当你想养育自己的孩子又无法生育……也许你就能够体会到克隆的巨大科学价值和现实意义。治疗性克隆的研究和完整克隆人的实验之间是相辅相成、互为促进的，治疗性克隆所指向的终点就是完整克隆人的出现，如果加以正确的利用，它们都可以而且应该为人类社会带来福音。科学从来都是一把双刃剑。但是，某项科技进步是否真正有益于人类，关键在于人类如何对待和应用它，而不能因为暂时不合情理就因噎废食。克隆技术确实可能和原子能技术一样，既能造福人类，也可祸害无穷。但“技术恐惧”的实质，是对错误运用技术的恐惧，而不是对技术本身的恐惧。目前，世界各国对克隆人的态度多有“暧昧”，英国去年以超过三分之二的多数票通过了允许克隆人类早期胚胎的法案，而在美国、德国、澳大利亚，也逐渐听到了要求放松对治疗性克隆限制的声音。可以说，哪一个国家首先掌握了克隆人的技术，就意味着这个国家拥有了优势和主动，而起步晚的国家可能因此而遭受现在还无法预测的损失。如同当年美国首先掌握了原子能技术，虽然这项技术从一开始便展现着它罪恶的一面，但后来各国又不得不加紧这方面的研究和实验。单从这个角度上讲，对克隆人实验采取简单否定的态度也是值得探讨的。至于人们担忧克隆技术一旦成熟，会有用心不良者克隆出千百个“希特勒”，或者克隆出另一个名人来混淆视听，则是对克隆的误解。克隆人被复制的只是遗传特征，而受后天环境里诸多因素影响的思维、性格等社会属性不可能完全一样，即克隆技术无论怎样发展，也只能克隆人的肉体，而不能克隆人的灵魂，而且，克隆人与被克隆人之间有着年龄上的差距。因此，所谓克隆人并不是人的完全复制，历史人物不会复生，现实人物也不必担心多出一个“自我”来。绵羊:1996年，多利（Dolly）猕猴:2000年1月，Tetra，雌性猪:2000年3月，5只苏格兰PPL小猪；8月，Xena，雌性牛:2001年，Alpha和Beta，雄性猫:2001年底，CopyCat（CC），雌性鼠:2002年兔:2003年3-4月分别在法国和朝鲜独立地实现；骡:2003年5月，爱达荷Gem，雄性；6月，犹他先锋，雄性鹿:2003年，Dewey马:2003年，Prometea，雌性狗:2005年，韩国首尔大学实验队，史纳比尽管克隆研究取得了很大进展，目前克隆的成功率还是相当低的：多利出生之前研究人员经历了276次失败的尝试；70只小牛的出生则是在9000次尝试后才获得成功，并且其中的三分之一在幼年时就死了；Prometea也是花费了328次尝试才成功出生。而对于某些物种，例如猫和猩猩，目前还没有成功克隆的报道。而狗的克隆实验，也是经过数百次反覆试验再得来的成果。多利出生后的年龄检测表明其出生的时候就上了年纪。她6岁的时候就得了一般老年时才得的关节炎。这样的衰老被认为是端粒的磨损造成的。端粒是染色体位于末端的。随着细胞分裂，端粒在复制过程中不断磨损，这通常认为是衰老的一个原因。然而，研究人员在克隆成功牛后却发现它们实际上更年轻。分析它们的端粒表明它们不仅是回到了出生的长度，而且比一般出生时候的端粒更长。这意味着它们可以比一般的牛有更长的寿命，但是由于过度生长，它们中的很多都过早夭折了。研究人员相信相关的研究最终可以用来改变人类的寿命。 克隆人违背人类生命伦理 现代科技，特别是现代生命科技，要不要尊重伦理学原则，要不要倾听伦理的声音？有关专家针对一些科学狂人在美国秘密克隆人的做法指出——克隆人违背人类生命伦理，存在着极大的争议和难以解决的一系列法律等问题。 我国多家媒体近日转载了国外媒体报道的一条惊人消息：一群受邪教组织操纵的科学狂人，正在美国内华达州大漠深处进行着一项克隆人的秘密实验。他们根据英国科学家创造世界第一只克隆羊“多利”的同样原理，从一个今年2月份夭折的10个月大的美国女婴身上提取细胞制造克隆人。据称，“如果进展顺利的话，世界上第一个克隆人将于明年年底诞生。” 消息披露后，克隆技术及其带来的伦理学问题再一次成为人们议论的热点。如果这一消息属实的话，应当如何看待此事，如何正确地评价和思考这个问题，记者为此走访了国家人类基因组南方研究中心伦理、法律和社会部主任、上海社科院哲学研究所沈铭贤研究员。 沈教授说：自1997年英国罗斯林研究所成功地克隆出“多利”羊后，国外不断有人在名利的驱使下，提出并试图从事克隆人的研究。尽管各国政府明令禁止，但与克隆人有关的报道近两年来不止一次见诸报端。但是，这次速度这么快，又与邪教组织有关联，确实令人感到震惊。 痛失爱女的父母，希望通过克隆技术使女儿复活，这种心情是可以理解的。但如果科学家借此进行克隆人的实验，就值得讨论了。沈教授认为：即使撇开邪教不谈，这种做法也是不可取的。就“克隆人”这一个体而言，他会生活在“我是一个死去的人的复制品” 这样一个阴影中，这对他的心理会产生什么样的影响？ 按照生命伦理学的观点，科学技术要从长远利益出发，造福整个人类。它必须遵循“行善、不伤害、自主和公正”这四项国际公认的伦理原则。“多利”羊的克隆成功经过了200多次的失败，出现过畸形或夭折的羊。而克隆人更为复杂，无疑会遇到更多的失败，如果制造出不健康、畸形或短寿的人，将是对人权的一种侵犯。 人类基因的多样性是人类进化的生物学基础，而那些科学狂人要制造的所谓“不朽的生命”，实际上是同一基因的翻版，这就有可能减少基因的多样性，不利于人类本身的进化。所以，无论从个体、整体，还是从社会进化、生命伦理角度看，都应该坚决反对克隆人的行为。 沈教授指出：现在科学界把克隆分为治疗性克隆和生殖性克隆两种。前者是利用胚胎干细胞克隆人体器官，供医学研究、解决器官移植供体不足问题，这是国际科学界和伦理学界都支持的，但有一个前提，就是用于治疗性克隆的胚胎不能超出妊娠14天这一界限。而对于生殖性克隆，即通常所说的克隆人，由于它在总体上违背了生命伦理原则，所以，科学家的主流意见是坚决反对的。联合国教科文组织、世界卫生组织和国际人类基因组伦理委员会和各国政府也都非常明确地表示，反对生殖性克隆。即使克隆人真的诞生了，我们还是要坚持这一基本立场。 现代科学技术是一把双刃剑，在其造福人类的同时也会带来一些负面效应。这就向我们提出了一个问题：现代科技，特别是现代生命科技，要不要尊重伦理学原则，要不要倾听伦理的声音？沈教授指出：现在有些科学家提出，只要科学上有可能做到的，就应该去做。事实上，这是错误的观点。如果技术上我们能制造出一种严重危害人类的超级生命，难道也可以去制造吗？一些科学狂人正是打着“科学自由”的旗号，去做一些危害人类的事。因此，我们要警惕现代科学技术被一些别有用心的人利用。另外，也不能把科学自由和伦理道德对立起来。现代生命科学发展的事实表明，伦理的规范和引导，并没有束缚科学的发展，倾听伦理的声音，有利于科学更健康、顺利地发展。选自2000年11月8日《文汇报》

在古希腊神话中，有着命运三女神的形象，长女克罗索，纺织着人类的生命线。每有新的人诞生在世上，她就会源源不断织出这个人的生命线来；而次女喇克希丝，手秉标尺，丈量着人类的生命线的长度。生命线的长短决定这个人的寿命长短。至于三女阿特诺珀斯，则双手持剪刀，寿期一到，即刻就剪断人类的生命线。生命线一断，生死相隔，人长眠而去。面对这大自然的生死定律，面对这逃不脱的死亡之剪，人类却从未放弃过延长生命的渴望和追求。 干细胞既不像生殖细胞，更不同于那些形形色色的体细胞。一方面，它有着自我复制，几乎无限增殖的潜能，可以像其他细胞系一样培养传代，另一方面，又可分化成各种成体细胞。因此可以说干细胞是一类中间类型的细胞。对干细胞的确认犹如发现了一块新大陆，人们激动地关注，开垦着这片处女地，希望从中找到长生不老，保治百病的灵丹仙术。 我们知道，人的个体生命起源于受精卵，此后伴随生命旅程的是细胞数目的增多和细胞的形态功能的分化，在胚胎发育过程中有胚胎干细胞起着全能分化的作用，胎儿出生后干细胞隐藏在人身体的各个角落，分化能力也逐渐减弱为多能或单能。在成年人体仍然发挥着作用，比如，我们的皮肤、头发不断地脱落，也不断地更新，身体某一部分受伤或因病遭到损坏，也能得到很好的修复，这些都是干细胞的神奇作用。 因为造血干细胞是最早发现，最多研究和最先用于治疗疾病的成体干细胞，长久以来在人们的观念中，“干细胞”只属于造血系统。近年来由于干细胞理论的突破和研究技术的长足进展，在几乎所有组织中都发现了“干细胞”。1999年干细胞研究被美国《科学》杂志推为21世纪最重要的10项科研领域之一，且排名第一，先于工程浩大的“人类基因组测序”。2000年干细胞研究再度入选美国《科学》杂志评选的当年十大科技成就。干细胞生物学和干细胞生物工程已经成为继人类基因组大规模测序之后最具活力，最有影响和最有应用前景的生命学科。 其中值得一提的是，1998年，James、Michael报道了他们成功体外培育了人类胚胎干细胞；2004年，韩国科学家首次利用克隆技术获得人类胚胎干细胞。这都是生命科学的里程碑，它提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的早期事件的良好材料，使体外产生人体细胞、组织、器官成为可能。人类似乎要以胚胎干细胞向命运女神证明生命线的坚韧。 科学家提出，要利用干细胞治疗疾病，首先要解决四个问题：第一，干细胞的来源和数目；第二，如何把干细胞转化成病人所需的功能细胞；第三，如何克服免疫排斥；第四，如何诱导干细胞形成一个具有一定解剖结构的脏器。这些问题的逐渐解决，就是干细胞治疗成熟时代的到来。比如，此次韩国科学家所采用的核移植技术建立病人胚胎干细胞系就是克服某些病人的组织不相容的理想办法，因为病人是在用自己的遗传物质制造适合自己的细胞或组织。 干细胞治疗疾病将具有很多传统治疗方法无法比拟的优点：它可以一次性介入，永久性治疗，不需要完全了解疾病发病的确切机理，这种治疗效果和模式可是医学界梦寐以求的事；如果应用自身干细胞移植，可以大大避免了产生免疫排斥反应。所以，干细胞可以用来治疗各种疾病，特别是那些对于传统治疗方法无能为力的组织坏死性疾病比如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。在如今，一些捐赠的器官和组织常常用以取代生病的或遭破坏的组织。但是，受这些疾病折磨的病人数量远远超过了可供移植的器官数量。而多能干细胞经刺激后可发展为特化的细胞，可用于治疗无数的疾病、身体不适状况和残疾。 此外，癌细胞在一些基本特征上与胚胎干细胞是一样的，它也具有自我更新能力和分化各种成体细胞的能力。癌细胞的特别之处，是它偏离正常发育途径，能“永葆青春”，无限制地进行恶性分生增长。正是因为癌细胞与胚胎干细胞十分相似，连人体内的“警察部队”免疫系统也不能识别它。作为人类最严重的医学难题，如癌症和先天缺陷就是因异常的细胞特化和细胞分化所导致。如果能借助干细胞的相关研究，搞清楚正常细胞的分化发育过程，就能更深刻地理解其中的基本错误，了解这些致死疾病的成因，就可以找到治疗疾病的方法。 在研制药品和进行安全性实验时，由于多能干细胞使更多类型的细胞体外培养成为可能。故可对药品进行不同细胞类型的细胞水平试验，避免了直接动物身上进行实验，动物的用量减少了，使药品研制的过程更为合理有效。 在许多科幻故事中，人们不光能使用生物有机体顺利生长发育，保证人能够无病无灾地度过一生，还能把老化的细胞、组织、器官返回青年状态，延长人的寿命，甚至还能人工创造新的，机体更加完美，机能更加完善的生命。这一切随着生命科学的发展，于人类将不再是幻想。 链接： ◎克隆一词是由clone音译而来，在音译名出现以前曾有一个意译名——无性繁殖系。克隆原来是个名词，指一群细胞或一群个体（如一个细菌菌落）。随着分子生物学的发展，出现了核移植与基因工程之类的操作，clone一词由名词转化成动词。核移植称为核克隆（nuclear cloning），通过基因工程得到DNA分子的无性系称为分子克隆（molecular cloning）。在这里克隆是一种实现无性繁殖（asexual reproduction）的操作，而不是一般意义上的无性繁殖或无性繁殖操作。

克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 回答者：chaojie2000904 - 秀才 二级 3-8 16:29克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 回答者：abcliubill - 魔法学徒 一级 3-8 21:57克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。

做分子克隆时，用T4连接酶将PCR产物与载体连接起来，形成环状重组子。

提问太简洁含糊了，你说的“克隆”是指生物学上的克隆还是电脑上系统Ghost克隆啊？生物学的克隆楼上几位已经回答的够详细了，我只说说电脑系统的Ghost手动克隆备份和恢复。。首先，我们先来试着手动备份一个分区，比如说我们想备份C盘到Ghost映像，随便找一张Ghost XP或者Ghost Win7的系统盘启动计算机，在随后出现的菜单中选择“手动运行Ghost 11”，或者在DOS命令行中输入“Ghost”，并回车。进入Ghost系统后，会弹出一个欢迎窗口，选择下面的“Done”进入Ghost界面，选择“file（文件）”→“local（本地）”→“Patition（分区，如果你的电脑中有两块或多块硬盘，想备份一块硬盘，请选择“disk”选项）”，→“to image（到映像文件）”，然后系统会弹出一个文件保存窗口，我们选择要保存映像文件的位置，然后起一个文件名，比如说Ghost C“，然后选择“Save（保存）。然后系统会出现一个进度条，等它走到100%，自动退出，这时重新启动计算机，系统克隆结束。将这个备份的映像文件刻录成光盘，就可以在其他任何一台与这台电脑配置完全相同的电脑上安装系统或恢复系统并正常使用了。这就是系统克隆。如果要恢复系统，我们可以这样做：还是用任意一张Ghost Xp 或Ghost win7的系统盘启动系统并进入Ghost，选择“file”→“local”→“Patition”→“From image”，然后在弹出的文件选择窗口中选择刚才备份的那个映像文件，等待进度条走到100%并重启计算机，系统恢复完成。

首先要明确下载的app是否为安全的正版app。如果是，就不会有问题，如果是盗版的，非安全的app，就要当心了。教你如何识别垃圾App教你如何识别垃圾App1.从正规渠道下载“从正规渠道下载”真是老生常谈了，但偏偏就是有人不听劝，直接通过搜索引擎搜到的结果并不一定代表着那就是正规应用，反而有很多恶意应用通过优化关键字或其它方式，达到在搜索结果中排名靠上的目的。用户可以从该应用的官网直接下载，或者通过大型应用市场下载。2.看认证标识或者下载量但应用市场中也是鱼龙混杂，一些恶意应用绕过了审核，堂而皇之的等着用户来下载，若是遇上了“高仿版本”则更难分辨，一模一样的图标，相似度极高的应用名称，甚至登上了推荐榜，一不留神就会失误下载。破解的方式只有一个：看认证标识!正规渠道的应用都会带有认证标记，比如“官方”或“已认证”等字样，看准这些再下载安全性会大大提升。3.看评论没有认证标记怎么办?看评论。如果这是一款来源可靠的好软件，可能很少有人愿意在评论中夸它几句，但如果这是一款功能差劲体验不佳的应用，肯定会有大批用户自愿到评论区中为它“美言”几句。如果大家无法判断一款应用的优劣，不妨看看其它用户是怎么说的。当然不排除水军的存在，但这类评论通常很“软”，容易识别，要是评论中清一色的点赞，那么可要留点心眼了。4.看流量是否有偷跑已经下载了好多应用该怎么办呢?难不成要一个一个重新下载吗?当然不用这么麻烦!安卓手机可以在设置菜单中查看到应用的流量使用情况，若是某些应用的流量使用高的不正常，必然常常在后台偷跑，要么限制它联网，要么直接删除永绝后患。5.有多个版本时怎么办为了适配不同的屏幕尺寸/分辨率，很多应用都推出了不同版本，比如HD版、XX系统专用版等等，若同为官方发布的应用，这些App也会带有官方认证的标识，若没有也不要紧，上述的几种方法都能帮助你辨别这款应用的真伪。6.破解版、绿色版一看到破解版、绿色版几个字，相信很多用户都会亮眼放光，其实这些应用都经过了再加工，让用户绕过授权码或者加密措施直接使用，看上去这种方式方便了用户，但实际上它们不仅侵犯了正版厂商的利益，还有可能在应用中植入一些乱七八糟的代码，用户可千万不要贪小便宜吃大亏，对于此类应用还是保持警惕为好。7.看权限在应用安装时，请求的权限会暴露出它所有的目的，拍照应用为何要通讯录权限?手电筒应用为何要录音权限?大家安装软件可能只是点击一下“安装”就完事了，但在那之前应该好好阅读一下权限列表，不让恶意应用有可乘之机。8.要账号密码?门都没有!好了，若是以上几项都很正常，是不是就是一款好应用呢?也不完全是!若是通讯应用突然让你填写银行账号和密码，那可就要小心了，密码是保障账户安全最重要的一道关卡，怎么能轻易告诉别人呢?此类应用必定存在不良目的，不要犹豫直接卸载。其实不仅是安卓，iPhone中也存在不少恶意应用，只是它们的伪装术更高明，更不易察觉，不过由于iOS系统的封闭性，已经帮助用户挡住了很多恶意应用的侵袭，但大家也不要放松警惕，时刻提防新骗术才是正经事。

这个有多方面的原理：一个：PCR有错误，虽然这个错误率很低，普通的酶大概在千分之一，而高保真的在百万分之一，但毕竟有。二个：基因保存的问题：PCR产物当然也可以保存，但保存时间长了会不会出问题？能保存几年？克隆进质粒就不一样了，这个基本可以保存很久，哪一天想要这个基因，拿出来摇一小瓶就可以了。三个：单克隆性，PCR片断可能有长有短（还有突变），而质粒就不一样了，可以挑单克隆，测序正确后就认为这是我们想要的基因。四个：做基因表达时连接方便。如果PCR产品上没有酶切位点，克隆载体上有，切下来可以连到表达载体上。象有些人做基因库时，都是克隆到载体上，肯定是这样有很多优点的。

加减法是测序的~科恩伯格最引人注目的研究工作，是在20世纪50年代中期用实验证明DNA的复制并分离了复制所需的酶，这集中反映在他于1956年发表的著名论文《脱氧核糖核酸的酶促合成》一文中，他因此于1959年获得诺贝尔生理学和医学奖。 在1953年以前，基因的物质本性一直是困扰着全世界生物学家的问题。1953年4月25日《自然》杂志发表了沃森（J. Watson）和克里克（F. Crick）的DNA双螺旋结构模型，既反映了DNA分子可能具有的无穷多样性，又能立刻提出DNA分子自我复制的可能机制，使生物学家一下子接受基因的物质本性就是DNA。但是，DNA双螺旋结构模型虽然是以众多的实验结果为依据，但它本身却尚有待于实验证明。尤其是，DNA果真是一种能自我复制的分子吗？在DNA双螺旋结构模型发表之后，科恩伯格就以这一模型作为设想基础，用实验方法研究DNA的复制，很快得到成功，于1956年发表了初步结果。他成功的原因之一在于他有一个正确的分析：他觉得构成DNA分子的单体虽然是4种脱氧核苷一磷酸，但是，DNA合成的原料却不是4种脱氧核苷一磷酸，而是4种脱氧核苷三磷酸。4种脱氧核苷三磷酸缺1种都不行，用4种脱氧核苷二磷酸或4种脱氧核苷一磷酸也都不行。他还设想，细胞内必有合成DNA所需的酶。于是他把大肠杆菌磨碎，用其提取液加上4种脱氧核苷三磷酸（其中至少有1种进行放射性同位素标记，以便于检查实验结果），再加一点点微量DNA作为“模板”（如小牛胸腺DNA、大肠杆菌DNA以及大肠杆菌T2噬菌体DNA）。把上述混合液在有镁离子存在的条件下于37℃静置30min，发现放射性标记已进入DNA部分，说明有新合成的DNA分子。新合成的DNA分子即实验产物可以用过氯沉淀法同作为原料的脱氧核苷三磷酸单体分开。科恩伯格测定了产物DNA的碱基组成，发现它们同各自的模板DNA组成惊人地相似, 这就充分证明新合成的DNA的特异性是由所加入的那一点点微量的模板DNA决定的，只不过数量大大增加了而已。DNA果然是一种能自我复制的分子！ 这里插叙一下，人们后来知道DNA合成还需要“引物”以提供3′端羟基，使DNA聚合酶得以从该处将一个个脱氧核苷酸聚合而成DNA。科恩伯格当年在制备模板DNA时进行了化学处理，造成了一些断裂，从而形成了一些现成的3′端羟基。这一点在当时是不知道的。 科恩伯格在获得诺贝尔奖后没有止步不前。他清楚地知道，他在体外合成的DNA是没有活性的。那么，能不能在体外合成有活性的DNA分子呢？1967年，他以大肠杆菌φⅩ174噬菌体DNA为材料进行体外复制实验。φⅩ174的基因组是单链环状DNA，共5 386个核苷酸。细胞内的情况是：当φⅩ174感染大肠杆菌时，单链环状DNA进入细菌，很快就按碱基配对原则合成其互补链，构成双链环状的“复制形式DNA”。一般把噬菌体颗粒中的单链称为“+链”，进入细菌后合成的互补链称为“-链”。在细菌内复制时，是以-链为模板，按“滚环” 方式合成许多个+链。这些+链与蛋白外壳构建成新的φⅩ174从细菌内释放出来。科恩伯格基本上仍用1956年所用的方法（但增加了连接酶，使新合成链的最后一个核苷酸的3′ 端羟基和最初第一个核苷酸的5′ 端磷酸基连接起来形成环状）,以φⅩ174+链DNA为模板，在体外合成-链，又以-链为模板，在体外合成+链。体外合成的φⅩ174+链DNA能感染大肠杆菌，在细菌内能复制，最后从细菌内释放出许多φⅩ174噬菌体颗粒，具有原来φⅩ174噬菌体的全部特性。由此，人类首次在试管内合成了具有生物学活性的DNA分子。 科恩伯格在DNA体外合成方面所取得的成就，其影响极为深远。首先是关于DNA复制所需的酶。 科恩伯格开始实验时所设想的大肠杆菌提取液中含有的DNA聚合酶，在1957年就被他分离纯化，那就是至今仍在全世界各个分子遗传学实验室里经常使用的“大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ”，又称“科恩伯格酶”。它既具有聚合酶的活性，又具有5′→3′ 外切酶和3′→5′外切酶的活性。今天我们用DNA分子杂交技术进行基因分离、基因结构分析、基因诊断等研究时要用放射性同位素标记的基因探针；标记基因探针常用的“缺刻前移法”（nick translation）就是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ兼有聚合酶活性和5′→3′ 外切酶活性这一特点，而其反应过程也就是科恩伯格当年进行的DNA体外合成的过程。所以，尽管后来证明在大肠杆菌细胞内复制时起主要聚合作用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ，不是DNA聚合酶Ⅰ，但在分子遗传学实验室里，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的重要性却处于实验室常用酶的最前列。 1970年，丹麦生物化学家克莱诺夫（H.Klenow）用枯草杆菌蛋白酶切割大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，电泳后获得大小两个片段。大片段保留了聚合酶和3′→5′外切酶活性，但丧失了5′→3′ 外切酶活性，被称为“克莱诺夫片段”，又称“克莱诺夫酶”。标记基因探针常用的另一种“随机引物法”（random priming）就必须用克莱诺夫酶而不能用科恩伯格酶。其次，科恩伯格的成就还直接导致了一些诺贝尔奖的获奖项目。 到目前为止，包括2003年4月完成的“人基因组计划” 在内，已有超过1000种的噬菌体、病毒、类病毒、细菌、原始细菌、真菌、植物、动物以及细胞器和质粒的基因组DNA全核苷酸序列被测定。DNA测序起始于英国生物化学家桑格（F. Sanger）在1975年建立的“加减法”以及他用该法在1977年首次测定了φⅩ174基因组DNA的全核苷酸序列。近30年来，DNA测序由半自动化发展到全部由仪器自动测序，但其基本原理仍然没有跳出桑格“加减法” 的范畴，而“加减法” 的“源头” 则是科恩伯格的DNA体外合成实验。它是设法控制DNA酶促合成反应，使之产生不同长度的互补链，从而测定一个一个核苷酸的排列顺序。其中， 所用的DNA聚合酶正是克莱诺夫酶。桑格因建立DNA测序方法而获得1980年诺贝尔化学奖。

克隆一词是由clone音译而来，在音译名出现以前曾有一个意译名--无性繁殖系，指由单一细胞或共同祖先经有丝分裂得到的细胞群体或有机群体。我们通过细胞培养可以得到一个细胞克隆。 克隆技术简史（小资料） 1938年，第一位现代胚胎学家、德国的汉斯u2022斯皮曼博士建议用成熟的细胞核植入卵子的办法进行哺乳动物克隆。 1952年，运用斯皮曼的构想，出现世界上第一只克隆青蛙。 1962年，约翰u2022格登宣布他用一个成熟细胞克隆出一只蝌蚪，从而引发了关于克隆的第一轮辩论。 1984年，斯蒂恩u2022威拉德森用胚胎细胞克隆出一只羊。这是第一例得到证实的克隆哺乳动物。 1995年10月，美国麻省麻醉学家维坎蒂博士利用改良组织工程，令老鼠背上长出人耳，从而使人类能在实验室培育出可向人类移植的皮肤和软骨。 1996年7月，英国苏格兰罗斯林研究所成功地用羊乳腺细胞克隆出小绵羊"多利"。 1997年10月，英国专家研制出一个无头的青蛙胚胎，令其有关技术可以制造人类器官以便作为医学移植用途。 1999年7月，日本科学家克隆出多头牛，并将其肉类推向市场出售。 2000年4月，美国先进细胞工程公司克隆出6头比它们本身实际年龄年轻的小牛。 2000年，美国科学家用无性繁殖技术成功克隆出一只猴子"泰特拉"，这意味着克隆人本身已没有技术障碍。 2001年11月25日，美国马萨诸塞州的生物技术公司成功克隆出人类胚胎，在克隆技术上迈出了重要一步。不过该公司表示其目的不是为了克隆人，而是为了获得能够用于治疗帕金森综合征和青少年糖尿病等各种疾病的干细胞。 克隆是什么？ 克隆一词是由clone音译而来，在音译名出现以前曾有一个意译名--无性繁殖系，指由单一细胞或共同祖先经有丝分裂得到的细胞群体或有机群体。我们通过细胞培养可以得到一个细胞克隆。在微生物实验时，通过倒平皿，我们可以得到一个个的菌落，这些菌落其实就是细菌的克隆。可见克隆原来是个名词，指一群细胞或一群个体。随着分子生物学的发展，出现了核移植与基因工程之类的操作。核移植操作可以得到重建细胞，重建细胞可以繁殖成一个无性系；基因工程操作可以将某一被选定的基因拼接到质粒的复制子上，随着复制子的复制也能得到DNA分子的无性系。于是，有人就把这类操作称作克隆，即将clone一词由名词转化成动词，并将核移植称为 nuclear cloning（核克隆），通过基因工程得到DNA分子的无性系称为molecular cloning（分子克隆）。在这里克隆是一种实现无性繁殖（asexual reproduction）的操作，是一种显微操作或分子生物学操作，而不是一般意义上的无性繁殖（或无性繁殖操作）。这也许正是克隆一词能够存在而不被无性繁殖替代的原因。 克隆羊 多利羊又称克隆羊，其实是用核克隆技术产生的羊。有人说，只有多利羊才是真正的克隆羊，其他报导，如克隆猪、克隆牛等，由于它们是由胚胎细胞发育而成的，而胚胎细胞是有性繁殖产生的，所以，不是真正意义上的克隆。这是一种误解，是由于对有性过程在时间上把握不准所造成的。有性过程到受精卵、即合子形成时即告结束，合子分裂一旦开始即与有性过程无关了。如果说分裂后的胚胎细胞是有性繁殖产生的，那么，体细胞追究下去也是有性繁殖产生的。但事实上它们都是由合子经有丝分裂逐渐产生的。这就是说，有性繁殖实际上是经过一次有性过程和许多次无性过程，最后产生一个成活的后代而实现的。从胚胎中取出一个细胞使之发育成一个个体，这显然应属于无性繁殖。所以，从这个意义上讲，杜里舒是克隆技术（细胞克隆技术）的创始人，他的将两分裂球时期的细胞分开，使之发育成两个海胆的实验，是最早的克隆实验。而人类的同卵双生双胞胎，就是经天然细胞克隆化产生的。而克隆猪、克隆牛，如果是经核移植育成的，则不管供核细胞是来自早期胚胎细胞，还是已分化细胞，均属于真正意义上的克隆技术，而且是比杜里舒的水平高得多的克隆技术。 走近"基因药物 人们为了实现某种目的，将克隆的外源目的基因(一般是人的DNA )，整合到动物受精卵的染色体内，使之在动物体内得到表达并能稳定地遗传给后代，这种含有外源基因的动物就叫做转基因动物。从事这项研究的科学家们说，一头转基因动物就是一座天然基因药物制造厂，不仅可以大大降低成本，而且还能够扩大生产，获得更多的基因药物。 利用转基因动物来生产基因药物是一种全新的生产模式，与传统的制药技术相比具有无可比拟的优越性。以美国为例，凝血因子Ⅷ的年需要量约为120 克。过去，这120克凝血因子Ⅷ需要120万升血浆提取，以每人献血200 毫升计，需600 名献血员提供血浆才能满足。而用转基因牛来生产，一头牛每年的奶产量是1万公斤，如每公斤乳汁中可制造10毫克凝血因子Ⅷ的话，那就只需1.2头这种牛即可满足需要。再以白蛋白为例，美国的年需要量为10万克，过去需从200 万升血浆中提取，而用转基因牛来生产，以每公斤乳汁制造2 克的蛋白计算，就只需5000头牛即可解决。此外，从人血中提取血清蛋白质可能产生的肝炎、艾滋病等传染性疾病，也可因此而得以避免。 生物技术是当今最为活跃的一门技术。1971年，诺贝尔奖获得者保罗u2022伯格首次成功地把两种不同的基因拼接在一起，使生物技术发展到基因重组与移植的新阶段。 此后，基因重组技术取得了一个个丰硕成果。1978年合成了人工胰岛素，1979年实现了生长激素基因在大肠杆菌中的表达，1982年研制成功了人工干扰素，基因制药从此走上了产业化道路。但是，目前的基因药物是通过基因重组技术培育大肠杆菌和动物细胞来制造的，而大肠杆菌这类低等生物是不可能生产出结构复杂的药物，动物细胞培养的成本又太高。所以，利用基因重组与移植技术来培育转基因动物生产药物便应运而生了在利用转基因动物提取药物方面，英国科学家首开先河。1997年年底，英国PPL治疗学公司率先利用克隆"多利"所采用的"细胞核转变"法，培育出200头携带人体基因的绵羊，并成功地从奶汁中提取了α－1抗胰蛋白酶。这是科学家首次从遗传工程培育的绵羊的奶中，提取可用于治疗人类疾病的药物成分，为建立"动物药厂" 打下了基础。随后，芬兰科学家将人体的促红细胞生长素基因，植入乳牛的受精卵中，创造了一种能生产出促红细胞生长素的乳牛。从理论上说，这种乳牛一年可提取60－80千克促红生长素，比目前全世界的使用量还多。 假如你是足球迷，你肯定希望世上再多一个罗纳尔多；假如你是音乐爱好者，你当然愿意再拥有一个贝多芬；再有一个爱迪生、爱因斯坦也是许多人所梦想的。古希腊有位哲学家曾经说过"世上不可能有两片完全相同的叶子"，换句话，以上的梦想都只能是空想，没有实现的可能。但是，现在情况却有了变化，有一种新兴生物技术"克隆"，或许可以做到这一点。那么克隆是什么呢?它奇妙在哪里呢?今天，就让我们一起走近——"奇妙的克隆"。 我们身边哪些动、植物先天具有克隆的本领？具有克隆能力的动植物有：土豆、蚯蚓、桑树，丝瓜藤,吊兰.水母，海参、仙人掌。水母在遭到伤害后，伤口会自动补好。章鱼的触手可以再生。龙虾的大钳子掉了 ，还会再长出来。还有秋海棠、富贵竹，它们插枝即活。壁虎。它遇到危险时，就将自己的尾巴断掉，然后再长出来。 能不能找出这些天生具有克隆本领的动植物的共同点，用自己的话说说克隆是什么?不由生殖细胞结合产生的后代。 克隆技术可以造福于人类：能使不具备繁殖能力的动物诸如骡扩大繁殖，还能挽救濒危动物。 假如你也掌握了克隆技术，你想克隆什么呢？为什么要克隆它？要求：1、想法要奇妙；2、想法要有益于人类；3、表达要有条理，语气、语调适当。 如果让我克隆，我会克隆无数对明澈的眼睛。许多人认为有一双好眼睛是理所当然的事，而我并不这么认为。当你看到那毫无光芒的双眼，听到期盼光明的心灵的呼唤，难道你的心灵没有震动吗？上天对他们不公，就让科学来为他们创造光明，就让社会让他们体会真爱。我坚信"科技以人为本"并不是空话。所以我要克隆眼睛，让更多的人重见光明. 我想克隆恐龙。因为我喜欢恐龙，想再现恐龙时代的盛景。而且具备克隆恐龙的条件，因为恐龙时代的南极有可能处在温带地区，当恐龙死后尸体藏在南极中，而此时的南极很可能已在冰天雪地中，由于寒冷可防止身体的腐化，所以可以提取恐龙的DNA，从而克隆恐龙，这样也可以使后代开阔眼界。 我不主张象他那样去克隆一些史前生物，如恐龙、猛蚂等。因为任何生物的生存与灭绝都不是人类所能控制的，人类应该严格遵守"自然法则"，让生物的发展顺其自然。如果再回到从前，就可能破坏生态平衡。 我想克隆水，目前世界上的淡水资源严重缺乏，已无法维持人类生存，而人类仍在无限制地浪费水，所以我想克隆水。 我要克隆粮食，拯救非洲正在挨苦受饿的人们，使他们过上温饱的日子。 我们都知道，热带雨林是地球之肺。而亚马逊平原是世界上最大的热带雨林，占地球上热带雨林总面积的50%，达650万平方公里。这里自然资源丰富，物种繁多，被称为"生物学家的天堂"。然而，亚马逊却没有因为它的富有得到人们的厚爱。70年代以来，人们的滥砍滥伐使其三分之一的面容消失在我们眼前，这将意味着维持人类生存的氧气将减少五分之一。所以，我想克隆亚马逊热带雨林，将其安放在撒哈拉沙漠上，使之净化环境。 我反对刚才三位同学的说法。他们的想法很好，表达了他们忧国忧民之心，表达了他们的美好愿望。可是水、热带雨林、粮食没有细胞，如何克隆？（众笑）（有人小声插话）：水可以的，有水分子。 如果我有克隆的技术，我会克隆孙悟空，因为他无所不能，可以实现我们很多改变社会的理想。（众大笑） 师：感谢这些同学给大家带来的大胆的、新奇的"克隆理想"，不管它们符不符和科学原理，但都表现了大家的美好愿望，希望科技能来社会的进步，使人类的生活更幸福！围绕"克隆技术造福人类?!"的辩题展开讨论。) 师：辩论要求：(1)语言清晰、流畅，声音洪亮；（2）观点鲜明，论据充足；(3)驳斥对方观点时既要有"理"，又要有"礼"。 （以"克隆技术能造福人类"为正方，"克隆技术不能造福人类"为反方展开辩论） 正方：我认为"克隆技术能造福人类"，课文的第四章节不是非常详细地介绍了克隆对人类的作用吗？如能使不具备繁殖能力的动物扩大繁殖，据有关报道，公驴和母马所生出来的杂种动物——骡，如何繁殖这些优良品种呢？只能用克隆。还能挽救如熊猫这类繁殖能力低的濒危动物。 反方：我觉得克隆无益于人类。你别不相信，请听我慢慢道来。（停顿，由于太激动，又重复了一遍，众笑）首先克隆正如正方辩友所说，的确可以挽救濒危动物，但你可曾想到，这样的克隆会破坏动物种群的正常发展，使动物走向衰弱，就算可以救一时，难道可以救一世吗？我想不可能。有人说克隆可以使动植物再生，有没有想过，只要人类不刻意破坏，这样的生态平衡已维持了千万年，你这样无限制的克隆，是否破坏了它的食物链，又是另一种生态平衡的破坏呢？ 正方：我听说在亚马逊的热带雨林中每天都要消失近百种植物，所以克隆能挽救一部分植物，虽然不是全部，但仍能部分保存。现在的克隆技术虽然不是十分发达，但我相信今后克隆水平会更好，这时克隆就有它的用武之地了，总不能等到地球全部荒芜才研究克隆吧？ 反方（冷笑）：对方辩友真是对未来充满希望啊！可是这也证明了这只是你的美好想象，寄希望于克隆技术的提高，而事实上呢，经过了247次失败后，才得到了"多利"克隆小绵羊。在这个过程中需要伤害多少动物啊，这与我们克隆的初衷不是背道而驰吗？ 正方：失败乃成功之母嘛！（众笑）现在的克隆技术或许不发达，但在今后我相信人类的克隆水平会越来越好，克隆出来的动植物会越来越优异，象失败247次这样的事将不再发生，它最终会造福于人类。而且克隆对于研究有些疾病和研究人的寿命有不可低估的作用。当某一天我们自身的某个器官出了问题，就可以从先前克隆的胚胎中取出这个器官进行培养，然后替换自己病变的器官。我们就再也不必害怕疾病了。所以克隆对人类还是有益的。 反方：你还嫌世界上的人口不多吗？如果一有严重的疾病就换器官，人不是都可以长生不老？如果这样，地球人口增长率岂不达到极点，地球不就要出现危机了吗？ 正方：或许那时人们可以到其他星球中生活了！（众笑） 反方：我想说说克隆人有哪些危害。（反方同学鼓掌）比如，如果克隆的供体细胞发生变异，或者培养胚胎的培养基因与科学家开了小小的玩笑，克隆出一个废品，我们能象对待阿狗阿猫那样处置他们吗？器官移植，供体匮乏，能不能未雨绸缪，为自己克隆一个器官仓库，以供将来不测之需？如果能，人们能够坦然从与我们一样五官齐全，表情丰富的克隆人身上摘下一只肾，挖走有一只眼吗？人类早就期望借助机器人，从繁重或危险的劳动中解脱，但再灵巧的机器人也是笨拙难如人意。能不能克隆一个"我"的替代品，赋予他灵巧的四肢和绝对服从的意志？如果那样，是不是有一天觉醒的克隆人会向我们呐喊："王侯将相，宁有种乎？"（反方同学热烈鼓掌，并大声叫好） 依样画葫芦克隆出的一个新生命，他们是儿子，还是弟弟？如果面对一群面貌、体态、风姿一样的克隆人，我们如何确认他们的身份？如果他们犯罪，我们又有什么手段缉拿真凶？再说，人类居住的地球早已因为人口爆炸难堪重荷，我们还有什么理由用另一种方法生产自身？（再次响起掌声） 正方（激动地）：事物总有它的两面性，你不能十分果断地判断它是好是坏。我认为一个技术存在就一定有它存在的理由。你不能否认它有对人类造福的一面，不能将它一棍子打死。克隆技术能否为人类造福是要看它克隆的对象是什么，在什么领域，它固然有坏处，是因为任何事都有它的双面性，不能是纯粹的好与坏，所以不能说克隆技术是绝无益处的。 师（做暂停的动作，学生依然激动万分）：同学们各抒己见，对此提出了不少看法，或许不够深刻，却是朴素而真实的。坦白地说，我在这方面的知识未必比你们高深，你们的发言给了我启发。克隆技术取得突破性进展，世界为之轰动，它对我们人类究竟是利大于弊，还是弊大于利呢?现在下结论还为时过早，这篇课文里引用了诺贝尔奖获得者、著名分子生物学家J．D.沃森的话作结束语： "许多生物学家，特别是那些从事无性繁殖研究的科学家，将会严肃地考虑它的含义，并展开科学讨论，用以教育世界人民。"，这也正是我们所期待的，我们希望"克隆技术造福人类"。

分子克隆在医学上的应用是：在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。并且通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。扩展资料：分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。在工业生产方面以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。参考资料来源：百度百科—分子克隆

在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法.常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入克隆载体,形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到插入DNA的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增.克隆(clone,clon)一词源于希腊文Klon,原意为树木的枝条.在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体,在不发生突变的情况下,具有完全相同的遗传性状,常称无性繁殖(细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning)含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中,即分子克隆技术.将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接,然后引入寄主细胞,再筛选获得重组的克隆,按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类.cDNA克隆是以mRNA为原材料,经体外反转录合成互补的DNA(cDNA),再与载体DNA分子连接引入寄主细胞.每一cDNA反映一种mRNA的结构,cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布.特点是：①有些生物,如RNA病毒没有DNA,只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选,因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆,而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；③cDNA能在细菌中表达.cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息,只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息.1.方法：(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下,用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA.(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子,DNA呈环状,大小为1-200千碱基对(kb).在细胞中以游离超螺旋状存在,很容易制备.质粒DNA可通过转化引入寄主菌.在细胞中有两种状态,一是“紧密型”；二是“松驰型”.此外还应具有分子量小,易转化,有一至多个选择标记的特点.质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段,适用于构建原核生物基因文库,cDNA库和次级克隆.②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链,长约49kb,约含50个基因,其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的,分布在噬菌体DNA两端.中间是非必需区,进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子.λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库.M13噬菌体是一种独特的载体系统,它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌,但不裂解寄主菌.M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子,象质粒一样自主制复,制备方法同质粒.寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体,又能方便地制备单链DNA,用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交.③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子.是噬菌体－质粒混合物.此类载体分子容量大,可携带45kb的外源DNA片段.也能象一般质粒一样携带小片段DNA,直接转化寄主菌.这类载体常被用来构建高等生物基因文库.(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一,方法有：①粘性末端连接,DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端,用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端.在连接酶的作用下可恢复原样,有些限制性内切酶虽然识别不同顺序,却能产生相同末端.②平头末端连接,用物理方法制备的DNA往往是平头末端,有些酶也可产生平头末端.平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来,但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接.④人工接头分子连接,在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段,经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端.连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率.以λ或Cos质粒为载体时,形成线性多连体DNA分子,载体与DNA片段的比率高些为佳.以质粒为载体时,形成环状分子,比率常为1∶1.(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染,方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上,待DNA被吸收后铺在平板培养基上,再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子,通常重组分子的转化效率比非重组DNA低,原因是连接效率不高,有许多DNA分子无转化能力,而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大,转化困难.②转导,病毒类侵染宿主菌的过程称为转导,一般转导的效率比转化高.(5)克隆的选择：①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记,能有效地将重组分子与本底区分.例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后,形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化,如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌,携带外源DNA片段后便能侵染乙菌,因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子.②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因,当外源DNA插入到抗药基因区后,基因失活,抗性消失.如一质粒有A和B两个抗药性基因,当外源基因插入到B基因区后,便只抗A药而不抗B药.因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子.③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆.方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上,变性后固定在原位,然后与标记的核酸探针进行杂交.阳性点的位置就是所需要的克隆.④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达,就可以用特异的蛋白质抗体为探针,进行原位杂交,选择特异的克隆.2.重要意义与应用：分子克隆技术是70年代才发展起来的,它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域,打开了人类了解、识别、分离和改造基因,创造新物种的大门.它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响,并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路.在医学方面,利用分子克隆技术已将胰岛素,人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松驰素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌,利用发酵工业进行了大规模生产.还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量.在基因治疗方面.通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性,例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞,在温度高时可逆转为正常细胞.为治疗半乳糖血症,用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞,发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平,并确实能代谢半乳糖.在工业生产方面,以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程,四者紧密联系、常综合利用.许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品.在环境保护方面,人们根据需要进行基因操作,将某种微生物的基因转入另一微生物,创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种,以分解工业污水中的有毒物质.在食品工业方面,细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等.在农业生产方面,植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能.有许多外源基因导入植物获得成功.

分子克隆技术对现代遗传学发展的作用及展望：1、在医学方面利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。2、在基因治疗方面通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。3、在工业生产方面以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。4、在农业生产方面植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。扩展资料：分子克隆在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。分子克隆是指分离一个已知DNA序列，并以in vivo（活体内）方式获得许多复制品的过程。这一复制过程经常被用于增加并获取DNA片段中的基因，但也可用来增加某些任意的DNA序列，如启动子、非编码序列、化学合成的寡核苷酸或是随机的DNA片断。参考资料：百度百科-分子克隆

分子克隆在医学上的应用是：在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。并且通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。扩展资料：分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。在工业生产方面以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。参考资料来源：百度百科—分子克隆

直接用DNA的分子扩增技术就可以了，就是PCR技术：使DNA分子先解螺旋，然后以得到的单恋为模版进行复制。步骤：　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA　　2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。　　3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。　　每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

工具酶：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶，核酸酶和修饰酶五大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。1、DNA限制性内切酶生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息；2、连接酶它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5"-PO4与另一DNA链的3"-OH生成磷酸二酯键；3、聚合酶系专司生物催化合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的一类酶的统称；4、核酸酶核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸，它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环；5、修饰酶体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节。

分子克隆实验流程第一天一:目的片段的扩增（PCR）PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。1.PCR(50ul) ddH2O 37.5ul10x buffer 5ulMgCl2（25mmol） 3uldNTP （10mmol） 1ulprimer 1（10mmol） 1ulprimer 2（10mmol） 1ulcDNA 1ulTaq 0.5ulPCR反应条件：94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30 72℃ 5min.4℃保温 或者94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10 72℃ 5min.4℃保温注意：当所要扩增的目的片段较大时需要适当的增加延伸时间（一般产物越长，需要的时间越长：　1分钟/1kb）2.琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+琼脂糖 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入EB混匀倒板。其中琼脂糖含量为1g/100ml,EB含量为0.1ul/ml） 注：琼脂糖凝胶电泳检测如果有杂带侧需要割胶回收目的片段。3.PCR产物纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物,最后用45ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.4.PCR产物酶切（50ul） PCR纯化产物 43ul 10xBuffer Tango 5ul E1 1ul E2 1ul 酶切反应条件：37℃反应过夜或者37℃反应3-4h。. PCR产物酶切纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物,最后用25-30ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.琼脂糖凝胶电泳检测：取2-5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。以确保回收到目的片段。二．载体的制备 1．质粒DNA的制备：用柱式质粒DNA小量试剂盒抽提我们所要的载体质粒。 2.载体酶切（100ul） 质粒DNA 2ug 10xBuffer Tango 10ul E1 2ul E2 2ul ddH2O 补足至100ul 反应条件：一般pGEX-4T 37℃水浴3-4h，pET系列37℃水浴过夜。 3. 琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，同时取200ng左右没有酶切的质粒做对照，保存电泳图片。（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+琼脂糖 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入EB混匀倒板。其中琼脂糖含量为1g/100ml,EB含量为0.1ul/ml） 4.酶切产物纯化：根据PCR产物回收试剂盒上流程回收酶切产物,最后用20-30ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.第二天三．外源DNA片段在质粒载体中的克隆 1.外源DNA片段与质粒载体的连接（10ul） DNA片段 6ul 载体 2ul T4 DNA Ligase 1ul Buf T4 DNA Ligase 1ul 反应条件：22℃水浴3-4h或者16℃或4℃水浴过夜。 一般目的片段：载体摩尔比约为3:1，但是在这里我们通常是按体积比。 2.连接产物转化 取全部连接产物加入到不少于5-7倍体积感受态细胞溶液中，冰浴20min，42℃热激90s后静置与冰浴中3-5min加入500-800ul（一般800）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温培养0.5-1h。4000rmp离心1min弃上清同时保留100-200ul混匀菌体沉淀后均匀涂布抗性平板上。37℃恒温箱培养过夜。 质粒转化取质粒1ul或50-100ng加入50-70ul所需的感受态细胞溶液中，冰浴20min，42℃热激90s后静置与冰浴中3-5min加入500-800ul（一般800）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温培养0.5-1h。取100-200ul菌体均匀涂布抗性平板上。37℃恒温箱培养过夜。 注：1一定要区分质粒和连接产物转化的不同，不要理所当然。 2根据实验要求选择所需要的感受态。 3在选择抗性平板的时候要根据所选载体和感受态两个方面确定。第三天 收集涂布的抗性平板检查菌落生长情况4℃保存待下一步实验;筛选鉴定或酶切鉴定 筛选鉴定 菌落 PCR(25ul) ddH2O 19.2ul10x buffer 2.5ulMgCl2（25mmol） 1.5uldNTP （10mmol） 0.5ulprimer 1（10mmol） 0.5ulprimer 2（10mmol） 0.5ulTaq 0.3ul模板为单菌落PCR反应条件：94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30 72℃ 5min.4℃保温 或者94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10 72℃ 5min.4℃保温注：1一般一个项目要挑选5个单菌落做菌落PCR 2在以菌落为模板时要事先准备相应抗性平板，用枪头挑选菌落时要先在事先准备的相应平板上划线标记好顺序再将枪头放入上述反应体系中搅匀一下。3该PCR 的primer 为通用primer 所以在原来目的片段的大小上加上100-200bp。琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。根据大小判断该菌落是否正确。下班前挑取（在划线的板子上）筛选正确的菌体接种到5ml 含相应抗性的LB培养基37℃ 200rmp培养过夜。

分子克隆使用最多的DNA连接酶和需要供的能量如下：1、DNA限制性内切酶，是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息；2、连接酶，它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5"-PO4与另一DNA链的3"-OH生成磷酸二酯键；3、聚合酶，系专司生物催化合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的一类酶的统称。

（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应　　外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５"磷酸和相邻的3"羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5"磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口（图1.8），当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５"磷酸和３"羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下述反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。　　ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在加作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这样，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。这样，j与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计，b是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响ＤＮＡ的刚度。　　i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度（单位：mol/L)。理论上，当j=i时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。图1.9显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等，1985）。现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。当连接混合物中线性质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源ＤＮＡ的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。　　涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含：　　１）足量的载体ＤＮＡ，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体ＤＮＡ为20-60μg/ml。　　２）末端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒ＤＮＡ或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。 　　(二）粘端连接 　　１）用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。　　２）按如下所述设立连接反应混合物：　　a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。　　b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。　　c．加入：10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液 １μl　　Ｔ４噬菌体ＮＤＡ连接酶 0.1Weiss单位　　５mmol/L ATP 1μl　　于16℃温育１－４小时　　10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液　　200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)　　50mmol/K MgCl2　　50mmol/L二硫苏糖醇　　500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）　　该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。　　另外，再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，１1968)对该酶进行标化。１个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如Ｎew England Biolabs公司所定义）。因此，0.015Ｗeiss单位的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。在本书中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶一律用Weiss单位表示。par 目前提供的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ４噬体ＤＮＡ连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。　　３）每个样品各取１－２μl转化大肠杆菌感受态细胞。 　　（三）平端ＤＮＡ连接　　Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件：　　１）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。　　２）不存在亚精胺一类的多胺。　　３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。　　４）高浓度的平端。　　１．凝聚剂　　在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：　　１）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行。　　２）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的ＤＮＡ浓度下，所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体。par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。　　（１）聚乙二醇（PEG8000）　　１）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。　　２）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。　　３）浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。　　４）PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。　　（２）氯化六氨合高钴　　１）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。　　２）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状ＤＮＡ将点尽优势。　　３）与ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。　　（四）质粒载体中的快速克隆　　质粒克隆中最慢的步骤是所需的外源ＤＮＡ片段和相应质粒ＤＮＡ区段的电泳纯化，下面的操作方案[由S.Michaelis(个人通讯）根据Struhl(1985)的方法修订而成]是从纯化的凝胶中回收琼脂糖块，熔化后直接进行质粒和外源ＤＮＡ的连接。这一方法寻平端连接和粘端连接都同样奏效，但需大量的连接酶，而且效率要比标准操作方案约低一个数量级。　　１）用适当的限制酶消化外源ＤＮＡ，其量应足以产生约0.2μg的靶片段。反应体积应为20μl或更小。在另一管中，用相应的限制酶消化约0.5μg载体ＤＮＡ，总反应体积为20μl或更小。如载体ＤＮＡ带相同的端，应用磷酸处理如下：用限制酶消化完全后，加2.5μl 100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25单位牛小肠碱性磷酸酶，于37℃温育30分钟。　　２）通过琼脂糖凝胶电泳分离目标片段。务必用低熔点琼脂糖灌制凝胶，务必用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的１xTAE作为电泳缓冲液而不是常规的0.5xTBE来配制凝胶并进行电泳。　　３）在长波长紫外照射下检查凝胶，根据目标条带的相对荧光强度估计所含ＤＮＡ的量（见附录Ｅ）。用刀片切出目标条带，尽可能少琼脂糖的体积（通常40-50μl)。将切下凝胶片分别放入作好标记的各个微量离心管中。　　４）于70℃加热10-15分钏，使琼脂糖熔化。　　５）合并熔化的小份凝胶并放到加温至37℃的中一管中，共终体积应不超过10μl,外源ＤＮＡ与质粒载体的摩尔比应接近２：１。　　用另外两个管设立两个对照连反应，一个只含质粒载体，另一个只含外源ＤＮＡ片段。　　６）将３个管于37℃温育5-10分钟，然后每管加10μl用冰预次的２xT４噬体ＤＮＡ连接酶混合物，在琼脂糖凝固前，充他混匀各管内容物，于16℃温育12-16小时。　　２xT４噬菌体ＤＮＡ连接酶混合物可制备如下：　　1mol/L Tris.Cl(pH7.6) 1.0μl　　100mmol/L氯化镁 1.0μl　　200mmol/L三硫苏糖醇 1.0μl　　10mmol/L ATP 1.0μl　　水 5.5μl　　Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶 １Ｗeiss单位　　混匀后放置于冰浴上。　　７）连接反应行将结束时，取出贮存于-70的３管各200μl的冻存大肠杆菌感受态细胞　　８）于70℃中热10-15分钟重新溶化连接混合物中的琼脂糖。　　９）立即从每管连接混全物中取出５μl加到200μl大肠杆菌感受态细胞中，小心摇晃，快速地混匀内容物。从剩下每管连接混合物中分别再取５μl重复以上步骤，将转化混合物在冰浴上放置30分钟。　　10）完成转化方案的其余各步 分子克隆化是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。克隆(clone,clon)一词源于希腊文Klon，原意为树木的枝条。在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning)含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。分子克隆化-方法 (1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。(5)克隆的选择：①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。分子克隆化-重要意义 分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松驰素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。在基因治疗方面。通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。在工业生产方面，以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。在农业生产方面，植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。

必备： 1.复制起始位点：可在工具细胞内进行复制 2.多克隆位点：可插入外源基因 可选： 3.筛选基因：如抗性或显色基因,可用于转化菌种的筛选 《基因工程》上的说法是： 1.自主复制性 2.可扩增性 3.可转移性 4.不相容性

什么叫克隆？ 克隆（clone）是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的生物群，即具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是“小树枝叶”的意思，用以指无性增殖物。现在则指个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物。（1）个体水平：在植物的无性增殖中，植物的发芽、插条等由同一个体通过无性生殖而增长的个体群均被视为克隆。采用组织培养方法可使植物细胞培养发育成完全的个体（愈伤组织），采用这种方法得到的具有相同基因型的个体群，也被称为克隆；在动物的无性增殖中，典型的例子是采用核移植实验方法，把分化细胞的核移植到一个事先去核的蛙卵中，让其发育并得到克隆蛙。克隆动物具有均一遗传性质，在研究环境条件对发育、分化的影响以及药物的检测方面都是重要的实验材料。在哺乳动物中，由于细胞分化，核异质化的程度加剧，因此核移植尚无成功的例子。（2）细胞水平：由一个细胞经过有丝分裂生成的细胞群叫克隆。但如果培养细胞发生转化，则很容易引起染色体变异。（3）基因水平：利用基因重组操作技术，使特定的基因与载体结合，在细菌等宿主中进行增殖，有可能得到均匀的基因群。克隆基因在基因功能与精细结构的关系等基础研究及在有用物质的生产方面，均已得到应用。 在上述3种水平上，增殖并分离获得单一的克隆群称为克隆化。此时，克隆一词也可作为动词理解。克隆是重组DNA技术的核心部分。事实上，克隆技术现已被人们用来通过营养方式繁殖病毒等微生物和植物的纯种，从而保证了这些生物基因组的准确连续性。现在，克隆这个词还包括单个自主遗传因子的分离与保存。细胞生物的克隆只需要营养培养基，而基因的克隆则需要某种载体复制子、特定的寄主细胞和营养培养基。各种类型生物的克隆技术在生物工程中均有其重要作用。 “克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 参考资料：zhidao

(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。(5)克隆的选择：①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。

什么是基因？ 含特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。除某些病毒的基因由核糖核酸（RNA）构成以外，多数生物的基因由脱氧核糖核酸（DNA）构成，并在染色体上作线状排列。基因一词通常指染色体基因。在真核生物中，由于染色体都在细胞核内，所以又称为核基因。位于线粒体和叶绿体等细胞器中的基因则称为染色体外基因、核外基因或细胞质基因，也可以分别称为线粒体基因、质粒和叶绿体基因。 在通常的二倍体的细胞或个体中，能维持配子或配子体正常功能的最低数目的一套染色体称为染色体组或基因组，一个基因组中包含一整套基因。相应的全部细胞质基因构成一个细胞质基因组，其中包括线粒体基因组和叶绿体基因组等。原核生物的基因组是一个单纯的DNA或RNA分子，因此又称为基因带，通常也称为它的染色体。 基因在染色体上的位置称为座位，每个基因都有自己特定的座位。凡是在同源染色体上占据相同座位的基因都称为等位基因。在自然群体中往往有一种占多数的（因此常被视为正常的）等位基因，称为野生型基因；同一座位上的其他等位基因一般都直接或间接地由野生型基因通过突变产生，相对于野生型基因，称它们为突变型基因。在二倍体的细胞或个体内有两个同源染色体，所以每一个座位上有两个等位基因。如果这两个等位基因是相同的，那么就这个基因座位来讲，这种细胞或个体称为纯合体；如果这两个等位基因是不同的，就称为杂合体。在杂合体中，两个不同的等位基因往往只表现一个基因的性状，这个基因称为显性基因，另一个基因则称为隐性基因。在二倍体的生物群体中等位基因往往不止两个，两个以上的等位基因称为复等位基因。不过有一部分早期认为是属于复等位基因的基因，实际上并不是真正的等位，而是在功能上密切相关、在位置上又邻接的几个基因，所以把它们另称为拟等位基因。某些表型效应差异极少的复等位基因的存在很容易被忽视，通过特殊的遗传学分析可以分辨出存在于野生群体中的几个等位基因。这种从性状上难以区分的复等位基因称为同等位基因。许多编码同工酶的基因也是同等位基因。 属于同一染色体的基因构成一个连锁群(见连锁和交换)。基因在染色体上的位置一般并不反映它们在生理功能上的性质和关系，但它们的位置和排列也不完全是随机的。在细菌中编码同一生物合成途径中有关酶的一系列基因常排列在一起，构成一个操纵子（见基因调控）；在人、果蝇和小鼠等不同的生物中，也常发现在作用上有关的几个基因排列在一起，构成一个基因复合体或基因簇或者称为一个拟等位基因系列或复合基因。 功能、类别和数目 到目前为止在果蝇中已经发现的基因不下于1000个， 在大肠杆菌中已经定位的基因大约也有1000个，由基因决定的性状虽然千差万别，但是许多基因的原初功能却基本相同。 功能 1945年G.W.比德尔通过对脉孢菌的研究，提出了一个基因一种酶假设，认为基因的原初功能都是决定蛋白质的一级结构（即编码组成肽链的氨基酸序列）。这一假设在50年代得到充分的验证。 类别 60年代初F.雅各布和J.莫诺发现了调节基因。把基因区分为结构基因和调节基因是着眼于这些基因所编码的蛋白质的作用：凡是编码酶蛋白、血红蛋白、胶原蛋白或晶体蛋白等蛋白质的基因都称为结构基因；凡是编码阻遏或激活结构基因转录的蛋白质的基因都称为调节基因。但是从基因的原初功能这一角度来看，它们都是编码蛋白质。根据原初功能（即基因的产物）基因可分为：①编码蛋白质的基因。包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码作用于结构基因的阻遏蛋白或激活蛋白的调节基因。②没有翻译产物的基因。转录成为RNA以后不再翻译成为蛋白质的转移核糖核酸(tRNA)基因和核糖体核酸（rRNA）基因：③不转录的DNA区段。如启动区、操纵基因等等。前者是转录时RNA多聚酶开始和DNA结合的部位；后者是阻遏蛋白或激活蛋白和DNA结合的部位。已经发现在果蝇中有影响发育过程的各种时空关系的突变型，控制时空关系的基因有时序基因 、格局基因 、选择基因等（见发生遗传学）。 一个生物体内的各个基因的作用时间常不相同，有一部分基因在复制前转录，称为早期基因；有一部分基因在复制后转录，称为晚期基因。一个基因发生突变而使几种看来没有关系的性状同时改变，这个基因就称为多效基因。 数目 不同生物的基因数目有很大差异，已经确知RNA噬菌体MS2只有3个基因，而哺乳动物的每一细胞中至少有100万个基因。但其中极大部分为重复序列，而非重复的序列中，编码肽链的基因估计不超过10万个。除了单纯的重复基因外，还有一些结构和功能都相似的为数众多的基因，它们往往紧密连锁，构成所谓基因复合体或叫做基因家族。 克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境――子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。

你问的这个问题比较难回答, 将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接,然后引入寄主细胞,再筛选获得重组的克隆,按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类. cDNA克隆是以mRNA为原材料,经体外反转录合成互补的DNA(cDNA),再与载体DNA分子连接引入寄主细胞.每一cDNA反映一种mRNA的结构,cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布.特点是： ①有些生物,如RNA病毒没有DNA,只能用cDNA克隆； ②cDNA克隆易筛选,因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆,而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息； ③cDNA能在细菌中表达.cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息,只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息. 1.方法： (1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下,用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA. (2)载体DNA的选择： ①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子,DNA呈环状,大小为1-200千碱基对(kb).在细胞中以游离超螺旋状存在,很容易制备.质粒DNA可通过转化引入寄主菌.在细胞中有两种状态,一是“紧密型”；二是“松驰型”.此外还应具有分子量小,易转化,有一至多个选择标记的特点.质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段,适用于构建原核生物基因文库,cDNA库和次级克隆. ②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链,长约49kb,约含50个基因,其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的,分布在噬菌体DNA两端.中间是非必需区,进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子.λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库. M13噬菌体是一种独特的载体系统,它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌,但不裂解寄主菌.M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子,象质粒一样自主制复,制备方法同质粒.寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体,又能方便地制备单链DNA,用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交. ③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子.是噬菌体－质粒混合物.此类载体分子容量大,可携带45kb的外源DNA片段.也能象一般质粒一样携带小片段DNA,直接转化寄主菌.这类载体常被用来构建高等生物基因文库. (3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一,方法有：①粘性末端连接,DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端,用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端.在连接酶的作用下可恢复原样,有些限制性内切酶虽然识别不同顺序,却能产生相同末端.②平头末端连接,用物理方法制备的DNA往往是平头末端,有些酶也可产生平头末端.平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来,但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接.④人工接头分子连接,在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段,经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端. 连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率.以λ或Cos质粒为载体时,形成线性多连体DNA分子,载体与DNA片段的比率高些为佳.以质粒为载体时,形成环状分子,比率常为1∶1. (4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染,方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上,待DNA被吸收后铺在平板培养基上,再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子,通常重组分子的转化效率比非重组DNA低,原因是连接效率不高,有许多DNA分子无转化能力,而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大,转化困难.②转导,病毒类侵染宿主菌的过程称为转导,一般转导的效率比转化高.

克隆是英语单词clone的音译，clone源于希腊文klon，原意是指幼苗或嫩枝，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如杆插和嫁接。 如今，克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。克隆也可以理解为复制、拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同。 1997年 2月，绵羊“多利”诞生的消息披露，立即引起全世界的关注，这头由英国生物学家通过克隆技术培育的克隆绵羊，意味着人类可以利用动物身上的一个体细胞，产生出与这个动物完全相同的生命体，打破了千古不变的自然规律。 克隆一词是由clone音译而来，在音译名出现以前曾有一个意译名--无性繁殖系，指由单一细胞或共同祖先经有丝分裂得到的细胞群体或有机群体。 我们通过细胞培养可以得到一个细胞克隆。在微生物实验时，通过倒平皿，我们可以得到一个个的菌落，这些菌落其实就是细菌的克隆。可见克隆原来是个名词，指一群细胞或一群个体。随着分子生物学的发展，出现了核移植与基因工程之类的操作。核移植操作可以得到重建细胞，重建细胞可以繁殖成一个无性系；基因工程操作可以将某一被选定的基因拼接到质粒的复制子上，随着复制子的复制也能得到DNA分子的无性系。于是，有人就把这类操作称作克隆，即将clone一词由名词转化成动词，并将核移植称为 nuclear cloning（核克隆），通过基因工程得到DNA分子的无性系称为molecular cloning（分子克隆）。在这里克隆是一种实现无性繁殖（asexual reproduction）的操作，是一种显微操作或分子生物学操作，而不是一般意义上的无性繁殖（或无性繁殖操作）。这也许正是克隆一词能够存在而不被无性繁殖替代的原因。 多利羊又称克隆羊，其实是用核克隆技术产生的羊。有人说，只有多利羊才是真正的克隆羊，其他报导，如克隆猪、克隆牛等，由于它们是由胚胎细胞发育而成的，而胚胎细胞是有性繁殖产生的，所以，不是真正意义上的克隆。这是一种误解，是由于对有性过程在时间上把握不准所造成的。有性过程到受精卵、即合子形成时即告结束，合子分裂一旦开始即与有性过程无关了。如果说分裂后的胚胎细胞是有性繁殖产生的，那么，体细胞追究下去也是有性繁殖产生的。但事实上它们都是由合子经有丝分裂逐渐产生的。这就是说，有性繁殖实际上是经过一次有性过程和许多次无性过程，最后产生一个成活的后代而实现的。从胚胎中取出一个细胞使之发育成一个个体，这显然应属于无性繁殖。所以，从这个意义上讲，杜里舒是克隆技术（细胞克隆技术）的创始人，他的将两分裂球时期的细胞分开，使之发育成两个海胆的实验，是最早的克隆实验。而人类的同卵双生双胞胎，就是经天然细胞克隆化产生的。而克隆猪、克隆牛，如果是经核移植育成的，则不管供核细胞是来自早期胚胎细胞，还是已分化细胞，均属于真正意义上的克隆技术，而且是比杜里舒的水平高得多的克隆技术。 这里顺便提一下，因为中文词不能从词形上看出词性，所以，"细胞克隆"一词既可看成名词，又可看成动词。作为名词，细胞克隆指细胞的一个无性繁殖系。作为动词，它与核克隆、分子克隆对应，指用细胞去无性繁殖。为了与前者区别，作者建议该意思可用"细胞克隆化"或"细胞克隆技术"来表达。应用细胞克隆技术，可将细胞克隆成一个无性繁殖的细胞群体，如细胞培养中得到的克隆；也可使克隆后的细胞分化、发育成一个无性繁殖的个体，如杜里舒得到的海胆，某些研究者得到的克隆猪、克隆牛等。 多利羊与其它克隆动物的区别不在于是不是无性繁殖，而在于供核细胞的分化程度。早期胚胎细胞基本上是未分化细胞，即使是成形胚胎的已分化细胞，其细胞分化程度也远低于成年个体的已特化细胞。能将已特化细胞克隆成一个成活的个体，从理论上讲这是一次重大突破。这说明，已特化细胞的遗传结构即使发生了变化，这种变化也不是不可逆的，至少特化至乳腺上皮细胞时还是如此。至于神经细胞、脑细胞的特化是不是不可逆的，也可用核移植的方法检验。不过可以预料，克隆神经细胞，难度肯定要高于乳腺上皮细胞。 话说到这里你一定能理解，为什么说克隆不是复制的同义词了。提起复制，我们最熟悉的就是用复印机复印文件，通过复印得到的复制品与原件是完全一样的。DNA的复制结果就是如此，所以复制用于DNA的合成是一个非常确切的术语。而克隆则是一个过程，克隆产生的个体还需进行胚胎发育和胎后发育，克隆个体与原本之间有一段年龄差异。由于发育过程既受基因主宰又受环境调控，而克隆与其原本尽管基因相同，所处环境却绝不会相同，所以，克隆与其原本是不可能像复制品与原件那样完全一样的。再者，如果克隆个体是由核移植产生的，那么，由于重建细胞的细胞质并非来自原本，而我们知道细胞质中也有遗传物质，它们必然会对个体产生影响，所以，更不能把克隆个体看成是原本的复制品。 克隆个体可以看成是原本的再生，但不是原本的复活。因为：i.克隆个体和原本可以同时存在，ii.尽管从遗传结构上看克隆个体和原本是姐妹（兄弟）关系，但从年龄上看它们却是亲子关系。无性繁殖的生物仍然有"代"的概念，克隆个体也应有"代"的概念。而且，克隆个体的代间界限也是很容易划分的。由原本的体细胞产生的克隆个体是第1代，克隆个体成为成体后从其体细胞再克隆，即可得到第2代克隆个体。理论上讲，正如无性繁殖可以一代接一代地传下去一样，克隆个体的代数也是无止境的。只不过克隆不是自然进行的繁殖，而是人为操作，是否有必要一代代克隆下去值得怀疑。如果没有理论或实际上的意义，可能不会有人愿意做多代克隆的工作。

这个有多方面的原理：一个：PCR有错误,虽然这个错误率很低,普通的酶大概在千分之一,而高保真的在百万分之一,但毕竟有.二个：基因保存的问题：PCR产物当然也可以保存,但保存时间长了会不会出问题?能保存几年?克隆进质粒就不一样了,这个基本可以保存很久,哪一天想要这个基因,拿出来摇一小瓶就可以了.三个：单克隆性,PCR片断可能有长有短（还有突变）,而质粒就不一样了,可以挑单克隆,测序正确后就认为这是我们想要的基因.四个：做基因表达时连接方便.如果PCR产品上没有酶切位点,克隆载体上有,切下来可以连到表达载体上.象有些人做基因库时,都是克隆到载体上,肯定是这样有很多优点的.

限制性内切酶是分子克隆的“手术刀”，它能把DNA分子按照科学家的要求切成合适的片段。目的DNA片段切好后，把它导入病毒（如烟草花叶病毒）中，然后让病毒侵染植物、动物或微生物细胞，利用病毒合成的酶的整合性让目的DNA片段整合到目的细胞的基因组上，这样就完成了分子克隆。当然这只是对分子克隆的简单描述，其实分子克隆是非常复杂的，其中有很多技术瓶颈。

“克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。

分子克隆的受体细胞只要有哪两类一个典型的基因克隆实验,主要有以下操作和结果：（1）包括有目的基因在内的DNA片断插入另一个DNA分子（克隆载体,通常是环状的）,形成重组DNA分子.（2）重组DNA分子通过转化或其他类似的方法被导入受体细胞.大肠杆菌是使用较多的受体细胞.（3）在受体细胞中,克隆载体指导重组DNA分子复制,产生许多完全相同的拷贝.（4）当受体细胞分裂时,重组DNA分子的拷贝进入子细胞,克隆载体的复制将在子细胞中继续.（5）大量分裂的受体细胞形成克隆：一个细胞群体,其中每个细胞都含有许多重组DNA分子的拷贝.

分子遗传学是在分子水平上研究生物遗传和变异机制的遗传学分支学科。经典遗传学的研究课题主要是基因在亲代和子代之间的传递问题；分子遗传学则主要研究基因的本质、基因的功能以及基因的变化等问题。分子遗传学的早期研究都用微生物为材料，它的形成和发展与微生物遗传学和生物化学有密切关系。分子遗传学发展简史1944年，美国学者埃弗里等首先在肺炎双球菌中证实了转化因子是脱氧核糖核酸(DNA)，从而阐明了遗传的物质基础。1953年，美国分子遗传学家沃森和英国分子生物学家克里克提出了DNA分子结构的双螺旋模型，这一发现常被认为是分子遗传学的真正开端。1955年，美国分子生物学家本泽用基因重组分析方法，研究大肠杆菌的T4噬菌体中的基因精细结构，其剖析重组的精细程度达到DNA多核苷酸链上相隔仅三个核苷酸的水平。这一工作在概念上沟通了分子遗传学和经典遗传学。关于基因突变方面，早在1927年马勒和1928年斯塔德勒就用 X射线等诱发了果蝇和玉米的基因突变，但是在此后一段时间中对基因突变机制的研究进展很慢，直到以微生物为材料广泛开展突变机制研究和提出DNA分子双螺旋模型以后才取得显著成果。例如碱基置换理论便是在T4噬菌体的诱变研究中提出的，它的根据便是DNA复制中的碱基配对原理。美国遗传学家比德尔和美国生物化学家塔特姆根据对粗糙脉孢菌的营养缺陷型的研究，在40年代初提出了一个基因一种酶假设，它沟通了遗传学中对基因的功能的研究和生物化学中对蛋白质生物合成的研究。按照一个基因一种酶假设，蛋白质生物合成的中心问题是蛋白质分子中氨基酸排列顺序的信息究竟以什么形式储存在DNA分子结构中，这些信息又通过什么过程从DNA向蛋白质分子转移。前一问题是遗传密码问题，后—问题是蛋白质生物合成问题，这又涉及转录和翻译、信使核糖核酸(mRNA)、转移核糖核酸(tRNA)和核糖体的结构与功能的研究。这些分子遗传学的基本概念都是在20世纪50年代后期和60年代前期形成的。分子遗传学的另一重要概念——基因调控在1960～1961年由法国遗传学家莫诺和雅各布提出。他们根据在大肠杆菌和噬菌体中的研究结果提出乳糖操纵子模型。接着在1964年，又由美国微生物和分子遗传学家亚诺夫斯基和英国分子遗传学家布伦纳等，分别证实了基因的核苷酸顺序和它所编码的蛋白质分子的氨基酸顺序之间存在着排列上的线性对应关系，从而充分证实了一个基因一种酶假设。此后真核生物的分子遗传学研究逐渐开展起来。分子遗传学的内容用遗传学方法可以得到一系列使某一种生命活动不能完成的突变型，例如不能合成某一种氨基酸的突变型、不能进行DNA复制的突变型、不能进行细胞分裂的突变型、不能完成某些发育过程的突变型、不能表现某种趋化行为的突变型等。不过许多这类突变型常是致死的，所以各种条件致死突变型，特别是温度敏感突变型常是分子遗传学研究的重要材料。在得到一系列突变型以后，就可以对它们进行遗传学分析，了解这些突变型代表几个基因，各个基因在染色体上的位置，这就需要应用互补测验，包括基因精细结构分析等手段。抽提、分离、纯化和测定等都是分子遗传学中的常用方法。在对生物大分子和细胞的超微结构的研究中还经常应用电子显微镜技术。对于分子遗传学研究特别有用的技术是顺序分析、分子杂交和重组DNA技术。核酸和蛋白质是具有特异性结构的生物大分子，它们的生物学活性决定于它们的结构单元的排列顺序，因此常需要了解它们的这些顺序。如果没有这些顺序分析，则基因DNA和它所编码的蛋白质的线性对应关系便无从确证；没有核酸的顺序分析，则插入顺序或转座子两端的反向重复序列的结构和意义便无从认识，重叠基因也难以发现。分子遗传学是从微生物遗传学发展起来的。虽然分子遗传学研究已逐渐转向真核生物方面，但是以原核生物为材料的分子遗传学研究还占很大的比重。此外，由于微生物便于培养，所以在分子遗传学和重组DNA技术中，微生物遗传学的研究仍将占有重要的位置。分子遗传学方法还可以用来研究蛋白质的结构和功能。例如可以筛选得到一系列使某一蛋白质失去某一活性的突变型。应用基因精细结构分析可以测定这些突变位点在基因中的位置；另外通过顺序分析可以测定各个突变型中氨基酸的替代，从而判断蛋白质的哪一部分和特定的功能有关，以及什么氨基酸的替代影响这一功能等等。生物进化的研究过去着眼于形态方面的演化，以后又逐渐注意到代谢功能方面的演变。自从分子遗传学发展以来又注意到DNA的演变、蛋白质的演变、遗传密码的演变以及遗传机构包括核糖体和tRNA等的演变。通过这些方面的研究，对于生物进化过程将会有更加本质性的了解。分子遗传学也已经渗入到以个体为对象的生理学研究领域中去，特别是对免疫机制和激素的作用机制的研究。随着克隆选择学说的提出，目前已经确认动物体的每一个产生抗体的细胞只能产生一种或者少数几种抗体，而且已经证明这些细胞具有不同的基因型。这些基因型的鉴定和来源的探讨，以及免疫反应过程中特定克隆的选择和扩增机制等既是免疫遗传学也是分子遗传学研究的课题。将雌性激素注射雄鸡，可以促使雄鸡的肝脏细胞合成卵黄蛋白。这一事实说明雄鸡和雌鸡一样，在肝脏细胞中具有卵黄蛋白的结构基因，激素的作用只在于激活这些结构基因。激素作用机制的研究也属于分子遗传学范畴，属于基因调控的研究。个体发生过程中一般并没有基因型的变化，所以发生问题主要是基因调控问题，也属于分子遗传学研究范畴。分子遗传学研究的方法，特别是重组DNA技术已经成为许多遗传学分支学科的重要研究方法。分子遗传学也已经渗入到许多生物学分支学科中，以分子遗传学为基础的遗传工程则正在发展成为一个新兴的工业生产领域。

长片段用重组质粒克隆法.因为一般PCR无法扩增大至8Kb以上的片段.,5,该用PCR就用PCR，该用重组质粒分子克隆法就用重组质粒分子克隆法,2,PCR是大量克隆的时候才用，重组质粒分子法有更强的针对性和目标性。比如，用后者得到目的基因，如果需要更多，则用前者大量克隆。,2,PCR简单快速,0,如果经过酶切可以获得想要的目的基因和合适的粘性末端，就采用重组质粒，这样变异的可能性很少，用PCR扩增的时候，即使用高保真酶也会有万分之几的出错率，实在不行才用PCR。,0,pcr的主要意义在于随意的增加酶切位点，方便克隆。如果通过酶切质粒能产生可用的位点就不用pcr了，毕竟pcr会有突变的,0,

1、PCR产物回收时应该注意哪些问题a.电泳检测时的缓冲液需要新鲜配制，以防止用重复利用的缓冲液时含有其它杂带b.电泳时间要尽量短，以能分离出条带为准c.切胶时紫外线照射时间要尽量短2、纯化回收PCR产物的目的是什么a.用于后续研究，如连接克隆、表达等b.纯化回收产物可以消除PCR反应的其它杂质，如聚合酶，dNTP，引物等c.可以得到浓度较高的目的基因3、若DNA纯化回收后的电泳结果为两条带是怎么回事，怎么解决a.如果你目的条带较大（大于3KB），有可能是回收过程中基因断裂了，这一点你可以通过Marker来判断。解决方法是回收过程动作要尽量轻柔b.如果不是基因断裂，考虑可能是回收过程中引物没有除去。如果两条带中有目的带，大可不必在意另一条带的存在4、DNA酶切后回收有哪些方法DNA酶切后一般不进行电泳回收，因为酶切反应体系一般比较小，且回收率比较低。为了不影响后续操作，一般的处理方法是使核酸内切酶失活，常用的是加热法5、制备感受态细胞时的关键步骤具体步骤我就不写了，比较关键的是：a.不要直接用甘油保藏的菌种，要先进行平板划线分离，挑选单菌落b.进行1%接种后，一定要控制好菌浓度，测OD600大概在0.4左右（不同菌株略微有差异）c.最主要的是，所有操作一定要在低温条件下进行6、SDS－PAGE鉴定没有蛋白质区带 是怎么回事a.如果连Marker带也没有，考虑是缓冲液或胶的问题b.如果Marker带正常，可能的原因是样品里不含蛋白质或含量太低7、为何有时候会出现洗脱的蛋白失活的现象可能的原因是洗脱过程含有某些试剂，比如EDTA，强酸等

克隆的本意是无性繁殖，分子克隆是通过人工构建出一段DNA序列，是完全属于无中生有这个概念的，只是分子克隆是在分子层面上的克隆羊的操作也是属于无性繁殖，即用体细胞核移植入去核卵细胞，这是生物水平上的克隆两个的区别是在不同层面上，本质上都是无性繁殖

你问的这个问题比较难回答，以下希望对你有帮助 将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。 cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。1.方法：(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。 M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。

“克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。

基因克隆基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。 基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一s次完整地建立起了基因克隆体系。一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等 克隆技术 现在已经克隆什么？蛙:1952年，未成功。鲤鱼:1963年，中国科学家童第周早在1963年就通过将一只雄性鲤鱼的遗传物质注入雌性鲤鱼的卵中从而成功克隆了一只雌性鲤鱼，比多利羊的克隆早了33年。但由于相关论文是发表在一本中文科学期刊，并没有翻译成英文，所以并不为国际上所知晓。（源自：PBS）古代神话里孙悟空用自己的汗毛变成无数个小孙悟空的离奇故事，表达了人类对复制自身的幻想。1938 年，德国科学家首次提出了哺乳动物克隆的思想，1996年，体细胞克隆羊“多利”出世后，克隆迅速成为世人关注的焦点，人们不禁疑问：我们会不会跟在羊的后面？这种疑问让所有人惶惑不安。然而，反对克隆的喧嚣声没有抵过科学家的执着追求，伴随着牛、鼠、猪乃至猴这种与人类生物特征最为相近的灵长类动物陆续被克隆成功，人们已经相信，总有一天，科学家会用人类的一个细胞复制出与提供细胞者一模一样的人来，克隆人已经不是科幻小说里的梦想，而是呼之欲出的现实。目前，已有三个国外组织正式宣布他们将进行克隆人的实验，美国肯塔基大学的扎沃斯教授正在与一位名叫安提诺利的意大利专家合作，计划在两年内克隆出一个人来。由于克隆人可能带来复杂的后果，一些生物技术发达的国家，现在大都对此采取明令禁止或者严加限制的态度。克林顿说：“通过这种技术来复制人类，是危险的，应该被杜绝！”全国政协委员、中国科学院国家基因研究中心主任洪国藩也明确表示反对进行克隆人的研究，而主张把克隆技术和克隆人区别开来。克隆人，真的如潘多拉盒子里的魔鬼一样可怕吗？实际上，人们不能接受克隆人实验的最主要原因，在于传统伦理道德观念的阻碍。千百年来，人类一直遵循着有性繁殖方式，而克隆人却是实验室里的产物，是在人为操纵下制造出来的生命。尤其在西方，“抛弃了上帝，拆离了亚当与夏娃”的克隆，更是遭到了许多宗教组织的反对。而且，克隆人与被克隆人之间的关系也有悖于传统的由血缘确定亲缘的伦理方式。所有这些，都使得克隆人无法在人类传统伦理道德里找到合适的安身之地。但是，正如中科院院士何祚庥所言：“克隆人出现的伦理问题应该正视，但没有理由因此而反对科技的进步”。人类社会自身的发展告诉我们，科技带动人们的观念更新是历史的进步，而以陈旧的观念来束缚科技发展，则是僵化。历史上输血技术、器官移植等，都曾经带来极大的伦理争论，而当首位试管婴儿于1978年出生时，更是掀起了轩然大波，但现在，人们已经能够正确地对待这一切了。这表明，在科技发展面前不断更新的思想观念并没有给人类带来灾难，相反地，它造福了人类。就克隆技术而言，“治疗性克隆”将会在生产移植器官和攻克疾病等方面获得突破，给生物技术和医学技术带来革命性的变化。比如，当你的女儿需要骨髓移植而没有人能为她提供；当你不幸失去5岁的孩子而无法摆脱痛苦；当你想养育自己的孩子又无法生育……也许你就能够体会到克隆的巨大科学价值和现实意义。治疗性克隆的研究和完整克隆人的实验之间是相辅相成、互为促进的，治疗性克隆所指向的终点就是完整克隆人的出现，如果加以正确的利用，它们都可以而且应该为人类社会带来福音。科学从来都是一把双刃剑。但是，某项科技进步是否真正有益于人类，关键在于人类如何对待和应用它，而不能因为暂时不合情理就因噎废食。克隆技术确实可能和原子能技术一样，既能造福人类，也可祸害无穷。但“技术恐惧”的实质，是对错误运用技术的恐惧，而不是对技术本身的恐惧。目前，世界各国对克隆人的态度多有“暧昧”，英国去年以超过三分之二的多数票通过了允许克隆人类早期胚胎的法案，而在美国、德国、澳大利亚，也逐渐听到了要求放松对治疗性克隆限制的声音。可以说，哪一个国家首先掌握了克隆人的技术，就意味着这个国家拥有了优势和主动，而起步晚的国家可能因此而遭受现在还无法预测的损失。如同当年美国首先掌握了原子能技术，虽然这项技术从一开始便展现着它罪恶的一面，但后来各国又不得不加紧这方面的研究和实验。单从这个角度上讲，对克隆人实验采取简单否定的态度也是值得探讨的。至于人们担忧克隆技术一旦成熟，会有用心不良者克隆出千百个“希特勒”，或者克隆出另一个名人来混淆视听，则是对克隆的误解。克隆人被复制的只是遗传特征，而受后天环境里诸多因素影响的思维、性格等社会属性不可能完全一样，即克隆技术无论怎样发展，也只能克隆人的肉体，而不能克隆人的灵魂，而且，克隆人与被克隆人之间有着年龄上的差距。因此，所谓克隆人并不是人的完全复制，历史人物不会复生，现实人物也不必担心多出一个“自我”来。绵羊:1996年，多利（Dolly）猕猴:2000年1月，Tetra，雌性猪:2000年3月，5只苏格兰PPL小猪；8月，Xena，雌性牛:2001年，Alpha和Beta，雄性猫:2001年底，CopyCat（CC），雌性鼠:2002年兔:2003年3-4月分别在法国和朝鲜独立地实现；骡:2003年5月，爱达荷Gem，雄性；6月，犹他先锋，雄性鹿:2003年，Dewey马:2003年，Prometea，雌性狗:2005年，韩国首尔大学实验队，史努比（Snoopy)猪:2005年8月8日，中国第一头供体细胞克隆猪尽管克隆研究取得了很大进展，目前克隆的成功率还是相当低的：多利出生之前研究人员经历了276次失败的尝试；70只小牛的出生则是在9000次尝试后才获得成功，并且其中的三分之一在幼年时就死了；Prometea也是花费了328次尝试才成功出生。而对于某些物种，例如猫和猩猩，目前还没有成功克隆的报道。而狗的克隆实验，也是经过数百次反覆试验再得来的成果。多利出生后的年龄检测表明其出生的时候就上了年纪。她6岁的时候就得了一般老年时才得的关节炎。这样的衰老被认为是端粒的磨损造成的。端粒是染色体位于末端的。随着细胞分裂，端粒在复制过程中不断磨损，这通常认为是衰老的一个原因。然而，研究人员在克隆成功牛后却发现它们实际上更年轻。分析它们的端粒表明它们不仅是回到了出生的长度，而且比一般出生时候的端粒更长。这意味着它们可以比一般的牛有更长的寿命，但是由于过度生长，它们中的很多都过早夭折了。研究人员相信相关的研究最终可以用来改变人类的寿命。 克隆人违背人类生命伦理 现代科技，特别是现代生命科技，要不要尊重伦理学原则，要不要倾听伦理的声音？有关专家针对一些科学狂人在美国秘密克隆人的做法指出——克隆人违背人类生命伦理，存在着极大的争议和难以解决的一系列法律等问题。 我国多家媒体近日转载了国外媒体报道的一条惊人消息：一群受邪教组织操纵的科学狂人，正在美国内华达州大漠深处进行着一项克隆人的秘密实验。他们根据英国科学家创造世界第一只克隆羊“多利”的同样原理，从一个今年2月份夭折的10个月大的美国女婴身上提取细胞制造克隆人。据称，“如果进展顺利的话，世界上第一个克隆人将于明年年底诞生。” 消息披露后，克隆技术及其带来的伦理学问题再一次成为人们议论的热点。如果这一消息属实的话，应当如何看待此事，如何正确地评价和思考这个问题，记者为此走访了国家人类基因组南方研究中心伦理、法律和社会部主任、上海社科院哲学研究所沈铭贤研究员。 沈教授说：自1997年英国罗斯林研究所成功地克隆出“多利”羊后，国外不断有人在名利的驱使下，提出并试图从事克隆人的研究。尽管各国政府明令禁止，但与克隆人有关的报道近两年来不止一次见诸报端。但是，这次速度这么快，又与邪教组织有关联，确实令人感到震惊。 痛失爱女的父母，希望通过克隆技术使女儿复活，这种心情是可以理解的。但如果科学家借此进行克隆人的实验，就值得讨论了。沈教授认为：即使撇开邪教不谈，这种做法也是不可取的。就“克隆人”这一个体而言，他会生活在“我是一个死去的人的复制品” 这样一个阴影中，这对他的心理会产生什么样的影响？ 按照生命伦理学的观点，科学技术要从长远利益出发，造福整个人类。它必须遵循“行善、不伤害、自主和公正”这四项国际公认的伦理原则。“多利”羊的克隆成功经过了200多次的失败，出现过畸形或夭折的羊。而克隆人更为复杂，无疑会遇到更多的失败，如果制造出不健康、畸形或短寿的人，将是对人权的一种侵犯。沈教授指出：现在科学界把克隆分为治疗性克隆和生殖性克隆两种。前者是利用胚胎干细胞克隆人体器官，供医学研究、解决器官移植供体不足问题，这是国际科学界和伦理学界都支持的，但有一个前提，就是用于治疗性克隆的胚胎不能超出妊娠14天这一界限。而对于生殖性克隆，即通常所说的克隆人，由于它在总体上违背了生命伦理原则，所以，科学家的主流意见是坚决反对的。联合国教科文组织、世界卫生组织和国际人类基因组伦理委员会和各国政府也都非常明确地表示，反对生殖性克隆。即使克隆人真的诞生了，我们还是要坚持这一基本立场。 现代科学技术是一把双刃剑，在其造福人类的同时也会带来一些负面效应。这就向我们提出了一个问题：现代科技，特别是现代生命科技，要不要尊重伦理学原则，要不要倾听伦理的声音？沈教授指出：现在有些科学家提出，只要科学上有可能做到的，就应该去做。事实上，这是错误的观点。如果技术上我们能制造出一种严重危害人类的超级生命，难道也可以去制造吗？一些科学狂人正是打着“科学自由”的旗号，去做一些危害人类的事。因此，我们要警惕现代科学技术被一些别有用心的人利用。另外，也不能把科学自由和伦理道德对立起来。现代生命科学发展的事实表明，伦理的规范和引导，并没有束缚科学的发展，倾听伦理的声音，有利于科学更健康、顺利地发展。选自2000年11月8日《文汇报》

“克隆”一词最初源自英文clone的音译，科学家们常用它来指由无性繁殖得到的一群细胞，即不是通过精子和卵子配合而繁殖得到的一群细胞或细胞系。克隆的本质就是无性繁殖。我们知道，哺乳类动物和我们人类都是通过性细胞(精子和卵子）结合成合子(受精卵），再由合子分化发育而来的。而通过克隆方法得到的细胞群或由未受精的卵细胞分化发育而来的个体，则不存在性细胞的结合问题。我们先以单克隆抗体为例来说明这一点。科学家们先通过某种方法获得一只分泌一种抗体的杂交瘤细胞，然后给予充分的条件让这个细胞分裂、繁殖，成为一群细胞。这群细胞或称细胞系，都是一个细胞的后代，具有相同的性状，因此都能够产生具有产生一种抗体。这群由一个单细胞经多次分裂繁殖而来的细胞群被称为单一的细胞克隆。由此产生的抗体被称为单克隆抗体。另一种情况是分子克隆，分子克隆实际上是基因克隆技术的别称，指的是通过一定的方法得到含某个特定基因的单一细胞或细菌，再进行大量繁殖，就得到了包含该基因的单一细胞克隆。这种细胞克隆即可以提供足量的目的基因供我们研究，也可以用于制造我们所需的该基因的蛋白质产物。单克隆抗体技术和基因克隆技术都是20世纪伟大的科学发明，它们的创立者都为此获得了诺贝尔奖。这两种技术操作工艺上差别极大，可它们都有一个共同的特点，就是要筛选出通过无性繁殖而来的单一细胞群。世界卫生组织在关于克隆的非正式声明中定义：克隆为遗传上同一的机体或细胞系(株）的无性生殖。根据上述的诠释和定义，我们将克隆分为4个层次：微生物或细胞、植物、动物和人，以及在自然界发生的克隆和只有人工条件下发生的克隆(见下表）。克隆的4个层次层次可发生于自然条件下可发生于人工条件下微生物可可正常机体细胞部分可可(即“永生细胞株”)癌细胞可可(即“永生细胞株”)植物可可动物(胚胎植入前分裂)可可动物(通过体细胞发育)不可可人(胚胎植入前分裂)可可人(通过体细胞发育)不可可2.克隆本身没有什么神秘随着生物科学的发展，克隆的内涵也在不断扩大，只要是从一个细胞得到两个以上的细胞、细胞群或生物体，就可以称为克隆。由此而分化所得到的细胞、生物体就是克隆细胞、克隆体。从基因角度看，克隆体和母体的遗传物质是完全相同的。英国科学家产生克隆羊所使用的技术就相应地被称为克隆技术，该技术是基因工程技术的一个重要组成部分。植物的克隆技术比较简单，发现和使用较早。这是因为植物细胞是所谓的全能细胞，经过适当培育，即可以发育成一完整植株。所以，克隆植物是相当普通的一件事。而动物的克隆技术发展较慢，这是由于动物的体细胞并不具有全能性。使用已经高度分化的动物体细胞无法直接培育出克隆动物。几十年来，科学家们一直孜孜不倦地探讨哺乳动物的克隆问题。近十几年来在此领域中已取得了不少进展。克隆的手段有多种类型，包括胚胎切割、细胞核移植等。在“多莉”降生之前，细胞核移植就是用机械的方法，把一个称之为“供体细胞”的细胞核移入另一个去除了细胞核的细胞质中。核移植采用的供体细胞有两种，一种是胚胎细胞，一种是体细胞，但二者有着本质的区别。胚胎细胞是由受精卵发而成的胚胎的细胞，故胚胎细胞克隆属于异体复制，“复制”的是提供受精卵胚胎的动物的下一代，相当于生了个“多胞胎”；而体细胞克隆属于自体复制，“拷贝”的是提供体细胞的动物本身。从技术操作的难度来看，前者难度小，后者难度大。在“多莉”降生之前，世界各国克隆动物都是用胚胎细胞作为供体细胞的，而胚胎细胞是有全能性的。就是说，把胚胎细胞的细胞核移植到去除了细胞核的卵细胞后，还能形成完整的个体，恢复到受精卵状态，从而发育成生物。英国科学家这次是用体细胞作为供体细胞，但体细胞是失掉了全能性的。他们用特殊方法处理后使体细胞恢复了全能性，小绵羊“多莉”也就成为世界上用体细胞克隆哺乳动物获得成功的第一只克隆动物。与以往的克隆动物最大的不同在于，它是世界上第一只只有母亲、没有父亲的哺乳动物。这就不难理解，为何以前科学家已用胚胎细胞克隆培育出了免、牛、羊、猪等但都没有引起轰动，而“多莉”一下子成为全世界关注的焦点，被国际科技界称之为20世纪最重要的科技成果之一。

克隆的定义是独立细胞繁殖系，指后代完全由一个细胞复制，具有完全相同的遗传物质。 一个细菌经过20分钟左右就可一分为二；一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就生根；一株草莓依靠它沿地“ 爬走”的匍匐茎，一年内就能长出数百株草莓苗 …… 凡此种种，都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代，这就是无性繁殖，无性繁殖的英文名称叫“Clone”，译音为“克隆”，实际上，英文的“Clone”起源于希腊文 “Klone”，原意是用“嫩枝”或“插条”繁殖。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡来自一个祖先，经过无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。 这种来自一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。自然界的许多动物，在正常情况下都是依靠父方产生的雄性细胞（精子）与母方产生的雌性细胞（卵子）融合（受精）成受精卵（合子），再由受精卵经过一系列细胞分裂长成胚胎，最终形成新的个体，这种依靠父母双方提供性细胞、并经两性细胞融合产生后代的繁殖方法就叫做有性繁殖，但是，如果我们用外科手术将一个胚胎分割成两块，四块、 八块……最后通过特殊的方法使一个胚胎长成两个、四个，八个…… 生物体，这些生物体就是克隆个体，而这两个、四个、八个……个体就叫做无性繁殖系（也叫克隆）。 克隆是英文Clone一词的音译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞丝分裂）可连续传代并形成的群体，常用于细胞水平的描述。克隆技术（Cloning）则指由众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或细胞的技术操作。 克隆羊的产生及其技术 哺乳动物的克隆是克隆概念在个体水平上的应用，即通过无性繁殖所产生的动物个体或群体，它们具有完全相同的遗传背景。同卵孪生的遗传背景是相同的，但它们来自有性繁殖，即由受精卵发育而成。同一胚胎分割产生的个体遗传背景亦是相同的，但来源于未分化的多能胚胎干细胞，是有性繁殖的继续。真正的克隆个体，其遗传背景除与单供体相同外，其遗传物质应来源于已分化的体细胞，而非胚胎细胞。哺乳动物个体的克隆技术是若干细胞工程技术的组合和优化。首先是采集卵子，并通过显微操作使核质分离，使卵失去原有的遗传物质，仅余细胞质；其次采用细胞融合技术，使供体的乳腺组织细胞的核移入到无核卵细胞中；核质融合的卵通过体外培养发育为早期胚胎并移植入假孕母体子宫中发育为个体。这里至少采用了核质分离、细胞融合、体外培养及胚胎移植等技术，而且必须密切衔接，充分优化。 细胞克隆技术 来源：公众科技网 细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养，既包括微生物细胞的培养，也包括动物和植物细胞及动植物组织的培养。 细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。 细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂(如琼脂)或固体培养物(如麸皮、大米等)便成为固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。 动物克隆技术 来源：公众科技网 高等动物特别是哺乳类以及人类的卵细胞最先是由卵巢中的卵原细胞发生而来的。卵原细胞与我们身体的体细胞，(以别于生殖细胞)一样具有双份染色体，即为二倍体细胞。它经过数次分裂，最终成为只含数目为体细胞一半的染色体(故称单倍体)的成熟卵细胞。当然，这种卵细胞是不可能发育成为一个新个体的，它必须与含有同样只有单倍染色体的精子结合，重新成为双倍体的受精卵才能继续发育下去，形成一个新生命。这个新生命已分别接受母方卵细胞与父方精子各一半的遗传特性了。因此，哺乳类的这种繁殖方式称为有性繁殖。 对于动物克隆来说，就是不需要精子参与，细胞或动物个体数量就可不断地繁殖增多，好像是一种工业产品按一定模型不断复制一样，以这种方式复制出来的动物外形、性能和基因类型等完全一样。 目前，克隆哺乳动物的方法由简单到复杂有几种：胚胎分割、人工授精与胚胎移植、动物细胞核移植、雌核生殖

我们现在都已经换成同源重组的方法进行一步法克隆了，只要37℃ 30min就可以进行转化了，也可以放在-20℃保存，有时间了再转化就可以了。你用的是传统的酶切连接方法进行克隆的，不能保存不转化。

克隆（Clone）在广义上是指利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组后代的过程。在园艺学上，克隆是指通过营养繁殖产生的单一植株的后代，很多植物都是通过克隆这样的无性生殖方式从单一植株获得大量的子代个体。在生物学上，是指选择性地复制出一段DNA序列（分子克隆）、细胞（细胞克隆）或是个体（个体克隆）。

PCR在进行碱基配对的时候,有一定的错配率,于是pcr的DNA链越长,出错的碱基数目就越多.既然你想要进行基因测序,肯定是克隆出的结果越准确越好啊使用分子克隆技术的好处是,它是通过生物体自身的DNA复制机制来进行的.我们一般都用细菌来进行克隆,细菌本身有纠错机制,当碱基配对出错时候,细菌中的一些酶会对其进行校对,使得错配率降低100倍.

【答案】：A所谓克隆就是来自同一始祖的相同拷贝的集合，获取同一拷贝的过程称为克隆化，亦称为无性繁殖。从遗传学上讲，分子克隆专指DNA克隆。

基因重组一般可以分为两类，即同源重组和非同源重组。同源重组也称一般重组，多发生于两条DNA链的同源区，同源性愈大，重组愈频繁。非同源重组又包括位点专一重组和非常规重组，位点专一重组只需要很少的顺序同源性，它发生在两种DNA的专一位点

“克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 参考资料：http://zhidao.baidu.com/question/2003221.html

克隆（clone)是指无性繁殖。从对象来说，有分子，细胞，器官，个体几个层次，各自都有对应的实验技术。分子克隆，主要是指DNA的重组技术。细胞克隆，即细胞体外培养。器官克隆，包括组织工程，和干细胞体外培养技术。目前除了皮肤，其他器官也没有完全实现。个体克隆，如克隆羊，目前可以用体细胞的细胞核与去核的卵细胞融合后实现。

分子克隆，转化后如果是过夜就取出来的平板，菌落可能不会长得很大。主要还是要看放置一段时间后，菌落形态是否有变化（可以在37C继续培养，如果怕长过了，也可以放在室温下）。如果还是保持原来的状态，或者长出来更多的小菌落，则很有可能是污染。如果菌落明显在生长，而且透明度也变化了，应该是正常生长。另外，如果这一批菌生长速度明显低于平常，需要考虑是不是抗性加高了，或者IPTG加高了，抑制了菌的生长。最后如果形态与平常相似了，再做做PCR，抽质粒酶切确认一下。

克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。

、T4连接酶介导的DNA克隆传统的分子克隆，通常需要使用相同的限制性内切酶酶切载体和目的片段，使得载体和片段产生相同的粘性或平末端，使用T4 DNA连接酶对其进行连接，转化，挑取阳性克隆，得到重组质粒为了更方便的对DNA进行克隆，后续又将克隆的载体进行了简化，出现了T载体，这样就可以不用酶切，直接将片段连接到载体上，以便于DNA的保存及后续扩增。以TA克隆为例来介绍整个连接过程。常规的连接是一个三分子共同反应的过程（图1），载体、片段和连接酶碰撞在一起，发生反应，完成连接过程。为了得到更多的阳性克隆，我们会倾向于加入更多的片段、载体和连接酶，以提高分子碰撞机率，但同时也会遇到一个问题，过高的DNA浓度和T4连接酶浓度会增加分子间相互作用促进串联体和载体自连的形成，反而导致片段和酶的利用率降低。所以在进行TA克隆时，并不是DNA和酶加入的越多越好。使用这种方法进行克隆，如果需要连接平末端的DNA片段（比如Pfu类酶扩增的片段），则需要进行额外的加A尾反应（可以使用Taq酶完成加A）二、EASY克隆EASY克隆的方法主要依赖于载体上所携带的拓扑异构酶。拓扑异构酶的生理作用主要体现在DNA复制的过程中，同时具有内切酶和连接酶的功能：酶切释放DNA复制过程中产生的螺旋力；在复制完成后，将缺口补上，完成DNA的复制。很多拓扑异构酶无明显特异性结合DNA序列的规律，直到1990年，科学家舒曼在牛痘病毒中发现了一种拓扑异构酶能特异性识别C/TCCTT序列（图2），并对后面序列进行切割和连接，才使得拓扑异构酶用于DNA克隆成为可能。图2 左图：拓扑异构酶识别特定的序列；右图：拓扑异构酶介导的基因克隆EASY克隆就是基于这一原理，将T碱基通过磷酸键与拓扑异构酶第274位酪氨酸结合，使拓扑异构酶和载体偶联在

直接用DNA的分子扩增技术就可以了，就是PCR技术：使DNA分子先解螺旋，然后以得到的单恋为模版进行复制。步骤：　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA　　2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。　　3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。　　每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

NLS 具有与核输出信号 nuclear export signal (NES) 相反的功能，后者针对细胞核外的蛋白质。** Tm值与退火温度： PCR产物纯化的方法 在PCR扩增完成后，反应体系中除了DNA片段，还存在离子、dNTP、引物及聚合酶等物质，这些物质会对后续的实验（克隆、测序等）产生不利的影响，需要对产物进行纯化回收。 回收DNA片段有两种途径，即直接回收和从凝胶中回收，每种纯化途径都有相对应的试剂盒。 在 PCR 扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测，在条带单一无其他杂带的情况下，可以用产物纯化试剂盒对 PCR 扩增产物直接进行纯化。目前市面上的产物纯化试剂盒大多是利用吸附柱的方法，其实验过程为“吸附-洗杂-洗脱”：将 PCR 产物置于 DNA 纯化柱中，产物中 DNA 片段会吸附于 DNA纯化柱上，利用 wash buffer 通过一系列快速漂洗-离心的步骤，将引物、核苷酸、蛋白、酶等杂质去除（洗杂需重复多次以尽可能的洗去杂质，提高产物纯度），最后用洗脱液将 DNA 片段洗脱。 如果电泳检测结果存在非特异性条带，则需要通过切胶将目的条带分离出来，随后利用胶回收试剂盒对凝胶回收纯化。凝胶回收纯化与产物直接纯化相比多了一个溶胶的过程，两者纯化原理基本相同。 产物直接纯化与凝胶回收纯化区别产物直接纯化的回收率比胶回收高，但只适用于电泳结果为单一条带的情况。凝胶回收纯化需要先跑胶然后将目的条带切胶回收，纯化产物更纯净。 PCR 产物纯化回收有两个重要的技术指标：纯度和回收率。回收率不理想会使工作量大大的增加， 如果质粒DNA打算用作PCR模板，建议将其用作线性DNA。圆形质粒大多具有超螺旋结构，其目的序列不易被引物和聚合酶获得。（If the plasmid DNA is intended for use as a PCR template, it is recommended to use it as a linear DNA. A circular plasmid mostly has a supercoiled conformation, where the target sequence is less accessible for primers and for polymerase.） 普通taq聚合酶： 只有5"-3"端聚合酶活性和5"-3"端外切酶活性。 高保真taq聚合酶： 还有3"-5"端外切酶活性，可以进行矫正。 因为TAE缓冲液的pH约为8.0，而DNA分子在pH为8.0时，磷酸基团全部解离，而碱基几乎不解离，从而使DNA分子带上负电荷，在电场的作用下会向正极移动 总结2：胶染料（Gelstain）和上样缓冲液（10x loading buffer） 1、胶染料作用：对核酸进行染色，使核酸分子在紫外光照射下能够被检测到。 2、上样缓冲液： ①溴酚蓝：可以指示电泳进度，当溴酚蓝染料移动到距离凝胶前沿1~2cm处停止电泳；②甘油、蔗糖：增加样品密度，使样品沉入胶孔。 Gibson无缝连接技术: poly(A) tail：真核生物mRNA的3"端都有一段） ，这种尾巴不由基因编码，而是在转录后加到mRNA上的。加尾过程受位于终止密码3"端的加尾信号序列所控制。 在结构基因的最后一个外显子中有一个保守的AATAAA序列，此位点下游有一段GT丰富区或T丰富区，这两部分序列共同构成poly(A)加尾信号。 哺乳动物细胞表达质粒主要是用于转录出mRNA， 常用的转录终止子有 SV40, hGH, BGH, 和rbGlob ，同时包含有AAUAAA基序促进聚腺苷酸化和转录终止。除了上面列出的， SV40 late polyA 和 rbGlob polyA 被认为可以更加有效的终止转录。 有一点特别需要注意的是，哺乳动物细胞的 poly(A) 信号和病毒包装系统的联合使用可能会降低病毒滴度，延长转录本的寿命，所以处理的时候需要谨慎一点。因为这个原因，病毒载体通常会使用其他非poly(A)的转录本稳定元件和出核元件，如 WPRE和CTE 或者使用其他弱的poly(A)信号，如 BGH 。 聚腺苷酸化一般认为是真核细胞特有的加工过程，但是原核细胞中它也会在RNA产物的末尾加上聚腺苷酸。与真核细胞不同的是，在真核细胞中poly(A)通常加在特定的poly(A)信号位点处，而在原核细胞中这个位点不是特异的，比较随机。poly(A)尾巴会加快RNA的降解，这一点与真核细胞也是不同的。由于加poly(A)尾没有特异性，所以poly(A)尾通常被认为是用来调节细胞内的RNA浓度水平，并作为一种质量控制机制来清楚错误折叠的RNA。

条件：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见 的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。扩展资料：分子克隆的意义和应用：1、在医学方面利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。2、在基因治疗方面通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。3、在工业生产方面以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。4、在农业生产方面植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。参考资料来源：百度百科-分子克隆参考资料来源：百度百科-克隆载体