普利斯特里最重要的是对氧气的发现。1774年，他得到了一个大型凸透镜(火镜），开始研究某些物质在凸透镜聚光产主的高温下放出的各种气体。他研究的物质中有“红色沉淀物”（氧化汞）和“汞灰”亦称水银烧渣，也就是氧化汞）。普利斯特里把氧化汞放置在玻璃钟罩内的水银面上，用一个直径30厘米、焦距为50厘米的火镜，将阳光聚集在氧化汞上。很快就发现氧化汞被分解了，放出一种气体，将玻璃罩内的水银排挤出来。他把这种气体叫做”脱燃素的空气”。他以排水集气法，把这种气体收集起来，然后研究其性质。发现蜡烛会在这种空气中燃烧，火焰非常明亮，老鼠在这种气体中生活正常，且比在等体积的普通空气中活的时间长了约4倍；他还亲自尝试了一下，感觉这种空气使人呼吸轻快、舒畅。他对实验的全过程做了详细的描述。其实早在1771年，普利斯特里把硝石加热对，已经制得了氧气。他在题为“各种空气的观察”一文中，曾提到：“在我从硝石得到的一定量（的空气）中，不仅蜡烛能点燃，而且火焰增大，还听到了响声，好像硝石在明火中烧爆的声音。”但由于他当时把这种气体，混同于一般空气，所以未能发现氧。普利斯特里认为空气是单一的气体，助燃能力之所以不同，其区别仅在于其中含燃素量的不同。从汞烧渣中分解出来的是新鲜的、不含一点燃素的空气，所以吸收燃素的能力和助燃能力都特别强。因此他把这种气体叫做“脱燃素空气”。而寻常的空气，由于经过动物呼吸、植物的燃烧和腐烂，已经吸收了不少燃素，所以助燃能力就差了：一旦空气被燃素饱和，那么它就不再助燃，变成“被燃素饱和了的空气”（指氮气）或叫“燃素化空气”。在后来的研究中，普利斯特里发现，绿色植物在阳光中也能放出“脱燃素空气”，成为光化学作用研究的基础。谢尔本勋爵支持普利斯特里的研究工作，一直为他提供研究经费。1774年，他带着普利斯特里一起访问了欧洲大陆。在欧洲，他们结识了许多科学家，这对普利斯特里的利学生涯具有重大意义。在巴黎，普利斯特里拜访了法国化学家拉瓦锡，他向拉瓦锡介绍并演示了从氧化汞中谁、取气体的实验。拉瓦锡后来又重复了他的实验，并且把普利斯特里的实验材料以及他本人的实验结果联系起来。拉瓦锡能摆脱传统思想的束缚，大胆地提出了氧化概念，形成了燃烧的氧化理论。他指出所谓“脱燃素空气”实际上就是氧气，终于推翻了统治化学近百年的燃素学说。而坚持燃素说的普利斯特里却坚决反对拉瓦锡的新观点，他拒绝接受拉瓦锡对氧和水的任何解释。于是，二人由此开始了一场争论。双方的争论最初出现在《哲学学报》上，后来，这些争论文章又被编辑成一些小册子。他们争论的最后批文章发表在美国出版的《美国哲学会会报》上，其它刊物上也时有他们的文章发表。在争论中，普利斯特里证明，不是所有的酸都含有氧，盐酸就是一个例子。他以此来反对拉瓦锡的氧化理论。但是，普利斯特里在争论中所使用的理论始终是燃素说。这使他象一个守旧的老人，嘴里经常念叨着教条的燃素学说，而丝毫不愿放弃它。普利斯特里与拉瓦锡，一直都在持续地进行各自的观察与研究。但他们观察的深度不同，对观察到的现象背后的本质理解不同。普利斯特里总是躲避开理论上的思考，他只埋头于实验，认为只有实验才是最重要的，陷入了狭隘的经验论，影响他的认识进一步发展。而拉瓦锡则不然，他在实验的基础上很重视理论思考，这使他在科学发展的历史长河中，实现了第一次化学革命。
