不白九百 -
用于基因工程的工具酶
一,限制性内切酶(Endonucleosase)
(一)限制性内切酶(Endonucleosase)的发现与分类
1) 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断,从而保证其不为外来噬菌体所感染,而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护,这种现象叫做限制-修饰,它们由三个基因位点所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年后,人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理:
hsd R---限制性内切酶
hsd M---限制性甲基化酶
hsd S---控制两个系统的表达
1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶,Hind II和Hind III,为基因工程技术的诞生奠定了基础.
截止到目前为止,已经分离出400余种II类酶,搞清识别位点的有300种,商品化的约有一百种,而实验室常用的有二十种 .
2)限制性核酸内切酶可分为三大类:
I类 能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性.
II类 识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断
III类 识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部.
因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶.
(二)II类限制性内切酶的命名及特性
命名原则:取属名的第一个字母大写,取种名的前两个字母小写,构成基本名称.该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等.如存在变种和品系,取变种或品系的一个字母.若酶存在于质粒上,则需大写字母表示非染色体遗传因子.
如,HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶.EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上.
(三)II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点
绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4,5,6碱基对,这些碱基对的顺序呈回文结构(Palindromic),而且切点就在其内部,如EcoRI 5"-GAATTC-3" .
DNA被限制性内切酶切开之后,呈现两种断口:
钝端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等
粘端(粘性末端)如:EcoR I等
图2-1 限制性内切酶产生的末端
(四)识别位点在DNA分子中的频率
对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸(44)有一个识别位点,而六碱基的酶大约4096(46)个核苷酸有一个识别序列,计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的.实践中这种方法不完全正确,如λ DNA长49kb,对于六碱基的酶应该有12个切割位点,实际上要少一些,如Bgl II只有6个,BamHI只有5个,而SalI只有2个.
二,甲基化酶
在专一位点上甲基化,与限制性内切酶相对应.
(一)大肠杆菌中的甲基化酶
dam甲基化酶: 可在5"GATC3"序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,这样可使一些识别顺序中含有5"GATC3"的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)则不会因为N6A的甲基化而失去活性,因为这两种酶对底物的特异性不同.
dcm甲基化酶 此酶在序列5"CCAGG3"或5"CCTGG3"中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影响的限制性内切酶是EcoR II.
(二) 甲基化酶在基因工程中用途
许多II类限制性内切酶,都存在着相对的甲基化酶,它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上,封闭酶切位点,从而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上,从而使DNA免受EcoRI的切割.
三,T4-DNA连接酶(T4-DNA Ligase)
来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,连接修复3"端羟基和5"端磷酸基因,脱水形成3"-5"磷酸二酯键
连接双链DNA上的单链缺口(Nick),因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端
连接RNA模板上的DNA链缺口
连接平头双链DNA速度很慢,在高浓度的底物和酶的作用下方可进行,这属于分子之间的连接.
图2-2 连接酶的作用方式
四,核酸酶
作用: 降解磷酸二酯键
分为:外切酶 内切酶
(一) Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性,双链特异的内切酶活性.依赖于Ca2+
用途:
构建限制酶图谱
产生末端缺失突变
DNA超螺旋线性化
(二)E. coli外切酶III
只降解DNA分子的一条链,产生单链的DNA分子.
(三)S1核酸酶(来源于米曲霉菌)
特性:
1. 降解单链DNA或RNA,降解DNA的速度大于降解的速度
2. 降解发生的方式为内切和外切
3. 酶切活性需4.0-4.5pH环境,Zn2+激活
4. 酶量过大时会降解双链核酸,因为双链降解活性比单链低75000倍
(四) DNase I: 来自于牛胰腺, 既可以降解单链也可以降解双链,没有特异性,产生单核苷酸或短链
五,聚合酶
(一)DNA聚合酶I
5"-3"聚合酶活性
3"-5"外切酶活性
5"-3"外切酶活性
核酸内切酶活性
可以被枯草杆菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5"-3"外切酶活性的分子.
图2-3 DNA聚合酶I
(二) Klenow酶
该酶无5"-3"外切活性,保留了5"-3"聚合活性及3"-5"外切活性,基因工程中利用该酶:
修复限制性内切酶造成的5"突出的粘性末端
标记DNA探针
催化cDNA第二条链的合成
末端终止法测序
图2-4 Klenow 酶的作用方式
(三) T4 DNA聚合酶
与Klenow酶相似,外切酶活性更高.体外诱变反应中效率很高.
(四)T7 DNA聚合酶
测序酶
(五) Taq DNA聚合酶
耐高温,主要用于PCR反应.
(六) 逆转录酶:将mRNA转录成cDNA
AMV逆转录酶(鸟类成髓细胞性白血病病毒)
DNA聚合酶活性
RNase H活性
DNA内切酶活性
核酸结合活性
M-MLV逆转录酶(Moloney鼠白血病病毒)
两种逆转录酶的区别
肽链的组成
禽酶2条肽链,具聚合酶和很强的RNase H活性
鼠酶1条,较弱的RNase H活性
反应的最适温度
禽酶42°C,二级结构丰富RNA,禽酶效率高
反应的最适pH值
禽酶pH 8.3
鼠酶pH 7.6
六,DNA修饰酶
有大量的修饰酶,主要的有以下几种:
1) 碱性磷酸酯酶(来自于大肠杆菌或小牛肠道)可以去掉DNA分子的5"端的磷酸基团.
2) polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌,在5"端增加磷酸基团.
3) 末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl tansferase) 来自于小牛胸腺组织,在DNA分子的3"端增加一个或多个脱氧核苷酸.
4) Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构
第二节 DNA的切割反应
一,缓冲系统的组成
II类酶的酶活条件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM
根据不同酶对盐离子要求不同,可将缓冲液分为以下三种情况:
高盐:100-150mM
中盐:50-100mM
低盐:0-50mM
二,酶切操作
DNA量的确定,加入酶量的确定,发应体积的确定(20μl),反应时间的确定,1-1.5hr,一般为37℃,但也有例外,如Taq I在65°C时活性最高.
单位限制性内切酶定义为:在最佳缓冲系统和20μl体积中反应1小时,完全水解1μgDNA所需的酶量.
三,酶切结果分析
(一) 酶切片段的检测
1) 通过凝胶电泳分离,根据分子量分离.根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段,聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子.
2) DNA分子的检测 a. 染色EB,DNA分子小于25ng,很难检测到
b. 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子.
(二)估计DNA分子的大小
根据DNA分子的迁移率,可以用公式计算出分子量D=a-b(logM)
D是移动的距离,M是分子量,a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变.
也可以根据已知大小的片段进行比较,误差约在5%左右.
四,多酶联合酶解
对于对浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶解;
对于对浓度要求不同的酶,可以:
1. 低盐浓度的酶先切,后补加NaCL
2. 一种酶切后,换缓冲液,加5mM NaAc 0.1体积,2体积乙醇,冰浴5min,4℃离心10min,干燥
五,定位酶切位点
建立酶切图谱需要一系列的酶.
首先确定每一种酶切后产生的分子量和片段的数目;
然后进行双酶切;
比较酶切和双酶切的结果,绘制酶切图谱;
含糊的位点可以通过部分酶切解决,可以短时间的酶切或者在4°C条件下进行.
六, 限制性内切酶的star活性
在PH不合适,或甘油浓度过高≥10%时,限制性内切酶的切割位点会出现非专一性,因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下.
第三节 DNA片段的连接
重组DNA分子构建的最后一步是连接,通过连接酶完成.相对而言,钝端的连接效率较低,因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会.而粘性末端的连接效率较高,因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对.这种暂时的,碱基配对结构可以提高连接的效率.在分子克隆的连接方式主要有以下几种:
一,连接方式
(一)相同粘性末端的连接
来源:
相同的酶
同尾酶
问题:
极性有两种可能
同尾酶连接后,不能用任何一种酶酶切.称为"焊死".
(二)平头末端的连接
粘性末端--分子内部连接,平头末端--分子间的连接.
提高连接效率的方法:
加大酶用量(10倍)
加大平头末端底物的浓度
加入10%PEG(8000),促进分子间的有效作用
加入单价阳离子, 150-200mM NaCl
提高反应温度
平头连接同样存在两种极性
(三)不同粘性末端的连接
突出5"末端
Klenow补平,或S1核酸酶切平,然后平头连接
突出3"末端
T4-DNApol切平,然后平头连接
突出末端不同
Klenow补平,或S1核酸酶切平
连接后,可能恢复限制性位点,甚至还可能产生新的位点.XbaI与HindIII( XbaI恢复), XbaI与EcoRI(均保留),BamHI与Bgl II(产生ClaI位点)
(四)人工粘性末端的连接
5"突出的末端
外源片段先用Klenow补平;然后用TdT补加polyC;载体片段也用Klenow补平,加polyG,退火不经连接即可转化.目的是:不使酶切位点遭受破坏.
3"突出的末端
外源片段先用TdT加polyG;载体片段加polyC;然后退火;再用Klenow补齐;连接
平头末端
可直接用TdT补加末端,但以加polyA/T为佳.这样稍微加热,AT区就会出现单链区域,然后用S1核酸酶水解即可回收片段
(五)粘端与平端的连接
linker : 人工合成的,含有限制性内切酶识别序列的,短的双链DNA片段.
– 连接的效率较高
– 酶切时可能破坏DNA分子的完整.
adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸.
图 2-5 linker的连接方式
(六)粘性末端的更换
在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口
– BamHI酶切片段用Klenow补平,或用S1酶切平;连接一段linker或Adaptor,使之产生EcoRI粘性末端.这样BamHI切口就换成了EcoRI切口 .
– 由AluI更换EcoRI:AluI切开,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切开,Klenow补平,连接,原来含有AluI的片段变成含有EcoRI
二,重组率
重组率:连接反应结束后,含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比.较为理想的重组率为25-75%
提高重组率的方法:
连接反应条件 外源片段:载体=2:1-10:1(分子数),增加碰撞机会,减少自身环化.
载体除磷 (磷酸酯酶5"除磷).
TdT在3"端增加人工粘性末端,防止载体自我环化 .