T7RNA聚合酶的介绍

T7是启动子（T7 promoter），是来自于T7噬菌体的能够对T7RNA聚合酶有特异性反应的强启动子，是启动T7噬菌体基因转录的一段序列。T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。T7 RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其合成mRNA的速度比普通大肠杆菌的RNA聚合酶快5倍左右。扩展资料体外转录技术不断完善，已相继建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体pSP和pGEM，这类载体在多克隆位点两侧分别带有SP6启动子和T7启动子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以进行RNA转录，如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段，则可以此DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。参考资料来源：百度百科-强启动子参考资料来源：百度百科-T7RNA聚合酶参考资料来源：百度百科-RNA探针

t7rna聚合酶没活性就无法使用该酶进行任何反应。根据查询相关公开信息显示，如果T7RNA聚合酶失去活性，就无法使用该酶进行任何反应。因此，必须首先确定原因，并采取适当的措施，才能使该酶恢复明显的活性，以确保反应效率。

T7是启动子（T7 promoter），是来自于T7噬菌体的能够对T7RNA聚合酶有特异性反应的强启动子，是启动T7噬菌体基因转录的一段序列。T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。T7 RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其合成mRNA的速度比普通大肠杆菌的RNA聚合酶快5倍左右。注意：启动子特异性除了基于转录RNA的类型选择启动子外，还需要确保质粒上的启动子能在使用的宿主细胞中工作。因为不同细胞类型和组织中的转录机器不同，相应的启动子也不同。细菌的启动子只能在原核细胞中或者只能在同种菌或亲缘关系较近的菌株中工作。同样地，各种类型的真核细胞（哺乳动物，酵母、植物等）需要独一无二的启动子，并且很少有交叉。一般来说，相比真核细胞启动子，细菌中启动子的多样性和复杂度更低。启动子不同，基因的表达状态可能也不同，一些启动子能一直保持活性状态，而另外一些会受到更严格的调控。受调控的启动子可能只在特定的组织或生长阶段起作用，启动子的开关可能还会受到诸如化学物质、环境温度、光照条件等环境因素的影响。在细胞中，启动子受到很多其它调控因子的控制，如增强子、绝缘子和沉默子等，然而，有时也会发生一些错误的转录，这对细菌来说不算什么大事，但是会影响实验的结果，甚至如果你的目的基因表达有毒产物，则可能会杀死细胞。为了避免这种情况发生，科学家创造了合成启动子，并且通常会融合一些其它的启动子元件，以便启动子能够被更严格地调控。

一个pcr反应体系中不包含的一项内容是：T7 RNA聚合酶。PCR反应体系主要由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成。设计PCR引物时的一般原则：1、引物长度：一般15~ 30碱基，过短则特异性低；过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。2、避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。3、G/C和A/T碱基均匀分布，G/C含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。4、要避免两个引物间特别是3"末端DNA序列互补以及同一引物自身3"末端的序列互补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。5、引物3"端碱基一般应与模板严格配对，并且3" 端为G、C或T时引发效率较高。6、引物5"端碱基可不与模板匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别位点、ATG起始密码子或启动子序列等)。这些与原初模板并不配对的非互补序列在后续的循不中将被带到双链DNA中去，这样反应产物不仅含有目的序列，同时在目的基因两侧又有了的限制酶切位点，用相应的限制酶切割后即可将PCR产物定向克隆到载体中。PCR反应体系的主要成分包括：PCR就是聚合酶链式反应。再外界情况下完成对核算片段的迅速合成。主要成分：有两端引物，Taq DNA聚合酶、模板DNA，合成DNA的核苷酸。主要程序：模板DNA的变性，两条链解开。引物模板退火，二者碱基配对。DNA聚合酶以四种核甘酸为底物，在引物引导下合成和模板互补的DNA新链。重复此过程。搜索：fmri基因检测是什么。rna的三个主要功能。反应体系。聚合酶标准。举例说明什么是核酶。什么是引物二聚体。pcr反应体系的原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应。将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

T7表达体系里面包括什么（） A.T7启动子B.T7RNA聚合酶C.T4DNA连接酶D.lac启动子正确答案：T7启动子；T7RNA聚合酶；lac启动子

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lpl(l噬菌体的左向启动子)、t7噬菌体启动子等。（1）lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是dna分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(laci)、启动基因(p)、操纵基因(o)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过cap(catabolitegeneactivationprotein)因子和camp来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生lacz阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如iptg可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与o基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）tac启动子：tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比lac和trp都强。其中tac1是由trp启动子的－35区加上一个合成的46bpdna片段(包括pribnow盒)和lac操纵基因构成，tac12是由trp的启动子-35区和lac启动子的-10区，加上lac操纵子中的操纵基因部分和sd序列融合而成。tac启动子受iptg的诱导。（4）lpl启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子。lpl启动子受控于温度敏感的阻遏物cits857。在低温(30℃)时，cits857阻遏蛋白可阻遏pl启动子转录。在高温(45℃)时，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl启动子转录。系统由于受cits857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导pl启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体ci+溶源菌，并用丝裂霉素c或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）t7噬菌体启动子：它是来自t7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有t7rna聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。t7rna聚合酶的效率比大肠杆菌rna聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有t7rna聚合酶。应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。

　　含有t7或sp6启动子质粒只能在大肠杆菌菌株中发挥作用的原因：　　T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。　　1、强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；　　2、诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；　　3、通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 （2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。 （4）lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子。lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物 cIts857。在低温(30℃)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(45℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。系统由于受cIts857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导PL启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体cI+溶源菌，并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。 （5）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体。

目录 1 拼音 2 英文参考 3 聚合酶链式反应的定义 4 聚合酶链反应的历史回顾 4.1 核酸体外扩增最早的设想 4.2 聚合酶链反应的发明 5 聚合酶链反应相关技术的发展 6 其它扩增技术 6.1 连接酶链反应 （A） 6.2 依赖核酸序列的扩增 （A） 6.3 转录依赖的扩增系统 （A） 6.4 Qβ复制酶反应 （A） 7 PCR技术的应用举例： 8 PCR的基本原理和概念 8.1 基本原理 8.2 参与PCR反应体系的因素及其作用 9 聚合酶链式反应检查 9.1 聚合酶链式反应正常值 9.2 聚合酶链式反应临床意义 10 参考资料 这是一个重定向条目，共享了聚合酶链式反应的内容。 1 拼音 jù hé méi liàn fǎn yìng 2 英文参考 polymerase chain reaction [WS/T 203—2001 输血医学常用术语] PCR [WS/T 203—2001 输血医学常用术语] 3 聚合酶链式反应的定义 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是指由引物选择性体外扩增DNA或RNA片段的检测方法[1]。该方法在输血领域可用于各种血型分型、骨髓移植配型、输血传播疾病病原体检测等[1]。 聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种分子生物学实验方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即模板DNA先经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与两条模板DNA链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）为底物，使退火引物得以延伸。如此反复，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。[2] 4 聚合酶链反应的历史回顾 4.1 核酸体外扩增最早的设想 由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时（1970年）Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。 4.2 聚合酶链反应的发明 直到1985年，美国PECetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）, 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA的体内 复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PECetus公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。 5 聚合酶链反应相关技术的发展 PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和 英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用 与技术本身的优化问题；第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进 展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。 （表）聚合酶链反应的相关技术 名　　　称 主要用途 简并引物扩增法 扩增未知基因片段 巢居PCR 提高PCR敏感性、特异性，分析突变 复合PCR 同时检测多个突变或病原 反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变 单一特异引物PCR 扩增未知基因组DNA 单侧引物PCR 通过已知序列扩增未知cDNA 锚定PCR 分析具备不同末端的序列 增效PCR 减少引物二聚体，提高PCR特异性 固著PCR 有利于产物的分离 膜结合PCR 去除污染的杂质或PCR产物残留 表达盒PCR 产生合成或突变蛋白质的DNA片段 连接介导PCR DNA甲基化分析、突变和克隆等 RACEPCR 扩增cDNA末端 定量PCR 定量mRNA或染色体基因 原位PCR 研究表达基因的细胞比例等 臆断PCR 鉴定细菌或遗传作用 通用引物PCR 扩增相关基因或检测相关病原 信使扩增表型分型（mapping） 同时分析少量细胞的mRNA 6 其它扩增技术 与PCR及其相关技术发展的同时，新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利 弊，与PCR互为补充，有的可结合应用，共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我 们相信，随着分子生物学技术的发展，这一家族一定会再涌现出新成员。 其它体外核酸扩增技术（表） 技术 应用 转录依赖的扩增系统（TAS） 检测HIV 连接酶链反应（LCR） 检测点突变 自主序列复制（3SR）系统 研究RNA，临床应用、法医学等 链替代扩增（SDA） 检测、鉴定基因 Qβ复制酶系统 增加探针检测敏感性 循环探针反应 增加探针检测敏感性 6.1 连接酶链反应 （A） 连接酶链反应（Ligase　chain　reaction，LCR）,是一种新的DNA体外扩增和检测 技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。是Backman　1997年为检出靶基因序列 中的点突变而设计发明，并申报了专利。 LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接,经变性退火连 接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。 LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94℃min变性 和65℃复性并连接，循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用 点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单堿基遗传病多 态性及单堿基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。 6.2 依赖核酸序列的扩增 （A） 依赖核酸序列的扩增（Nucleic　acid　sequencebased　amplification,NASBA） ，又称自主序列复制系统（selfsustained　sequence　replication，3SR）或再生长 序列复制技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术。 NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序。 其基本方法为：将引物,标本加入扩增反应液，65℃1min使RNA分子二级结构打 开,降温至37℃加入逆转录酶,T7RNA聚合酶和RNase　H,并在37℃反应1～1.5小时,其 产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。 NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。 6.3 转录依赖的扩增系统 （A） 转录依赖的扩增系统（Tranbased　amplification　sytem，TAS），是 Kwen等人于1989年研究报道的，主要用于扩增RNA。 TAS的主要特点是扩增效率高，因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加，只需6个 循环靶序列的拷贝数就能达到2×106。它的另一个特点是特异性高，由于TAS只能进行 6次温度循环，错掺率低，加之用葡聚糖珠夹心杂交，因而特异性也高。 虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和 T7RNA多聚酶，有待进一步研究。 6.4 Qβ复制酶反应 （A） Kacian等于1972年首次报报Qβ复制酶（Qbeta　replicase）催化RNA模板的自我 复制功能，它能在常温30min，将其天然模板MDV1RNA扩增至109。1986年Chu等报道 用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV1RNA杂交，经洗脱未被结合 的MDV1后，再加入Qβ复制酶，扩增复制MDV1拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同 源性的第二探针杂交。 Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点：①不需寡核苷酸引物的引 导就可启动RNA的合成。②能特异地识别RNA基因中由于分子内堿基配对而形成的特有 的RNA折叠结构。③在Q　β复制酶的天然模板MDV1　RNA的非折叠结构区插入一短的 核酸序列不影响该酶的复制。　因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被 Qβ复制酶扩增。 1988年Lizardi等，将靶基因序列 *** MDV1质粒里，用T7　RNA聚合酶催化转录 出MDV1　RNA探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针,加入Qβ 复制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增。其产物 按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复 制等技术。 7 PCR技术的应用举例： 研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结 合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆 或表达载体；检测某基因的内切酶多态性 诊断：细菌（螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致 病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等）；病毒（HTLV、HIV、HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19）；寄生虫（疟疾 等）；人遗传病（LeshNyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等） 免疫学：HLA分裂；T细胞受体或抗体多样化的定性；自身免疫病基因作图；淋巴因子定量 人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建（检测DNA、 多态性或 *** 绘图）；物理图谱的构建；测序，表达图谱 法医：犯罪现场标本分析；HLADQ 肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤 组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；生态学；环境科学；实验遗 传学。 古生物学：考古与博物馆标本分析 动物学：动物传染病的诊断等 植物学：检测植物病原等 8 PCR的基本原理和概念 8.1 基本原理 DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。 PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热（变性）、冷却（退火、保温（延伸）等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。PCR的具体过程如下： 将PCR反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3"端与5"端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3"端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为2^n倍。当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。PCR扩增过程见图81。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）^n，R为扩增效率。 8.2 参与PCR反应体系的因素及其作用 参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、反应温度与循环次数、PCR仪等。现对它们的作用介绍如下： （一）模板核酸 用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。 PCR反应时加入的DNA模板量一般为100100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的堿基错配。 通常模板DNA用线性DNA分子，若为环状质粒，最好先用酶将其切开成线状分子，因为环状DNA复性太快。 （二）引物 引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。因此，引物设计决定PCR反应的成败。 PCR反应中有两种引物，即5"端引物与3"端引物。5"端引物是指与模板5"端序列相同的寡核苷酸，3"端引物是指与模板3"端序列互补的寡核苷酸。对引物的基本要求有：①引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有1630bp，因为4^164.29x10^9，已大于哺乳动物基因组3x10^9bp，保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74度），亦会影响产物的特异性。②G+C的含量一般为40％60％。③四种堿基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。尤其是引物3"端，不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。④引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补堿基不能大于3bp。⑤两引物之间不应互补，尤其是它们的3"端不应互补。一对引物之间不应多于4个连续堿基有互补性，以免产生引物二聚体。④引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补堿基同源，否则导致非特异性扩增。①引物3"端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3"端A影响最大，因此，尽量避免在引物3"端第一位堿基是A。引物3"端也不要是编码密码子的第三个堿基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。⑧引物5"端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等，引物的设计最好以电脑软件进行指导。 反应体系中，引物浓度一般要求在O.10.5μmol之间。浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。 引物Tm值与退火温度有关，计算公式为：Tm4（G+C）+2（A+T）。引物Tm值最好在5580℃范围，以接近72℃为最好。 （三）耐热的TaqDNA聚合酶 1976年Chien分离出热稳定聚合酶，1986年Erlich分离并纯化了适于PCR的Tq热稳定性聚合酶，为PCR成为实用技术奠定了基础，现已用基因重组生产。日前可用于PCR的聚合酶有多种：有从水生栖热菌中提取的Taq酶、从嗜热栖热苗中获得的Taq酶、从Litoralis栖热球菌中分离的VENT酶、及从酸热浴硫化裂片苗中分离的Sac酶，而以Taq酶用得最广泛。Taq DNA聚合酶分子量为94kD，75℃时酶比活性为150bs/酶分子，反应温度过高或过低均影响其延伸率，Taq蕾有很高的耐热稳定性。实验表明，在92.5℃、95℃、97.5℃时，其半衰期分别为40min、30min和5min。 纯化的Taq酶在体外无3"5"外切酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。错配堿基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。通常，30次循环Taq酶的错配率约为0.25％，高于Klenow酶的错配率。Taq酶在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，堿基替换率为1/8000。应用低浓度的dNTP（各20μmol／L）、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10^6次/（核苷酸*循环）。 Taq酶具有类似于末端转移酶的TdT的活性，可在新生成的双链产物的3"端加上—个堿基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲将PCR产物克隆到载体上，可以用两种处理办法：一是构建dT载体；二是用Klenow酶将3"端的A去掉，即在PCR反应后，先在99℃加热10min灭活Taq酶，调整Mg2+浓度至510mmol/L，加入12U Klenow片段，室温下作用1520min，3"端的A即被切去， Taq酶还具有反转录活性。在23mmol/L Mg2+浓度下68℃时出现类似反转录酶的活性。若有Mg2+存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于RNAPCR，尤其是短片段的扩增。 以往用Taq酶进行PCR扩增，一般只能扩增小于400bp的DNA片段，经过对酶的结构与功能的改造，以及PCR方法学的改进，现已能扩增20kb以上的DNA分于。 Taq酶在PCR反应中加入的量也很重要，太少当然不好，太多一方面浪费，同时也导致非特异性扩增，通常每lOOμl反应液中含12.5U Taq酶为好。最好在0.55U范围内确定最佳酶浓度。另一个问题是，虽然Taq酶是热稳定性较好的工具酶，也应注意在20℃贮存。 （四）缓冲液 缓冲液提供PCR反应合适的酸堿度与某些离子，常用1050mmol/L。TrisHCI（pH8.38.8）缓冲液。缓冲液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火。有人并加入小牛血清白蛋白（100μg/L）或明胶（0.0％）或Twen20（0.05％0.1％）或二硫基苏糖醇（DDT，5mmol/L）等，认为这些物质可以保护Taq酶。 （五）Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低；Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等。Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，而PCR反应体系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+的游离浓度。因此，Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.20.25mmol/L。如果反应体系中含有EDTA等螯合剂，也可结合掉一部分Mg2+。 为了获得Mg2+的最佳浓度，可用下面的优化法。首先在PCR缓冲液小不加入Mg2+，从配置的10mmol/L的Mg2+储存液中取一定量加入到各反应管中，开始以0.5mmol/L的浓度梯度递增（0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L），由PCR反应后的电泳结果可确定Mg2+大概浓度范围，再在该浓度的上下以0.2mmol/L递增与递减几个浓度来精确确定Mg2+最适浓度。 （六）dNTP dNTP为PCR反应的合成原料。每种dNTP浓度应相等，通常的浓度范围为20200gmol/L，在此范围内，PCR产物的量、反应的特异性与忠实性之间的平衡最佳。例如，当每种dNTP为20μmol/L时，理论上可以产生2.6μg的400bp的DNA。使四种dNTP的浓度保持在其Km值（1015μmol/L）以上，可保持堿基掺入的忠实性；若dNTP的浓度大于50mmol/L，则可抑制Taq酶的活性。 （七）反应温度和循环次数 1．变性温度与时间 PCR反应中变性这一步很重要，若不能使模板DNA和PCR产物完全变性，PCR反应就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的变性温度愈高。太高的变性温度和时间又会影响Taq酶的活性，通常的变性温度和时间分别为95℃、30s，有时用97℃、15s。虽然DNA链在变性温度时两链分离只需几秒钟，但反应管内部达到所需温度还需要一定的时间，团此要适当延长时间。为了保证模板DNA能彻底变性．最好为710min，然后在以后的循环中，将变性步骤设为95℃/min。 扩增100300bp短片段时，还呵以用快速的两步PCR法，即变性（9497℃）、退火及延长（5575℃）。 为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管内加入12滴液体石蜡。 2．复性温度和时间 复性温度决定PCR的特异性，合适的复性温度应低于引物Tm值的5℃。退火温度过低，引起非特异性扩增；增高退火温度，可提高扩增的特异性，因此要严格规定退火温度。退火反应时间一般为1min。 在PCR开始的头一次循环时，反应从远低于Tm值的温度开温，由于Taq酶在低温时仍具有活性，这时就可能因引物与模板非特异性配对面出现非特异性产物或出现引物二聚体 然后在以后整个PCR反应中，非特异性产物反复扩增，而使PCR严重失败。为了尽量消除这种非特异性扩增，可以使用热起动的方式，热起动方法有几种：一种方法是在PCR系统中加入抗Taq酶抗体。抗体与Taq酶结合，使Taq酶活性受抑制。因此在开始时，虽然温度低，引物可与与模板错配，但因Taq酶没有活性，不会引起非特异性扩增；当进行热变性时，抗体在高温时失活，Taq酶被释放，就可发挥作用，在以后的延伸步骤进行特 异的DNA聚合反应。另一种热起动法是用石蜡将Taq酶与PCR反应系统分隔，因此一开始在室温条件下也没有非特异性扩增。当升温到热变性温度下，石蜡熔化，Taq酶与PCR反面系统混合，从而在以后的步骤中发挥作用。使用热起动可以提高PCR扩增的特异性。 3．延伸温度与时间 延伸温度一般为72℃左右，此时Taq酶活性为每秒钟掺入核苷酸35100个，2kb的片段用1min已足够，若DNA片段较长，扩增时间可适当延长。延伸时间过长又可引起非特异性扩增。 4．循环次数 循环次数主要取决于最初靶分子的浓度，例如在初始靶分子为3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷贝数时，循环数可分别为2530、3035、3540从4045。过多的循环次数会增加非特异性产物量及堿基错配数。PCR反应后期，扩增产物的增加并不成为指数方式，称为平台效应。平台效应可能与下列因素有关：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，多次循环后酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸。 （八）PCR仪 有多种进口与国产PCR仪。仪器的升降温方式可有气体加温、水加温及电热块加温等。温度、循环次数及时间等参数现多用电脑控制。可根据需要选择仪器。 由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而引起以后的PCR假阳性。为此，应将PCR仪及PCR产物检测等过程与标本制备及PCR反应管的制备尽量在空间分开，最好在不同的房间进行。通常可将实验空间分为标本处理区、反应混合制备和PCR扩增区、产物分析区等。 9 聚合酶链式反应检查 聚合酶链式反应是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 9.1 聚合酶链式反应正常值 体内菌群的种类和比例正常，人体处于动态平衡健康状态。 9.2 聚合酶链式反应临床意义 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。 异常结果： 各种疾病所致的异常，例如梅毒。①一期梅毒。即硬下疳 ，潜伏期2～4周，外生殖器部位发生暗红色硬肿块 、浅溃疡 ，有软骨样硬度，周围淋巴结肿大。②二期梅毒。在一期梅毒 1～2 个月之后，全身皮肤、粘膜发生对称泛发皮疹、斑疹、丘疹、脓疱疹等。粘膜可发生粘膜斑、扁平湿疣，传染性强。③三期梅毒。发生在感染后2～3年乃至10年，皮肤为树胶样肿，还可涉及骨、关节、心、血管，表现为主动脉炎、主动脉瓣闭锁不全和主动脉瘤等，侵及神经为脊髓痨 ，全身麻痹 （ 麻痹性痴呆 ）等等。

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还是有必要的，Origin：Theoriginofreplication，由复制起始位点和相关调控元件组成，pET-28a(+)中的复制子属于松弛型中低拷贝型复制子，目标蛋白的高表达会对宿主菌造成较大的压力，所以表达载体的拷贝数通常较低。Kan：编码氨基糖苷磷酸转移酶，使质粒产生卡那霉素抗性，用于筛选培养过程中含有目标质粒的宿主菌。Rop：编码ROP蛋白，ROP蛋白是一种复制调控蛋白，将质粒的拷贝数维持在15-20，该元件缺失会导致质粒拷贝数升高。乳糖操纵子元件lacIpromoter+lacI表达LacI阻遏蛋白，该阻遏蛋白形成四聚体可以与LacOperator结合，使T7RNA聚合酶无法与与启动子结合以及向下转录，从而关闭下游基因的表达。乳糖类似物IPTG可与阻遏蛋白结合解除对下游基因表达的抑制，使下游基因正常表达。

通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。1.准备工作(试剂配置和器材准备)1)操作流程示意图主要步骤操作①制备pET-32a(+)载体 用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收③插入片段克隆到pET-32a(+)载体 插入片段与pET连接，转化④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白⑥放大试验纯化目的蛋白 放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。2.操作步骤[1] 制备载体1)载体消化和胶纯化3μg pET载体3μl 10×限制性内切酶buffer10-20U 两种酶(是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%)3μl 1mg/ml乙酰BSA(根据需要补足水到30μl2)37℃温浴2-4h3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度4)消化完全后，加入0.05U小牛碱性磷酸酶，37℃ 30min5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳，切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。6)-20℃保存备用。[2]制备插入片段限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T-载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。[3]在pET32a载体中插入片段连接反应2μl 10×连接buffer2-5μl 50ng/μl 预制的pET32a载体1μl T4连接酶5-7μl 预制目标基因插入片段加水到20μl，枪头混匀，16℃反应2h-过夜[4]转化转化方法同T-载体转化大肠杆菌DH5α一样，既可转化BL21也可转化DH5α，若转化DH5α，需要重新抽提质粒，再转化BL21。筛选LB平板需含50μg/μl 卡那霉素。[5]pET重组子鉴定如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。[6]DE3溶原菌的诱导表达(1)、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。(2)、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM(T7启动子)或1 mM(T7lac启动子)，继续培养2-3小时。(3)、将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。(4)、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl (pH8.0)中，离心。(5)、除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析(1)、机械破碎细胞。一般用弗氏压碎法或超声波处理。(2)、裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。(3)100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上样buffer和水。85℃迅速加热3min使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。(4)若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。750μl20mMTris-HCl,pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min,除去上清重复洗涤。然后1.5ml 1%SDS上样buffer中重悬沉淀，重复(3)的步骤进行SDS-PAGE分析。3.总结(注意事项)(1)所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性;(2)根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。(3)构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。(4)长期保存的pET重组子在高浓度甘油(19%)中会导致质粒不稳定。(5)T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度(25uM-1mM之间)使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温(15-20℃)延长诱导时间(过夜)可以使溶解性蛋白的产量达到最大。(7)进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。

1.脂肪酸的生物合成，植物中是在叶绿体及前质体中进行，合成4～16碳及16碳以上的饱和脂肪酸。动物是在胞液中进行，只合成16碳饱和脂肪酸，长于16碳的脂肪酸是在内质网或线粒体中合成。就胞液中16碳饱和脂肪酸的合成过程来看，与β－氧化过程有相似之处，但是合成过程不是β-氧化过程的逆转, 脂肪酸合成和脂肪酸β氧化的异同可归纳如下：（1）两种途径发生的场所不同，脂肪酸合成主要发生于细胞浆中，分解发生于线粒体；（2）两种途径都有一个中间体与载体相连，脂肪酸合成为ACP，分解为CoA；（3）在两种途径都有4步反应，脂肪酸合成是缩合，还原，脱水和还原，脂肪酸分解是氧化，水合，氧化和裂解。虽然从化学途径二者互为逆反应。但他们的反应历程不同，所用的辅助因子也不同；（4）两种途径都有原料转运机制，在脂肪酸合成中，有三羧酸转运机制将乙酰CoA从线粒体转运到细胞浆，在降解中，有肉碱载体系统将脂酰CoA从细胞浆转运到线粒体；（5）两种途径都以脂肪酸链的逐次轮番的变化为特色，在脂肪酸合成中，脂肪酸链获得2碳单位而成功延伸，在降解中则是以乙酰CoA形式的2碳单位离去，以实现脂肪酸链的缩短；（6）脂肪酸合成时，是以分子的甲基一端开始到羧基端为止，降解则是相反的方向，羧基的离去为第一步。（7）羟酯基中间体在脂肪酸合成中是D-构型，但是在降解中为L-构型；（8）脂肪酸合成由还原途径构成，需要NADPH参与，脂肪酸分解由氧化途径构成，需要FAD和NAD+的参与；（9）在动物体中，脂肪酸合酶是一条多肽链构成的多功能酶，而脂肪酸的分解是由多种酶协同催化的。以上是胞液中脂肪酸合成过程和在线粒体中β-氧化作用的重要异同之处。在线粒体中，脂肪酸的合成反应是β-氧化反应的逆过程。2....核酸分子杂交法这是最早用于性病诊断的重组DNA技术。基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。探针以放射核素或非放射性核素标记，以利于杂交信号的检测。 所谓杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体（hybrid），杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。将探针技术与分子杂交技术相结合，从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。 （一）DNA的变性 DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，称为DNA变性。加热、改变DNA溶液中的pH，或有机溶剂等理化因素的影响，均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。 （二）DNA复性 变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。 核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间，由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合成双链过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。 （三）探针——靶分子反应 从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。抗体——抗体、外源凝集素——碳水化合物、亲合素——生物素、受体——配基（Ligand）以及互补核酸间的杂交均属于探针——靶分子反应，蛋白质探针（如抗体）与特异靶分子是通过混合力（疏水离子和氢键）的作用在少数特异位点上的结合，而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同，通过氢键几十、几百甚至上千个位点上的结合。这就决定它的特异性。 基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。DNA探针还有单链和双链之分。下面分别介绍这几种探针。 一、核酸探针的种类 （一）DNA探针 DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获的DNA探针种类很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类ALU探针，这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比用G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向，加之分子杂交技术的高度敏感性，分子杂交在临床性病病原体诊断上具有广泛的前景。 DNA探针（包括cDNA探针）有三大优点：第一，这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。其次，DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。第三，DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。 （二）cDNA探针 cDNA是指互补于mRNA的DNA分子（complementary DNA）。cDNA是由RNA经一种称为逆转录酶的DNA聚合酶催化产生的。携带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后，病毒RNA在逆转录酶的催化下转化成双链cDNA，并进而整合入宿主细胞染色体DNA分子，随宿主细胞DNA复制同时复制，这种整合的病毒基因组称为原病毒。在静止状态下，可被复制多代，但不被表达，故无毒性，一旦因某种因素刺激而被活化，则该病毒大量复制。如其带有癌基因，还可能诱发细胞癌变。 逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术，广泛用于基因的克隆和表达。从逆转录病毒中提取的逆转录酶也已商品化。最常用的有AMV逆转录酶。利用真核mRNA3′末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸用作引物，在逆转录酶催化下合成互补于mRNA的cDNA链，然后再用RNase H将mRNA消化掉，再加入大肠杆菌DNA聚合酶I催化合成另一条DNA链，即完成了从mRNA到双链DNA的逆转录过程。 所得到的双链cDNA分子经S1核酸酶切平两端后接一个有限制酶切点的接头(Adapter),再经特定限制酶消化产生粘性末端，即可与含互补末端的载体进行连接。常用的克隆载体是λ噬菌体DNA，如λgt、EMBL和Charon 系列等。用这类载体可以得到包含105以上转化子文库，再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。 （三）RNA探针 RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利用，获得HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。 随着体外逆转录技术不断完善，已成功的建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体PSP和PGEM，这类载体在多克隆位点两侧分别带有SP6启动子和T7启动子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可进行RNA转录。如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段，则可以以DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。这种体外转录反应效率很高，在1小时内可合成近10μg的RNA产物。只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记的dUTP，则所合成的RNA可得高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记分子的利用率。 RNA探针和cDNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。 （四）寡核苷酸探针 前述三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆探针。克隆探针一般较寡核苷酸探针的特异性强，复杂度也高，从统计学角度而言，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少。克隆探针的另一优点是，可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。但是，较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低。对于仅是单个碱基或少数碱基不配的两个序列，克隆探针不能区分，往往杂交信号相当。这既是其优点，又是其缺点，优点是当用于检测病原微生物时，不会因病毒或细菌DNA的少许变异而漏诊，缺点则是不能用于检测突变点。这种情况，通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。 合成的寡核苷酸探针具有以下特点：第一，由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。第二，寡核苷酸探针可识别靶序列内一个碱基的变化，因为短探针中碱基错配能大幅度降低杂交体的Tm值。第三，一次可大量合成寡核苷酸探针，使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。最常用的寡核苷酸探针长18—40个碱基，目前的合成可有效地合成至少50个碱基的探针。 对于合成的寡核苷酸探针有以下要求： （1）长度以18-50碱基为宜，较长探针杂交时间较长，合成量也低；较短探针特异性较差。 （2）碱基成分：G+C含量为40%-60%，超出此范围则会增加非特异杂交。 （3）探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。 （4）避免单一碱基的重复出现。 （5）一旦选定某一序列符合上述标准，最好将该序列与核酸库中的核酸序列比较，探针序列应与靶序列核酸杂交，而与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源。否则，该探针不能用。【【【【【【【【【【【【【【【【【【【希望对你有帮助】】】】】】】】】】】】】】】】

RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。又如进行中的转录分析（nuclearrunontranscrip－tionassay）时，在体外将细胞核分离出来，然后在α-32P-ATP的存在下进行转录，所合成mR－NA均掺入同位素而得到标记，此混合mRNA与固定于硝酸纤维素滤膜上的某一特定的基因的DNA进行杂交，便可反映出该基因的转录状态，这是一种反向探针实验技术。近几年体外转录技术不断完善，已相继建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体pSP和pGEM，这类载体在多克隆位点两侧分别带有SP6启动子和T7启动子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以进行RNA转录，如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段，则可以此DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。这种体外转录反应效率很高，在1h内可合成近10μg的RNA产生，只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记的NTP，则所合成的RNA可得到高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记物的利用率。值得一提的是，通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链以模板转录RNA。这种可以得到同义RNA探针（与mRNA同序列）和反义RNA探针（与mRNA互补），反义RNA又称cRNA，除可用于反义核酸研究外，还可用于检测mRNA的表达水平。在这种情况下，因为探针和靶序列均为单链，所以杂交的效率要比DNA-DNA杂交高几个数量级。RNA探针除可用于检测DNA和mRNA外，还有一个重要用途，在研究基因表达时，常常需要观察该基因的转录状况。在原核表达系统中外源基因不仅进行正向转录，有时还存在反向转录（即生成反义RNA），这种现象往往是外源基因表达不高的重要原因。另外，在真核系统，某些基因也存在反向转录，产生反义RNA，参与自身表达的调控。在这些情况下，要准确测定正向和反向转录水平就不能用双链DNA探针，而只能用RNA探针或单链DNA探针。

依赖于DNA的RNA聚合酶（DNA：dependent：RNA：polymerase）包括SP6噬菌体RNA聚合酶（来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株）和T4或T7噬菌体RNA聚合酶（来源于噬菌体感染的大肠杆菌）。这些RNA聚合酶实际上是转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。它与DNA聚合酶不同，无需引物，但需识别特异性位点，因此常用于体外合成RNA分子和用于外源基因表达研究。

BL21（DE3），整合了T7噬菌体基因组；而BL21(DE3)plysS 比它多表达T7溶菌酶，这个酶的存在使它可以溶解含有T7 噬菌体基因I的DE3，所以说降低了背景啊

启动子(promoter)DNA模板上专一地与RNA聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，也决定基因的转录效率。生物中有许多启动子，如大肠杆菌约有2000个启动子。各启动子的效率可不相同，大肠杆菌的强启动子每2秒钟启动一次转录，而弱启动子每10分钟才启动一次，从百多个大肠杆菌启动子结构的分析，得知两个强启动子的同源序列的中心在转录起始部位(基因编码链上第一个核苷酸) 5"侧约10和35个核苷酸处，弱启动子序列中往往有多处核苷酸被置换。许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：真核生物的启动子部位与原核生物不同，而且启动转录的活性，除需启动子外，还需某些外加序列

Xl1-Blue菌株基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F‘[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。用途：分子克隆和质粒提取。BL21(DE3)菌株 基因型：F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。用途：蛋白质表达。BL21(DE3)ply菌株基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)。特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。 适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。用途：蛋白质表达DH5α菌株基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ–特点：一种常用于质粒克隆的菌株。 其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和 endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。JM109菌株基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F‘ traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。

体外酶法合成：与化学合成相比体外酶法合成要经济得多，此法需首先合成两段29nt的DNA，包括8个与T7启动子3′端互补的碱基（称为引导序列，leader：sequence）和由21个碱基构成的siRNA编码序列。将这两段DNA分别和T7启动子混合，T7启动子和DNA引导序列退火结合，然后用DNA聚合酶Klenow大片断补齐成为可用于转录的双链DNA模板，分别用T7：RNA聚合酶进行体外转录，再将产物混合形成dsRNA。新的双链RNA包含5′端单链的引导序列和中间互补的19个碱基序列以及3′端两个重复的U（UU），以DNA酶降解模板，同时用单链专一的核糖核酸酶（RNase）消化5′的引导序列，由于RNase不能切开U碱基也不能降解双链RNA，所以得到的产物就是所需的21bp的双链siRNA，它有19对碱基互补，3′端各有2个U突出。目前Ambion公司可提供相关试剂盒，用试剂盒可一次合成多个siRNA分子。用酶法合成的siRNA比化学合成的同序列siRNA活性高20倍，可能是由于siRNA纯度的差异造成的结果。

Xl1-Blue菌株基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F‘[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。用途：分子克隆和质粒提取。BL21(DE3)菌株基因型：F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。用途：蛋白质表达。BL21(DE3)ply菌株基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)。特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。 适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。用途：蛋白质表达DH5α菌株基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ–特点：一种常用于质粒克隆的菌株。 其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和 endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。JM109菌株基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F‘ traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达

1：DH5a菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株.E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补.可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株.基因型：F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA12：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因.T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上.该菌适合表达非毒性蛋白.基因型：F-,ompT,hsdS（rBB-mB－）,gal,dcm（DE3）

核酸的等温扩增是一个简单的过程，可以在恒定温度下快速有效地积累核酸序列。自1990年代初期以来，已开发出各种等温扩增技术来替代聚合酶链反应（PCR）。这些等温扩增方法已用于生物传感目标，例如DNA，RNA，细胞，蛋白质，小分子和离子。这些技术在原位或细胞内生物成像和测序中的应用已得到充分证明。通过等温扩增方法生产的扩增子也已被用于构建通用的核酸纳米材料，有望用于生物医学，生物成像和生物传感领域。将等温扩增整合到微系统或便携式设备中，可改善基于核酸的现场测定，并具有很高的灵敏度。也已经基于集成的微流体系统实施了单细胞和单分子分析。 聚合酶链反应（PCR）是目前最受欢迎的扩增技术，用于扩增和检测低丰度核酸，已广泛应用于各个领域。但它需要大型且昂贵的热循环仪，这极大地限制了PCR在资源受限的环境中以及在即时医疗点（POC）分析中的应用。 与需要复杂的热循环以介导变性，退火和随后的延伸的PCR相比，等温扩增可以在一个反应温度和简单条件下（例如在水浴中）进行。核酸的等温扩增已成为一种有前途的替代方法，其中在恒定温度下无需PCR所需的热循环即可实现快速有效的扩增。自1990年代初以来，已开发出数十种采用各种扩增机制的等温核酸扩增技术，这些方法中的大多数对核酸的检测具有惊人的灵敏度。至今已经发表了数千项与核酸等温扩增相关的研究。但是核酸的等温扩增的概念，应用和观点尚未得到全面审查。许多等温扩增技术[例如，指数链置换扩增（E-SDA）和超支化滚环扩增（HRCA）]基于DNA复制，其他的则基于基于酶的消化或无酶的核酸组装。我们根据等温扩增技术的反应动力学将其分类：指数扩增，线性扩增和级联扩增。 各种实验室已经开发出十多种等温指数扩增方法。这些主要包括基于核酸序列的扩增（NASBA），E-SDA，HRCA，引物生成滚环扩增（PG-RCA），环介导的等温扩增（LAMP），解旋酶依赖性扩增（HDA），重组酶聚合酶扩增（RPA），指数扩增反应（EXPAR）和全基因组扩增（WGA）。这些扩增方法中的大多数（例如，NASBA，E-SDA，LAMP，HDA和RPA）使用两种或多种引物扩增核酸模板，而其他诸如HRCA，PG-RCA和EXPAR的引物则利用一种功能模板来扩增核酸模板。此外，尽管HRCA和LAMP仅使用DNA聚合酶即可实现指数扩增，但其他方法则需要其他酶或蛋白质。重要的是，这些方法都具有与PCR相当的高扩增效率。表1提供了不同等温扩增技术的比较。 链置换扩增（SDA）利用两个外部“凸块”引物和两个内部5"尾部区域引物，其中包含一个切口酶识别位点。与切口酶（例如，Nt.BstNBI）一起，离散DNA产物的扩增以快速的方式发生。 NASBA在40℃的较低温度下进行，导致特异性降低。E-SDA使用两个或什至四个引物克服了这一缺点，但是必须针对DNA聚合酶和NEase对该缓冲液进行优化。HRCA仅使用聚合酶，但始终需要在扩增前进行额外的连接过程才能特异性识别靶标。为了提高序列特异性并简化扩增系统，LAMP最初是由Notomi及其同事在2000年提出的。环介导的等温扩增（LAMP）使用4-6个引物，识别目标DNA的6-8个不同区域。 置换链的DNA聚合酶启动合成，其中2个引物形成环结构，以促进随后的扩增 与PCR相反，上述等温扩增方法不能扩增更长的DNA靶标，例如千碱基（kb）区域，这在许多基础研究和诊断应用中是必需的。为了克服这些缺点，HDA于2004年设计出了模仿DNA复制的技术。在体内，DNA通过DNA聚合酶复制，并且各种辅助蛋白（包括DNA解旋酶）被用于分离DNA双链体。在HDA中，DNA解旋酶也用于分离目标dsDNA，并生成用于引物杂交和随后通过DNA聚合酶延伸的sstemplates（图1F）。 HDA反应是一个三步循环过程（模板分离，引物杂交和引物延伸），类似于PCR。但是，dsDNA不会通过DNA解旋酶解链，而不是通过PCR中的热循环步骤解链。通过在一个温度下同时进行链反应，可以实现靶序列超过百万倍的扩增。在第一版HDA中，由于大肠杆菌UvrD解旋酶的热不稳定性，反应温度为37℃。热稳定蛋白的开发使得能够在更高的温度（60-65℃）下更快地扩增，并提高了对病原体和SNP检测的灵敏度和特异性。商业HDA试剂盒可从BioHelix Corporation获得 重组酶聚合酶扩增（RPA）和基于链入侵的扩增（SIBA）是等温扩增方法，可通过重组酶的活性来实现，该酶可帮助引物侵入双链DNA。 T4 UvsX与它的辅助蛋白UvsY和单链结合蛋白gp32结合使用，形成D环重组结构，用于通过Bsu或其他变温链置换DNA聚合酶引发扩增。 RPA使用两个寡核苷酸作为正向和反向引物，例如“等温PCR”，而SIBA还包括更长的侵入寡核苷酸，以帮助促进链的侵入和扩增。独特的是，在等温方法中，RPA可以产生高达1 kb（引物间距离）的扩增子。尽管非特异性扩增可能是一个普遍的挑战，但RPA和SIBA都通常在u301c37°C下进行，避免了其他方法的较高温度。探针可与两种方法一起使用以检测特定的产品。除了诊断扩增应用外，基于重组酶的扩增还显示了在下一代测序工作流程中用于克隆扩增的效用 全基因组扩增（WGA）是表示旨在扩增整个基因组的方法的总称，通常从低量（皮克级到纳克级）的DNA开始，最多产生数十微克量的扩增产物。 WGA已成为利用有限数量的珍贵原料样品或实现单细胞基因组DNA测序的宝贵方法。 MDA过程从与DNA模板结合的随机六聚体引物开始。置换链的聚合酶（通常是phi29 DNA聚合酶）启动扩增，最终结果是长而分支的DNA网络。如果DNA产物将用于下游应用，则可以使用T7核酸内切酶1解析分支。 已经开发出了几种用于高保真全基因组扩增的方法，包括基于PCR的方法，例如简并寡核苷酸PCR（DOP-PCR）和引物延伸预扩增（PEP），但是最常用的方法是多置换扩增（MDA）。该方法利用了phi29或Bst等DNA聚合酶的链置换活性。 对于带有phi29 DNA聚合酶的MDA，将高浓度（10–50μM）的随机六聚体与模板材料和phi29混合，并根据需要的扩增水平孵育1–12小时。 phi29的校对核酸外切酶活性可确保模板DNA的高保真复制，但还需要六聚体引物中的硫代磷酸酯键才能实现高效。对于高产率的反应，可以包括焦磷酸酶，以避免产生高浓度焦磷酸副产物而抑制聚合酶。反应产物非常长（> 30 kb），并通过多重置换机制高度分支。对于下一代测序应用，声波剪切或NEBNext Fragmentation System可以将这些产物解析为可读片段，这是文库制备工作流程的一部分。当将这些产品用于其他下游应用（如纳米孔测序）时，可以使用T7核酸内切酶1解析分支。 尽管指数扩增技术提供了高扩增效率和检测灵敏度，但它们遭受了快速的非特异性扩增和复杂设计的困扰。相反，线性扩增策略更方便，并且排除了非特异性扩增的干扰。尽管测定灵敏度相对较低，但它们仍适合潜力无限的各种应用。 线性SDA仅使用一个引物引发。与E-SDA的双向特性相反，其扩增过程（切口和聚合/置换）是单向的，累积了数千个目标拷贝。通过设计靶标特异性发夹型荧光探针，开发了一种类似的方法，即圆链置换聚合反应，以在1000 s内达到ssDNA靶标的检测限6.4×10-15M。这些线性方法已应用于多个目标的检测。 RCA产生长的重复靶序列的ssDNA。以这种线性格式，HRCA中不需要第二个引物，并且核酸合成是由HRCA中的Phi 29 DNA聚合酶而不是Vent exo-DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶催化的。RCA（u301c37℃）的反应温度低于HRCA（u301c60℃）的反应温度。RCA在1小时内达到了约103倍的扩增，并且可以通过添加ssDNA结合蛋白进一步提高效率。除生物分析应用外，RCA还被用于纳米生物医学，纳米技术，和材料科学中。用RNA聚合酶替代Phi 29 DNA聚合酶，使滚环转录（RCT）成为可能。合成具有重复序列的长RNA链，有望在RNA干扰（RNAi）中得到应用。 核酸测序扩增（NASBA）和转录介导扩增（TMA）是通过RNA进行的类似等温扩增技术。 尽管DNA主要用于RNA检测，但也可以用作起始材料。 设计引物以靶向目标区域为目标，但重要的是，一种引物在5"端包括T7 RNA聚合酶的启动子序列。 这使得能够产生单链RNA物质，其通过反应中包括的逆转录酶被逆转录成cDNA。 DNA-RNA杂种中的RNA被RNase H活性破坏（来自NASBA中的外源蛋白质，或被TMA中的RNase H + RT破坏），而dsDNA由RT产生。然后，该模板通过T7 RNAP和指数扩增结果转录为RNA。 尽管线性扩增策略既方便又快速，但受到信号增益低和检测灵敏度低的限制。为了克服这些限制，已经开发了整合两种或更多种扩增方法的技术。这种所谓的“级联放大”表现出与某些指数放大技术相当的灵敏度。级联扩增的关键要求是上游方法的产物充当下游方法的触发器，因此充当连接这些模块的“桥梁”。 与dsDNA相比，ssDNA在级联扩增的设计上更具通用性。具有积累数千种ssDNA产物的能力，SDA已广泛应用于不同的级联扩增策略。2006年，Willner和同事首次提出了SDA / DNAzyme组合级联扩增的方法，方法是设计一个独特的DNAzyme生成模板。产生了数千个DNAzyme分子，每个分子都可以氧化许多底物分子，从而产生放大的光学信号。因此，实现了级联信号放大。金属离子依赖性DNA酶随后与SDA结合用于级联裂解反应。这种类型的级联策略已应用于各种生物传感器的构建。值得注意的是，前一种方法需要在核酸扩增后产生信号的其他步骤，而后一种方法需要在DNA探针中修饰核糖核苷酸。 除DNA酶外，核酸酶也已整合到SDA中以进行级联扩增。Xia等人通过合并λExo（λExo）。他们开发了一种称为发夹介导的二次酶扩增（HQEA）的一步法。HQEA结合了靶标循环的杂交反应和随后的循环裂解反应，对单细胞水平的microRNA（miRNA）分析显示出很高的敏感性。 NEase最初用于SDA代替Exo， NEase辅助方法与SDA的集成应可导致简单的传感系统，而无需优化反应缓冲液。我们的团队通过开发酶协同等温二次DNA机器（ESQM）证实了这一假设。该DNA机器利用专门设计的发夹探针和两个功能部分来桥接这些方法，并且可以在SDA反应条件下进行级联扩增。 ESQM的信号增强明显高于SDA。Ye等人设计了一种相关方法。此外，我们提出了另一种结合了SDA的级联扩增反应，而没有引入额外的酶来创建三重SDA过程。第一个SDA的产物循环诱导下一个SDA，并且产物回收过程等效于一个SDA过程。该方法在SDA反应条件下可获得明显更高的放大信号。 不同的研究小组还提出了其他几种结合了SDA的级联扩增策略。这些方法将级联扩增过程分为两个独立的反应步骤，这延长了测定时间，并使操作复杂化。 与SDA相似，RCA产生ssDNA产物，并已与其他扩增方法广泛结合。在2007年，Willner和同事开发了RCA / DNAzyme级联扩增，其中合成了长的DNAzyme链以进行第二次扩增反应。已经使用该级联扩增设计了几种生物传感器。目标序列回收的RCA（TR-RCA）和树状RCA也已被设计为RCA级联。在TR-RCA中，哑铃式挂锁探针旨在识别靶序列以激活由过量引物触发的RCA。然后，该RCA过程将目标移开，以激活下一个RCA过程。因此，级联RCA是通过回收靶序列来实现的。在树状RCA中，发夹结构是关键要素。它可以与靶标引发的RCA产物杂交，从而导致释放新的靶标序列。该释放的靶序列在发夹结构中诱导了新的RCA过程，从而导致级联扩增。通过一步扩增反应，这三种级联策略均可提供显着扩增的信号 还已经报道了RCA结合了级联扩增策略以及结合了核酸酶辅助扩增方法的多个反应步骤。 Smith和他的同事们设计了第一种方法，该方法基于FEN催化的侵入性切割，然后进行RCA。表面上人类基因组DNA的两步扩增为SNP分析提供了足够的灵敏度。其他两种核酸酶（NEase和Exo）也已用于开发RCA组合级联扩增。最近证明了一种基于RCA的生物传感器，将无酶CHA与两个单独的扩增反应偶联。尽管需要多个反应步骤，但这些级联方法仍具有很高的测定灵敏度。 前面提到的级联扩增方法涉及聚合酶催化的DNA合成。不含聚合酶的级联技术也已建立。在FEN辅助侵袭方法发展一年后，通过在同质测定中耦合两个侵袭反应，提出了串行侵袭信号放大反应（SISAR）.这种级联版本可在4个分子内为每个靶DNA产生107个以上的报告分子。 FEN辅助的侵入式方法也与NEase辅助的方法结合用于级联酶促信号扩增（CESA）。除了FEN之外，其他核酸酶也可用于序列扩增和循环扩增。Nuclease / DNAzyme-还已经证明了利用级联方法，和相继设计了几种基于HCR和CHA的无酶级联 等温扩增也可以通过信号扩增来实现，而无需依赖新核酸产物（DNA或RNA）的产生。与采用聚合酶的方法相反，这些方法受焦磷酸盐的积累抑制，这些信号放大策略不受产物抑制。基于信号放大机制，这些策略可分为三种类型：核酸酶辅助，DNAzyme辅助和无酶反应。 核酸酶可以切割核酸的磷酸二酯键，并且包括切割DNA的脱氧核糖核酸酶（DNase）和切割RNA的核糖核酸酶（RNase），并且可以进一步分类为Exos和Endos。通常，核酸酶辅助策略涉及回收由不同核酸酶催化的核酸裂解，例如襟翼内切核酸酶（FEN），NEase，双工特异性核酸酶（DSN），REase，Exos，DNase I ，和RNase H，NEase辅助方法和Exo辅助方法被广泛使用，并且基于FEN的方法（入侵者或侵入性测定法）已通过Third Wave Technologies商业化用于SNP基因分型和病毒检测。 在DNA核酶辅助方法中，金属离子依赖性DNA核酶通常用于进行核酸切割。 DNA酶是可催化化学反应并通过在金属离子（例如Mg2+和Pb2 +）存在下形成致密结构而被激活的DNA分子。通过三个步骤（激活，切割和周转）实现了丰富的扩增，为不同的分析物提供了出色的传感性能.具有模仿过氧化酶活性的过氧化物酶的G四联体DNA酶也已被用于通过催化氧化来催化快速信号放大。在这种特殊的DNA酶的基础上，开发了比色，荧光，化学发光（CL），和电化学生物传感应用。 在无酶方法中，既不使用蛋白质酶也不使用DNA酶。代替循环裂解反应，扩增反应仅涉及杂交过程。Pierce和Dirks在2004年提出了第一个无酶方法，即杂交链反应（HCR）。在HCR中，设计了两个具有相同发夹结构（长茎和短环）的部分互补单体DNA构建块（图A）。在没有靶标的情况下，由于势能在长茎保护下的短环中储存，因此杂交反应无法在室温下进行。靶标ssDNA触发交替（两个发夹物种）杂交的链反应，产生长切口的共聚物。该方法将触发的DNA自组装引入纳米结构，并利用DNA作为生物传感和生物成像的放大换能器。另一种无酶信号放大方法是催化发夹装配（CHA），这是通过DNA的模块化电路实现的。杂交（自组装和拆卸）而不是连锁反应（图B），并导致目标和分析形式（荧光，比色和电化学信号）的多样性 由于操作方便和扩增效率高，等温扩增技术已成为生物分析应用中非常有希望的PCR替代方法。最初，通过这些技术成功地证明了核酸（DNA和RNA）检测，SNP基因分型，甚至DNA甲基化分析。随着分子生物学的发展以及适体，抗体和DNA酶的使用，这些方法已广泛用于其他分析物的生物传感，包括蛋白质，细胞，小的生物分子甚至离子。还已经证明了通过几种等温方法进行的原位和细胞内成像。 [1] Zhao Y, Chen F, Li Q, et al. Isothermal amplification of nucleic acids[J]. Chemical reviews, 2015, 115(22): 12491-12545. [2] https://www.neb.com/applications/dna-amplification-pcr-and-qpcr/isothermal-amplification

Xl1-Blue菌株基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F‘[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。用途：分子克隆和质粒提取。BL21(DE3)菌株基因型：F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。用途：蛋白质表达。BL21(DE3)ply菌株基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)。特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。 适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。用途：蛋白质表达DH5α菌株基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ–特点：一种常用于质粒克隆的菌株。 其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和 endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。JM109菌株基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F‘ traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达

转录，是指遗传信息从基因（DNA）转移到RNA，在RNA聚合酶的作用下形成一条与DNA碱基序列互补的mRNA的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，进行转录时，一个基因会被读取并被复制为mRNA，即特定的DNA片断作为遗传信息模板，以依赖DNA的RNA聚合酶作为催化剂，通过碱基互补的原则合成前体mRNA。RNA聚合酶通过与一系列组分构成动态复合体，完成转录起始、延伸、终止等过程。生成的mRNA携有的密码子，进入核糖体后可以实现蛋白质的合成。转录仅以DNA的一条链作为模板，被选为模板的单链称为模板链，亦称无义链；另一条单链称为非模板链，即编码链，因编码链与转录生成的RNA序列一致，所以又称有义链。DNA上的转录区域称为转录单位。（节选自百度百科）因此，是以特定的DNA片断作为遗传信息模板

1 RNAi的机制 RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成-22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponent nuclease，RISC)并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达. RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员. Dicer酶广泛存在于蠕虫、真菌、物及哺乳动物体内. 他的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点. 在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21-23个核苷酸的siRNA，他启动了细胞内的RNAi反应. 因少量双链RNA即能阻断基因表达，且此效应可传至子代细胞，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统. 研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP). 在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增. 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成小片段siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA. 小片段siRNA生成后与核酸酶形成复合物，随后mRNA与小片段的正义链置换，被mRNA替代. mRNA的位置与最初正义链的位置相同，从而被核酸酶在相同的位点降解. 更有意义的是mRNA的降解使核酸酶得以再生，这样周而复始，mRNA得以降解，因此RNAi呈酶解动态. 由于mRNA也以21-23 nt的特定间隔降解，因此认为降解dsRNA与mRNA的核酸酶相同. 另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链. 结果mRNA也变成了双链RNA，他在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA. 这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制. RNAi不同于其他基因阻断技术，他是转录后水平的基因静默机制，因此注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应. RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果. dsRNA小片段如小于21-23 nt (如10-15 nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21-23 nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围. RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代2 双链RNA的构建 双链RNA可先在体外构建好，用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差，转化到细胞内的双链RNA半衰期短. 而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用. 构建双链RNA表达载体，使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成. 因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，他指导的转录就会终止，且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，因此合成的RNA无polyA尾. U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别，合成出RNA. Sui et al 用Bluescript作为载体，RNA多聚酶Ⅲ可识别的U6作为启动子，从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1)，将其插入到Bluescript载体中. 然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2. 他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA. 片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止. 而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3"端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而有利于双链RNA诱发RNAi. RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA. T7也可作为启动子合成dsRNA. 将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体. 用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA. 在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶. 腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al 用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA，并成功的阻断了基因的表达.RNA interference (RNAi) is a mechanism in molecular biology where the presence of certain fragments of double-stranded RNA (dsRNA) interferes with the expression of a particular gene which shares a homologous sequence with the dsRNA. RNAi is distinct from other gene silencing phenomena in that silencing can spread from cell to cell and generate heritable phenotypes in first generation progeny when used in Caenorhabditis elegans.Before RNAi was well characterized, it was called by other names, including post transcriptional gene silencing and transgene silencing. Only after these phenomena were characterized at the molecular level was it obvious that they were the same phenomenon.The use of RNA to reduce expression in plants has been a common procedure for many years. Single-stranded antisense RNA was introduced into plant cells that hybridized to the cognate, single-stranded, sense messenger RNA. While scientists first believed that the resulting dsRNA helix could not be translated into a protein, it is now clear that the dsRNA triggered the RNAi response. The use of dsRNA became more widespread after the discovery of the RNAi machinery, first in petunias and later in roundworms (C. elegans).RNAi原理图解http://lddljf.stedu.net/Article_Show.asp?ArticleID=1974RNAi知识介绍powerpoint1 http://www.biox.cn/content/20050519/13420.htm2 http://www.biox.cn/content/20050519/13422.htm3 http://www.biox.cn/content/20050519/13423.htm4 http://www.biox.cn/content/20050519/13425.htm5 http://www.biox.cn/content/20050519/13426.htm6 http://www.biox.cn/content/20050519/13429.htm7 http://www.biox.cn/content/20050519/13431.htm8 http://www.biox.cn/content/20050519/13433.htm9 http://www.biox.cn/content/20050519/13434.htm

博凌科为的pSURE-T 载体连接试剂盒有许多高温DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3"-末端后都带有一个突出的碱基A，这样的PCR产物可以用3"-末端后带有一个突出碱基T的载体方便地进行克隆。pSURE-T载体是为简化PCR产物的克隆而设计的。pSURE-T是一种新颖的pUC系列T载体，和传统T载体ECOR V切开后加T方法不同，pSURE-T通过Xcm I酶切后使其多克隆位点两侧的3"末端直接产生未配对的T碱基，因此有更高的重组效率。其多克隆位点更多的单切点和b-半乳糖苷酶阅读框架的调整大大方便了克隆的蓝/白筛选。插入位点两端独特设计的两个PstI位点使插入片段可以用Pst I单酶切进行检测，也可以用非常廉价而高效的EcoR I和Hind III 双酶切进行检测。可以用M13通用引物和T7启动子引物对PCR产物进行测序。pSURE-T含有T7 RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。

核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3"羟基末端。同时该酶具有从5"→3"的核酸外切酶活性,能从切口的5"端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3"端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。材料： 待标记的DNA。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。(2)未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4单位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。(7)10mol/L NH4Ac。操作步骤:(1) 按下列配比混合:未标记的dNTP 10μl10×切口平移缓冲液 5μl待标记的DNA 1μg[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μlE.coli DNA聚合酶 4单位DAN酶 I 1μl加水至终体积 50μl(2) 置于15℃水浴60分钟。(3) 加入5μl EDTA终止反应。(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。[注意]1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5"→3"外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。材料：待标记的DNA片段。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。(2)10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。(3)Klenow片段。(4)20mmol/L DTT。(5)未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。(7)缓冲液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5% SDS。操作步骤:(1) 200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。(2) 与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物:20mmol/L DTT 1μl未标记的dNTP溶液 1μl10×随机标记缓冲液 1μl[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μlddH2O 1μl(3) 将步骤(1)eppendorf管中的溶液移到步骤(2)管中。(4) 加入5单位(约1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。(5) 在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。 用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:(1) 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; (2) 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。1. 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。材料：已制备好的单链DNA模板（方法参见第十章中有关内容）。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)10×Klenow缓冲液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris·Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。(2)0.1mol/L DTT溶液。(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。(4)40mmol/L和20mmol/L的未标记的dNTP溶液。(5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。(6) Klenow片段（5单位/ml）。(7)适宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。(8)0.5mol/L EDTA （pH8.0）。操作步骤：(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：单链模板（约0.5pmol） 1mg适当引物 5pmol10×Klenow缓冲液 3ml加水至 20ml(2)将eppendorf管加热到85℃ 5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37℃；(3)依次加入：DTT 2ml[a-32P]dATP 5ml未标记的dATP 1mldGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。(4)加1ml（5单位）Klenow酶室温下30分钟。(5)加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。(6)68℃加热10分钟，使Klenow片段失活。调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。(7)加入20单位限制性内切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1小时。(8)酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度10mmol/L。(9)用电泳方法分离放射性标记的探针。2. 从RNA合成单链cDNA探针 cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3"末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。 材料：已提纯的RNA或mRNA设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)合适的引物：随机引物或oligo(dT)15-18。(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。(4)反转录酶(200000单位/ml)。(5)100mmol/L DTT。(6)250mmol/L MgCl2。(7)1mol/L KCl。(8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)。(9)10% SDS。(10)RNasin(40单位/ml)。操作步骤:(1)在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：RNA或mRNA 10.0ml合适的产物(1mg/ml) 10.0ml1mol/L Tris·Cl(pH7.6) 2.5ml1mol/L KCl 3.5ml250mmol/L MgCl2 2.0ml5mmol/L dNTP 10.0ml[a-32P]dCTP 10.0ml0.1mol/L DTT 2.0mlRnasin 20U加水至 48ml反转录酶(200000单位/ml) 2ml混匀后,稍稍离心，37℃保温2小时。(2) 反应完毕后加入下列试剂： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保温30分钟以水解RNA。(4) 冷却至室温后, 加入10ml 1mol/L Tris·Cl (pH7.4)。混匀。然后加入3ml 2mol/L HCl。(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。 [注意] RNA极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC处理后，灭菌备用。 现以Klenow片段标记3"末端为例说明末端标记的方法。1、材料：待标记的双链含凹缺3"末端的DNA。2、设备：高速台式离心机，水浴锅等。3、试剂：(1)3种不含标记的dNTP各为200mmol/L。(2)合适的限制酶。(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。(4)Klenow片段(5U/ml)。(5)10×末端标记缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。4、操作步骤：(1)25μl反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。(2)按下列成分加入试剂并混匀： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端标记缓冲液 5ml 2mmol/L 3种dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 适量 加水至 50ml(3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。(4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15分钟。(5)70℃加热5分钟,终止反应。(6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。[注意]1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5"端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该酶进行交换反应标记5"末端。 利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。1、材料：待标记的寡核苷酸(10pmol/μl)。2、设备：高速离式离心机，恒温水浴锅等。3、试剂：(1)10×T4多核苷酸激酶缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT, 1mmol/L Spermidine·HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。(3)T4多核苷酸激酶（10单位/ml）。4、操作步骤：(1)100ng寡核苷酸溶于30ml水中。置65℃变性5分钟，迅速置冰溶中。(2)立即加入下列试剂：10×激酶缓冲液 5ml[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10mlT4多核苷酸激酶 2ml加水至 50ml混匀后置37℃水浴20分钟。(3)再加入20单位T4多核苷酸激酶，置37℃水浴20分钟后立即置冰浴中。(4)Sephadex G-50柱层析。此方法是在每个探针的5"末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA的杂交。因此，建议使用Klenow DNA聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。除了常见的同位素标记探针外，还有利用非同位素标记探针和杂交的方法，许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。 许多载体如pBluescript, pGEM等均带有来自噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA探针。RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是： RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。 RNA:RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制,所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。噬菌体依赖DNA的RNA聚合酶所需的rNTP浓度比Klenow片段所需的dNTP浓度低,因而能在较低浓度放射性底物的存在下,合成高比活性的全长探针。 用来合成RNA的模板能转录许多次,所以RNA的产量比单链DNA高。并且用来合成RNA的模板能转录多次，可获得比单链DNA更高产量的RNA。反应完毕后，用无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理,即可除去模板DNA,而单链DNA探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA分离。另外噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶不识别克隆DNA序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高,故在异常位点起始RNA合成的比率很低。因此,当将线性质粒和相应的依赖DNA的RNA聚合酶及四种rNTP一起保温时,所有RNA的合成,都由这些噬菌体启动子起始。而在单链DNA探针合成中,若模板中混杂其他DNA片段,则会产生干扰。但它也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA，它对RNase特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。

你说的是体外翻译系统。一般的大肠杆菌体外翻译系统需要：启始因子(IF1、IF2及IF3)、伸长因子(EF-G、EF-Tu及EF-Ts)、终止因子(RF1、RF2及RF3)、脂质体循环因子、与20种氨基酸相对应的氨基酰tRNA合成酶、甲硫氨酸酰胺tRNA转移酶、T7 RNA聚合酶等。此外,还包括脂质体、氨基酸、tRNA、能量源及能量再生系统

T7噬菌体DNA聚合酶（T7：phage：DNA：polymerase）来源于T7噬菌体感染的emphasis：role=italicE.coliemphasis，为两种紧密结合的蛋白质复合体，一种是噬菌体基因5蛋白，另一个是宿主蛋白的硫氧还蛋白。T7噬菌体DNA聚合酶是所有DNA聚合酶中持续合成DNA能力最强的一个，在DNA测序时有优势，它的聚合活性功能与T4噬菌体DNA聚合酶和Klenow：DNA聚合酶类似，但3′→5′外切活性更强，为Klenow的1000倍，T7噬菌体DNA聚合酶可替代T4DNA聚合酶的聚合功能并可用于长模板的引物延伸。

一、一般来说，以DNA为模板的DNA聚合酶和RNA聚合酶都的结合位点都在DNA上。但是也有以RNA为模板的DNA聚合酶和RNA聚合酶 （也就是反转录酶和RNA依赖的RNA聚合酶）,它们的结合位点在RNA上.也就是说，模版是谁，结合位点就在谁上。二、结合位点就是启动合成DNA或者RNA的碱基序列，如RNA聚合酶结合位点是转录起始位点,是一段特殊的位于编码基因上游的DNA序列.这段DNA序列可以结合RNA聚合酶,从而起始转录过程.经典的RNA聚合酶结合位点是TATA box.TATA box是编码序列前的4个碱基.在大多数生物的基因前面都有TATA着4个碱基序列的存在,它就是一个RNA聚合酶结合位点.拓展资料：DNA聚合酶：polymerase又称DNA聚合酶。系专司生物催化合成脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的一类酶的统称。1957年，美国科学家阿瑟·科恩伯格（Arthur Kornberg）首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶，这种酶被称为DNA聚合酶I（DNA polymerase I，简称：Pol I）。1970年，德国科学家罗尔夫·克尼佩尔斯（Rolf Knippers）发现DNA聚合酶II（Pol II）。随后，DNA聚合酶III（Pol III）被发现。原核生物中主要的DNA聚合酶及负责染色体复制的是Pol III。RNA聚合酶：RNA聚合酶(RNA polymerase):以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶，是催化以DNA为模板(template)、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶，因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。

MicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止， 在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA 分子(Release 21: June 2014) 。大多数miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因组中(Lagos2Quintanaet al, 2001;Lau et al,2001) 。 基本介绍 中文名 ：MicroRNA 性质 ：非编码单链RNA 分子 特点 ：由内源基因编码的长度等 缩写 ：miRNA 简介,MicroRNA,特征,功能,MicroRNA的过表达,MicroRNA的下调,作用方式,识别方法,siRNA,待解决问题,研究工具,分离,探针制备,检测,功能分析,miRNA展望, 简介 MicroRNA (miRNA) 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网路既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。最近的研究表明大约70 %的哺乳动物miRNA 是位于TUs区( transcriptionunits , TUs ) ( Rodriguez et al ,2004) , 且其中大部分是位于内含子区( Kim &Nam , 2006) 。一些内含子miRNA 的位置在不同的物种中是高度保守的。miRNA 不仅在基因位置上保守, 序列上也呈现出高度的同源性(Pasquinelli etal , 2000 ; Ruvkun et al , 2001 ; Lee & Ambros ,2001) 。miRNA 高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。miRNA 与其靶基因的进化有着密切的联系, 研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。 micro RNA MicroRNA MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，几个miRNAs也可以调节同一个基因。可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。 MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300~1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70~90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20~24nt的成熟miRNA。 实际研究中，pre-miRNA套用最早，也最广泛，很多商业化的MicroRNA库都是pre-miRNA形式的。近几年来，研究发现microRNA的双臂对成熟miRNA的形成有着十分重要的作用，所以天然的pri-miRNA形式越来越多地被研究者采用。 MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是线上虫中首次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。 特征 已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构，约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5"端磷酸基和3"羟基，大小约21—25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3"端或者5"端。 3个研究小组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNAs中，有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性（只有有1—2个碱基的区别）。Lau 和Bartel 实验室的同事更加认为：所有的miRNAs可能在其他物种中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类，这些类似的基因被称为“直向同源物”）。 Bantam 最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的一个基因位点。已知几个包含增强子的转座子插入跨越这个位点的一段12.3kb区域会导致果蝇的眼和翅重复生长，而由转座子介导的一段跨越该位点的23kb片断缺失则导致突变果蝇个体小于野生型果蝇。Cohen和同事用一段3.85kb的片断导入21kb片断缺失的果蝇中使其恢复原来的大小。但是奇怪的是表达这个3.85kb片断中的EST却没有同样的效果。Cohen将这个片断和疟蚊Anopheles gambiae的同源序列进行比较，发现一段90bp的高度保守区，经过RNA folding program (mfold)发现这个保守序列可以形成发夹结构，使得这个区段很象是一个miRNA的前体。这个结果经过Northern blot证实突变果蝇的幼体缺少一个21bp的bantam miRNA ，用这个90bp的mRNA前体经过一系列的“功能缺失”—“功能恢复”实验，证实 bantam miRNA在细胞增殖中的作用。研究人员用电脑程式检索在hid mRNA的3"非编码区找到了bantam的3个潜在的结合位点（ hid是果蝇中一个诱导凋亡的基因），并证实 bantam miRNA抑制hid 的翻译而非转录。 micro RNA miRNAs的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。 功能 科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。线上虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNAs中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，因而具有重要意义。 第一个被确认的miRNA——线上虫中首次发现的lin-4和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3"非编码区(3"UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译从而调控线虫发育进程(reviewed in Pasquinelli 2002)。 bantam miRNA是第一个被发现有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知还有一些miRNAs可能参与在细胞分化和组织发育过程中起重要作用的基因的转录后调控，例如mir-14、mir-23 等。 在植物miRNAs的研究中有两条线索提示miRNAs可能参与植物的发育过程。一是在carpel factory (car) 突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。CARPEL FACTORY 是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育。 对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育(Reinhart 2000)，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代谢（Xu 2003)和细胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一个研究表明，2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关，提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin 2002)。 由于miRNAs存在的广泛性和多样性，提示miRNAs可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段，据推测miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是：miRNAs可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。 然而，大多数miRNAs的功能仍然是个谜。 MicroRNA的过表达 MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA ，长度大约为300-1000个碱基pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA 即microRNA前体，长度大约为70-90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24nt的成熟miRNA 。实际研究中，pre-miRNA套用最早，也最广泛，目前很多商业化的MicroRNA库都是pre-miRNA形式的。近几年来，研究发现microRNA的双臂对成熟miRNA的形成有着十分重要的作用，所以天然的pri-miRNA形式越来越多地被研究者采用。 MicroRNA的下调 化学合成的miRNA inhibitors ，用于下调目的细胞中的miRNA ，以实现loss-of function研究。 如果您需要进行长期、稳定的miRNA下调，则可以选用载体形式的miRNA inhibitor。其转染效率高，下调效果好，可以实现对目的miRNA的长期、稳定的下调。 载体形式的miRNA inhibitor，采用的方法如miRNA sponge法，这也是目前SCI文献中用的较多的一种方法。 作用方式 microRNA-RISC对靶基因mRNA的作用主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，有三种方式。 第一种是切断靶基因的mRNA分子——miRNA与靶基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常相似，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA都以这种方式，靶基因mRNA断裂后，无poly(A)的分子的3‘ 端加上多个U并很快降解，含poly(A)的分子能稳定存在一段时间（如拟南芥miR-171）。在植物中目前有一个miRNA和3个潜在的目标靶基因完全互补（这些scarecrow 基因编码潜在的转录因子），尽管还不清楚这些基因是否就是miRNA的目标靶，这仍是第一次发现miRNA 和其潜在的目标靶完全互补，也提示miRNA可能包含和siRNA类似的作用方式。 第二种是抑制靶基因的翻译——作用时与靶基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类（如线虫lin-4）。而在植物中极少数的miRNA通过此方式来抑制靶基因。 第三种是结合抑制——具有以上两种作用模式：当与靶基因互补结合时，直接靶向切割mRNA；当与靶基因不完全结合时，起调节基因表达的作用。 识别方法 多个研究小组采用生物化学结合是生物信息学的方法开展对miRNAs的研究工作。由于据推测都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23个碱基大小、有5"端磷酸基和3"羟基的RNA片断，有的实验室采用改良的定向克隆方法来筛选具有相同特征的小分子——筛选一定大小的RNA分子，连线到3"和5"的适配子（adapters），逆转录并通过PCR扩增、亚克隆并测序。miRNA前体在基因组上的定位和聚类是通过向基因组资料库查询进行。这个方法有助于判断miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解产物。 有的实验室通过一种RNA folding program "mfold" 来判断C. elegans 和C. briggsae 之间的高度保守区域是否含有潜在的miRNA前体，然后用Northern Blots的方法来确定这些miRNAs是否真的表达了。 尽管有数百个miRNAs通过生化或者是生物信息学的方法被鉴别出来，已经鉴别出来的miRNAs只不过是沧海一粟，由于很多已经鉴别出来的miRNAs是从单个克隆中鉴别出来的，所以可以假设还有很多miRNAs在分离和鉴定过程中被“漏掉”了，测序工作还远远不够。 siRNA miRNA和siRNA之间的关系令人迷惑。从表面上说，一个是非编码的单链小分子RNA，在进化上高度保守，通过翻译抑制调控基因表达；另一个是针对编码区的双链小分子RNA，每个转录本都可能有很多个siRNAs，是通过降解目标靶，在转录后调控基因表达。由于每个mRNA模版可能产生很多个siRNAs，要给每个siRNA定一个基因的名字就很困难。miRNA是进化进程中高度保守的，因此给直向同源物一个同样的名字可能有助于了解他们的功能，而给另一个物种中一段无关的序列一个同样的名字就容易造成混乱。 然而，据推测miRNAs通常是由较大的（70­90 nt）的茎环结构（发夹结构）前体经Dicer酶切割得到的，而Dicer同样负责将长双链RNA切割为siRNA，而且二者的长度也差不多，同样有调控基因表达功能。因而这两类小分子RNA之间的关系格外令人关注。 两个广为人知的miRNA——线上虫中首次发现的lin-4 和let-7，通过一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制从而抑制蛋白质合成。这种结合并不诱导mRNA靶的降解，就是说作为翻译抑制子本身不影响对应mRNA的丰度，其原因据推测是由于miRNA和结合位点之间不完全互补。这就区别于siRNA的介导的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以类似siRNA的方式介导目的RNA的降解。实验表明引入和let-7目的mRNA靶完全互补的miRNA会诱导mRNA靶的降解。还有实验结果表明一些miRNA，包括在植物中发现的Scarecrow miRNA，能结合完全互补的mRNA链从而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。这提示miRNAs可以和siRNAs一样作用，这两种小分子RNA作用通路可能有重叠的部分。这种重叠同样提示siRNAs可能也有和miRNAs同样的功能。 一个很有趣的实验证实这个观点：Doench和同事挑选一个已知在体内可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在萤光素酶报告基因的3"端插入对应的CXCR4结合位点——其中一个拷贝是插入一个完全匹配的CXCR4结合位点，另一个拷贝插入4个只有3"和5"端匹配，而中间不同的CXCR4结合位点，这样选定的siRNA就不能完全结合到这个结合位点——中间形成一个突起的不匹配的环。将这两个拷贝转入Hela细胞并用siRNA诱导基因沉默。结果很有趣——两个实验都录得萤光素酶活性下降了超过10倍，RT-PCR和Northern分析证实，第一个实验的萤光素酶转录本下降了超过10倍，这正是正常的siRNA介导的RNAi反应，目标靶mRNA降解导致表达水平的下降，而第二个实验中萤光素酶转录本仅仅下降1.2倍，这种目的基因表达水平下看起来象源于miRNA介导的翻译抑制降，而不是siRNA介导的影响mRNA的稳定性导致。实验表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。实验人员还进行了另一个实验：改变第二个实验中的不匹配环的碱基序列看起来不影响抑制效果，但是siRNA和报告基因上的结合位点的匹配程度越高抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好——这一点和siRNA抑制的情况一样——唯一不同的是：完全匹配的结合位点（siRNA作用方式）可以单独起作用而相互不影响，而增加不完全配对的结合位点（注意在第二个实验中用了4个CXCR4结合位点）的个数对翻译抑制有显著的加乘作用。 在哺乳动物细胞中还没有找到内源的siRNA，外源的siRNA介导的RNAi作用正是一种抵御机制。而miRNAs则广泛存在于哺乳动物细胞中，从理论上推测可能参与多种调控作用。这两种小东西的作用机制和相互关系的本质就显得更加扑朔迷离。如何在实验中正确鉴定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成为一个值得关注的问题。 待解决问题 miRNAs在多个物种中广泛被发现，而且在进化上高度保守。这些“小玩意儿”留给我们一大堆谜团：miRNA的确切功能是什么？它的目标靶是什么？作用机制是什么？也许需要对植物或者线虫的基因组进行miRNAs突变株的筛选，在果蝇中可以用targeted-disruption缺失miRNA序列。对miRNA突变株伴随的表型缺失进行研究，有助于解释miRNAs的功能。 正如Phillip Zamore说的：“如果miRNAs在进化的进程中如此高度保守而没有任何实际功能，那真是大自然拿科研人员开涮——而且是一个残酷的玩笑”。 研究工具 随着小分子RNA日益受到研究人员的重视，很多研究小分子RNA的新方法不断推出。 分离 由于小分子RNA可能参与分化、发育、组织生长、脂肪代谢等生理过程，在不同的组织和发育阶段的表达水平有所不同，进一步了解小分子RNA的生物功能需要确定其在各种生物样品中的表达水平，因而需要一种精确的定量纯化方法，从而得到可信的数据。 现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的矽胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于矽胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA（200nt以上），小分子RNA往往被淘汰掉，因而不适用于小分子RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留小分子RNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。mirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter，GFF)，既能够有效富集10mer以上的RNA分子，又能够兼备离心柱快速离心纯化的优点，是一个不错的选择。对于特别稀有的分子，由于需要分离大量RNA而导致高背景而降低灵敏度，还可以进一步富集10mer到200bp的小分子RNA来提高灵敏度。 探针制备 方法其实很简单：只需要准备目的基因的一小段寡核苷酸序列，3"端另外增加8个和T7启动子互补的碱基，将这段寡核苷酸和T7启动子引物退火，用Klenow大片断补齐得到双链的转录模版，然后用T7 RNA聚合酶、rNTP和标记物混合，体外转录得到标记的小分子RNA探针。这种方法可以快速制备各种标记（同位素、非放射性标记均可）的小于100nt的小分子RNA探针，适用于包括RPAs，Northerns 和原位杂交等各种方法检测小分子核仁RNA( small nuclear RNA,snRNA)，small interfering RNA (siRNA),，micro RNA (miRNA)和 mRNA。非放射性标记的探针还可以用于原位杂交研究miRNA或者mRNA在组织中的分布。 检测 由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究非常困难，多数研究人员采用Northern Blots——一种技术复杂而费力的方法来检测小分子RNA的存在。传统的Northern Blot的方法是是用探针检测固相支持物（膜）上的目标分子，由于用探针检测液相中的目标分子远比检测固相中的目标更为灵敏，生物通在这里为大家推荐一种基于核酶保护分析方法改进的新方法——将同位素标记好的小分子RNA探针和待检测样品混合杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并纯化杂交的RNA分子，最后通过变性胶电泳放射自显影检测结果。这个基于液相杂交的新方法不但操作简单而快速，而且灵敏度极高——可以半定量检测少至10ng总RNA模版中的小分子RNA，或者说，可以检测attomole (10-18 mol)级别的靶目标！灵敏度是Northern Blot的100倍。除此之外，研究人员还可以在同一个样品中同时检测多个小分子RNA和长的RNA模版。应该说，这个灵活巧妙的设计可以为从事小分子RNA实验的研究人员带来不少方便。 总而言之，无论是siRNA, miRNA, snRNA还是其他的小东西，小分子RNA研究的不断深入将帮助我们揭示更多生命的奥秘。 功能分析 miRNA 的上调可用于鉴定功能获得表型；抑制或下调可以研究功能缺失表型。上调与下调的结合可用于鉴定被特定miRNA 调节的基因，以及特定miRNA 参与的细胞进程。 MicroRNA功能分析 主套用包括： ◇miRNA 靶定位点的鉴定和验证 ◇筛选调节某个特定基因表达的miRNAs ◇筛选影响某个特定细胞进程的miRNAs miRNA展望 miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越多的引起研究人员的关注。随着对于miRNA作用机理的进一步的深入研究，以及利用最新的例如miRNA晶片等高通量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究，将会使人们对于高等真核生物基因表达调控的网路理解提高到一个新的水平。这也将使miRNA可能成为疾病诊断的新的生物学标记，还可能使得这一分子成为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发，这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。

rna酶在实验过程中起到催化的作用，能够加快反应。RNA聚合酶是以一条DNA链或RNA为模板，三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶，因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。以下是RNA聚合酶种类的相关介绍：通常可根据生物的类别，将RNA聚合酶分为原核生物RNA聚合酶、真核生物RNA聚合酶。原核生物和真核生物的RNA聚合酶有共同特点，但在结构、组成和性质等方面又不尽相同。1、原核生物RNA聚合酶研究得最清楚的是大肠杆菌RNA聚合酶。该酶是由五种亚基组成的六聚体分子量约500000。其中六聚体称为核心酶，σ因子与核心酶结合后称为全酶。2、真核生物RNA聚合酶真核生物具有3种不同的细胞核RNA聚合酶，分别是RNA聚合酶I、RNA聚合酶Ⅱ、和RNA聚合酶Ⅲ。这三种RNA聚合酶不仅在功能和理化性质上不同，而且对鹅膏蕈碱（一种毒蘑菇含有的环八肽毒素）的敏感性也不同。以上资料参考百度百科——RNA聚合酶种类

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lpl(l噬菌体的左向启动子)、t7噬菌体启动子等。（1）lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是dna分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(laci)、启动基因(p)、操纵基因(o)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过cap(catabolitegeneactivationprotein)因子和camp来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生lacz阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如iptg可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与o基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）tac启动子：tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比lac和trp都强。其中tac1是由trp启动子的－35区加上一个合成的46bpdna片段(包括pribnow盒)和lac操纵基因构成，tac12是由trp的启动子-35区和lac启动子的-10区，加上lac操纵子中的操纵基因部分和sd序列融合而成。tac启动子受iptg的诱导。（4）lpl启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子。lpl启动子受控于温度敏感的阻遏物cits857。在低温(30℃)时，cits857阻遏蛋白可阻遏pl启动子转录。在高温(45℃)时，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl启动子转录。系统由于受cits857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导pl启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体ci+溶源菌，并用丝裂霉素c或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）t7噬菌体启动子：它是来自t7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有t7rna聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。t7rna聚合酶的效率比大肠杆菌rna聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有t7rna聚合酶。应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lpl(l噬菌体的左向启动子)、t7噬菌体启动子等。（1）lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是dna分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(laci)、启动基因(p)、操纵基因(o)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过cap(catabolitegeneactivationprotein)因子和camp来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生lacz阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如iptg可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与o基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）tac启动子：tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比lac和trp都强。其中tac1是由trp启动子的－35区加上一个合成的46bpdna片段(包括pribnow盒)和lac操纵基因构成，tac12是由trp的启动子-35区和lac启动子的-10区，加上lac操纵子中的操纵基因部分和sd序列融合而成。tac启动子受iptg的诱导。（4）lpl启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子。lpl启动子受控于温度敏感的阻遏物cits857。在低温(30℃)时，cits857阻遏蛋白可阻遏pl启动子转录。在高温(45℃)时，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl启动子转录。系统由于受cits857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导pl启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体ci+溶源菌，并用丝裂霉素c或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）t7噬菌体启动子：它是来自t7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有t7rna聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。t7rna聚合酶的效率比大肠杆菌rna聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有t7rna聚合酶。应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lpl(l噬菌体的左向启动子)、t7噬菌体启动子等。（1）lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是dna分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(laci)、启动基因(p)、操纵基因(o)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过cap(catabolitegeneactivationprotein)因子和camp来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生lacz阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如iptg可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与o基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）tac启动子：tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比lac和trp都强。其中tac1是由trp启动子的－35区加上一个合成的46bpdna片段(包括pribnow盒)和lac操纵基因构成，tac12是由trp的启动子-35区和lac启动子的-10区，加上lac操纵子中的操纵基因部分和sd序列融合而成。tac启动子受iptg的诱导。（4）lpl启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子。lpl启动子受控于温度敏感的阻遏物cits857。在低温(30℃)时，cits857阻遏蛋白可阻遏pl启动子转录。在高温(45℃)时，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl启动子转录。系统由于受cits857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导pl启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体ci+溶源菌，并用丝裂霉素c或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）t7噬菌体启动子：它是来自t7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有t7rna聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。t7rna聚合酶的效率比大肠杆菌rna聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有t7rna聚合酶。应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lpl(l噬菌体的左向启动子)、t7噬菌体启动子等。（1）lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是dna分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(laci)、启动基因(p)、操纵基因(o)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过cap(catabolitegeneactivationprotein)因子和camp来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生lacz阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如iptg可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与o基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）tac启动子：tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比lac和trp都强。其中tac1是由trp启动子的－35区加上一个合成的46bpdna片段(包括pribnow盒)和lac操纵基因构成，tac12是由trp的启动子-35区和lac启动子的-10区，加上lac操纵子中的操纵基因部分和sd序列融合而成。tac启动子受iptg的诱导。（4）lpl启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子。lpl启动子受控于温度敏感的阻遏物cits857。在低温(30℃)时，cits857阻遏蛋白可阻遏pl启动子转录。在高温(45℃)时，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl启动子转录。系统由于受cits857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导pl启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体ci+溶源菌，并用丝裂霉素c或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）t7噬菌体启动子：它是来自t7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有t7rna聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。t7rna聚合酶的效率比大肠杆菌rna聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有t7rna聚合酶。应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等.（1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子,是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列,由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成.Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控.正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子,促使转录进行.负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白,该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录.乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物,使其构型改变,不能与O基因结合,从而解除这种阻遏,诱导转录发生.（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子,其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性.当缺乏色氨酸时,该启动子开始转录.当色氨酸较丰富时,则停止转录.b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合,解除阻遏蛋白的活性,促使trp启动子转录.（3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子,受Lac阻遏蛋白的负调节,它的启动能力比Lac和trp都强.其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成,Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区,加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成.Tac启动子受IPTG的诱导.（4）lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子,是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子.lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物 cIts857.在低温(30℃)时,cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录.在高温(45℃)时,cIts857蛋白失活,阻遏解除,促使PL启动子转录.系统由于受cIts857作用,尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物,缺点是温度转换不仅可诱导PL启动子,也可诱导热休克基因,其中有一些热休克基因编码蛋白酶.如果用l噬菌体cI+溶源菌,并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导,可缓解这一矛盾.（5）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子,具有高度的特异性,只有T7RNA聚合酶才能使其启动,故可以使克隆化基因独自得到表达.T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右,它能使质粒沿模板连续转录几周,许多外源终止子都不能有效地终止它的序列,因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列.这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因.但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶.应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶,它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体.

1、核酸序列依赖性扩增法，NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在 42 ℃进行 ,可在2h内将RNA模板扩增约109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA 退火, 在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量扩增。 2、转录介导的扩增技术，TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在41.5 ℃进行,可在1h内将RNA模板扩增约109倍。 3、连接酶酶促链式反应(LCR)，LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术，是继PCR后新发展的一种较有前景的体外扩增技术。它的原理就是由2段寡核苷酸单链DNA探针与目标序列杂交,当该2段DNA探针与没有发生突变的模板褪火后,如果2探针是紧邻的,中间没有核苷酸间隔,则可在连接酶作用下连接起来,连接以后的新链又可以作为模板,引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基突变,则连接反应不能发生,扩增反应终止。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lpl(l噬菌体的左向启动子)、t7噬菌体启动子等。（1）lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是dna分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(laci)、启动基因(p)、操纵基因(o)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过cap(catabolitegeneactivationprotein)因子和camp来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生lacz阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如iptg可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与o基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）tac启动子：tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比lac和trp都强。其中tac1是由trp启动子的－35区加上一个合成的46bpdna片段(包括pribnow盒)和lac操纵基因构成，tac12是由trp的启动子-35区和lac启动子的-10区，加上lac操纵子中的操纵基因部分和sd序列融合而成。tac启动子受iptg的诱导。（4）lpl启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子。lpl启动子受控于温度敏感的阻遏物cits857。在低温(30℃)时，cits857阻遏蛋白可阻遏pl启动子转录。在高温(45℃)时，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl启动子转录。系统由于受cits857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导pl启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体ci+溶源菌，并用丝裂霉素c或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）t7噬菌体启动子：它是来自t7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有t7rna聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。t7rna聚合酶的效率比大肠杆菌rna聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有t7rna聚合酶。应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 （2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。 （4）lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子。lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物 cIts857。在低温(30℃)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(45℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。系统由于受cIts857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导PL启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体cI+溶源菌，并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。 （5）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体。

目录 1 拼音 2 英文参考 3 聚合酶链式反应的定义 4 聚合酶链反应的历史回顾 4.1 核酸体外扩增最早的设想 4.2 聚合酶链反应的发明 5 聚合酶链反应相关技术的发展 6 其它扩增技术 6.1 连接酶链反应 （A） 6.2 依赖核酸序列的扩增 （A） 6.3 转录依赖的扩增系统 （A） 6.4 Qβ复制酶反应 （A） 7 PCR技术的应用举例： 8 PCR的基本原理和概念 8.1 基本原理 8.2 参与PCR反应体系的因素及其作用 9 聚合酶链式反应检查 9.1 聚合酶链式反应正常值 9.2 聚合酶链式反应临床意义 10 参考资料 1 拼音 jù hé méi liàn shì fǎn yìng 2 英文参考 Polymerase Chain Reaction [WS/T 455—2014 卫生监测与评价名词术语] PCR [WS/T 455—2014 卫生监测与评价名词术语] 3 聚合酶链式反应的定义 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是指由引物选择性体外扩增DNA或RNA片段的检测方法[1]。该方法在输血领域可用于各种血型分型、骨髓移植配型、输血传播疾病病原体检测等[1]。 聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种分子生物学实验方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即模板DNA先经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与两条模板DNA链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）为底物，使退火引物得以延伸。如此反复，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。[2] 4 聚合酶链反应的历史回顾 4.1 核酸体外扩增最早的设想 由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时（1970年）Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。 4.2 聚合酶链反应的发明 直到1985年，美国PECetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）, 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA的体内 复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PECetus公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。 5 聚合酶链反应相关技术的发展 PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和 英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用 与技术本身的优化问题；第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进 展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。 （表）聚合酶链反应的相关技术 名　　　称 主要用途 简并引物扩增法 扩增未知基因片段 巢居PCR 提高PCR敏感性、特异性，分析突变 复合PCR 同时检测多个突变或病原 反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变 单一特异引物PCR 扩增未知基因组DNA 单侧引物PCR 通过已知序列扩增未知cDNA 锚定PCR 分析具备不同末端的序列 增效PCR 减少引物二聚体，提高PCR特异性 固著PCR 有利于产物的分离 膜结合PCR 去除污染的杂质或PCR产物残留 表达盒PCR 产生合成或突变蛋白质的DNA片段 连接介导PCR DNA甲基化分析、突变和克隆等 RACEPCR 扩增cDNA末端 定量PCR 定量mRNA或染色体基因 原位PCR 研究表达基因的细胞比例等 臆断PCR 鉴定细菌或遗传作用 通用引物PCR 扩增相关基因或检测相关病原 信使扩增表型分型（mapping） 同时分析少量细胞的mRNA 6 其它扩增技术 与PCR及其相关技术发展的同时，新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利 弊，与PCR互为补充，有的可结合应用，共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我 们相信，随着分子生物学技术的发展，这一家族一定会再涌现出新成员。 其它体外核酸扩增技术（表） 技术 应用 转录依赖的扩增系统（TAS） 检测HIV 连接酶链反应（LCR） 检测点突变 自主序列复制（3SR）系统 研究RNA，临床应用、法医学等 链替代扩增（SDA） 检测、鉴定基因 Qβ复制酶系统 增加探针检测敏感性 循环探针反应 增加探针检测敏感性 6.1 连接酶链反应 （A） 连接酶链反应（Ligase　chain　reaction，LCR）,是一种新的DNA体外扩增和检测 技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。是Backman　1997年为检出靶基因序列 中的点突变而设计发明，并申报了专利。 LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接,经变性退火连 接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。 LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94℃min变性 和65℃复性并连接，循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用 点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单堿基遗传病多 态性及单堿基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。 6.2 依赖核酸序列的扩增 （A） 依赖核酸序列的扩增（Nucleic　acid　sequencebased　amplification,NASBA） ，又称自主序列复制系统（selfsustained　sequence　replication，3SR）或再生长 序列复制技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术。 NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序。 其基本方法为：将引物,标本加入扩增反应液，65℃1min使RNA分子二级结构打 开,降温至37℃加入逆转录酶,T7RNA聚合酶和RNase　H,并在37℃反应1～1.5小时,其 产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。 NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。 6.3 转录依赖的扩增系统 （A） 转录依赖的扩增系统（Tranbased　amplification　sytem，TAS），是 Kwen等人于1989年研究报道的，主要用于扩增RNA。 TAS的主要特点是扩增效率高，因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加，只需6个 循环靶序列的拷贝数就能达到2×106。它的另一个特点是特异性高，由于TAS只能进行 6次温度循环，错掺率低，加之用葡聚糖珠夹心杂交，因而特异性也高。 虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和 T7RNA多聚酶，有待进一步研究。 6.4 Qβ复制酶反应 （A） Kacian等于1972年首次报报Qβ复制酶（Qbeta　replicase）催化RNA模板的自我 复制功能，它能在常温30min，将其天然模板MDV1RNA扩增至109。1986年Chu等报道 用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV1RNA杂交，经洗脱未被结合 的MDV1后，再加入Qβ复制酶，扩增复制MDV1拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同 源性的第二探针杂交。 Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点：①不需寡核苷酸引物的引 导就可启动RNA的合成。②能特异地识别RNA基因中由于分子内堿基配对而形成的特有 的RNA折叠结构。③在Q　β复制酶的天然模板MDV1　RNA的非折叠结构区插入一短的 核酸序列不影响该酶的复制。　因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被 Qβ复制酶扩增。 1988年Lizardi等，将靶基因序列 *** MDV1质粒里，用T7　RNA聚合酶催化转录 出MDV1　RNA探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针,加入Qβ 复制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增。其产物 按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复 制等技术。 7 PCR技术的应用举例： 研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结 合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆 或表达载体；检测某基因的内切酶多态性 诊断：细菌（螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致 病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等）；病毒（HTLV、HIV、HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19）；寄生虫（疟疾 等）；人遗传病（LeshNyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等） 免疫学：HLA分裂；T细胞受体或抗体多样化的定性；自身免疫病基因作图；淋巴因子定量 人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建（检测DNA、 多态性或 *** 绘图）；物理图谱的构建；测序，表达图谱 法医：犯罪现场标本分析；HLADQ 肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤 组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；生态学；环境科学；实验遗 传学。 古生物学：考古与博物馆标本分析 动物学：动物传染病的诊断等 植物学：检测植物病原等 8 PCR的基本原理和概念 8.1 基本原理 DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。 PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热（变性）、冷却（退火、保温（延伸）等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。PCR的具体过程如下： 将PCR反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3"端与5"端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3"端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为2^n倍。当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。PCR扩增过程见图81。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）^n，R为扩增效率。 8.2 参与PCR反应体系的因素及其作用 参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、反应温度与循环次数、PCR仪等。现对它们的作用介绍如下： （一）模板核酸 用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。 PCR反应时加入的DNA模板量一般为100100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的堿基错配。 通常模板DNA用线性DNA分子，若为环状质粒，最好先用酶将其切开成线状分子，因为环状DNA复性太快。 （二）引物 引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。因此，引物设计决定PCR反应的成败。 PCR反应中有两种引物，即5"端引物与3"端引物。5"端引物是指与模板5"端序列相同的寡核苷酸，3"端引物是指与模板3"端序列互补的寡核苷酸。对引物的基本要求有：①引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有1630bp，因为4^164.29x10^9，已大于哺乳动物基因组3x10^9bp，保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74度），亦会影响产物的特异性。②G+C的含量一般为40％60％。③四种堿基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。尤其是引物3"端，不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。④引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补堿基不能大于3bp。⑤两引物之间不应互补，尤其是它们的3"端不应互补。一对引物之间不应多于4个连续堿基有互补性，以免产生引物二聚体。④引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补堿基同源，否则导致非特异性扩增。①引物3"端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3"端A影响最大，因此，尽量避免在引物3"端第一位堿基是A。引物3"端也不要是编码密码子的第三个堿基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。⑧引物5"端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等，引物的设计最好以电脑软件进行指导。 反应体系中，引物浓度一般要求在O.10.5μmol之间。浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。 引物Tm值与退火温度有关，计算公式为：Tm4（G+C）+2（A+T）。引物Tm值最好在5580℃范围，以接近72℃为最好。 （三）耐热的TaqDNA聚合酶 1976年Chien分离出热稳定聚合酶，1986年Erlich分离并纯化了适于PCR的Tq热稳定性聚合酶，为PCR成为实用技术奠定了基础，现已用基因重组生产。日前可用于PCR的聚合酶有多种：有从水生栖热菌中提取的Taq酶、从嗜热栖热苗中获得的Taq酶、从Litoralis栖热球菌中分离的VENT酶、及从酸热浴硫化裂片苗中分离的Sac酶，而以Taq酶用得最广泛。Taq DNA聚合酶分子量为94kD，75℃时酶比活性为150bs/酶分子，反应温度过高或过低均影响其延伸率，Taq蕾有很高的耐热稳定性。实验表明，在92.5℃、95℃、97.5℃时，其半衰期分别为40min、30min和5min。 纯化的Taq酶在体外无3"5"外切酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。错配堿基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。通常，30次循环Taq酶的错配率约为0.25％，高于Klenow酶的错配率。Taq酶在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，堿基替换率为1/8000。应用低浓度的dNTP（各20μmol／L）、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10^6次/（核苷酸*循环）。 Taq酶具有类似于末端转移酶的TdT的活性，可在新生成的双链产物的3"端加上—个堿基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲将PCR产物克隆到载体上，可以用两种处理办法：一是构建dT载体；二是用Klenow酶将3"端的A去掉，即在PCR反应后，先在99℃加热10min灭活Taq酶，调整Mg2+浓度至510mmol/L，加入12U Klenow片段，室温下作用1520min，3"端的A即被切去， Taq酶还具有反转录活性。在23mmol/L Mg2+浓度下68℃时出现类似反转录酶的活性。若有Mg2+存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于RNAPCR，尤其是短片段的扩增。 以往用Taq酶进行PCR扩增，一般只能扩增小于400bp的DNA片段，经过对酶的结构与功能的改造，以及PCR方法学的改进，现已能扩增20kb以上的DNA分于。 Taq酶在PCR反应中加入的量也很重要，太少当然不好，太多一方面浪费，同时也导致非特异性扩增，通常每lOOμl反应液中含12.5U Taq酶为好。最好在0.55U范围内确定最佳酶浓度。另一个问题是，虽然Taq酶是热稳定性较好的工具酶，也应注意在20℃贮存。 （四）缓冲液 缓冲液提供PCR反应合适的酸堿度与某些离子，常用1050mmol/L。TrisHCI（pH8.38.8）缓冲液。缓冲液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火。有人并加入小牛血清白蛋白（100μg/L）或明胶（0.0％）或Twen20（0.05％0.1％）或二硫基苏糖醇（DDT，5mmol/L）等，认为这些物质可以保护Taq酶。 （五）Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低；Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等。Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，而PCR反应体系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+的游离浓度。因此，Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.20.25mmol/L。如果反应体系中含有EDTA等螯合剂，也可结合掉一部分Mg2+。 为了获得Mg2+的最佳浓度，可用下面的优化法。首先在PCR缓冲液小不加入Mg2+，从配置的10mmol/L的Mg2+储存液中取一定量加入到各反应管中，开始以0.5mmol/L的浓度梯度递增（0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L），由PCR反应后的电泳结果可确定Mg2+大概浓度范围，再在该浓度的上下以0.2mmol/L递增与递减几个浓度来精确确定Mg2+最适浓度。 （六）dNTP dNTP为PCR反应的合成原料。每种dNTP浓度应相等，通常的浓度范围为20200gmol/L，在此范围内，PCR产物的量、反应的特异性与忠实性之间的平衡最佳。例如，当每种dNTP为20μmol/L时，理论上可以产生2.6μg的400bp的DNA。使四种dNTP的浓度保持在其Km值（1015μmol/L）以上，可保持堿基掺入的忠实性；若dNTP的浓度大于50mmol/L，则可抑制Taq酶的活性。 （七）反应温度和循环次数 1．变性温度与时间 PCR反应中变性这一步很重要，若不能使模板DNA和PCR产物完全变性，PCR反应就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的变性温度愈高。太高的变性温度和时间又会影响Taq酶的活性，通常的变性温度和时间分别为95℃、30s，有时用97℃、15s。虽然DNA链在变性温度时两链分离只需几秒钟，但反应管内部达到所需温度还需要一定的时间，团此要适当延长时间。为了保证模板DNA能彻底变性．最好为710min，然后在以后的循环中，将变性步骤设为95℃/min。 扩增100300bp短片段时，还呵以用快速的两步PCR法，即变性（9497℃）、退火及延长（5575℃）。 为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管内加入12滴液体石蜡。 2．复性温度和时间 复性温度决定PCR的特异性，合适的复性温度应低于引物Tm值的5℃。退火温度过低，引起非特异性扩增；增高退火温度，可提高扩增的特异性，因此要严格规定退火温度。退火反应时间一般为1min。 在PCR开始的头一次循环时，反应从远低于Tm值的温度开温，由于Taq酶在低温时仍具有活性，这时就可能因引物与模板非特异性配对面出现非特异性产物或出现引物二聚体 然后在以后整个PCR反应中，非特异性产物反复扩增，而使PCR严重失败。为了尽量消除这种非特异性扩增，可以使用热起动的方式，热起动方法有几种：一种方法是在PCR系统中加入抗Taq酶抗体。抗体与Taq酶结合，使Taq酶活性受抑制。因此在开始时，虽然温度低，引物可与与模板错配，但因Taq酶没有活性，不会引起非特异性扩增；当进行热变性时，抗体在高温时失活，Taq酶被释放，就可发挥作用，在以后的延伸步骤进行特 异的DNA聚合反应。另一种热起动法是用石蜡将Taq酶与PCR反应系统分隔，因此一开始在室温条件下也没有非特异性扩增。当升温到热变性温度下，石蜡熔化，Taq酶与PCR反面系统混合，从而在以后的步骤中发挥作用。使用热起动可以提高PCR扩增的特异性。 3．延伸温度与时间 延伸温度一般为72℃左右，此时Taq酶活性为每秒钟掺入核苷酸35100个，2kb的片段用1min已足够，若DNA片段较长，扩增时间可适当延长。延伸时间过长又可引起非特异性扩增。 4．循环次数 循环次数主要取决于最初靶分子的浓度，例如在初始靶分子为3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷贝数时，循环数可分别为2530、3035、3540从4045。过多的循环次数会增加非特异性产物量及堿基错配数。PCR反应后期，扩增产物的增加并不成为指数方式，称为平台效应。平台效应可能与下列因素有关：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，多次循环后酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸。 （八）PCR仪 有多种进口与国产PCR仪。仪器的升降温方式可有气体加温、水加温及电热块加温等。温度、循环次数及时间等参数现多用电脑控制。可根据需要选择仪器。 由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而引起以后的PCR假阳性。为此，应将PCR仪及PCR产物检测等过程与标本制备及PCR反应管的制备尽量在空间分开，最好在不同的房间进行。通常可将实验空间分为标本处理区、反应混合制备和PCR扩增区、产物分析区等。 9 聚合酶链式反应检查 聚合酶链式反应是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 9.1 聚合酶链式反应正常值 体内菌群的种类和比例正常，人体处于动态平衡健康状态。 9.2 聚合酶链式反应临床意义 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。 异常结果： 各种疾病所致的异常，例如梅毒。①一期梅毒。即硬下疳 ，潜伏期2～4周，外生殖器部位发生暗红色硬肿块 、浅溃疡 ，有软骨样硬度，周围淋巴结肿大。②二期梅毒。在一期梅毒 1～2 个月之后，全身皮肤、粘膜发生对称泛发皮疹、斑疹、丘疹、脓疱疹等。粘膜可发生粘膜斑、扁平湿疣，传染性强。③三期梅毒。发生在感染后2～3年乃至10年，皮肤为树胶样肿，还可涉及骨、关节、心、血管，表现为主动脉炎、主动脉瓣闭锁不全和主动脉瘤等，侵及神经为脊髓痨 ，全身麻痹 （ 麻痹性痴呆 ）等等。

一、基因型不同：1、DH5a：DH5a的基因型为：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1。2、BL21：BL21的基因型为F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）。二、特性不同：1、DH5a：DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。2、BL21：该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。菌株作用BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的染色体上，所以称为BL21(DE3)。可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。BL21(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率达107cfu/μg DNA。以上内容参考：百度百科-大肠杆菌菌株

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。（1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。（4）lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子。lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物 cIts857。在低温(30℃)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(45℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。系统由于受cIts857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导PL启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体cI+溶源菌，并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体。

一、基因型不同：1、DH5a：DH5a的基因型为：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1。2、BL21：BL21的基因型为F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）。二、特性不同：1、DH5a：DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。2、BL21：该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。菌株作用BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的染色体上，所以称为BL21(DE3)。可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。BL21(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率达107cfu/μg DNA。以上内容参考：百度百科-大肠杆菌菌株

Xl1-Blue菌株 基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F‘[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。 特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。 用途：分子克隆和质粒提取。 BL21(DE3)菌株 基因型：F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。 特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达。 BL21(DE3)ply菌株 基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)。 特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基 因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。 适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达 DH5α菌株 基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ– 特点：一种常用于质粒克隆的菌株。 其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和 endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 JM109菌株 基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F‘ traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。 特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达

转录，是指遗传信息从基因（DNA）转移到RNA，在RNA聚合酶的作用下形成一条与DNA碱基序列互补的mRNA的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，进行转录时，一个基因会被读取并被复制为mRNA，即特定的DNA片断作为遗传信息模板，以依赖DNA的RNA聚合酶作为催化剂，通过碱基互补的原则合成前体mRNA。RNA聚合酶通过与一系列组分构成动态复合体，完成转录起始、延伸、终止等过程。生成的mRNA携有的密码子，进入核糖体后可以实现蛋白质的合成。转录仅以DNA的一条链作为模板，被选为模板的单链称为模板链，亦称无义链；另一条单链称为非模板链，即编码链，因编码链与转录生成的RNA序列一致，所以又称有义链。DNA上的转录区域称为转录单位。 （节选自百度百科）因此，是以特定的DNA片断作为遗传信息模板

启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。SD序列1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3cent;末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。终止子在一个基因的3cent;末端或是一个操纵子的3"末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构。这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构，并且有与A/T富含区对应的一串U。转录终止的机制较为复杂，并且结论尚不统一。但在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。

1、复制（duplication）是在分子进化过程中产生新的遗传物质的主要机制。它可以定义为遗传物质的任何复制行为。复制的常见来源包括异位重组、逆转录、异倍性、多倍性和滑链错配等。2、转录（Transcription）是遗传信息从DNA流向RNA的过程。即以双链DNA中的确定的一条链（模板链用于转录，编码链不用于转录）为模板，以A、U、C、G四种核糖核苷酸为原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的过程。3、翻译是蛋白质生物合成（基因表达中的一部分，基因表达还包括转录）过程中的第二步（转录为第一步），翻译是根据遗传密码的中心法则，将成熟的信使RNA分子（由DNA通过转录而生成）中“碱基的排列顺序”（核苷酸序列）解码，并生成对应的特定氨基酸序列的过程。但也有许多转录生成的RNA，如转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）和小核RNA（snRNA）等并不被翻译为氨基酸序列。转录特点转录时，细胞通过碱基互补的原则来生成一条带有互补碱基的mRNA，通过它携带密码子到核糖体中可以实现蛋白质的合成。与DNA的复制相比，转录有很多相同或相似之处，亦有其自己的特点。转录中，一个基因会被读取并复制为mRNA。就是说，以特定的DNA片段作为模板，以DNA依赖的RNA聚合酶作为催化剂，合成前体mRNA。在体内，转录是基因表达的第一阶段，并且是基因调节的主要阶段。转录可产生DNA复制的引物，在反转录病毒感染中也起到重要作用。转录仅以DNA的一条链作为模板。被选为模板的单链叫模板链，又称无义链；另一条单链叫非模板链，又称编码链、有义链、信息链。DNA上的转录区域称为转录单位（transcription unit）。RNA聚合酶合成RNA时不需引物，但无校正功能。

启动子连接RNA聚合酶。RNA聚合酶是负责合成RNA链的酶。在转录过程中，RNA聚合酶结合到启动子的序列上，并开始合成RNA。启动子是基因的调控区域，位于基因的上游区域，用于启动基因转录过程。

转录时RNA聚合酶能识别DNA中特定碱基序列是对的。转录时，需要催化酶，就是RNA聚合酶，而发生反应的前提是该酶与DNA结合，结合部位在DNA编码区上游的启动子，被识别的那一段特定碱基序列就叫启动子。不同的RNA聚合酶识别不同的启动子。所以，RNA聚合酶首先要识别找到启动子，结合后在转录。