克隆

DNA的大量复制。分子遗传学领域的分子克隆是指DNA的大量复制，分子克隆是指分离一个已知DNA序列，并以invivo（活体内）方式获得许多复制品的过程，这一复制过程经常被用于增加并获取DNA片段中的基因。

方法：DNA片段的制备、载体的选择、片段与载体连接。在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。原理：外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5"磷酸和相邻的3"羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5"磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。载体DNA的选择质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。以上内容参考：百度百科-分子克隆

DNA分子克隆和PCR反应都是用来扩增DNA片段的方法，但是它们有一些明显的不同。DNA分子克隆是指在细胞中将某段DNA复制到一种载体上（如质粒或转基因菌），从而增加DNA的数量。该过程需要运用质粒介导的遗传克隆技术，通常需要进行一些操作，如酶切、酶连接、转录、翻译等。PCR反应是一种快速的增广DNA的技术，它可以通过从DNA样品中分离出任意一段DNA片段并进行多次复制，从而增加该片段的数量。该过程通常在实验室中进行，并不需要利用生物体内的生物机制。因此，两种技术的最大不同在于它们所采用的方法不同，一个是利用生物体内的生物机制，另一个是利用实验室条件和工具。此外，DNA分子克隆需要许多操作，比较复杂，而PCR反应简单快速，但是灵敏度较低。

自从1953年，沃森和克里克提出DNA分子双螺旋结构模型以来，基因的分子生物学迅速发展起来。1967年，DNA连接酶首次被分离出来，这种酶能使DNA分子的末端之间形成3"，5"-磷酸二酯键，因此可以使2个DNA分子连接起来。1970年，科学家发现了第一种限制性内切酶，这种酶能识别特定的DNA顺序，并且在这个顺序内的一定位置上把DNA分子切断。1972年，美国斯坦福大学的伯格（P．Berg）等人设想，如果把猿病毒DNA和λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，就会产生一种新的重组DNA分子，这是分子克隆的开创性工作。1973年，科恩（S．Cohen）等人将外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成一个重组质粒，并成功地将其转移到大肠杆菌中，从而首次建立了分子克隆体系。 克隆是clone的译音，是无性繁殖的意思。分子克隆又称重组DNA或基因工程，是指用人工方法取出某种生物的个别基因，把它转移到其它生物的细胞中去，并使后者表现出新的遗传性状，这是一种DNA的无性繁殖技术。这项技术从20世纪70年代开始，迅速发展起来，先后培育出一些具有商业价值的转基因产品。例如1988年，我国科学家合成了抗黄瓜花叶病毒基因，并把这一基因引入到烟草等作物的细胞中，得到抗病能力很强的新品种。1989年，中国科学院武汉水生生物研究所的朱作言等科学家将人的生长激素基因成功地导入泥鳅、鲤鱼、鲫鱼的卵细胞中，从而使这些鱼的生长速度明显加快。基因工程在改良生物品种，治疗人类的遗传病等方面潜力还很大，但仍有很多难题需突破。另外，在遗传工程中还有一种细胞水平的遗传。1997年，首例体细胞克隆羊问世。据1997年2月27日英国《自然》杂志报道，英国苏格兰卢斯林研究所的科学家们首次成功利用细胞核移殖技术，经人工繁殖产生哺乳动物—多莉羊。其克隆过程大致是：从一个6龄母羊身上取乳腺细胞，经培养后取核，利用电打孔使该核进入另一只羊的去核卵细胞中，经培养后植入第三只羊（替代母羊）的子宫中生长，直至分娩。经基因图分析，多莉与供核者（6龄母羊）基因组成相同，也就是说，多莉几乎是第一只羊的翻版，这就是无性繁殖——克隆，即细胞水平的遗传工程。这项实验的成功使由人体细胞克隆产生克隆人成为可能，从而引起了道德、伦理与法律等问题的激烈争论。总之，一次新的技术或新的理论的产生与成熟，必将会带来新的革命与挑战。随着道德、法律的不断完善，人们终将受益。在分子生物学飞速发展的今天，人们还是不能忘记它的创始人沃森和克里克。他们将一生都献给了20世纪的分子生物学，由他们两个人所掀起的狂澜，席卷了全球，带动一系列学科的发展。人们尊称他们为“分子生物学的元勋”。

分子克隆转化步骤有两种情况，转化和非转化。在转化过程中根据合适的选择条件可以区分转化细胞和非转化细胞。体外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞，否则会很快降解，而且只有导入到细胞中后，才能扩增及研究其功能的表达，细胞转化是常用也是最有效的方法之一，细菌转化是指裸露的（或纯化的）DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。大肠杆菌的感受态需诱导。将对数生长期的细菌放入0°C的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀，形成原生质球，诱导感受态。DNA加入后，形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于原生质球表面，42°C热冲击，DNA被吸收，将细胞混合物涂布于合适的（筛选）培养基培养几小时，细胞得以恢复和增殖，转化基因得以表达。

克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因的个体或种群。

最近在做克隆载体，入手了一款非常好用的软件 SnapGene 。网上教程挺多的，其中最推崇 四方居士 的 视频教程 ，在优酷上可以直接观看。 这款软件用来绘制图谱，编辑序列，设计引物，重组克隆都非常方便。对于克隆，在软件的Action工具栏内除了常规的限制性酶切插入克隆 ，PCR等常规操作，还列出了5种成熟的商业化的 无缝克隆 供使用者选择。这5种克隆技术分别是： <!> 本文作为观后笔记，将四方居士讲解的克隆技术的原理进行文字记录和整理，以便收藏和分享。更多内容，请大家一定去观看四方居士的视频教程！ PCR是所有分子生物学实验的基础，全称为聚合酶链式反应，通过高温变性，退火和延伸反应三部曲来扩增目的DNA序列。通过引物的设计变化，扩增反应的组合，特殊酶的使用等等，基础的PCR反应可以有千万种变化。下面介绍两种在克隆构建中经常会被用到的PCR方法。 不论变种PCR设计得多么复杂，只要画成示意图，就能一目了然。真是一图抵千言。 如图所示，重叠延伸PCR中的“重叠”指的就是两组PCR的产物，通过引物引入一段相同的序列。这段相同的序列，使得两组PCR产物的单链能够在退火时结合，这种杂交产物在DNA聚合酶的帮助下延伸成完整的DNA双链。再通过最两端的引物对融合的长篇段DNA进行扩增。 需要注意的是，引物设计时引入的“重叠”序列是反向互补配对的。 重叠延伸PCR可以将两段DNA序列进行融合，通过这种方法可以构建融合基因，也可以用来将无法一次获得全长的DNA序列，通过分段扩增，再拼接的方法获得。此外，如果“重叠”序列也可以经过特殊设计，来引入一段插入序列，如酶切位点等。 由于引物与模版不完全互补配对并不影响延伸，所以用PCR引入突变主要是在引物上“做手脚”。（但注意，引物3‘末端的碱基必须互补配对！） 在引物上添加一段序列即可获得插入突变。这时候需要注意，对于表达序列，插入碱基的数目一定要是三的倍数，否则会造成阅读框移码。在引物上替换几个碱基也可以引入突变，一般用于表达产物的氨基酸突变。此外，还需要提防改造后的引物匹配到模版中的其它位置。这里可以提前用blast预测看看。 限制性酶切和连接是最常见的载体构建方法。利用限制性内切酶对DNA序列和载体质粒进行酶切，暴露出相同的黏性末端或者平末端，再利用DNA连接酶（一般是T4 ligase）进行连接。 由于限制性酶切和连接的方法依赖限制性内切酶的使用，构建成功与否取决于目的DNA和载体序列上是否存在合适的酶切位点以及对应的酶。因此开发出无缝克隆的技术，不依赖限制性内切酶，使得克隆更加便捷，应用范围更广。 Gateway Cloning，翻译成门途径克隆，是由invitrogen公司研发的技术，目前经过多轮收购，属于Thermo公司。Gateway的核心是利用λ噬菌体位点同源重组。 目的基因和载体基因ccdB的序列两段带有 att X 序列，这个 att X 可以看作是同源重组的“信号序列”，分为 "att B"、"att P"、"att L"、"att R" 四种。其中 "att B" 和 "att P" 通过BP重组酶进行交换（BP反应）；其中 "att L" 和 "att R" 通过LR重组酶进行交换（LR反应）。 目的基因首先通过与供体质粒（Donor vector）进行BP反应，获得含有目的基因序列的克隆载体，算是“入门”。随后可以与多种目的载体进行LR反应，将目的基因置换到目的载体当中。 ccd B 是一种致死性基因，载体上表达 ccd B 时，感受态细胞无法存活，由此来清除Gateway cloning过程中的副产物。 吉布森无缝克隆是JCVI研究所的“吉布森”教授（Daniel G. Gibson）发明，利用DNA同源重组原理，比GAteway cloning更加简单，应用非常广泛，基本上各大公司都有相应的产品。 首先目的DNA和载体两段需要有15bp的同源序列。由于这段序列可以源自载体序列，通过PCR加到目的序列上，所以实际获得的拼接是无缝的。然后通过5‘外切酶是的目的序列和载体都暴露出单链DNA，形成类似于黏性末端的单链接头，退火使目的序列和载体互补配对，利用DNA聚合酶补齐末端缺失的碱基，再用DNA连接酶“缝合”切口，从而完成克隆。 看似用到多个酶的多步反应，通过混合酶或重组酶也可以Mix的体系，进行一步操作。 In-Fusion cloning是由clontech公司开发的，其原理与Gibson cloning大体相同，主要区别也是在于使用的酶，也属于专利产品。 NEB公司的高保真DNA组装与Gibson cloning的原理类似，使用的就是经过改造的重组酶，为其公司的专利产品。可以用一步反应进行DNA组装。它的特色还在于反应中使用的酶的高保真性。 NEB公司自己就拥有上述三种克隆方法对应的产品，官网中有对它们自家的三款产品平行比较。仅供参考。 TA克隆和GC克隆是最简单，也是最“小学生”的克隆。TA克隆利用Tag酶在PCR产物3‘末端加A的特性，设计对应5‘末端加T的载体与之配对。这样PCR的产物不用经过任何处理就可以与载体进行连接，一步完成。GC克隆与之相同，是利用了另一种DNA聚合酶3"末端加G的原理，当然目前这种酶用得越来越少了，几乎是停产，所以一般没人使用了。

1、提取DNA基因组或则mRNA（可用试剂盒完成，一般问题都能解决）。2、设计引物，PCR扩增目的片段。3、选择合适质粒载体，进行酶连接，构建亚克隆子（有商品化质粒可供选择）。4、用构建好的质粒转化感受态细胞（方法生物技术实验书中有详细介绍）。5、筛选阳性克隆。

工具酶：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶，核酸酶和修饰酶五大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。1、DNA限制性内切酶生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息；2、连接酶它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5"-PO4与另一DNA链的3"-OH生成磷酸二酯键；3、聚合酶系专司生物催化合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的一类酶的统称；4、核酸酶核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸，它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环；5、修饰酶体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节。

分子克隆实验流程第一天一:目的片段的扩增（PCR）PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。1.PCR(50ul) ddH2O 37.5ul10x buffer 5ulMgCl2（25mmol） 3uldNTP （10mmol） 1ulprimer 1（10mmol） 1ulprimer 2（10mmol） 1ulcDNA 1ulTaq 0.5ulPCR反应条件：94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30 72℃ 5min.4℃保温 或者94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10 72℃ 5min.4℃保温注意：当所要扩增的目的片段较大时需要适当的增加延伸时间（一般产物越长，需要的时间越长：　1分钟/1kb）2.琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+琼脂糖 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入EB混匀倒板。其中琼脂糖含量为1g/100ml,EB含量为0.1ul/ml） 注：琼脂糖凝胶电泳检测如果有杂带侧需要割胶回收目的片段。3.PCR产物纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物,最后用45ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.4.PCR产物酶切（50ul） PCR纯化产物 43ul 10xBuffer Tango 5ul E1 1ul E2 1ul 酶切反应条件：37℃反应过夜或者37℃反应3-4h。. PCR产物酶切纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物,最后用25-30ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.琼脂糖凝胶电泳检测：取2-5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。以确保回收到目的片段。二．载体的制备 1．质粒DNA的制备：用柱式质粒DNA小量试剂盒抽提我们所要的载体质粒。 2.载体酶切（100ul） 质粒DNA 2ug 10xBuffer Tango 10ul E1 2ul E2 2ul ddH2O 补足至100ul 反应条件：一般pGEX-4T 37℃水浴3-4h，pET系列37℃水浴过夜。 3. 琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，同时取200ng左右没有酶切的质粒做对照，保存电泳图片。（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+琼脂糖 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入EB混匀倒板。其中琼脂糖含量为1g/100ml,EB含量为0.1ul/ml） 4.酶切产物纯化：根据PCR产物回收试剂盒上流程回收酶切产物,最后用20-30ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.第二天三．外源DNA片段在质粒载体中的克隆 1.外源DNA片段与质粒载体的连接（10ul） DNA片段 6ul 载体 2ul T4 DNA Ligase 1ul Buf T4 DNA Ligase 1ul 反应条件：22℃水浴3-4h或者16℃或4℃水浴过夜。 一般目的片段：载体摩尔比约为3:1，但是在这里我们通常是按体积比。 2.连接产物转化 取全部连接产物加入到不少于5-7倍体积感受态细胞溶液中，冰浴20min，42℃热激90s后静置与冰浴中3-5min加入500-800ul（一般800）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温培养0.5-1h。4000rmp离心1min弃上清同时保留100-200ul混匀菌体沉淀后均匀涂布抗性平板上。37℃恒温箱培养过夜。 质粒转化取质粒1ul或50-100ng加入50-70ul所需的感受态细胞溶液中，冰浴20min，42℃热激90s后静置与冰浴中3-5min加入500-800ul（一般800）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温培养0.5-1h。取100-200ul菌体均匀涂布抗性平板上。37℃恒温箱培养过夜。 注：1一定要区分质粒和连接产物转化的不同，不要理所当然。 2根据实验要求选择所需要的感受态。 3在选择抗性平板的时候要根据所选载体和感受态两个方面确定。第三天 收集涂布的抗性平板检查菌落生长情况4℃保存待下一步实验;筛选鉴定或酶切鉴定 筛选鉴定 菌落 PCR(25ul) ddH2O 19.2ul10x buffer 2.5ulMgCl2（25mmol） 1.5uldNTP （10mmol） 0.5ulprimer 1（10mmol） 0.5ulprimer 2（10mmol） 0.5ulTaq 0.3ul模板为单菌落PCR反应条件：94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30 72℃ 5min.4℃保温 或者94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10 72℃ 5min.4℃保温注：1一般一个项目要挑选5个单菌落做菌落PCR 2在以菌落为模板时要事先准备相应抗性平板，用枪头挑选菌落时要先在事先准备的相应平板上划线标记好顺序再将枪头放入上述反应体系中搅匀一下。3该PCR 的primer 为通用primer 所以在原来目的片段的大小上加上100-200bp。琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。根据大小判断该菌落是否正确。下班前挑取（在划线的板子上）筛选正确的菌体接种到5ml 含相应抗性的LB培养基37℃ 200rmp培养过夜。

载体　所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。基因库的建造特异基因的筛选核酸序列测定　一、基因克隆的基本方法　　一个典型的基因克隆实验，主要有以下操作和结果：　　（1）包括有目的基因在内的DNA片断插入另一个DNA分子（克隆载体，通常是环状的），形成重组DNA分子。　　（2）重组DNA分子通过转化或其他类似的方法被导入受体细胞。大肠杆菌是使用较多的受体细胞。　　（3）在受体细胞中，克隆载体指导重组DNA分子复制，产生许多完全相同的拷贝。　　（4）当受体细胞分裂时，重组DNA分子的拷贝进入子细胞，克隆载体的复制将在子细胞中继续。　　（5）大量分裂的受体细胞形成克隆：一个细胞群体，其中每个细胞都含有许多重组DNA分子的拷贝。　　显而易见，基因克隆是一个比较直观而简单的操作程序。它之所以具有非常重要的生物学意义，是因为这一技术可以为我们提供一个纯粹的基因标本。通常，一个基因总是和细胞里其他基因同在。基因克隆技术诞生之前，我们根本无法纯化单个基因，这意味着我们只能对基因群、而不是特定基因的结构与功能进行研究和开发利用。　　１、重组DNA分子的构建　　构建重组DNA分子是基因克隆实验的第一步，亦即，把环状的载体在指定部位切断，然后把含目的基因的DNA分子插入其中，再将两者连接起来。这一过程需要两种DNA操作酶：限制性内切酶（restriction endonucleases）和连接酶（ligases）。　　限制性内切酶能够识别DNA分子上的特定核苷酸序列，并在该处特异性切断DNA分子。例如，PvuI（细菌Proteus vulgaris分离）只识别和切断6核苷酸序列CGATCG；从相同细菌分离的PvuII，却只识别并切断CAGCTG。许多限制性内切酶的识别位点是6个核苷酸，但是，也有识别4个或5个、甚至8个核苷酸顺序的限制性内切酶。此外，有些限制性内切酶的识别顺序可能不是唯一的，例如，HinfI可以识别并切断GAATC、GATTC，GAGTC和GACTC。因此，通常也将HinfI的识别位点记为GANTC，N代表A、T、G和C中的任意一种核苷酸。　　经限制性内切酶处理后的DNA分子断端有两种：平端和粘端，它们的性质对基因克隆的实验设计有重要影响。其中，具有不同识别位点的限制性内切酶可以产生相同的粘端。例如，BglII（AGATCT）和BamHI（GGATCC）产生与Sau3A相同的GATC粘端。显然，经上述三种酶处理的DNA分子片断之间均可以在相应的断端形成互补双链。　　DNA分子片断通过粘端形成的碱基互补并不能使之相互连接，后一过程需要连接酶的催化作用。所有生物细胞中都产生连接酶，但是，基因克隆中最常用的是T4噬菌体的连接酶。连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键。由于平端不能使DNA片断保持相互接近的位置，因而，和粘端相比，连接酶对平端DNA分子之间连接反应的催化效率较差。　　２、克隆载体及其主要功能

中译本序译者的话第三版前言上册第1章 质粒及其在分子克隆中的应用第2章 λ噬菌体及其载体第3章 M13噬菌体载体第4章 高容量载体的应用第5章 DNA凝胶电泳和脉冲场琼脂糖凝胶电泳第6章 真核基因组DNA的制备和分析第7章 真核mRNA的提取、纯化和分析第8章 聚合酶链式反应体外扩增DNA第9章 放射性标记DNA探针与RNA探针的制备第10章 合成寡核苷酸探针第11章 cDNA文库制备及其基因鉴定下册第12章 DNA测序第13章 诱变第14章 表达文库的筛选第15章 在大肠杆菌中表达克隆化基因第16章 哺乳动物培养细胞中导入克隆化基因第17章 哺乳动物培养细胞的基因表达分析第18章 蛋白质相互作用研究技术附录1 分子克隆中使用的缓冲液和试剂的配制附录2 培养基附录3 载体和细菌菌株附录4 分子克隆所用的酶附录5 酶的抑制物附录6 核酸附录7 密码子和氨基酸附录8 分子克隆中的常用技术附录9 检测系统附录10 DNA陈列技术附录11 生物信息学附录12 告戒附录13 供应商附录14 商标索引

克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 克隆技术即无性繁殖技术。通常的有性生殖是由雌雄交配，精子和卵子结合发育成胚胎，经妊娠后产出新的个体。克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。 克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。 克隆（clone）是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的生物群，即具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是“小树枝叶”的意思，用以指无性增殖物。现在则指个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物。（1）个体水平：在植物的无性增殖中，植物的发芽、插条等由同一个体通过无性生殖而增长的个体群均被视为克隆。采用组织培养方法可使植物细胞培养发育成完全的个体（愈伤组织），采用这种方法得到的具有相同基因型的个体群，也被称为克隆；在动物的无性增殖中，典型的例子是采用核移植实验方法，把分化细胞的核移植到一个事先去核的蛙卵中，让其发育并得到克隆蛙。克隆动物具有均一遗传性质，在研究环境条件对发育、分化的影响以及药物的检测方面都是重要的实验材料。在哺乳动物中，由于细胞分化，核异质化的程度加剧，因此核移植尚无成功的例子。（2）细胞水平：由一个细胞经过有丝分裂生成的细胞群叫克隆。但如果培养细胞发生转化，则很容易引起染色体变异。（3）基因水平：利用基因重组操作技术，使特定的基因与载体结合，在细菌等宿主中进行增殖，有可能得到均匀的基因群。克隆基因在基因功能与精细结构的关系等基础研究及在有用物质的生产方面，均已得到应用。 在上述3种水平上，增殖并分离获得单一的克隆群称为克隆化。此时，克隆一词也可作为动词理解。克隆是重组DNA技术的核心部分。事实上，克隆技术现已被人们用来通过营养方式繁殖病毒等微生物和植物的纯种，从而保证了这些生物基因组的准确连续性。现在，克隆这个词还包括单个自主遗传因子的分离与保存。细胞生物的克隆只需要营养培养基，而基因的克隆则需要某种载体复制子、特定的寄主细胞和营养培养基。各种类型生物的克隆技术在生物工程中均有其重要作用。 克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 -------------------------------------------------------------------------------- 克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。

　　把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。　　简介：　　克隆的过程：　　先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后，再被植入动物子宫中使动物怀孕，便可产下与提供细胞核者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。　　克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。

连接T-vector之前进行PCR得到带A的PCR产物，然后进行转化，对expression vector和质粒进行相同酶切，连接，转化。在整个clone中有时会用PCR来鉴定，如目的基因是否转入进感受态细胞。

克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因的个体或种群。

个细菌经过20分钟左右就可一分为二；一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎，一年内就能长出数百株草莓苗……凡此种种，都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代，这就是无性繁殖，无性繁殖的英文名称叫“Clone”，译音为“克隆”，实际上，英文的“Clone”起源于希腊文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插条”繁殖。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡来自一个祖先，经过无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。 自然界的许多动物，在正常情况下都是依靠父方产生的雄性细胞（精子）与母方产生的雌性细胞（卵子）融合（受精）成受精卵（合子），再由受精卵经过一系列细胞分裂长成胚胎，最终形成新的个体，这种依靠父母双方提供性细胞、并经两性细胞融合产生后代的繁殖方法就叫有性繁殖，但是，如果我们用外科手术将一个胚胎分割成两块，四块、八块……最后通过特殊的方法使一个胚胎长成两个、四个，八个……生物体，这些生物体就是克隆个体，而这两个、四个、八个……个体就叫做无性繁殖系（也叫克隆）。 可以这样说，关于克隆的设想，我国明代的大作家吴承恩已有精彩的描述——孙悟空经常在紧要关头拔一把猴毛变出一大群猴子，猴毛变猴就是克隆猴。 1979年春，中国科学院武汉水生生物研究所的科学家用鲫鱼囊胚期的细胞进行人工培养，经过385天59代连续传代培养后，用直径10微米左右的玻璃管在显微镜下从培养细胞中吸出细胞核，在此同时，除去鲫鱼卵细胞的核，让卵细胞留出空间作好接纳囊胚细胞核的准备，一切准备就绪后，把玻璃管吸出的核移放到空出位置的鲫鱼卵细胞内，得到了囊胚细胞核的卵细胞在人工培养下大部分夭亡了，在189个这种换核卵细胞中，只有两个孵化出了鱼苗，而最终只有一条幼鱼度过难关，经过80多天培养后长成8厘米长的鲫鱼。这种鲫鱼并没有经过雌、雄细胞的结合，仅仅是给卵细胞换了个囊胚细胞的核，实际上是由换核卵产生的，因此也是克隆鱼。 在克隆鲫鱼出现之前，英国牛津大学的科学家已经在1960年和1962年，先后用非洲一种有爪的蟾蜍（非洲爪蟾）进行过克隆试验。试验方式是先用紫外线照射爪蟾卵细胞，破坏其中的核，然后依靠高超的外科手术从爪蟾蝌蚪的肠上皮细胞、肝细胞、肾细胞中取出核，并把这些细胞的核精确地放进已被紫外线破坏了细胞核的卵细胞内，经过精心照料，这些换核卵中终于有一部分长出了活蹦乱跳的爪蟾，这种爪蟾也不是经过精细胞和卵细胞州结合产生的，所以也是克隆爪蟾。 我国著名生物学家童第周先生在1978年成功地进行了黑斑蛙的克隆试验，他将黑斑蛙的红细胞的核移人事先除去了核的黑斑蛙卵中，这种换核卵最后长成能在水中自由游泳的蝌蚪。 鱼类换核技术的成熟和两栖类换核的成功，使一批从事良种培育工作的科学家激动不己，既然鲫鱼的囊胚细胞核取代鲫鱼卵细胞核后能得到克隆鱼，那么异种鱼换核能否得到新的杂种鱼呢？我国科学家首先提出了这个问题，也首先解决了这个问题，就是培养克隆鲫鱼成功的那个研究所，设法把鲤鱼胚胎细胞的核取代了鲫鱼卵细胞的核。鲤鱼细胞核和鲫鱼卵细胞质居然能相安无事，并开始了类似受精卵分裂发育的过程，最后长出有“胡须”的“鲤鲫鱼”，这种鱼有“胡须”，生长快，完全像鲤鱼，但它的侧线鳞片数和脊椎骨的数目与鲫鱼相同，而且鱼味鲜美不亚于鲫鱼。这种人工克隆新鱼种的出现为鱼类育种开辟了新途径。 对科学的追求是永无止境的，鱼类，两栖类克隆的成功自然而然地使科学家把目光投向了哺乳类。美国和瑞士的科学家率先从灰色小鼠的胚胎细胞中取出细胞核，用这个核取代黑色小鼠受精卵细胞核。实际上，这个黑色小鼠的受精卵在精细胞核刚进入卵细胞后，就把精细胞核连同卵细胞的核一起除去。灰鼠胚胎细胞的核移人黑色小鼠的去核受精卵后，在试管里人工培养了四天，然后再把它植人白色小鼠的子宫内、经几百次灰、黑、白这样的操作以后，白色小鼠终于生下了三只小灰鼠。 去年2月27日出版的英国“自然”杂志公布了爱丁堡罗斯林研究所威尔莫特等人的研究成果：经过247次失败之后，他们在前年7月得到了一只名为“多利”的克隆雌性绵羊。 “多利”绵羊是如何“创造”出来的呢？威尔莫特等学者先给“苏格兰黑面羊”注射促性腺素，促使它排卵，得到卵之后，立即用极细的吸管从卵细胞中取出核，与此同时，从怀孕三个月的“芬多席特”六龄母羊的乳腺细胞中取出核，立即送人取走核的“苏格兰黑面羊”的卵细胞中，手术完成之后，用相同频率的电脉冲刺激换核卵，让“苏格兰黑面羊”的卵细胞质与“芬多席特”母羊乳腺细胞的核相互协调，使这个“组装”细胞在试管里经历受精卵那样的分裂、发育而形成胚胎的过程，然后，将胚胎巧妙地植人另一只母羊的子宫里。到去年7月，这只“护理”体外形成胚胎的母羊终于产下了小绵羊“多利”。“多利”不是由母羊的卵细胞和公羊的精细胞受精的产物，而是“换核卵”一步一步发展的结果，因此是“克隆羊”。 “克隆羊”的诞生，在世界各国引起了震惊，它难能可贵之处在于换进去的是体细胞的核，而不是胚胎细胞核。这个结果证明：动物体中执行特殊功能、具有特定形态的所谓高度分化的细胞与受精卵一样具有发育成完整个体的潜在能力。也就是说，动物细胞与植物细胞一样，也具有全能性。 克隆技术会给人类带来极大的好处，例如，英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。 母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡，骡不能繁殖后代，那么，优良的骡如何扩大繁殖？最好的办法也是“克隆”，我国的大熊猫是国宝，但自然交配成功率低，因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物？“克隆”为人类提供了切实可行的途径。 克隆动物还对于研究癌生物学、研究免疫学、研究人的寿命等都有不可低估的作用。 不可否认，“克隆绵羊”的问世也引起了许多人对“克隆人”的兴趣，例如，有人在考虑，是否可用自己的细胞克隆成一个胚胎，在其成形前就冰冻起来。在将来的某一天，自身的某个器官出了问题时，就可从胚胎中取出这个器官进行培养，然后替换自己病变的器官，这也就是用克隆法为人类自身提供“配件”。 有关“克隆人”的讨论提醒人们，科技进步是一首悲喜交集的进行曲。科技越发展，对社会的渗透越广泛深入，就越有可能引起许多有关的伦理、道德和法律等问题。我想用诺贝尔奖获得者，著名分子生物学家J.D.沃森的话来结束本文：“可以期待，许多生物学家，特别是那些从事无性繁殖研究的科学家，将会严肃地考虑它的含意，并展开科学讨论，用以教育世界人民。” 回答者：yyfreeliang - 魔神 十六级 3-11 08:36--------------------------------------------------------------------------------“克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 回答者：dahuzi1954 - 进士出身 八级 3-11 08:41--------------------------------------------------------------------------------“克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。

克分子的解释[gram molecule] 以克计的化合物或元素的重量,其量在数值上等于该化合物或元素的 分子量 词语分解 克的解释 克 （④克） è 能够：克勤克俭。 战胜，攻下：攻克。克复（战胜 敌人 并收回失地）。 制伏：克服。 克制 。克己奉公。以柔克刚。 严格限定： 克日 。克期。克扣。 消化 ：克食。 公制重量单位或质量单位：一克等于 分子的解释 构成某一整体的各个体;归属某 社会 群体的人劳改分子积极分子详细解释.支庶之子孙。《谷梁传·庄公三十年》：“北伐 山戎 ，危之也。则非之乎？善之也。何善乎尔？ 燕 ， 周 之分子也。” 范宁 注：“分子

克隆技术 克隆技术即无性繁殖技术。通常的有性生殖是由雌雄交配，精子和卵子结合发育成胚胎，经妊娠后产出新的个体。克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。 克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。 ——《素质教育新学案》 克隆技术的危害？ ...尽管如此，克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。 ... ...这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。 四、克隆技术的应用前景 克隆技术已展示出广阔的应... 寒冰163 - 2005-12-7 19:38 - 最佳回答者: 十字军刀客 - 教育/科学 > 自然科学 克隆技术是怎么回事？ 克隆技术 克隆技术即无性繁殖技术。通常的有性生殖是由雌雄交配，精子和卵子结合发育成胚胎，经妊娠后产出新的个体。克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动... sfn123 - 2005-12-19 17:52 - 最佳回答者: 272928861ml - 教育/科学 克隆技术有关资料 ...科学家把人工遗传操作动、植物的繁殖过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。 克隆技术的设想是由德国胚胎学家于1938年首次提 出的，1952年，科学家首先用青蛙开展克隆实验，之后不断有人利用各种动物进行克隆技术研究。由于该项技术几乎没有取得进展，研究... jywjyw333 - 2006-3-5 13:42 - 最佳回答者: leijunyu - 教育/科学 > 学习帮助 我国的克隆技术是世界前列吗? ... 动物克隆技术被生物科学家誉为“生物原子弹”，各国都在竞相发展。动物克隆技术分胚胎克隆和体细胞克隆。相比而言，体细胞克隆... ... 西北农林科技大学动物克隆技术科研群体，在1990年就掌握了胚胎克隆技术，繁育出世界首批克隆山羊。1995年又利用胚胎克隆技术，... 仙人指3 - 2005-9-21 13:01 - 最佳回答者: 我字不帅 - 教育/科学 > 自然科学 以现在的克隆技术能把一个死去的人克隆出来吗???? 只有有这个人的活细胞。提取这个细胞的DNA，然后通过RNA复制出千千万万个细胞。以现在的克隆技术是可以做到的。以前这个人某处... ...目前的克隆技术，只能克隆生命的肉体而已，并不能克隆生命的“灵魂”。也就是说，克隆出来的人无感情，以前学过的东西、遇过的... shundechaoren - 2006-2-20 18:10 - 最佳回答者: kingkongs - 教育/科学 > 自然科学 克隆技术和第一只克隆羊的情况 ...它的诞生被视为20世纪末最重要的科学成就之一，它引发了全世界科学家研究克隆技术的热潮，也导致了大量技术和伦理方面的争论。 ... ...当时，曾领导克隆多利的研究的伊恩·威尔穆特教授曾表示，多利患有关节炎可能意味着克隆技术“效率低”，需要进一步研究。(完) ... 5072159 - 2005-10-9 20:36 - 最佳回答者: 晋山河 - 社会/文化 克隆技术是什么东西 克隆技术其实就是从动物A上拿一个细胞，取出细胞核！再到同种动物B的身上拿一个细胞，去掉细胞核！把取出来的细胞核放到另一个去掉细胞核的细胞中！再把它放到同种动物母体C的子宫中！这样将C将会生出一个和A一模一样的动物来！还有就是直接拿一种动物的细胞... wasong - 2005-10-7 16:18 - 最佳回答者: 紫色残云 - 教育/科学 > 入学信息 能不能用克隆技术增加大熊猫的数量?为什么? ...而克隆技术则不能增加大熊猫的进化过程。 自上世纪90年代以来，北京动物园、四川大熊猫繁育中心、卧龙自然保护区的大熊猫繁育中心等几个地方都比较成功地繁殖了大熊猫；而在秦岭650平方公里的地方，大约150只大熊猫在13年的时间内始终处于相对稳定的状... 小小花生 - 2005-12-28 21:42 - 最佳回答者: 我是张楚 - 教育/科学 > 自然科学 克隆技术会在生活中应用吗？为什么？ 看运用在什么地方因为现在的克隆技术还不是很发达，掌握得也不是很到位，所以容易出些差错。如果运用得好的话，可以运用到人体重要器官的移植以及对稀有动物的繁衍但对人的克隆还在争论中，因为这样不利于人的辨认与管理。容易出现政治问题 409257127 - 2005-11-4 20:39 - 最佳回答者:匿名 - 教育/科学 > 自然科学 法律更有利于控制克隆技术的恶性发展 不是法律有利于干吗，而是制定相应规制的法律更有利于控制克隆技术恶性发展。 克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 克隆技术即无性繁殖技术。通常的有性生殖是由雌雄交配，精子和卵子结合发育成胚胎，经妊娠后产出新的个体。克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。 克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。 克隆（clone）是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的生物群，即具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是“小树枝叶”的意思，用以指无性增殖物。现在则指个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物。（1）个体水平：在植物的无性增殖中，植物的发芽、插条等由同一个体通过无性生殖而增长的个体群均被视为克隆。采用组织培养方法可使植物细胞培养发育成完全的个体（愈伤组织），采用这种方法得到的具有相同基因型的个体群，也被称为克隆；在动物的无性增殖中，典型的例子是采用核移植实验方法，把分化细胞的核移植到一个事先去核的蛙卵中，让其发育并得到克隆蛙。克隆动物具有均一遗传性质，在研究环境条件对发育、分化的影响以及药物的检测方面都是重要的实验材料。在哺乳动物中，由于细胞分化，核异质化的程度加剧，因此核移植尚无成功的例子。（2）细胞水平：由一个细胞经过有丝分裂生成的细胞群叫克隆。但如果培养细胞发生转化，则很容易引起染色体变异。（3）基因水平：利用基因重组操作技术，使特定的基因与载体结合，在细菌等宿主中进行增殖，有可能得到均匀的基因群。克隆基因在基因功能与精细结构的关系等基础研究及在有用物质的生产方面，均已得到应用。 在上述3种水平上，增殖并分离获得单一的克隆群称为克隆化。此时，克隆一词也可作为动词理解。克隆是重组DNA技术的核心部分。事实上，克隆技术现已被人们用来通过营养方式繁殖病毒等微生物和植物的纯种，从而保证了这些生物基因组的准确连续性。现在，克隆这个词还包括单个自主遗传因子的分离与保存。细胞生物的克隆只需要营养培养基，而基因的克隆则需要某种载体复制子、特定的寄主细胞和营养培养基。各种类型生物的克隆技术在生物工程中均有其重要作用。

从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。 　　一、RNA制备　　模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。　　细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3"末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 　　二、cDNA第一链的合成　　所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNANA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。 　　AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3"端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。　　三、cDNA第二链的合成　　cDNA第二链的合成方法有以下几种: 　　(1) 自身引导法 合成的单链cDNA 3"端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5"端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。 　　(2) 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。　　四、cDNA的分子克隆 　　已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体。

分子克隆中常用的工具酶连接酶、T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶、核酸酶、琼脂糖酶、蛋白酶、溶菌酶以及一些DNA 结合蛋白。分子克隆在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。工具酶：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶，核酸酶和修饰酶五大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。

载体是指能传递能量或运载其他物质的物体。条件：1.能在受主细胞内稳定存在,不会对宿主细胞造成危害,能自我复制。2.具有标记基因。3.含有1至多个限制酶的识别序列及切点。4.含有启动子,终止子。

克分子的解释 [gram molecule] 以克计的化合物或元素的重量,其量在数值上等于该化合物或元素的 分子量 词语分解 克的解释 克 （④克） è 能够：克勤克俭。 战胜，攻下：攻克。克复（战胜 敌人 并收回失地）。 制伏：克服。 克制 。克己奉公。以柔克刚。 严格限定： 克日 。克期。克扣。 消化 ：克食。 公制重量单位或质量单位：一克等于 分子的解释 构成某一整体的各个体;归属某 社会 群体的人劳改分子积极分子详细解释.支庶之子孙。《谷梁传·庄公三十年》：“北伐 山戎 ，危之也。则非之乎？善之也。何善乎尔？ 燕 ， 周 之分子也。” 范宁 注：“分子

“克隆”是什么？克隆的概念在生物学中早已存在，但人们对其一直知之甚少。只有当克隆羊“多莉”诞生时，才引起了最广泛的关注。 克隆是英文“CLONE”的音译，源于希腊文，原意是指植物幼苗或嫩枝以“无性繁殖”或“营养繁殖”的方式培育，也就是说用除种子之外的植物体的任何一部分进行无性繁殖。现在它的范围扩大了，凡是没有精卵结合过程，而由同一个祖先细胞获得的两个以上的细胞、细胞群或生物体，或由同一个亲本遗传密码等，得到的后代就是克隆，其分化发育得到的生物体与母体的基因是完全相同的。通俗地讲，通过这种方式得到的生物体与它们的“母体”在生物学上是同等的，它们没有父亲与母亲，只是母体的“翻版”后代，相当于计算机中的文件拷贝一样，所有拷贝中的信息应该完全相同。但克隆毕竟是比拷贝文件复杂得多的生命过程，在实际操作中，难免受到外部环境及内部条件的影响，并不容易做到完全相同，在动物克隆中尤其如此。在植物界和低等生物中，克隆并不神秘。如从某些花枝上剪下枝条，插在花盆里就可以长成许多完全相同的植株；蚯蚓被切成两段后，每段都能再生为完整的个体。但壁虎断了尾巴会长出新的，螃蟹掉了钳子会长出比原来小些的新蟹钳，章鱼的腕足被割掉后能再长等现象，却只是断肢、器官等的再生，不能算是完全的“克隆”。除非壁虎的尾巴长成小壁虎，或是蟹钳子长成小螃蟹，才是“克隆”的范畴。而高等动物一般都是通过有性生殖的方式繁殖后代的，因此，高等动物的“复制”成功，确实让人类大吃一惊。从理论上讲，就是人类的任何细胞都可以用来制造出同一基因的克隆人。这引发了一场世界范围的关于科学与伦理、科学与生命、科学与人类未来命运的大讨论，反对克隆人的呼声占了上风。

《分子克隆实验指南》的前两版以其无可匹敌的声誉，在近20年的时间里一直被作为分子生物学实验的经典参考书。在第三版中，作者对图书内容进行了完全的升级，修订了实验的每条方案，增加了大量新的材料，拓宽了它涉及的领域，内容丰富而详细，使其具有用于学习遗传学、分子细胞生物学、发育生物学、微生物学、神经科学和免疫学等科学的重要指导和参考价值。《分子克隆实验指南 第三版（上、下册）》具有先进性、实用性、权威性的特点，是生命科学实验室内当之无愧的“圣经”。

　　如何利用分子克隆技术获得dna复制起始区　　由于DNA分子是一个独特的双螺旋结构，是由两条平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成，在复制时，以亲代DNA分子的两条链分别为模板合成子代DNA分子，所以DNA分子的复制是半保留复制．　　1. 复制的起始点与方向　　DNA分子复制时，在亲代分子一个特定区域内双链打开，随之以两股单链为模板复制生成两个子代DNA双链分子。开始时，复制起始点呈现一叉形（或Y形），称之为复制叉（replication fork）。复制进行中，复制叉乃向前移动。　　（1）复制的起始点　　DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此特定部位称为复制起始点（origin of replication），可以ori表示。在原核生物中复制起始点常位于染色体的一个特定部位，即只有一个起始点。真核生物的染色体中是在几个特定部位上进行DNA复制的，是有几个复制起始点。　　（2）复制的方向　　复制的方向可以有三种不同的机制，其一是从两个起始点开始，各以相反的单一方向生长出一条新链，形成两个复制叉【图示1】，例如腺病毒DNA的复制。其二是从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉【图示2】，例如质粒ColEI。其三是从一个起始点开始，沿两个相反的方向各生长出两条链，形成两个复制叉【图示3】。这种方式最为常见，因此也是最重要的双向复制（bidirectional replicatim）。故答案为：半保留复制

分子克隆一般需要在引物上加酶切碱基序列（6-8个碱基+2-6个保护碱基），在引物的5`端加这些碱基，对PCR扩增还是有影响的，有时候就扩增不出来所以就先用不加酶切序列的引物扩增一轮，连TA载体，测序，然后用加酶切位点序列引物，进行第二轮扩增，更容易扩增。如果需要设计定量PCR引物，可以在微信小程序搜索“引物库”，提供30多个植物、动物的定量PCR引物，并且列出了每一对引物所在的外显子，并进行了非特异性扩增的检测（ePCR）网页链接

8小时左右。分子克隆涂板后需要8小时左右长出菌落，需要进行先预热有抗平板再涂转化菌。分子克隆涂板时要注意反应建议使用PCR仪进行。水浴锅等常规仪器对温度控制不精确，影响重组效率。

(一)DNA复制的引发　　复制的引发阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子，RNA引物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3"-OH末端复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滞后链模板转录一短的RNA分子。在有些DNA复制中，(如质粒ColE)，该RNA分子经过加式成为DNA复制的引物。但是，在大部分DNA复制中，该RNA分子没有引物作用。它的作用似乎只是分开两条DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板DNA上开始合成RNA引物，这个过程称为转录激活，在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的dnaA蛋白。这两种蛋白质可以和复制起点处DNA上高度保守的4个9bp长的序列结合，其具体功能尚不清楚。可能是这些蛋白质与DNA复制起点结合后能促进DNA聚合酶Ⅲ复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶。DNA复制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，通过转录激活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白质结合在被解开的链上。由复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n"蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶(primase)组装成引发体(primosome)。引发体可以在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引发体在滞后链上沿5"→3"方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后)，在一定距离上反复合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷酸长。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。　　为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3"-OH端而进入DNA链的延伸阶段。(二)DNA链的延伸　　DNA新生链的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必须由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学上的问题:由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。但是，在细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。有两种机制可以防止这种现象发生:[1]DNA在生物细胞中本身就是超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和;[2]DNA拓扑异构酶Ⅰ要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而DNA拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链，再由DNA聚合酶Ⅲ合成新的DNA链。前已述及DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶催化，该酶是由7种蛋白质(多肽)组成的聚合体，称为全酶。全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。α亚基具有聚合功能和5"→3"外切酶活性，ε亚基具有3"→5"外切酶活性。另外，全酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。　　在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶Ⅲ在同一时间分别进行复制DNA前导链和滞后链。如果滞后链模板环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。　　　这样，当DNA聚合酶Ⅲ沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从DNA聚合酶Ⅲ上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度)。而且，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移动。　　按上述DNA复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通过其5"→3"外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5"→3"合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。(三)DNA复制的终止　　过去认为，DNA一旦复制开始，就会将该DNA分子全部复制完毕，才终止其DNA复制。但最近的实验表明，在DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少在NDA复制终止阶段令人困惑的一个问题是，线性DNA分子两端是如何完成其复制的?已知DNA复制都要有RNA引物参与。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合Ⅰ所填充。但是，在线性分子的两端以5"→3"为模板的滞后链的合成，其末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。　　在研究T7DNA复制时，这个问题部分地得到了解决。T7DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。而且，在T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3"端单链尾巴，两个子代DNA的3"端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。　　在研究痘病毒复制时，发现了线性DNA分子完成末端复制的第二种方式。痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。然后，在发夹的中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。这样，在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。在真核生物染色体线性DNA分子复制时，尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。但最近的实验表明，真核生物染色体末端DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端DNA序列加在刚刚完成复制的DNA末端。这种机制首先在四膜虫中发现。该生物细胞的线性DNA分子末端有30-70拷贝的5"TTGGGG3"序列，该细胞中存在一种酶可以将TTGGGG序列加在事先已存在的单键DNA末端的TTGGGG序列上。这样有较长的末端单链DNA，可以被引物酶重新引发或其他的酶蛋白引发而合成RNA引物，并由DNA聚合酶将其变成双链DNA。这样就可以避免其DNA随着复制的不断进行而逐渐变短。　　在环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在上述问题。环状DNA复制到最后，由DNA拓扑异构酶Ⅱ切开双链DNA，将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA

一般用mRNA反转录地方法得到cDNA或者从文库里直接得到cDNA之后用PCR就可以扩增 克隆cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。1.方法：(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。

cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是： ①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆； ②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息； ③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。 1.方法： (1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。 (2)载体DNA的选择： ①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。 ②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。 M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。 ③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。 (3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。 (4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。

（1）首先以mRNA为模板逆转录形成DNA单链，即③； （2）再以逆转录形成的DNA单链为模板，在DNA聚合酶的作用下复制形成双链DNA，即②； （3）最后再以合成的双链DNA为亲代DNA，经过DNA复制形成许多完全相同的子代DNA，即②． 故选：D．

基因工程，包括转基因技术。当然，蛋白质工程等也属于基因工程。转基因，即把优质基因导入受体细胞，使细胞发育成个体表现出优良性状。克隆，即把优质亲本进行近乎100%的复制。把供体细胞核取出（实际并不这么操作，这是理论上的），放入去核的卵母细胞，发挥其全能性，发育成个体。

不是，是直接由细菌繁殖而来。因为细菌繁殖很快。用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”。

基因克隆的基本步骤流程如下：一、目的DNA片段的获得：DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。二、载体的选择：基因克隆常用的载体有：质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、单链DNA噬菌体载体、噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。三、体外重组：体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰；如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。四、导入受体细胞：载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。五、重组子的筛选：从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。（2）PCR筛选和限制酶酶切法：提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。（3）核酸分子杂交法：制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。（4）免疫学筛选法：获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。扩展资料：基因克隆的注意事项：1、平端连接：DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。2、加尾连接：同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。3、人工接头连接：对平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头(linker)或适当分子连到平端，使产生新的限制性内切酶位点。再用识别新位点的限制性内切酶切除接头的远端，产生粘性末端。参考资料来源：百度百科-基因克隆参考资料来源：百度百科-DNA克隆

1.获得目的基因，并进行酶切 获得粘性末端2.将载体也进行酶切 获得相同的粘性末端3.将载体与目的基因相连4.将重组好的载体导入宿主细胞中进行表达 克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移 植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后（罗斯林研究所克隆羊采用的时间约为 6天）再被植入动物子宫中使动物怀孕使可产下与提供细胞 者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。