菌落阳性克隆pcr产物电泳条带在孔里，跑不下去是怎么回事

实验原理。经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间通常说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

1、琼脂糖凝胶电泳判别是阳性克隆琼脂糖凝胶电泳判别是阳性克隆根据重组子遗传重组表型改变的筛选法：利用抗生素抗性基因进行筛选，利用报告基因筛选克隆子，据重组子结构特征的筛选法，琼脂糖凝胶电泳比较重组DNA的大小。2、限制性内切酶分析。印迹杂交方法。PCR法。

掌握碱裂解法提取技术。阳性克隆的筛选实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和克隆载体的筛选与鉴定方法，了解抗药性筛选互补筛选的原理。

【答案】：B阳性杂交瘤细胞的克隆化（单个细胞培养）方法包括有限稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选仪、软琼脂平板法。其中实验室最常用的是有限稀释法。

大肠埃希菌转化实验中，出现假阳性克隆的原因可能是（） A.载体自身环化效率过高B.琼脂平板上的抗生素失活或含量过低C.载体DNA与插入片段的分子比率过高D.抗生素的浓度过高E.感受态细胞失活正确答案：ABC

简单的说一下：1.扩增目的基因，比如通过PCR的方法。2.PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPOTA的方法插入到载体质粒。3.转染大肠杆菌4.筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。5.挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

做PCR都要考虑Tm值吧。M13引物一般是M13F,M13R；M13F(-47),M13R(-48)配对使用。如果做菌落PCR验证阳性克隆的话，如果只是把目的片段插入到多克隆位点处，这两对引物哪一对都可以的。如果是样品需要测序的话，由于接近引物的读出效果不好，如果克隆的位点接近CMS的两端，一般需要用M13F(-47),M13R(-48)来测序。

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这是一种分子生物学的方法。比如，在大肠杆菌中导入一个目的基因，要怎样才知道有没有导入进去呢？所以要同时导入一个报告基因（目的基因和报告基因位于同一个载体上）。导入了报告基因的大肠杆菌在含抑制性物质的培养基上就可以生长，而不含报告基因的大肠杆菌（就是转化失败的）就不能生长。这样过了两三天后，在培养基上看见的菌落就是阳性科隆。这一过程就是阳性科隆筛选。一般选用的报告基因像青霉素抗性基因，链霉素抗性基因等等。如果还想了解得更详细，就去买本分子生物学实验书或入门书籍看看就明白了。

含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子 。氨苄霉素简称为氨苄，具有杀灭细菌的作用，如常见的大肠杆菌、DH5α这一类的感受态细胞。在未重组的情况下，他们是不具备抗氨苄的能力，一起培养会被氨苄杀死。如果在感受态细胞里重组加入像PUC18一类的具有抗氨苄性质的基因片段，在与氨苄一起培养生存下来的只有重组的这一种，其他的杂菌会被氨苄杀死，因此得到纯净的重组细菌。氨苄的作用就是筛选出来目的菌种即为重组的细菌。

你这种插法，阳性克隆子会失去抗性，死于四环素，正常情况没有这么筛选的。非要这么设计实验的话，那就先用不含四环素的培养基培养单菌落，然后每个单菌落进行扩增，逐个去涂含有四环素的培养基，无法存活的就是阳性克隆子。

1 菌落PCR。设计引物扩增质粒特有的目的片段，如果阳性克隆里面有改片段，则说明转化成功。2 快抽质粒。将阳性菌落划平板，几个小时后，富集菌，然后快速抽提。看质粒大小有没有插入目的片段。3 提质粒，酶切鉴定。4 提质粒测序。1,2 都是早期的快速鉴定，假阳性高；3,4慢，但是比较确信。一般组合来用。

质粒被切以后，和目的基因放在一个体系中，加入dna连接酶，有可能质粒在切口处重新接上。这样的质粒上面有标记基因，但没有目的基因。因此，这样的质粒导入受体细胞后也有抗性。这就是假阳性。还有一种假阳性，就是目的基因和质粒在连接时，方向接反了。如何防止假阳性，方法有三种。第一，用同尾酶去切，可防止质粒自身环化；第二、用双标记基因法，如抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因两个标记基因，这个方法一句话给你说不清楚，先简单了解一点；第三、用基因探针去检测，这个方法是最可靠的。

原因可能是多方面的：1.你所说的阳性克隆仅仅是在抗性平板上生长的菌落吗？如果是，或许它是假阳性。因为抗性平板上抗生素的分布不均匀，部分降解等会造成抗生素的失效，从而出现没有转进质粒的假阳性菌落，这时当然提不出质粒来。2.如果能保证阳性菌落是正确的（确实转进质粒），那么质粒提不出来很可能是你所用的质粒快提试剂盒或者试剂有问题，这就需要重新配试剂或购买新试剂盒。

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

克隆技术的应用克隆技术已展示出广阔的应用前景,概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种,保存和传播动物物种资源.以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明. 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一,转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器,以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等.但目前转基因动物的实际应用并不多,除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外,转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长,已进行了10多年,但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验,6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生.转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵,以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状,是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因. 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命,动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能.采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移,可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率.同时,采用转基因体细胞系,可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选.在核移植前,先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中,再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆,然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中,最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物.采用此法,Schnieke等（Bio Report,1997）已成功获得6只转基因绵羊,其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因）,3只带有标记基因,目的外源基因整合率高达50％.Cibelli（Science,1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛,证实了该法的有效性.由此可以看出,当今动物克隆技术最重要的应用方向之一,就是高附加值转基因克隆动物的研究开发. 胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞.科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型,来替代那些受损的体内组织,比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内.科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞,使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞.这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路.目前,科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998,Science）,而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能.把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚,把重组胚体外培养到囊胚,然后从囊胚内分离出ES细胞,获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞,肌肉细胞和血细胞）,用于替代疗法.这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗,而非得到克隆个体,科学家们称之为“治疗克隆”. 克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的,它为研究配子和胚胎发生,细胞和组织分化,基因表达调控,核质互作等机理提供了工具. 就医学界而言,现今全世界有成千上万的人因为失去自身的器官而十分痛苦,克隆技术对于这些人来说,无疑是一大福音.试想,一个从小失明的人能在成年后重见光明,一个因交通事故失去双手的人能重新“长”出一双手来……如果克隆的研究获得成功,白血病、帕金森病②、心脏病和癌症等疾病患者带来生的希望.而且这种治疗方法会最大程度地减少副作用的产生. 克隆技术的发展对生物学界也是有很大益处的.目前人类对自然界的各种生物乃至人类本身的了解还是十分有限的.如果能运用先进的克隆技术对某些生物进行研究,那么将大大提高研究的效率,从而加快生物界乃至人类社会发展的进程. 刀,可以用来杀人,也可以用来救人,关键看它掌握在什么人手中.“科学是一柄双刃剑”,善良的人们可以利用它来为人类服务,为人类造福,而邪恶的人们却能用它来危害人类的生存.任何科学技术的发展,都有利有弊,只要人类正确运用克隆技术,那么它一定会有益于人类.如果我们只看到它的弊端,而畏缩不前,那么人类社会就不会有发展,也不会有进步.我们不能因噎废食,因为那样只能使人类固步自封,这就是我们想看到的结果吗?我坚信,只要能正确对待克隆技术,那么人类一定会从中受益匪浅.

最常见的就是蓝白斑筛选，详细的楼主可参考这个http://baike.baidu.com/view/161221.htm方法很多，除蓝白斑筛选外，像菌落PCR验证：详见http://baike.baidu.com/view/4118663.htm从细菌里提取质粒后双酶切验证：用构建重组质粒时的两种限制性酶进行酶切，电泳，观察条带是否和重组之前，目的基因电泳时条带所处的位置一致。测序验证：送测序公司

GFP本身是绿色荧光蛋白(Green Fluorecent protein)的缩写，至于你说的大肠杆菌GFP是个菌，要么是可以表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌重组菌，要么是你把蛋白和菌搞混了。筛选氨苄青霉素抗性的阳性克隆很简单，将氨苄青霉素加到所用培养基中，终浓度100ug/ml，把要筛选的菌液涂布其上，能长出的就是氨苄青霉素阳性菌株。要注意的是生长时间不可太长，因为水解氨苄青霉素的beta-内酰胺酶能分泌到细菌外，导致阳性菌周围的阴性菌也能生长，即所谓的卫星菌落。

在单克隆抗体中，为何需要多次检测细胞阳性，检测阳性，就是能产生特定抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

胞培养动物细胞培养：从动物机体中取出相关的组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，生长，增殖。1丶选材：动物胚胎或幼龄动物的器官或组织。2丶细胞分离：使器官组织分离成单个细胞，常用方法，物理：剪刀剪碎，化学法：胰蛋白酶，胶原蛋白酶3丶制作细胞悬浮液，方法：加培养液。形成细胞悬浮液4丶培养细胞株，原代培养，传代培养5丶形成细胞系，传代培养，遗传物质的改变。2细胞融合方法：物理法，电刺激，振动，离心。化学法，聚乙二醇（PEG）强烈的吸水性，有凝聚蛋白质的作用。病毒法，紫外线照射后灭活仙台病毒，丧失了感染活性，保留了融合活性原理：细胞膜的流动性。用途及意义：制备单克隆抗体。3克隆抗体单克隆：由一个细胞通过有丝分裂形成一个细胞群。单克隆抗体：由一个浆细胞通过有丝分裂形成一个细胞群，这个细胞群可以产生特异性抗体。4原理利用了免疫，细胞融合，动物细胞培养等原理。B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。5材料效应B细胞（只有效应B淋巴细胞才能产生出特异性的抗体）骨髓瘤细胞（能无限增殖）6过程1）免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。3）细胞融合的关键:1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。5）克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。6）细胞的冻存与复苏7）大规模单克隆抗体的制备 选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。

基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程叫基因克隆。 基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。 体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰，如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。导入受体细胞载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化（transformation），转染（transfection），转导（transduction）。重组质粒通过转化技术可以导入到宿主细胞中，同样重组噬菌体DNA可以通过转染技术导入。转染效率不高，因此将重组噬菌体 DNA或柯斯质粒体外包装成有浸染性的噬菌体颗粒，借助这些噬菌体颗粒将重组DNA分子导入到宿主细胞转导技术，这种转导技术的导入效率要比转染的导入效率高。 从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：（一）插入失活法外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。（二）PCR筛选和限制酶酶切法提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。（三）核酸分子杂交法制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。（四）免疫学筛选法获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。

BamH 1 的酶切位点在tet上，所以酶切重组后，质粒就不会再表达四环素抗性抗性了，筛选阳性克隆要挑选在Amp平板上生长的菌株，而在Tet平板上生长的菌株是插入失败的。

　　G418的选择细胞原理：　　由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。　　由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml～1000ug/ml范围。在筛选之前，一定要确定细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。　　由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。　　加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。　　为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除阴性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或者用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。　　一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。　　G418（Geneticin,遗传霉素） 是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞DNA后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

将载体转入大肠杆菌，在含有Amp的培养基上培养，蓝白斑筛选阳性克隆，再提取质粒DNA，PCR检测就可以了。

不知对不对。第一， TA克隆的自身环化是造成这种现象的最主要原因，根据我的经验，不同公司提供的TA载体的自身环化率在20%到50%之间。这个比例可以通过优化连接反应的条件进行改善。无非就是提高反应体系中目的基因片段的含量，通常DNA:TA载体大概应在1：3左右，加入更多片段可以显著提高链接的效率。再就是提高DNA片段的纯度，减少其中的杂质，这需要通过改进DNA凝胶纯化的方法来实现。QIAGEN的凝胶纯化试剂盒非常好。常量高纯度也好。 第二， 除了自身环化之外就是在PCR产物不纯，里面还有引物等小片段，这些东西更容易与TA载体链接，最后进行酶切鉴定时又看不到插入片段。这一般不容易发生，有的人喜欢用柱子纯化PCR产物，我则习惯跑胶后纯化，这样PCR产物和引物等已经完全分离，则不会发生这种情况。 第一点是最主要的，改善链接反应后可以将假阳性的比例降至极低，前段时间我克隆了10个基因，每板挑取4个克隆，其中8个基因的片段插入率都能达到100%。另2两也能达到75%。选用高质量的TA和凝胶纯化试剂盒是关键。推荐QIAGEN的凝胶纯化和PROMEGA的TA克隆。作为常规的TA克隆法,所需连接时间较长,因载体自连而造成较多的假阳性，这句摘自http://www.bio-toyobo.cn/origin/protocol/TAK.pdf你再看看http://www.takara.com.cn/bbs/showtopic.asp?TOPIC_ID=2399&Forum_ID=1能不能有什么收获。

基因敲除小鼠已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的实验动物模型，在生命科学、人类医药和健康研究领域中发挥着重要的作用。基于胚胎干细胞的基因打靶技术、EGE技术（基于Crispr cas9技术）是当下比较火热的基因敲除小鼠制备技术。利用这两种技术制备基因敲除小鼠的流程是什么样的？一、 基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠的流程：1. 课题设计，订购课题BAC菌；2. 按照课题设计，完成打靶载体设计和构建；3. 将重组载体电转到胚胎干细胞中，用G418筛选转染后的胚胎干细胞，得到阳性克隆；4. 进一步通过PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对上一步得到的阳性克隆进行筛选，得到稳定整合外源基因的胚胎干细胞阳性克隆；5. 将胚胎干细胞阳性克隆注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宫内；6. 得到嵌合鼠，并获得F1阳性杂合子小鼠。基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠是目前为止唯一一个可以满足几乎所有基因组修饰要求的打靶技术，但目前只应用在小鼠的基因敲除上，而且其周期长工作量大。二、 利用EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠的流程1. 设计构建识别靶序列的sgRNA;2. 设计构建致靶基因切割的EGE系统载体质粒；3. 利用百奥赛图自主开发的UCA试剂盒对sgRNA/Cas9进行活性检测；4. 设计构建打靶载体；5. 体外转录sgRNA/Cas9 mRNA;6. 小鼠受精卵原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体；7. 获得Fo代小鼠，利用PCR对Fo代小鼠进行基因型鉴定；8. 获得F1代小鼠，利用PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对F1代小鼠进行基因型鉴定。虽然EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠看似比基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠流程繁琐，其实不然，EGE技术（基于Crispr cas9技术）系统构建简单，基因敲除/敲入效率高，速度快，可实现多基因、多物种基因敲除/敲入，最快2个月即可得到F0代阳性鼠，5个月得到F1F1代杂合子小鼠。

首先，要了解重组DNA的大小；然后选择引物进行PCR；最后跑电泳，看在相应位置是否存在DNA带。

目的基因的克隆是利用一个单一的基因副本的行为。有pcr方法，凝胶电泳方法，色谱法，琼脂糖凝胶电泳法，质粒法等。具体方法可分别检索文献。 常用的植物目的基因克隆技术1、通过已知基因产物的分析和鉴定 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。 （2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共』虮嗦氲氖芴逯浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担圆≡し⒆拥鞍孜咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共』颍绶延胛薅净騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。 3、以图谱为基础的定位克隆技术 以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。

挑出几个菌落直接培养测序是不适当的.菌落中有很大一部分比例转进去的是空载体,没有成功连入目的基因片段.所以要多挑一些单菌落,培养后用菌液PCR或者提质粒后双酶切鉴定是否连入目的基因,选择成功连入目的基因（阳性克隆）的再拿去测序.你现在的测序结果,很有可能只是载体本身的序列.质粒如果需要测序，说明你们实验室对这个质粒中插入的基因序列不清楚，需要通过测序知道其中到底是什么基因，绝大多数情况下是做了克隆之后需要去确认插入到目的载体中的序列是不是正确，这样才能进行下一步的实验。PCR产物测序一般是为了确认PCR产物序列的正确，因为PCR过程中有可能会发生突变或者其他导致序列改变的情况，只有确认之后才能进行后续实验。

1 不是。因为没有生色底物，阴性菌落虽然可以表达lacZ，但无法显色。2 全部转接至含X-gal的新鲜选择培养基上，培养后看是否为白色。要么以pcr法对所有菌落作鉴定。或者所有菌落转接至液体培养基扩增后抽质粒，看质粒大小。

可能感受态细胞转化效率太低，用质粒作为阳性对照检测感受态的转化效率；可以尝试提高载体或插入片段的纯度，对于平端连接需注意适当延长连接时间；可能载体酶切不够充分，用未经连接的载体转化作为阴性对照；连接体系不合适，如连接酶可能失活或活性下降，更换新的连接酶及Buffer；连接条件不合适，温度或反应时间不合理，请仔细参照连接酶的产品说明书。

最常用的方法是在PCR之后 用Northern杂交的方式检测 这个效果很好的 当然了 如果实验室里面有专用的芯片就更好了

因为你选择的引物不太合适，最好用一个载体上的通用引物加一条目的基因的特异引物做菌落PCR，这样会大大降低假阳性；如果你用目的基因本身引物做菌落PCR，挑菌时一定要小心不要沾到培养基（里面有大量的未连接的片段），然后PCR扩增的循环数要少（<25）,做好阴性对照（在平板上没有斑的地方挑一下），跑出亮亮的目的片段才是真的阳性克隆

3.通过构建原核表达载体，将该蛋白的基因转入细菌中，利用细菌的翻译系统，表达该蛋白。4.具体步骤目的片段的获得 根据已知序列设计带酶切位点的基因引物，扩增得到该基因序列。连接 将目的片段和原核表达载体分别酶切处理，回收酶切片段。通过连接酶连接。转化 讲构建好的表达载体转化细菌，涂布在特定抗性的平板上。阳性克隆的筛选、鉴定 挑取阳性克隆，通过菌落PCR鉴定是否为阳性。目的蛋白的表达 将经过验证的阳性克隆扩大培养，即成功在细菌内表达了人体蛋白。望采纳

因为酶切鉴定比蓝白斑选择要可靠些，而且有好多质粒没有Lac-系统，此外蓝白斑不同的质粒显色效率也不一样。重组质粒也可采用PCR鉴定，最可靠的只直接测序。

将重组载体电转到胚胎干细胞中基因敲除小鼠已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的实验动物模型。基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠是目前为止唯一一个可以满足几乎所有基因组修饰要求的打靶技术.课题设计.获得F1代小鼠.利用百奥赛图自主开发的UCA试剂盒对sgRNA/Cas9进行活性检测；7、EGE技术（基于Crisprcas9技术）是当下比较火热的基因敲除小鼠制备技术；4;Cas9mRNA；5；2，利用PCR和southernblot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对F1代小鼠进行基因型鉴定.得到嵌合鼠.小鼠受精卵原核注射sgRNA/.按照课题设计，完成打靶载体设计和构建;2，基因敲除/，用G418筛选转染后的胚胎干细胞.体外转录sgRNA/。利用这两种技术制备基因敲除小鼠的流程是什么样的，得到阳性克隆;敲入效率高，速度快;敲入，可实现多基因，最快2个月即可得到F0代阳性鼠.进一步通过PCR和southernblot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对上一步得到的阳性克隆进行筛选，但目前只应用在小鼠的基因敲除上，在生命科学;6.设计构建打靶载体；3.获得Fo代小鼠，利用PCR对Fo代小鼠进行基因型鉴定；3.设计构建识别靶序列的sgRNA，其实不然；4、利用EGE技术（基于Crisprcas9技术）制备基因敲除小鼠的流程1，5个月得到F1F1代杂合子小鼠、人类医药和健康研究领域中发挥着重要的作用、基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠的流程.将胚胎干细胞阳性克隆注射到小鼠囊胚中。基于胚胎干细胞的基因打靶技术？一，并获得F1阳性杂合子小鼠，得到稳定整合外源基因的胚胎干细胞阳性克隆，EGE技术（基于Crisprcas9技术）系统构建简单：1；5。虽然EGE技术（基于Crisprcas9技术）制备基因敲除小鼠看似比基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠流程繁琐，而且其周期长工作量大，订购课题BAC菌.设计构建致靶基因切割的EGE系统载体质粒；8;Cas9mRNA和打靶载体，并植入到假孕小鼠的子宫内；6。二、多物种基因敲除/

简单的说一下：扩增目的基因，比如通过PCR的方法。PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。转染大肠杆菌筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

简单的说一下：扩增目的基因，比如通过PCR的方法。PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPOTA的方法插入到载体质粒。转染大肠杆菌筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子 。

最常见的就是蓝白斑筛选,详细的楼主可参考这个http://baike.baidu.com/view/161221.htm 方法很多,除蓝白斑筛选外,像 菌落PCR验证：详见http://baike.baidu.com/view/4118663.htm 从细菌里提取质粒后双酶切验证：用构建重组质粒时的两种限制性酶进行酶切,电泳,观察条带是否和重组之前,目的基因电泳时条带所处的位置一致. 测序验证：送测序公司

最常见的就是蓝白斑筛选，详细的楼主可参考这个http://baike.baidu.com/view/161221.htm方法很多，除蓝白斑筛选外，像菌落PCR验证：详见http://baike.baidu.com/view/4118663.htm从细菌里提取质粒后双酶切验证：用构建重组质粒时的两种限制性酶进行酶切，电泳，观察条带是否和重组之前，目的基因电泳时条带所处的位置一致。测序验证：送测序公司

gfp本身是绿色荧光蛋白(green fluorecent protein)的缩写，至于你说的大肠杆菌gfp是个菌，要么是可以表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌重组菌，要么是你把蛋白和菌搞混了。载体带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。筛选氨苄青霉素抗性的阳性克隆很简单，将氨苄青霉素加到所用培养基中，终浓度100ug/ml，把要筛选的菌液涂布其上，能长出的就是氨苄青霉素阳性菌株。要注意的是生长时间不可太长，因为水解氨苄青霉素的beta-内酰胺酶能分泌到细菌外，导致阳性菌周围的阴性菌也能生长，即所谓的卫星菌落菌种筛选strain screening指将从自然界或实验室保藏的菌株中用不同方法选出具有特殊性能的菌株，如筛选抗生菌时可用能对其产生拮抗作用的菌作为筛选对象进行筛选;[1] 在筛选能利用烃类的菌时可用仅含烃类的培养基进行筛选:

简单的说一下：扩增目的基因，比如通过PCR的方法。PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。转染大肠杆菌筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

1. 扩增目的基因，比如通过PCR的方法。2. PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。3. 转染大肠杆菌4. 筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。5. 挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

1. 查明mRNA 全序列2。 PCR扩增从ATG 到终止密码的全长3。 连接入载体，比如TA TOPO或者直接接入表达载体4。 转染大肠杆菌5。 筛选阳性克隆，测序确认。6。 培养表达蛋白，提纯。

2.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。抗原-抗体杂交原理

【答案】：B阳性杂交瘤细胞的克隆化（单个细胞培养）方法包括有限稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选仪、软琼脂平板法。

是dna与dna配对的 一般是采用含有特异的dna序列的一小段作为探针 1979年Riggs及Comings都提出用某一段已知的DNA作为探针，称为互补DNA（complement DNAs），放射标记后，与羊水细胞的DNA杂交，并用放射自显影法得出结果，诊断胎儿的遗传性疾病 DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。 现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。 对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。这也是许多重要蛋白质的编码基因的克隆方法。该方法的第一步是分离纯化蛋白质，然后测定该蛋白的氨基或羟基末端的部分氨基酸序列，然后根据这一序列合成一套寡核苷酸探针。用此探针在DNA文库中筛选，阳性克隆即是目标蛋白的编码基因。值得一提的是真核细胞和原核细胞DNA组织有所不同。真核基因中含有非编码的内含子序列，而原核则没有。因此，真核基因组DNA探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于cDNA探针。 DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记. 参考资料：http://baike.baidu.com/view/212975.htm

原理：B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。过程1）免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。6）细胞的冻存与复苏7）大规模单克隆抗体的制备 选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。意义：用于以下各种生命科学实验并具有医用价值（1）沉淀反应：Precipitation reaction（2）凝集实验：haemaglutination （3）放射免疫学方法检测免疫复合物（4） 流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离。（5）ELISA 等免疫学检测（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的 亲和力 。 (7) 免疫印记（western blotting)（8） 免疫沉淀：（9） 亲和层析：分离蛋白质（10） 磁珠分离细胞（11）临床疾病的诊断和治疗；

目的基因的克隆是利用一个单一的基因副本的行为。有pcr方法，凝胶电泳方法，色谱法，琼脂糖凝胶电泳法，质粒法等。具体方法可分别检索文献。 常用的植物目的基因克隆技术1、通过已知基因产物的分析和鉴定 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。 （2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共』虮嗦氲氖芴逯浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担圆≡し⒆拥鞍孜咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共』颍绶延胛薅净騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。 3、以图谱为基础的定位克隆技术 以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。