DNA

半保留复制：DNA在复制时,以亲代DNA的每一股作模板,合成完全相同的两个双链子代DNA,每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链,这种现象称为DNA的半保留复制(semiconservative replication).DNA以半保留方式进行复制,是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明. 2．有一定的复制起始点：DNA在复制时,需在特定的位点起始,这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段,即复制起始点（复制子）.在原核生物中,复制起始点通常为一个,而在真核生物中则为多个. 3．需要引物(primer)：DNA聚合酶必须以一段具有3"端自由羟基（3"-OH）的RNA作为引物,才能开始聚合子代DNA链.RNA引物的大小,在原核生物中通常为50～100个核苷酸,而在真核生物中约为10个核苷酸. 4．双向复制：DNA复制时,以复制起始点为中心,向两个方向进行复制.但在低等生物中,也可进行单向复制. 5．半不连续复制：由于DNA聚合酶只能以5"→3"方向聚合子代DNA链,因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的.以3"→5"方向的亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连续进行的,这一条链被称为领头链(leading strand).而以5"→3"方向的亲代DNA链为模板的子代链在聚合时则是不连续的,这条链被称为随从链(lagging strand).DNA在复制时,由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment).冈崎片段的大小,在原核生物中约为1000～2000个核苷酸,而在真核生物中约为100个核苷酸.

只考虑半保留复制

在上世纪中叶（1950s）James Watson 和 Francis Crick提出了著名的DNA双螺旋以及双链间碱基配对的模型，根据这个模型，他们进一步提出了DNA复制的半保留模型（semiconservative model），虽然这个模型比当时并存的全保留模型（conservative 模型）看起来简单易行的多，但始终缺乏有说服力的数据。 最后在1957年，当时在Caltech作研究生的Matthew Meselson和作博士后的Franklin Stahl设计并实现了这组著名的，证明了DNA复制半保留机理的实验。试验中，他们先将大肠杆菌细胞培养在用15NH4Cl作为唯一氮源的培养液里养很长时间（14代），使得细胞内所有的氮原子都以15N的形式存在（包括DNA分子里的氮原子）。这时再加入大大过量的14NH4Cl和各种14N的核苷酸分子，细菌从此开始摄入14N，因此所有既存的“老”DNA分子部分都应该是15N标记的， 而新生的DNA则应该是未标记的。接下来他们让细胞们继续高高兴兴地生长，而自己则在在不同时间提取出DNA分子,利用CsCl密度梯度离心分离，而当细胞分裂了一次的时候只有一个DNA带，这就否定了所谓的全保留机理，因为根据全保留机理，DNA复制应该通过完全复制一个“老”DNA双链分子而生成一个全新的DNA双链分子，那么当一次复制结束，应该一半DNA分子是全新（双链都完全只含14N）， 另一半是“全老”（双链都完全只含15N）。这样一来应该在出现在离心管的不同位置，显示出两条黑带。通过与全14N和全15N的DNA标样在离心管中沉积的位置对比，一次复制（分裂）时的这根DNA带的密度应当介于两者之间，也就是相当于一根链是14N，另一根链是15N。而经历过大约两次复制后的DNA样品（generation＝1.9）在离心管中显示出强度相同的两条黑带，一条的密度和generation＝1时候的一样，另一条则等同于完全是14N的DNA。这样的结果跟半保留机理推测的结果完美吻合就这样，关于DNA复制机理的争论终于被Meselson和Stahl完美解决，而基因学和基因组学也得以在此后的五十年取得一系列重大突破。

因为破坏细胞膜才能复制。就是一条DNA链在复制是相互分离,然后其他碱基按照分开的一条链进行复制,因为是按照半条DNA链复制的,所以叫半保留复制。半保留复制是：dna在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶（dna聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两个新的dna分子。子代dna分子其中的一条链来自亲代dna，另一条链是新合成的，这种方式称半保留复制。半保留复制的意义：遗传稳定性的分子机制。

人的细胞先在含氮15的培养基和普通培养基上扩增,得到含氮15的DNA和不含氮15的氮14DNA的两种细胞下一步是将含氮15DNA的细胞取适量转移至普通培养基,经过一代后,用氯化铯密度梯度离心等数量的三种细胞（只经过氮十四培养的、只经过氮十五培养的和两种都经历的）,因为同位素的密度不同,一半氮十五一半氮十四的DNA分子会在氮十五和氮十四的DNA分子之间出现一个新的区带,两代后的细胞离心和一代的比较会发现含有两种氮的杂合的DNA并不会增加,而氮十四的会加倍,这说明DNA在复制时会分成两部分分别构成子代DNA的一半,这些DNA在多代后仍然保持其完整性或者用放射性同位素标记法~！用DNA中含有的P ，S等进行标记`

1．半保留复制：DNA在复制时,以亲代DNA的每一股作模板,合成完全相同的两个双链子代DNA,每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链,这种现象称为DNA的半保留复制(semiconservative replication).DNA以半保留方式进行复制,是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明.2．有一定的复制起始点：DNA在复制时,需在特定的位点起始,这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段,即复制起始点（复制子）.在原核生物中,复制起始点通常为一个,而在真核生物中则为多个.3．需要引物(primer)：DNA聚合酶必须以一段具有3"端自由羟基（3"-OH）的RNA作为引物,才能开始聚合子代DNA链.RNA引物的大小,在原核生物中通常为50～100个核苷酸,而在真核生物中约为10个核苷酸.4．双向复制：DNA复制时,以复制起始点为中心,向两个方向进行复制.但在低等生物中,也可进行单向复制.5．半不连续复制：由于DNA聚合酶只能以5"→3"方向聚合子代DNA链,因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的.以3"→5"方向的亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连续进行的,这一条链被称为领头链(leading strand).而以5"→3"方向的亲代DNA链为模板的子代链在聚合时则是不连续的,这条链被称为随从链(lagging strand).DNA在复制时,由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment).冈崎片段的大小,在原核生物中约为1000～2000个核苷酸,而在真核生物中约为100个核苷酸.

　　在上世纪中叶（1950s）James Watson 和 Francis Crick提出了著名的DNA双螺旋以及双链间碱基配对的模型，根据这个模型，他们进一步提出了DNA复制的半保留模型（semiconservative model），虽然这个模型比当时并存的全保留模型（conservative 模型）看起来简单易行的多，但始终缺乏有说服力的数据。 最后在1957年，当时在Caltech作研究生的Matthew Meselson和作博士后的Franklin Stahl设计并实现了这组著名的，证明了DNA复制半保留机理的实验。　　试验中，他们先将大肠杆菌细胞培养在用15NH4Cl作为唯一氮源的培养液里养很长时间（14代），使得细胞内所有的氮原子都以15N的形式存在（包括DNA分子里的氮原子）。这时再加入大大过量的14NH4Cl和各种14N的核苷酸分子，细菌从此开始摄入14N，因此所有既存的“老”DNA分子部分都应该是15N标记的， 而新生的DNA则应该是未标记的。接下来他们让细胞们继续高高兴兴地生长，而自己则在在不同时间提取出DNA分子,利用CsCl密度梯度离心分离，而当细胞分裂了一次的时候只有一个DNA带，这就否定了所谓的全保留机理，因为根据全保留机理，DNA复制应该通过完全复制一个“老”DNA双链分子而生成一个全新的DNA双链分子，那么当一次复制结束，应该一半DNA分子是全新（双链都完全只含14N）， 另一半是“全老”（双链都完全只含15N）。这样一来应该在出现在离心管的不同位置，显示出两条黑带。　　通过与全14N和全15N的DNA标样在离心管中沉积的位置对比，一次复制（分裂）时的这根DNA带的密度应当介于两者之间，也就是相当于一根链是14N，另一根链是15N。而经历过大约两次复制后的DNA样品（generation＝1.9）在离心管中显示出强度相同的两条黑带，一条的密度和generation＝1时候的一样，另一条则等同于完全是14N的DNA。这样的结果跟半保留机理推测的结果完美吻合　　就这样，关于DNA复制机理的争论终于被Meselson和Stahl完美解决，而基因学和基因组学也得以在此后的五十年取得一系列重大突破。

有一个层面上的意义在这： 旧链一般会甲基化,而新链刚出来的时候还没有,所以在半保留复制产生的新DNA分子中,只有一条链是有甲基化的另一条没有,这样机体就可以区分那一条是旧的,哪一条是新的.如果出现错误配对的情况,比如说A和G配了,修复系统就知道旧链上那个就是对的,新链上那个才是错的,然后就把新链上的那个切掉重新安装 如果是全保留复制的,产生的新DNA中有一个是由两个新链组成的,机体无法修复其中的错误

1．半保留复制：DNA在复制时,以亲代DNA的每一股作模板,合成完全相同的两个双链子代DNA,每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链,这种现象称为DNA的半保留复制(semiconservative replication).DNA以半保留方式进行复制,是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明. 2．有一定的复制起始点：DNA在复制时,需在特定的位点起始,这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段,即复制起始点（复制子）.在原核生物中,复制起始点通常为一个,而在真核生物中则为多个. 3．需要引物(primer)：DNA聚合酶必须以一段具有3"端自由羟基（3"-OH）的RNA作为引物,才能开始聚合子代DNA链.RNA引物的大小,在原核生物中通常为50～100个核苷酸,而在真核生物中约为10个核苷酸. 4．双向复制：DNA复制时,以复制起始点为中心,向两个方向进行复制.但在低等生物中,也可进行单向复制. 5．半不连续复制：由于DNA聚合酶只能以5"→3"方向聚合子代DNA链,因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的.以3"→5"方向的亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连续进行的,这一条链被称为领头链(leading strand).而以5"→3"方向的亲代DNA链为模板的子代链在聚合时则是不连续的,这条链被称为随从链(lagging strand).DNA在复制时,由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment).冈崎片段的大小,在原核生物中约为1000～2000个核苷酸,而在真核生物中约为100个核苷酸.

人的细胞先在含氮15的培养基和普通培养基上扩增，得到含氮15的dna和不含氮15的氮14dna的两种细胞下一步是将含氮15dna的细胞取适量转移至普通培养基，经过一代后，用氯化铯密度梯度离心等数量的三种细胞（只经过氮十四培养的、只经过氮十五培养的和两种都经历的），因为同位素的密度不同，一半氮十五一半氮十四的dna分子会在氮十五和氮十四的dna分子之间出现一个新的区带，两代后的细胞离心和一代的比较会发现含有两种氮的杂合的dna并不会增加，而氮十四的会加倍，这说明dna在复制时会分成两部分分别构成子代dna的一半，这些dna在多代后仍然保持其完整性

DNA的复制顺序是从5"到3"。DNA的复制过程1、起始阶段：解旋酶在局部展开双螺旋结构的DNA分子为单链，引物酶辨认起始位点，以解开的一段DNA为模板，按照5"到3"方向合成RNA短链。形成RNA引物。2、DNA片段的生成：在引物提供了3"-OH末端的基础上，DNA聚合酶催化DNA的两条链同时进行复制过程，由于复制过程只能由5"->3"方向合成，因此一条链能够连续合成，另一条链分段合成，其中每一段短链成为冈崎片段（Okazaki fragments）。3、RNA引物的水解：当DNA合成一定长度后，DNA聚合酶水解RNA引物，补填缺口。4、DNA连接酶将DNA片段连接起来，形成完整的DNA分子。5、最后DNA新合成的片段在旋转酶的帮助下重新形成螺旋状。扩展资料DNA复制的特点1、半保留复制：DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制。DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。2、有一定的复制起始点：DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。3、需要引物（primer)：DNA聚合酶必须以一段具有3"端自由羟基（3"-OH）的RNA作为引物，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。4、双向复制：DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制。5、半不连续复制：由于DNA聚合酶只能以5"→3"方向聚合子代DNA链，因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。参考资料来源：百度百科-DNA复制

DNA 半保留复制是：DNA 在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两个新的DNA分子。 子代DNA分子 其中的一条链来自亲代DNA ，另一条链是新合成的，这种方式称半保留复制。

你好！一般dna分子是由两条链组成的，在产生子代dna时，这两条链就会解开，然后分别以一条链为模板再复制一条新的链，这样子产生的新的两个dna分子就各自有一条链是原来dna分子的。就好比两条铁线a和b缠绕在一起，然后把它们分开，有另外两条铁线c和d，然后让a和c缠绕在一起，b和d缠绕在一起。那么原来的ab就被分到另外两个去了。所以叫半保留复制。

cDNA文库（cDNA library）：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般具有10^5种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都仅有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

DNA文库严格来讲应称作cDNA文库，中文名称是基因文库，是指某生物基因组中所有可表达的基因片段，经mRNA反转录后获得相应的cDNA的集合，将这些cDNA的集合经转入和克隆后贮存于受体细胞群落中，这个受体细胞群落即构成该生物的cDNA文库。

是cDNA文库的基因,大肠杆菌本身是原核生物,真核生物基因组基因往往含有内含子,在真核生物中转录后会被修饰,剪切下来的,而在大肠杆菌中,不能被剪切,所以转基因的时候最好转的是cDNA文库的基因,已切除内含子.另外,不是所有外源基因都适合用大肠做表达菌的,还要具体问题具体分析哦~

酵母单杂交法是研究特定DNA序列和蛋白质相互作用的有效手段，cDNA文库构建作为酵母单杂交实验的核心技术，那么酵母单杂交实验中cDNA文库选择什么试剂盒构建呢？酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白质间的相互作用。酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用。酵母单杂交原理：将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter，Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(activation domain，AD)融合表达载体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件结合，而激活Pmin启动子使报告基因表达。……详细资料请参考：on http://www.bio1000.com/experiment/fenzi/353355.html

一个生物体内的所有基因组成基因文库，基因文库里的基因都是已知的，想要用的时候拿出来就可以，这叫目的基因的获取

这位是搞分子生物学的吗? DNA测序的方法有很多种. 目前最常见的是双脱氧终止法了. 在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了. 也许这样说你不一定明白. 举一个例子, 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下: 在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT. 所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段: GA, GATCCGA, 同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC, 在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG 在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT, 电泳时按分子量大小排列, A反应的片段长度为2, 7; C反应的为4, 5; G反应的为1, 6; T反应的为3, 8, 四个反应的产物分别电泳, 结果为 8 7 6 5 4 3 2 1 A | | C | | G | | T | | 我们可以从右向左读, 为GATCCGAT, 至此, 测序完成(上面这个图在百度知道中显示不正常, 因为百度知道的网页用的是比例字体, 你如果想看它, 拷贝到记事本中, 用等宽的字体来看).

cdna文库以mrna为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cdna，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cdna，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mrna信息的cdna克隆集合称为该组织细胞的cdna文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cdna文库具有组织细胞特异性。cdna文库显然比基因组dna文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组dna文库获得的基因与从cdna文库获得的不同，基因组。dna文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cdna文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cdna基因组文库用限制性内切酶切割细胞的整个基因组dna，可以得到大量的基因组dna片段，然后将这些dna片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组dna片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。将某种生物的基因组dna切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组dna片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。

理论上可以，但是内含子也参与表达调控。实验室用的一般没有内含子。

【答案】：DNA复制时，亲代DNA先行解链，然后以这两条亲代链为模板，按照碱基配对的原则，各形成一条互补的新链。这样，从亲代DNA的一个双股螺旋变为子代的两个双股螺旋。子代DNA分子的一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式就是半保留复制。1958年，Meselson和Stahl首次用15N标记的大肠杆菌DNA实验直接证明了DNA的半保留复制。用14NH4Cl作为唯一的N源培养大肠杆菌，使大肠杆菌DNA全部是含15N的，再将大肠杆菌转移到14N培养基上培养，每隔一段时间取样，提取DNA并作密度梯度离心，经过一代后，DNA只出现一条区带，浮力密度位于15N-DNA和14N-DNA之间，表明这条区带的DNA是由14N/15N-DNA组成的。经过两代后，出现两条区带，一条为14N-DNA，另一条为14N/15N-DNA，若再继续培养，可以看到14N-DNA分子增多。以此方法可证明新合成的DNA双链中，一条链来自亲代，另一条链是新合成的，从而证明了DNA的复制是半保留复制。半保留复制具有极其重要的生物学意义。生物细胞的遗传特性是通过DNA的复制而传给子代细胞的，DNA以半保留的方式进行复制，使子代DNA分子与亲代DNA分子顺序相同，保证了遗传上的稳定性。

dna半保留复制和全保留复制只有一个区别：那就是复制的方式不同。全保留复制是说复制完一次，其中一个DNA还是原来的，另一个DNA两条链是新合成的；半保留复制是复制一次得到的两个DNA各含一条新链和一条原来的旧链。DNA有两条链，以其中一条链作为模板复制的方式叫半保留复制，产生的两个新DNA里都各包含着一条旧链和一条新链、全保留复制则是一两条链为模板复制的，产生的两个新DNA，要不都包含着两条旧链，要不就是两条新链。扩展资料DNA复制的起始机制：虽然不同生物中的复制基因和起始蛋白等会有很大差异，但DNA复制的起始过程都符合识别复制起点-加载解旋酶-组装复制体这个基本程序。复制起点的识别由起始蛋白负责。细菌的起始蛋白是DnaA，含有HTHDNA结合结构域和AAA +结构域。与之相应，复制起点中含有多个DnaA box，可以被HTH结构域识别并结合。DUE是DNA解链元件，富含AT，易于打开双螺旋结构。DnaA-trios是三联体重复序列，可与DnaA的AAA +结构域相互作用，有助于解链。真核生物的复制起点称为自主复制序列（ARS），其中包含一个保守的ARS共识序列ACS。ORC通过AAA +域的起始蛋白特异性基序（ISM）与DNA的磷酸核糖骨架结合，WH域通过一个进入DNA大沟的β-发夹motif结合DNA。这些作用在DNA离开ORC的中央通道时使其弯曲，有助于解旋酶Mcm2-7的装载。

DNA复制分子机制的基本特点是：1. 复制是半保留的；2. 复制起始于细菌或病毒的特定部位，真核生物有多个起始点；3. 复制可以朝一个方向，也可以向两个方向进行，后者更为常见；4. 复制时，DNA的两条链都从5"端向3"端延伸；5. 复制是半不连续的，前导链是连续合成的，后随链是不连续合成的，即先合成短的冈崎片段，再连接起来构成后随链；6. 冈崎片段的合成起始于一小段RNA引物，这一小段RNA以后被酶切除，缺口由脱氧核苷酸补满后再与新生DNA链连接在一起；7. 复制有多种机制，即使在同一个细胞里，也可因环境-酶的丰富程度、温度、营养条件等的不同而具有不同的起始机制和链延长的方式。

DNA 半保留复制是：DNA 在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两个新的DNA分子。 子代DNA分子 其中的一条链来自亲代DNA ，另一条链是新合成的，这种方式称半保留复制。半保留复制的意义：遗传稳定性的分子机制。

【答案】：①在复制时，首先打开亲代DNA分子的双螺旋，然后以每一条单链为模板，按照碱基互补配对原则，酶促合成与模板DNA链完全互补的新链，在子代DNA分子的两条链中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，这种复制方式叫做半保留复制。②DNA分子由方向相反的两条链组成，一条为3"→5"，另一条为5"→3"；但目前所有已知的DNA聚合酶都只能催化DNA链沿5"→3"方向合成，所以延伸方向与复制叉前进方向相同的一条DNA新链可以被连续合成，叫作前导链；而另一条新链的延伸方向与复制叉的前进方向正好相反，不能被连续合成．只能先不连续地生成一些片段，然后由DNA连接酶将这些冈崎片段以3"，5"-磷酸二酯键连接成为一条完整的DNA链，这种过程被称为半不连续复制。

是的，DNA的复制方式就是半保留复制，边解旋边复制

(1)分生区，胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。(2)24都有显示放射性染色体都有显示放射性，每条染色体上有一条染色单体显示放射性。(3)看不到图，估计是上中下三条带，最下边是重，中间是中，上边是轻。没标记是全轻，标记的是全重，分裂一次全是中，那么答案应该是一半轻，一半中。

有一个层面上的意义在这：旧链一般会甲基化，而新链刚出来的时候还没有，所以在半保留复制产生的新DNA分子中，只有一条链是有甲基化的另一条没有，这样机体就可以区分那一条是旧的，哪一条是新的。如果出现错误配对的情况，比如说A和G配了，修复系统就知道旧链上那个就是对的，新链上那个才是错的，然后就把新链上的那个切掉重新安装如果是全保留复制的，产生的新DNA中有一个是由两个新链组成的，机体无法修复其中的错误

1 直接筛选： 1 利用抗性基因标记 2 营养标记 3 阿拉法半乳糖苷酶标记（插入突变）2 菌落原位杂交杂交（质粒文库）/噬菌斑原位杂交（噬菌体文库），然后用southern杂交检测阳性的位点3 对于表达文库的鉴定，可以通过1表形分析，2利用免疫学探针，3 产物生物功能来判断

1 核酸杂交是最常用,最可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子.1)同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.2)部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.3)总cDNA探针:通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.cDNA扣除探针:从第一种mRNA制备cDNA探 针, 连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交;回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的第一种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.* 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆.5)合成寡核苷酸探针2 特异性免疫学检测在cDNA表达文库中,目的基因的表达产 物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测3 cDNA克隆的同胞检测将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆.4 cDNA克隆的确证cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.第四节 目的基因的分离外源基因:插入到载体内的那个特定的片段基因.目的基因:那些已被或者准备要分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA片段.

【答案】：基因文库是指包含某一生物基因组DNA片段的全部克隆。即将整个基因组DNA切成片段，并用合适的载体将全部DNA片段进行克隆。文库中每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。cDNA文库是指包含某一生物mRNA的全部cDNA克隆。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。cDNA文库的优点：①文库中只含表达基因的cDNA，种类数比基因数少得多，较易筛选到目的基因克隆。②真核生物基因由于含有内含子，在原核生物细胞中不能直接表达。cDNA文库中筛选到cDNA克隆，只要附上原核生物的调节和控制序列，就能在原核细胞内表达。③由于cDNA不含真核生物基因的启动子和内含子，因而其DNA序列比基因短，可选用质粒或噬菌体载体作为克隆载体。微生物的单个基因只占基因组DNA的很小部分，要从中分离某一目的基因，就好比大海捞针，是一项十分艰巨的工作。建库后，利用标记的基因探针进行：DNA杂交，或者用抗体与表达蛋白进行免疫反应，或检测表达蛋白活性，从文库中较易筛选出含目的基因的克隆。

提取基因工程的目的基因。基因保存。

必须要酶切，切割的是质粒！夜深了，手机打字也慢，明天中午，我再给你补充详细解释吧。 ——————让您久等了。。。。。。。是的，基因组文库需要酶切，cDNA文库不需要酶切，但这指的是目的基因。不管哪一种，目的基因要想与质粒连接，都是需要酶切的，因为必须把质粒切开，才能连接目的基因。基因组文库，是直接从染色体DNA分子上获取目的基因，肯定需要限制酶进行特异性切割。cDNA文库构建，是用细胞内总的mRNA进行反转录，每个mRNA上只有一个基因，并且不含有内含子（这也是cDNA文库的优点所在）。反转录获得的cDNA不需要酶切（因为只含有一个基因），两端适当处理，即可与切开的质粒DNA连接，再进行转化即可。cDNA不能切，切了就没用了。一般，一个细胞内有上千种mRNA，所以反转录得到的cDNA也是上千种，都不一样，但每个只含有一个基因，cDNA是比较短的。一个cDNA就可以转化一个受体菌，形成一个菌落，这个菌落就只含有这种cDNA了。具体，可以百度一下“cDNA文库”，百科里介绍的有。大学王镜岩《生物化学》教材里介绍的也有。

刚开始我也不知道，在百科里查了一下差不多懂了： 真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难. 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多.

cDNA文库 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA基因组文库 用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。

建库的话随便找个T载体就可以了，只要方便测序就好，至于要实现原核表达的话我个人建议您还是在完成测序后将表达框分离（PCR也好、酶切也好），连接到原核表达载体，我个人推荐使用IPTG诱导、含有组氨酸标签的表达载体，这样也方便后期的纯化工作等。当然如果想直接在普通的大肠杆菌中表达也是可以的，比如前一段时间我搞土壤DNA文库时就是直接将文库在含有筛选剂的极限培养基上筛，获得的克隆直接测序，得到了一个基因，当然其表达框前面不远处就是一个35BP的原核启动子，之后就将这个启动子加上个AGGAGG以及GFP基因的上游18bp序列做引物（上游刚好59bp再多一个都不是1.2元每个碱基了），下游直接是GFP下游引物验证了一下功能。肯定能用的。你也可以试着这样原核表达。不过很冒风险。

构建cDNA文库时，需要将双链cDNA与表达载体连接起来，以便将目标基因表达出来。为了保证双链cDNA与表达载体以正确的方向连接，可以采取以下措施：选择合适的限制性内切酶：在连接双链cDNA和表达载体时，需要使用限制性内切酶进行切割。选择合适的限制性内切酶可以保证连接的方向正确。选择合适的连接方式：连接双链cDNA和表达载体时，可以采用两种不同的连接方式，即末端连接和内部连接。末端连接可以保证连接的方向正确，而内部连接则需要在连接前进行反向转录，以保证连接的方向正确。进行PCR扩增：在连接双链cDNA和表达载体之前，可以进行PCR扩增，以检查连接的方向是否正确。PCR扩增可以通过引物的设计来检查连接的方向是否正确。进行测序验证：在连接双链cDNA和表达载体之后，可以进行测序验证，以确保连接的方向正确。测序验证可以通过测序连接产物来检查连接的方向是否正确。综上所述，为了保证双链cDNA与表达载体以正确的方向连接，需要选择合适的限制性内切酶和连接方式，并进行PCR扩增和测序验证。

cDNA文库 以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库.基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达,而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同,所以cDNA文库具有组织细胞特异性.cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因.但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同,基因组.DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA 基因组文库 用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA,可以得到大量的基因组DNA片段,然后将这些DNA片段与载体连接,再转化到细菌中去,让宿主菌长成克隆.这样,一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段,整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库. 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆.这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合,即基因组文库,它包含了该生物的所有基因.

cDNA以mRNA为模板，基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

是dna与dna配对的 一般是采用含有特异的dna序列的一小段作为探针 1979年Riggs及Comings都提出用某一段已知的DNA作为探针，称为互补DNA（complement DNAs），放射标记后，与羊水细胞的DNA杂交，并用放射自显影法得出结果，诊断胎儿的遗传性疾病 DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。 现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。 对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。这也是许多重要蛋白质的编码基因的克隆方法。该方法的第一步是分离纯化蛋白质，然后测定该蛋白的氨基或羟基末端的部分氨基酸序列，然后根据这一序列合成一套寡核苷酸探针。用此探针在DNA文库中筛选，阳性克隆即是目标蛋白的编码基因。值得一提的是真核细胞和原核细胞DNA组织有所不同。真核基因中含有非编码的内含子序列，而原核则没有。因此，真核基因组DNA探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于cDNA探针。 DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记. 参考资料：http://baike.baidu.com/view/212975.htm

质粒被切以后，和目的基因放在一个体系中，加入DNA连接酶，有可能质粒在切口处重新接上。这样的 质粒上面有标记基因，但没有目的基因。因此，这样的质粒导入受体细胞后也有抗性。这就是假阳性。还有一种假阳性，就是目的基因和质粒在连接时，方向接反了。如何防止假阳性，方法有三种。第一，用同尾酶去切，可防止质粒自身环化；第二、用双标记基因法，如抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因两个标记基因，这个方法一句话给你说不清楚，先简单了解一点；第三、用基因探针去检测，这个方法是最可靠的。

质粒被切以后，和目的基因放在一个体系中，加入dna连接酶，有可能质粒在切口处重新接上。这样的质粒上面有标记基因，但没有目的基因。因此，这样的质粒导入受体细胞后也有抗性。这就是假阳性。还有一种假阳性，就是目的基因和质粒在连接时，方向接反了。如何防止假阳性，方法有三种。第一，用同尾酶去切，可防止质粒自身环化；第二、用双标记基因法，如抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因两个标记基因，这个方法一句话给你说不清楚，先简单了解一点；第三、用基因探针去检测，这个方法是最可靠的。

首先，要了解重组DNA的大小；然后选择引物进行PCR；最后跑电泳，看在相应位置是否存在DNA带。

基因重组 是基因的重新组合，可发生在减一后期，四分体时期，以及基因工程导入基因。重组DNA 是DNA，就是通过基因工程技术接上了新基因的DNA重组质粒 是质粒，是接上了目的基因的质粒。基因重组是理论名字，重组质粒是基因工程技术的中间物，是载体。重组DNA 是结果。

质粒小提试剂盒（TIANprep Mini Plasmid Kit 离心柱型）--碱裂解法 本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异地结合溶液中的DNA。 碱裂解法抽提质粒主要的试剂为溶液P1,P2,P3，其在抽提质粒DNA中的作用如下： Prepare: 检查试剂盒里的试剂是不是都在，2mL灭菌离心管，涡旋振荡器，12000rpm离心机，ddH 2 O 65℃水浴锅预热，溶液P1保存在4℃冰箱中。 Reference: 1.分子生物学实验教程 2.天根质粒小提试剂盒说明书

重组DNA 重组质粒是利用了基因重组原理。基因重组还包括了减数分裂第一阶段末期同源染色体分开，非同源染色体自由组合，这里是一个基因重组；还有就是受精也是基因重组。还有一个就是DNA 重组质粒，这也算是基因重组！

正置的原因是你本来涂板抹开了，但是你没有抹干，如果直接倒置会引起一体流动，结果你会发现，一大堆菌落挤在一起，你没有办法挑单克隆，你会痛不欲生的。在烘箱中正置30分钟是为了烘干液体，防止上述情况发生。而倒置是为了防止，细菌由于重力作用向培养基里面发展而非向上发展哦~

重组质粒主要是DNA，不含蛋白质。只有有核小体结构的（真核生物中），才是由DNA和蛋白质组成。

学习克隆基因组学一.重组质粒的转化、筛选和鉴定操作实验目的:1、学习克隆工作中最常用的双酶切;2、学习将外源基因与质粒连接方法及操作技术;3、学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的技术

重组DNA是目的基因与DNA载体连接而成的。如果该DNA载体是质粒，则重组DNA就是重组质粒。如果该DNA载体不是质粒而是噬菌体的遗传物质或者其他的，就有别的说法，具体我也不清楚。因为基因工程中经常用大肠杆菌质粒作为DNA载体，所以通常称重组质粒为重组DNA。

为什么用同一种限制酶处理质粒和外源DNA形成方式很多（1）质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团．从图1可以看出，质粒上只含有一个SmaⅠ的切点，因此被改酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团．（2）DNA分子的一条多核苷酸链中，两个脱氧核苷酸之间以磷酸基团和五碳糖相连．由题目可知，SmaⅠ识别的DNA序列只有G和C．（3）用SmaⅠ酶切割外源DNA和质粒来重组质粒，其结果是目的基因与抗性基因被破坏．（4）将游离末端重新结合形成DNA使用的是连接酶，获得的环状DNA可能有：原质粒切割的粘性末端重新连接；目的基因的粘性末端连接而成环状；目的基因与切割质粒形成重组质粒．（5）如果使用BamHⅠ和HinRⅢ两种限制酶同时处理外源DNA和质粒，比用EcoRⅠ酶切割的优点是：避免切割的外源DNA、质粒的粘性末端自身环化．（6）导入重组质粒的大肠杆菌能在含有抗生素B的培养基上生存，因此为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加抗生素的培养基培养．

（1）质粒上含有两个SmaⅠ限制酶的切割位点，所以用SmaⅠ限制酶处理图甲所示的质粒会得到2个DNA片段；图乙所示的外源DNA含有一个AluⅠ限制酶的切割位点，所以用AluⅠ处理外源DNA会形成两个黏性末端，增加2个游离的磷酸基团．（2）外源DNA含有四个酶切位点，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位点位于目的基因上，所以不能用此酶切割；用SmaⅠ酶切割会将质粒上两个标记基因均破坏，所以不能用SmaⅠ酶切割；应选用 PstⅠ和HindⅢ酶同时酶切质粒和含目的基因的外源DNA，这样可以避免目的基因和质粒在酶切后产生的片段发生自身环化或任意连接，也便于筛选需要．如果是用PCR技术扩增目的基因，设计引物是关键，但在扩增时退火温度一般为55～60℃，对于（A+T）%＞50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%时一般用60℃，原因是G与C之间是三个氢键，所以C和G比例越高，DNA越稳定．（3）用 PstⅠ和HindⅢ酶同时酶切质粒，会破坏氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能抗四环素，但不能抗癌变青霉素．为了筛选获得含有重组质粒的大肠杆菌，首先将经转化处理过的大肠杆菌接种在含四环素的培养基中，然后用影印法将该培养基上的菌落按原来的方向印在含氯霉素培养基上，以筛选获得含重组质粒的细菌．在含四环素培养基中能生长繁殖，而在含氯霉素培养基中不能生长繁殖的是导入了重组质粒的大肠杆菌．（4）因为大肠杆菌细胞内缺乏内质网与高尔基体，不能对多肽链进行折叠、组装与修饰，所以在上述导入了重组质粒的大肠杆菌菌株中，目的基因正常转录形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白质却并不具有生物活性．故答案为：（1）2　2　（2）PstⅠ和HindⅢ酶　G与C（之间是三个氢键）比例越高越稳定（3）四环素　氯霉素　重组质粒（或目的基因）　（4）大肠杆菌细胞内缺乏内质网与高尔基体（或大肠杆菌缺乏生物膜系统），不能对多肽链进行折叠、组装与修饰

基因组DNA会在你抽提过程中发生断裂,形成几十至几百kb的大片段.如果你跑的是比较浓的胶的话,无法区分不同大小的DNA,所以看起来像是一条带.你可以配点0.6%的胶加lamda hindIII marker跑长时间看看.

基因重组是基因的重新组合，可发生在减一后期，四分体时期，以及基因工程导入基因。重组dna是dna，就是通过基因工程技术接上了新基因的dna重组质粒是质粒，是接上了目的基因的质粒。基因重组是理论名字，重组质粒是基因工程技术的中间物，是载体。重组dna是结果。

启动子和终止子是帮助外源DNA表达的，就是控制转录过程的，要想进行复制，需要的是复制原点

NCBI上查询Bacillus licheniformis。大小在4.16-4.32Mb（10^6 bp）。

采用在细胞核被裂解之前去除细胞质中的茶多酚和蛋白质，而后用SDS裂解细胞核，异丙醇和乙醇沉淀基因组DNA的方法，分别从不同茶树品种新梢、干梢及冰冻新梢中成功地提取和纯化基因组DNA，并对其DNA的得率和质量进行了鉴定。DNA的得率在205～963ng／mg鲜重之间，所得到的DNA样品片段均大于21kb，适宜于进行限制性酶切和RAPD反应。实践证明，上述提取富含酚类物质植物基因组DNA的方法，不仅迅速简单，而且经济有效。

一般来说高等生物的基因组大小也就是DNA碱基数目的大小要大一点，低等生物的要小一点，比如细菌的基因组大小约为10的六次方这个数量级，人的是10的9次方数量级，但也不是绝对，比如阿米巴变形虫的是10的11次方这个数量级，也就是说基因组的大小因物种而异，决定因素暂时没有被报道，但是一般认为功能越复杂的生物基因组的越大。希望能有帮助~~

这个有多方面的原理：一个：PCR有错误，虽然这个错误率很低，普通的酶大概在千分之一，而高保真的在百万分之一，但毕竟有。二个：基因保存的问题：PCR产物当然也可以保存，但保存时间长了会不会出问题？能保存几年？克隆进质粒就不一样了，这个基本可以保存很久，哪一天想要这个基因，拿出来摇一小瓶就可以了。三个：单克隆性，PCR片断可能有长有短（还有突变），而质粒就不一样了，可以挑单克隆，测序正确后就认为这是我们想要的基因。四个：做基因表达时连接方便。如果PCR产品上没有酶切位点，克隆载体上有，切下来可以连到表达载体上。象有些人做基因库时，都是克隆到载体上，肯定是这样有很多优点的。

分子克隆使用最多的DNA连接酶和需要供的能量如下：1、DNA限制性内切酶，是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息；2、连接酶，它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5"-PO4与另一DNA链的3"-OH生成磷酸二酯键；3、聚合酶，系专司生物催化合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的一类酶的统称。

（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应　　外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５"磷酸和相邻的3"羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5"磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口（图1.8），当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５"磷酸和３"羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下述反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。　　ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在加作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这样，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。这样，j与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计，b是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响ＤＮＡ的刚度。　　i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度（单位：mol/L)。理论上，当j=i时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。图1.9显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等，1985）。现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。当连接混合物中线性质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源ＤＮＡ的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。　　涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含：　　１）足量的载体ＤＮＡ，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体ＤＮＡ为20-60μg/ml。　　２）末端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒ＤＮＡ或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。 　　(二）粘端连接 　　１）用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。　　２）按如下所述设立连接反应混合物：　　a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。　　b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。　　c．加入：10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液 １μl　　Ｔ４噬菌体ＮＤＡ连接酶 0.1Weiss单位　　５mmol/L ATP 1μl　　于16℃温育１－４小时　　10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液　　200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)　　50mmol/K MgCl2　　50mmol/L二硫苏糖醇　　500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）　　该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。　　另外，再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，１1968)对该酶进行标化。１个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如Ｎew England Biolabs公司所定义）。因此，0.015Ｗeiss单位的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。在本书中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶一律用Weiss单位表示。par 目前提供的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ４噬体ＤＮＡ连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。　　３）每个样品各取１－２μl转化大肠杆菌感受态细胞。 　　（三）平端ＤＮＡ连接　　Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件：　　１）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。　　２）不存在亚精胺一类的多胺。　　３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。　　４）高浓度的平端。　　１．凝聚剂　　在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：　　１）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行。　　２）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的ＤＮＡ浓度下，所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体。par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。　　（１）聚乙二醇（PEG8000）　　１）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。　　２）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。　　３）浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。　　４）PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。　　（２）氯化六氨合高钴　　１）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。　　２）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状ＤＮＡ将点尽优势。　　３）与ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。　　（四）质粒载体中的快速克隆　　质粒克隆中最慢的步骤是所需的外源ＤＮＡ片段和相应质粒ＤＮＡ区段的电泳纯化，下面的操作方案[由S.Michaelis(个人通讯）根据Struhl(1985)的方法修订而成]是从纯化的凝胶中回收琼脂糖块，熔化后直接进行质粒和外源ＤＮＡ的连接。这一方法寻平端连接和粘端连接都同样奏效，但需大量的连接酶，而且效率要比标准操作方案约低一个数量级。　　１）用适当的限制酶消化外源ＤＮＡ，其量应足以产生约0.2μg的靶片段。反应体积应为20μl或更小。在另一管中，用相应的限制酶消化约0.5μg载体ＤＮＡ，总反应体积为20μl或更小。如载体ＤＮＡ带相同的端，应用磷酸处理如下：用限制酶消化完全后，加2.5μl 100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25单位牛小肠碱性磷酸酶，于37℃温育30分钟。　　２）通过琼脂糖凝胶电泳分离目标片段。务必用低熔点琼脂糖灌制凝胶，务必用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的１xTAE作为电泳缓冲液而不是常规的0.5xTBE来配制凝胶并进行电泳。　　３）在长波长紫外照射下检查凝胶，根据目标条带的相对荧光强度估计所含ＤＮＡ的量（见附录Ｅ）。用刀片切出目标条带，尽可能少琼脂糖的体积（通常40-50μl)。将切下凝胶片分别放入作好标记的各个微量离心管中。　　４）于70℃加热10-15分钏，使琼脂糖熔化。　　５）合并熔化的小份凝胶并放到加温至37℃的中一管中，共终体积应不超过10μl,外源ＤＮＡ与质粒载体的摩尔比应接近２：１。　　用另外两个管设立两个对照连反应，一个只含质粒载体，另一个只含外源ＤＮＡ片段。　　６）将３个管于37℃温育5-10分钟，然后每管加10μl用冰预次的２xT４噬体ＤＮＡ连接酶混合物，在琼脂糖凝固前，充他混匀各管内容物，于16℃温育12-16小时。　　２xT４噬菌体ＤＮＡ连接酶混合物可制备如下：　　1mol/L Tris.Cl(pH7.6) 1.0μl　　100mmol/L氯化镁 1.0μl　　200mmol/L三硫苏糖醇 1.0μl　　10mmol/L ATP 1.0μl　　水 5.5μl　　Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶 １Ｗeiss单位　　混匀后放置于冰浴上。　　７）连接反应行将结束时，取出贮存于-70的３管各200μl的冻存大肠杆菌感受态细胞　　８）于70℃中热10-15分钟重新溶化连接混合物中的琼脂糖。　　９）立即从每管连接混全物中取出５μl加到200μl大肠杆菌感受态细胞中，小心摇晃，快速地混匀内容物。从剩下每管连接混合物中分别再取５μl重复以上步骤，将转化混合物在冰浴上放置30分钟。　　10）完成转化方案的其余各步 分子克隆化是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。克隆(clone,clon)一词源于希腊文Klon，原意为树木的枝条。在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning)含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。分子克隆化-方法 (1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。(5)克隆的选择：①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。分子克隆化-重要意义 分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松驰素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。在基因治疗方面。通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。在工业生产方面，以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。在农业生产方面，植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。

这个有多方面的原理：一个：PCR有错误,虽然这个错误率很低,普通的酶大概在千分之一,而高保真的在百万分之一,但毕竟有.二个：基因保存的问题：PCR产物当然也可以保存,但保存时间长了会不会出问题?能保存几年?克隆进质粒就不一样了,这个基本可以保存很久,哪一天想要这个基因,拿出来摇一小瓶就可以了.三个：单克隆性,PCR片断可能有长有短（还有突变）,而质粒就不一样了,可以挑单克隆,测序正确后就认为这是我们想要的基因.四个：做基因表达时连接方便.如果PCR产品上没有酶切位点,克隆载体上有,切下来可以连到表达载体上.象有些人做基因库时,都是克隆到载体上,肯定是这样有很多优点的.

【答案】：A所谓克隆就是来自同一始祖的相同拷贝的集合，获取同一拷贝的过程称为克隆化，亦称为无性繁殖。从遗传学上讲，分子克隆专指DNA克隆。

不可以，基因芯片的工作原理是碱基互补配对，所以待测的DNA分子要解旋为单链，才可用基因芯片测序，不能直接测序。因为基因探针就是与DNA的其中一条链特异结合形成双螺旋结构才稳定的，待测DNA不解旋的话探针就结合不上去。基因芯片是铺上一层核酸探针，以杂交的方式来检测待测DNA，而不是用来测序的。基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1）固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。它是在基因探针的基础上研制出的，所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。由于尚未形成主流技术，生物芯片的形式非常多，以基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等；以所检测的生物信号种类分，有核酸、蛋白质、生物组织碎片甚至完整的活细胞；按工作原理分类，有杂交型、合成型、连接型、亲和识别型等。由于生物芯片概念是随着人类基因组的发展一起建立起来的，所以至今为止生物信号平行分析最成功的形式是以一种尼龙膜为基质的“cDNA阵列”，用于检测生物样品中基因表达谱的改变。

基因探针就是核酸探针是一段带有检测标记并且序列已知的与目的基因互补的核苷酸序列。

基因工程检测MRNA时所用的探针也是目的基因单链制成的,若目的基因转录成功,则转录的mRNA能够与该探针完全杂交（即碱基互补配对）,当然可以叫做DNA分子探针（或基因探针）

探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA（或RNA）分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术叫核酸探针技术。探针制备就是将目的基因进行标记。特异性探针有三种形式——cDNA、RNA、寡核苷酸。cDNA和寡核苷酸是目前最常采用的探针。RNA探针用途很广，也容易获得，但其不稳定性限制了其商业用途。cDNA探针的获得是，将特定的基因片段装载到质粒或噬菌体中，经过扩增、酶切、纯化等复杂的步骤，才能得到一定长度的cDNA探针。这一过程比较复杂，有相应条件的实验室才能做到。寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下，由核酸合成仪来完成，可廉价获得大量的此类探针。质量也相对来说更为稳定。由于cDNA探针长度通常为数百至数千个碱基，所以有良好的信号放大作用，但其渗透性比较差。寡核苷酸探针一般为十数个至数十个碱基，渗透性强，但信号放大作用则较差，合成的多相寡核苷酸探针，敏感性可以达到cDNA探针水平。探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记。特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期短，虽使用不方便，但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶，经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物（ABC法），酶催化底物显色，观察结果。ABC法底物显色生成不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差，成本高，但便于运输、保存，灵敏度与放射物标记法相当。 ①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5′端核苷酸，同时在3′端修复加入被标记核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀，多用于大分子DNA标记，(>1000bp最好)，但单链DNA、RNA不能用该法标记。 ②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有a-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。 ③末端标记法（又叫尾标）。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测，该探针可用核酸合成仪人工合成，克隆出的探针一般较长，特异性好，标记量大，杂交的检出信号强。 1、4—6微米切片，用防脱片胶（多聚赖氨酸）处理过的玻片贴附 2、56—60℃烤片2—16h 3、新鲜二甲苯脱蜡，10minX2（趁热脱蜡） 4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空气干燥 5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸馏水稀释，浓度为25μg/ml），37℃消化10—15min 6、弃去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然后空气干燥 7、加入20μl探针，加盖薄膜。（探针用预杂交液稀释，浓度为5μg/ml）。 8、95℃变性10—12min；立刻置于冰块上，防止复性。 9、37℃杂交16—20h 10、揭去薄膜，每张切片加入以下杂交后洗涤液： >用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次； >0.5XSSC37℃洗涤3minX2次； >0.2XSSC37℃洗涤3minX2次； 11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤，1minX3次 12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育45—60min； 13、0.1MPBS浸洗，5minX3次 14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液，37℃孵育45—60min。 15、0.1MPBS浸洗，5minX3次 16、滴加NBT/BCIP显色6—16h， 17、双蒸水终止反应（37℃10min—2h），双蒸水浸洗，5minX2次 18、滴加核固红，30秒—5min； 19、双蒸水浸洗，5minX3次 20、脱水、透明、封片

DNA探针和标记基因可以是同一个东西吗DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。

DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。这也是许多重要蛋白质的编码基因的克隆方法。该方法的第一步是分离纯化蛋白质，然后测定该蛋白的氨基或羟基末端的部分氨基酸序列，然后根据这一序列合成一套寡核苷酸探针。用此探针在DNA文库中筛选，阳性克隆即是目标蛋白的编码基因。值得一提的是真核细胞和原核细胞DNA组织有所不同。真核基因中含有非编码的内含子序列，而原核则没有。因此，真核基因组DNA探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于cDNA探针。DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。 cDNA（complementary DNA）是指互补于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA经一种称为逆转录酶（reversetranscriptase）的DNA聚合酶催化产生的，这种逆录酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒时发现的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称反向转录或逆转录。携带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后，病毒RNA在逆转录酶的催化下转化成双链cDNA，并进而整合人宿主细胞染色体DNA分子，随宿主细胞DNA复制同时复制。这种整合的病毒基因组称为原病毒。在静止状态下，可被复制多代，但不被表达，故无毒性。一旦因某种因素刺激而被活化，则该病毒大量复制，如其带有癌基因，还可能诱发细胞癌变，后来发现逆转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，而且哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞也含有逆转录酶。逆转录酶的作用是以dNTP为底物，RNA为模板，tRNA（主要是色氨酸tRNA）为引物，在Trna3"-OH末端上，5"－3"方向，合成与RNA互补的DNA单链，称为互补DNA（cDNA），单链cDNA与模板RNA形成RNA-DNA杂交体。随后在逆转录酶的RNaseH活性作用下，将RNA链水解成小片段。cDNA单链的3"末端回折形成一个小引物末端，逆转录酶又以第一条cDNA链为模板再合成第二第cDNA链，至此，完成逆转录全过程，合成双链cDNA。逆转录已成为一项重要的分子生物学技术，广泛用于基因的克隆和表达。从逆转录病毒中提取的逆转录酶已商品化，最常用的有AMV逆转录酶。利用真核Mrna3"末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT)）用作引物，在逆转录酶催化下合成互补于mRNA的cRNA链，然后再用RNaseH将mRNA消化掉，再加入大肠杆菌的DNA聚合酶I催化合成另一条DNA链，即完成了从mRNA到双链DNA的逆转录过程。所得到的双链cDNA分子经S1核酸酶切平两端后接一个有限制酶切点的接头（linker），再经特定的限制酶消化产生粘性末端，即可与含互补末端的载体进行连接。常用的克隆载体是λ噬菌体DNA，如λgt，EMBL和Charon系列等。用这类载体可以得到包含104以上的转化子的文库，再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。 RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。又如进行中的转录分析（nuclearrunontranscrip－tionassay）时，在体外将细胞核分离出来，然后在α-32P-ATP的存在下进行转录，所合成mR－NA均掺入同位素而得到标记，此混合mRNA与固定于硝酸纤维素滤膜上的某一特定的基因的DNA进行杂交，便可反映出该基因的转录状态，这是一种反向探针实验技术。近几年体外转录技术不断完善，已相继建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体pSP和pGEM，这类载体在多克隆位点两侧分别带有SP6启动子和T7启动子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以进行RNA转录，如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段，则可以此DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。这种体外转录反应效率很高，在1h内可合成近10μg的RNA产生，只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记的NTP，则所合成的RNA可得到高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记物的利用率。值得一提的是，通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链以模板转录RNA。这种可以得到同义RNA探针（与mRNA同序列）和反义RNA探针（与mRNA互补），反义RNA又称cRNA，除可用于反义核酸研究外，还可用于检测mRNA的表达水平。在这种情况下，因为探针和靶序列均为单链，所以杂交的效率要比DNA-DNA杂交高几个数量级。RNA探针除可用于检测DNA和mRNA外，还有一个重要用途，在研究基因表达时，常常需要观察该基因的转录状况。在原核表达系统中外源基因不仅进行正向转录，有时还存在反向转录（即生成反义RNA），这种现象往往是外源基因表达不高的重要原因。另外，在真核系统，某些基因也存在反向转录，产生反义RNA，参与自身表达的调控。在这些情况下，要准确测定正向和反向转录水平就不能用双链DNA探针，而只能用RNA探针或单链DNA探针。综上所述，RNA探针和cRNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。 合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点：一.由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短，如20nt的寡核苷酸探针在浓度为100ng/ml，靶序列为1～100pg、1kb片段或3×10-18~3×10-16mol/L时，达到最大程度的杂交只需10min，而用2kb的克隆探针在同样条件下达到完全杂交则需16h。二.寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。三.一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列和/或选择相对长的序列（>30nt）亦可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有18～40个碱基，合成仪可有效地合成至少50个碱基的探针。 下面是筛选寡核苷酸针的一些原则。一.长18～50nt，较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些。二.碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。三.探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。四.避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。五.一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。按上述原则选出的探针会增加成功的机会，选定后进行合成与标记，并摸索合适的杂交条件。方法是制备几张点有特异靶DNA和不相关DNA的膜，各膜分别在不同温度下与探针杂交，特异靶DNA杂交信号强而非特异DNA不产生任何杂交反应的就是最适杂交温度。在进行点突变检测杂交的反应时，洗膜条件和温度物选择往往更为重要。所选漂洗条件必需使野生型靶DNA与探针产生强的杂交信号而突变型靶DNA则不产生杂交信号，这可以通过逐渐提高洗膜温度来完成。寡核苷酸探针还有一个重要用途。在用于检测单个碱基差异时尚可采用一种称为寡核苷酸限制（oligonucleotiderestriction）的技术。该技术只有在突变点位于某一限制性内切酶识别位点时才有效。例如，镰刀状红细胞贫血是因β珠蛋白基因的第6个寡码子由GAG变成GTG，从而导致所编码氨基酸由酪氨酸变成缬氨酸。突变的β-珠蛋白功能异常，称作S珠蛋白，而野生型称为A珠蛋白，其基因型分别为βS和βA。恰好突变点A→T位于DelI的识别序列CT－NAG之内，这就为设计寡核苷酸限制实验创造了条件。方法是合成一个长40个碱基的寡核苷酸探针，其5"末端距突变碱基有11个碱基，该探针与βA基因的非编码链互补。将此探针的5"末端标记上32P。杂交方法采用液相杂交法，即在液相中将靶DNA变性解链，然后与探针退火，产生杂交体。如靶DNA为βA型，则两条链完全互补，并产生DdeI的酶切位点；如待检DNA为βS型，则所形成的杂交体中两条链在突变碱基处不配对，从而不能被DelI所识别。用DelI消化杂交DNA，显然βA会被切开而βS不被切开。βADNA杂交体被切开后，5"端探针序列因只有8个碱基，与杂交链结合不紧而解离，从而产生游离的5"端标记8核苷酸单链。不被切开的βS杂交体尚可被另一个限制酶HinfI消化，该酶的识别位点紧靠DelI识别位点上游。βS杂交DNA经HinfI消化后，将释出探针DNA的5"末端3核苷酸小片段。βADNA杂交体因已无HinfI识别序列，故而不能被HinfI消化。这样βA和βSDNA经此寡核苷酸探针杂交和DelI及HinfI消化后，分别产生游离的8核苷酸（8nt）和3核苷酸（3nt）片段，它们可以经电泳分离后进行放射自显影而获证实。藉此策略，可轻易将各种β珠蛋白突变型鉴别开，如纯合野生型AA结果为仅有8nt片段，纯合突变型SS则仅可检出3nt片段，而杂合子AS型则两种片段均存在。

DNA分子克隆和PCR反应都是用来扩增DNA片段的方法，但是它们有一些明显的不同。DNA分子克隆是指在细胞中将某段DNA复制到一种载体上（如质粒或转基因菌），从而增加DNA的数量。该过程需要运用质粒介导的遗传克隆技术，通常需要进行一些操作，如酶切、酶连接、转录、翻译等。PCR反应是一种快速的增广DNA的技术，它可以通过从DNA样品中分离出任意一段DNA片段并进行多次复制，从而增加该片段的数量。该过程通常在实验室中进行，并不需要利用生物体内的生物机制。因此，两种技术的最大不同在于它们所采用的方法不同，一个是利用生物体内的生物机制，另一个是利用实验室条件和工具。此外，DNA分子克隆需要许多操作，比较复杂，而PCR反应简单快速，但是灵敏度较低。

从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。 　　一、RNA制备　　模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。　　细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3"末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 　　二、cDNA第一链的合成　　所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNANA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。 　　AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3"端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。　　三、cDNA第二链的合成　　cDNA第二链的合成方法有以下几种: 　　(1) 自身引导法 合成的单链cDNA 3"端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5"端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。 　　(2) 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。　　四、cDNA的分子克隆 　　已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体。

　　如何利用分子克隆技术获得dna复制起始区　　由于DNA分子是一个独特的双螺旋结构，是由两条平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成，在复制时，以亲代DNA分子的两条链分别为模板合成子代DNA分子，所以DNA分子的复制是半保留复制．　　1. 复制的起始点与方向　　DNA分子复制时，在亲代分子一个特定区域内双链打开，随之以两股单链为模板复制生成两个子代DNA双链分子。开始时，复制起始点呈现一叉形（或Y形），称之为复制叉（replication fork）。复制进行中，复制叉乃向前移动。　　（1）复制的起始点　　DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此特定部位称为复制起始点（origin of replication），可以ori表示。在原核生物中复制起始点常位于染色体的一个特定部位，即只有一个起始点。真核生物的染色体中是在几个特定部位上进行DNA复制的，是有几个复制起始点。　　（2）复制的方向　　复制的方向可以有三种不同的机制，其一是从两个起始点开始，各以相反的单一方向生长出一条新链，形成两个复制叉【图示1】，例如腺病毒DNA的复制。其二是从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉【图示2】，例如质粒ColEI。其三是从一个起始点开始，沿两个相反的方向各生长出两条链，形成两个复制叉【图示3】。这种方式最为常见，因此也是最重要的双向复制（bidirectional replicatim）。故答案为：半保留复制

cDNA区别于后面，这个是RNA反转录得到的基因，最大特点是没有内含子。结构基因和调节基因联系记：前者转录翻译出组成人体组织蛋白质，后者转录翻译出调节体内生化反应蛋白质。编码基因与DNA编码链和模版链联系起来记。结构基因，调控基因联系到操纵子里面记。

……作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，……基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(dna或rna)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基基因探针因的一部分；可以是dna本身，也可以是由之转录而来的rna。

不一定。基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。1．探针的来源DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomicprobe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa探针（cDNaprobe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。2．探针的制备进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过分子克隆（molecularcloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。为了制备cDNA探针，首先需分离纯化相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。3.探针的标记为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用放射性同位素32P标记探针的某种核苷酸α磷酸基。但近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素标记的优点是保存时间较长,而且避免了同位素的污染。最常用的探针标记法是缺口平移法(nicktranslation)。首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNapolymerasⅠ）的5"→3"的外切酶活性，切去带有5"磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5"→3"聚酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3"的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。探针的标记也可以采用随机引物法，即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3"OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得比放射性很高的DNA探针。

基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。

目录 1 拼音 2 注解 1 拼音 DNA tàn zhēn 2 注解 DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百堿基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。 对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。这也是许多重要蛋白质的编码基因的克隆方法。该方法的第一步是分离纯化蛋白质，然后测定该蛋白的氨基或羟基末端的部分氨基酸序列，然后根据这一序列合成一套寡核苷酸探针。用此探针在DNA文库中筛选，阳性克隆即是目标蛋白的编码基因。值得一提的是真核细胞和原核细胞DNA组织有所不同。真核基因中含有非编码的内含子序列，而原核则没有。因此，真核基因组DNA探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于cDNA探针。 DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。

基因探针是 单链DNA吗基因探针是单链DNA基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。1．探针的来源 DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa 探针（cDNa probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。2．探针的制备 进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组 DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。为了制备cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。3.探针的标记为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用放射性同位素32P标记探针的某种核苷酸α 磷酸基。但近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素标记的优点是保存时间较长,而且避免了同位素的污染。最常用的探针标记法是缺口平移法(nick translation)。首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNa poly merasⅠ）的5"→3"的外切酶活性，切去带有5"磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5"→3"聚酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3"的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。探针的标记也可以采用随机引物法，即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3"OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得比放射性很高的DNA探针。

DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。DNA探针可以用来诊断寄生虫病，现场调查及虫种鉴定，可用于病毒性肝炎的诊断，遗传性疾病的诊断，可用于改造变异的基因，可用于检测饮用水病毒含量。具体方法：用一个特定的DNA片段制成探针，与被测的病毒DNA杂交，从而把病毒检测出来。与传统方法相比具有快速、灵敏的特点。传统的检测一次，需几天或几个星期的时间，精确度不高，而用DNA探针只需一天。据报道，能从1t水中检测出 10个病毒来，精确度大大提高