一步法免疫组化和SP法免疫组化有什么区别

如果是同公司同货号的抗体，差异就是在生物素上，生物素化的抗体是在一抗上偶联了生物素，这样可以在下游检测时通过亲和素放大一抗的信号强度，而未生物素化的抗体，需要二抗用anti特异种属的来进行信号放大。

为了增强在质谱中的检测信号。根据查询分析测试百科网得知，质谱分析中生物素化的作用是将含有生物素标记的小分子或大分子探针与待测样品中的目标分子结合，从而增强它们在质谱中的检测信号。质谱是一种与光谱并列的谱学方法。

5分钟。生物素化反应是在脱羧羧化反应和脱氨反应中起辅酶作用，这个过程会持续5分钟之久才有反应，如果在不到5分钟的时间停止这个实验，就不会产生反应了。

细胞膜蛋白质的含量测定。生物素化膜蛋白提取法(biotin-label membrane protein isolation)属于亲和纯化蛋白质的方法,将生物素与膜蛋白相偶联,利用生物素同鸡蛋清中的亲和。

将生物素转化为生物素AMP。TurboID是一种工程生物素连接酶，它使用ATP将生物素转化为生物素AMP，这是一种共价标记近端蛋白质的反应性中间体。

在做western blot或免疫组化时我们常使用一抗二抗来放大、显示抗原，用酶或荧光标记二抗。生物素化的抗体，是在抗体上连接生物素（biotin），生物素能和亲和素（avitin）特异性高亲和性结合，亲和力是抗原抗体结合的一万倍，而且一个avitin可以结合四个biotin，这样又起到级联放大的作用。所以能更加灵敏的显示微量抗原。这种方法也叫亲和免疫组化。

【答案】：DABC为亲和素-生物素化酶复合物技术；LAB为标记亲和素-生物素的方法；直接法为生物素化第一抗体；间接法BAS为生物素化第二抗体。

可以。和其他抗体的保存方法一样。生物素非常稳定，而且一旦标记到抗体上后就不会脱落。所以只要按照普通抗体的保存方法保存就可以了。生物素只有在长时间暴露在紫外下才会分解，其他时候都非常稳定的。

可以。

SP，但其实和ABC基本原理是一样的，生物素化的二抗孵育之后还需要一步是用HRP（或者其他酶类）标记的链霉卵白素复合物孵育使其与生物素结合，然后和DAB反应的是HRP。简单来说就是：一抗--生物素化二抗结合一抗种属IgG--带HRP链霉卵白素结合生物素--DAB与HRP反应显色。

生物素化的抗体和生物素化的酶可以直接结合上亲和素化的磁珠，也就是Biotin-Avidin的亲和结合，具有高度特异性和可逆性等特点。

免疫组化检测小鼠组织抗原表达情况时,采用免疫组化用纯化抗体（小鼠）进行抗原抗体反应,纯化小鼠抗体通常有多个表位,除去和抗原反应的表位外,还可以有一个表位结合羊抗小鼠IgG,在羊抗小鼠IgG上面连上生物素,可以通过SABC法进行生物素显色,根据显色情况来判断抗原的表达水平,属于间接检测法.该方法比较灵敏,但是实验过程条件太多,容易出现假阳性……

是为了放大信号，使显色更加灵敏。如果直接用HPR结合的检测抗体，信号会相对弱一些。

亲和素生物素系统加热到95度会分离BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。BAS用于检测的基本方法可分为三大类。第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为桥联亲和素-生物素法(BRAB)。第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。 亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。生物素-亲和素系统可以与亲和层析的方法结合，大大提高纯化蛋白质的纯度，或者为已知配体寻找受体。步骤是首先将生物素共价结合到配体蛋白上，再将生物素化后的配体蛋白加入含有受体蛋白的混合物，然后将此混合物通过预先固定了亲和素的层析柱，这时配体受体复合物就通过生物素-亲和素系统停留在层析柱上，最后通过选择性洗脱获得此受体配体蛋白复合物或者仅有受体。这一方法被广泛运用于药物研发行业，当人们发现某种药物分子具有疗效但是又不清楚它具体作用于哪种蛋白质时，可以将其生物素化然后把靶蛋白从成千上万种蛋白质中“抓”出来。生物素-亲和素系统还可以用相似的方法分离DNA.方法是在DNA探针的一端挂上生物素，然后用其获得目的DNA片段，再利用固定化的亲和素回收这些DNA。传统的基因探针是由带放射性的磷酸碱基合成的，我们可以用被生物素标记的磷酸碱基合成基因探针，避免了实验过程中放射性物质可能造成的伤害。

免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验（ELISA）的测定过程；第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原（如牛血清白蛋白（BSA））包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素（Protein A-Streptavidin）嵌合体（重组融合蛋白）中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19（质粒DNA) (Biotin-pUC19）中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。PCR由 ①待测抗原；②生物素化抗体；③亲和素（连接分子）；④生物素化DNA；⑤PCR扩增五部分构成。 连接分子是连接特异抗体与DNA之间的分子。目前介绍的方法中均是通过生物素与亲和素系统使特异抗体与DNA连接，生物素和亲和素作为免疫PCR的连接分子在连接方式上有许多差异。Sano首次报道PCR时用的是重组葡萄球菌A蛋白-亲和素嵌合蛋白（SPA-亲和素）。其具有结合IgG和生物素的两个位点，因此可以将IgG与生物素化的DNA连接成复合物。由于重组的SPA-亲和素没有商品试剂，且SPA不但可以结合特异抗体的IgG，而且还可以与样品中吸附于固相的无关IgG结合，特别是检测的抗原就是某种IgG，因此，Ruzicke认为Sano的免疫PCR本底高和特异性差。Ruzicke用商品化的亲和素系统试剂建立了一种免疫PCR，这种方法是先将亲和素与生物素化的DNA预结合成复合物，然后再与结合固相的特异性抗体结合，这种方法存在的问题是亲和素与生物素化的DNA分子预结合时二者的分子比例并不是等同的，一个亲和素分子可以结合4个分子生物素，因此在预结合时生物素化的DNA分子不能过多，否则DNA分子上的生物素将亲和素完全饱和，亲和素再无结合生物素化抗体的能力；但在低饱和生物素化DNA时，亲和素结合的生物素化DNA存在许多种类的复合物，甚至还有游离的亲和素，只有部分结合生物素化DNA的亲和素才能起到连接分子的作用，因此，这样预结合的亲和素和生物素化DNA是一均质性很差的混合物。虽然预结合的复合物可以减少测试过程中的1次孵育和冲洗，但是这样的复合物作为连接分子必然导致敏感性低和误差大，并且每次制备的连接分子均有差异，从而导致重复性差。Hong zhou等建立了一种免疫PCR方法，连接分子是链亲和素，在连接抗体和DNA时是以游离的方式加入，这样链亲和素先与生物素化抗体结合，冲洗后，再加入生物素化的DNA。这个方法虽然多了1次孵育和冲洗过程，但具有较好的敏感性和重复性。 免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样，主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相进行抗原抗体反应，同时又需要对固相结合的DNA进行扩增，因此，免疫PCR固相的选择应根据具体情况确定。用微量板作为固相必须有配套的PCR仪，以使可以用微量板直接扩增，否则需要用PCR反应管作为固相扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据PCR产物的大小选择两种凝胶的浓度。电泳后凝胶经染色和拍照记录结果，再检测底片上PCR产物的光密度，并与标准品比较就可以得出待检抗原量。

Elisa Kit使用方法（以人IL-4 ELISA KIT为例）：检测原理:本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可 通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。试剂盒组成：1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6）2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支）3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml）4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支）5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支）7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）8．浓缩洗涤液 20× （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml）9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）11．封板胶纸（6/3 张）12．产品说明书（1 份）标本收集:1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。注意事项:1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后 再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻 融。5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试 验结果。9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时， 请按国家生物试验室安全防护条列执行。 检测前准备工作:1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。3. 标准品: 加入标准品/标本稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。复溶标准品原液（1000 pg/ml）若未用完请分装后放入-20℃以下电冰箱内保存，保存两个月。已稀释的标准品请废弃。4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致生物素化 抗体量不足，可向我们公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以酶结合物稀释液稀释浓 缩酶结合物(1:30) 成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足， 可向我们公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号） 洗涤方法:1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350ul，注入与吸出间隔15－30秒。洗板5次。2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。操作步骤:1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。4．洗板5次。5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。7．洗板5次。8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。10．洗板5次。11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。结果判断:1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。灵敏度、特异性和重复性:● 灵敏度：最小可测人IL-4达7pg/ml。● 特异性：不与IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反应。● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。IL-4简介：IL-4是一种由活化的T细胞产生的细胞因子，以往称为B细胞生长因子1。在B细胞生长的早期活化B细胞，并使被抗原、抗IgM或脂多糖活化的B细胞进入细胞周期G1期。IL-4增强MHCII类抗原的表达和CD23（FceRII）在B细胞上的表达，诱导同种型（isotype）转换，如促使小鼠B细胞从分泌IgM、IgG3、 IgG2b转变成分泌IgG1、IgG2a、IgA和IgE。也增强单个核吞噬细胞表达MHCII类抗原，但对炎症性细胞因子（如IL-1,TNF,IL-8）的释放和这些细胞的杀菌活性有抑制作用。IL-4 也活化细胞毒性 T细胞，它被认为是典型的由TH2细胞产生的细胞因子，对于T,B淋巴细胞的发育以及驱动体液免疫反应和抗体产生都是十分重要的。

生物素的活化与活化生物素的标记2007-01-12 03:33 1． 生物素的活化 生物素预先活化后，通过噻吩环的戊酸侧链上羧基与抗体、酶等生物大分子以酰胺键偶联。活化生物素的制备是获得高敏感度BAS制剂的关键环节。常用方法有以下几种： 1） 生物素N—羟基丁二酰亚胺酯（biotinyl-N-hydroxy-succinnimide，BNHS）的制备：取生物素1g混悬于12 ml，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加人0．6g N-羟基丁二酰亚胺(HOSU)和0. 8 g二环己基碳二亚胺(DCC)，置于密闭容器内，室温下磁力搅拌作用过夜。过滤，滤液经旋转蒸干。加10mL乙醚洗涤，继加200 ml异丙醇使其重结晶，获得白色粉末状晶体。 BNHS酯键中的-C=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基结合，使生物素标记在蛋白分子上，含赖氨酸残基越多，或蛋白质的等电点在pI 6.0以上，其标记效果越好。因此，BNHS适用于标记抗体及中性和偏碱性的抗原。 2）长臂活化生物素(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS)的制备生物素的分子量仅为244.31，当与抗体或酶结合后应用于免疫试验时，极易受到大分子蛋白空间位阻效应(steric hindrance)的影响。使用长臂生物素可以减少位阻效应，提高试验的灵敏度。长臂生物素是在生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加2分子6－氨基己糖，犹如给生物素分子增添一只手臂，使其不受位阻效应影响，更易与抗体、酶等生物大分子结合而发挥作用、BCNHS的制备过程分为两步：先制成长臂生物素，然后再使其活化。 长臂生物素的制备：称取BNHS 3 41 mg ,6-氨基己糖盐酸盐200mg，溶解于5mLDMF，再加入0.152 mL三乙胺(TEA)，室温搅拌下作用20h。蒸发去除DMF，加l mmol/L NaOH 3mL，继加甲醇至溶液变清，搅拌2h。蒸发去甲醇，加10mL蒸馏水，搅拌下滴加浓盐酸酸化至刚果红指示剂恰好变色。室温静置2h后，移放冰箱过夜。收集白色固体物，干燥后用水重结晶，再经真空干燥，所得物即为长臂生物素，平均获得率为64％。熔点为206-215℃。 长臂生物素的活化：称取长臂生物素357mg溶于DMF10ml 。中，加HOSU 130 mg和适量缩合剂，室温搅拌下作用48h。过滤，收集滤液蒸发干，加乙醚洗涤后，用无水异丙醇10－15ml重结晶。所得粉末状固体即为活化长臂生物素，平均获得率为41％，熔点为156-162℃。 3) 生物素酰肼(biotin hydrazide，BHZ)的制备 BHZ是水合肼(hydrazine hydrate)与生物素的合成物，因在生物素的羧基侧链上带有肼基，故能标记带醛基的蛋白质。 BHZ制备过程：取10生物素和氯化亚砜0.1 ml，在搅拌下缓慢加入冰冷的无水甲醇1ml中。溶解后放置28℃24h，继经真空干燥；加无水甲醇lml，待溶解后再次真空干燥。残余物溶于0.5mL无水甲醇，并缓慢加入水合肼0.1ml，置28℃24h后用滤纸过滤，沉淀物用乙醚20ml反复淋洗，最后用DMF l0 ml淋洗，移置37℃温箱内烘干，放4℃保存备用。BHZ主要用于标记偏酸性的糖蛋白。如在其侧链上添加1分子赖氨酸作为连接臂，可使生物素免受位阻作用，更易与亲合素结合。 4）肼化生物胞素 (biocytin hydazide ，BCHZ)的制备 生物胞素为ε生物素赖氨酸，是生物素通过C=O基与赖氨酸的ε-氨基连接生成的化合物。BCHZ可与蛋白质的醛基和氨基结合，优于只能与醛基结合的BHZ。 BCUZ制备过程：取生物胞素甲酯100mg溶于甲醇2 ml，加入无水肼0.1 ml，25℃反应48h.浓缩至近乎干燥时，在H2SO4干燥装置中减压抽干，直至只测出少量的肼。产物溶于l ml蒸馏水中，通过聚苯乙烯型色谱固定相Q去肼。BCHZ可在热乙醇中结晶。 2．生物素结合物的制备经过活化的生物素及其衍生物可以和各种蛋白质(包括抗体、葡萄球菌A蛋白、酶、激素等)、多肽、多糖、核酸及核素、荧光素、胶体金等结合；并可借助交联剂与细胞、琼脂糖珠等偶联。广泛应用于免疫学、细胞生物学和分子生物学的实验研究领域，以及作为亲和分离制剂，用于相应配基的分离与纯化。以下重点介绍生物素化抗体、抗原及酶结合物的制备方法。 1）生物素化抗体制备 (1)BNHS溶液lmg／ml以二甲亚砜(DMSO)制备。 (2)将待偶联的抗体溶液以0．1m01／LpH9．0NaHCO。配成1—2mg／m1。 (3)将BNHS与待偶联抗体(如IgG)按1：8混合，室温搅拌4h。 (4)4℃条件下使上述混合液体以o．05m01儿，pH7．2PBS透析过夜，加等体积甘油或0．02％NaN：一30℃分装存放。生物素化抗体应避免反复冻融，按使用需量分装小瓶。一旦启封稀释使用，勿继续冻存保留。 2）生物素化辣根过氧化物酶(bio—HRP)制备： (1)取BNHS(MW454)2．?mg溶于4m1DMF。 (2)以0．1m01儿pH8．4的NaHC02配制5mg／m1的HRP，按BNHS：HRP为1：8混合(应将BNHS溶液缓慢加至HRP溶液)。置22℃反应4h。； (3)上述混合液于4℃条件下对0．01m01儿pH7．4PBS透析，48h，中间换液8次以上。 (4)收集透析液加等量甘油混合，或加o．02％NaN，分装，-20℃存放。

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　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 　　（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 　　（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 　　（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 　　（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。（二）双位点一步法　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 　　在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。（三）间接法测抗体　　间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： 　　（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 　　（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 　　（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 　　（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 　　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。（四）竞争法　　竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： 　　（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 　　（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。（五）捕获法测IgM抗体　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： 　　（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 　　（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 　　（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 　　（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 　　（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。（六）应用亲和素和生物素的ELISA　　亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素（streptavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。 　　亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。 　　ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酶或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色。

主要表现在以下几个方面。1放射免疫测定中的应用BAS主要与免疫放射分析（IRMA）检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）：先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原（标准抗原和待测抗体）同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物；再加入125I标记的亲和素（或链霉亲和素）与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，进一步提高IRMA的灵敏度。如该系统用于测定促甲状腺激素（TSH）时，由于方法的高灵敏性，即可将甲亢患者降低的TSH水平与正常值低限有效地予以区别。此外，BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离：先将生物素化的McAb和放射性核素标记的McAb与抗原的不同抗原决定簇结合，反应平衡后，加入表面偶联有亲和素的聚苯乙烯珠与免疫复合物中的生物素连接成固相终产物。该法的优点是克服了其他IRMA法需多次离心的麻烦．待测复合物与固相结合更牢固，操作更简便。2在分子生物学中的应用BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测，用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化以及将免疫测定技术与PCR结合建立免疫—PCR（immuno-PCR）用于抗原的检测等三方面。

【答案】：AABC为亲和素-生物素化酶复合物技术；LAB为标记亲和素-生物素的方法。

1.　ELISA的原理　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 操作步骤:1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。4．洗板5次。5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。7．洗板5次。8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。10．洗板5次。11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。

灵敏度生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。特异性亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。稳定性亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。普适性生物素-结合素系统的多功能性还能提供一套统一的研究方法。例如对于某待测分子，已经得到了对于该分子的生物素标记抗原，那么配合结合亲和素的胶体金可以在电镜下观测，配合结合荧光标记的亲和素可以使用流式细胞仪筛选，配合连接到酶的亲和素可以进行ELISA等免疫组化实验。

博凌科为-为你解答：免疫-PCR主要由两个部分组成。第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验（ELISA）的抗原抗体反应。第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测。免 疫-PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果，而免疫-PCR 则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，并进行电泳检测，因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量。由于PCR 的高扩增能力，只要存在着极微量的抗原抗体反应，PCR都能大量扩增抗体所连接的DNA分子，再用电泳来表明实验结果。免疫-PCR的关键之处就在于用一 个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。最初Sano等人建立的免疫 -PCR实验流程如下：（1）再包被缓冲液稀释抗原BSSA，并固定在微滴定板上。（2）微滴定板上加入相应的已稀释的单克隆抗体，并洗去未结合的抗体分 子。（3）加入稀释的已与生物素化PUC19的结合的链亲和素-蛋白A嵌合体（蛋白A能与抗体结合，而链亲和素可与生物素化PUC19中的生物素结合）， 并洗去未结合的嵌合蛋白-Puc19复合物。（4）PCR扩增抗体所连接的Puc19。（5）琼脂糖凝胶电泳，EB 显色检测Puc19. 运用这种方法，Sano等人可检测到600个BSA抗原分子。与用碱性磷酸酶作为标记物的ELISA方法相比，免疫-PCR的敏感度比 ELISA高106。在这免疫-PCR系统中，链亲和素-蛋白A嵌合体作为一个连接分子起着桥梁作用。它的两个独立结合位点蛋白A和链亲和素分别与IgG 的Fc段和生物素化DNA中的生物素结合，从而在蛋白质和核酸之间建立对应关系，通过PCR扩增，将抗原抗体反应的特异性高度放大。因此，免疫-PCR结 合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高度敏感性，成为一种极为敏感的抗体依赖的抗原检测技术。

维生素Bu2087又名维生素H、生物素、辅酶R等，最初是从蛋黄中分离的一种结晶，能促进酵母生长而被称为生物素，属于水溶性维生素。 生物素吸收的主要部位是小肠的近端。浓度低时，被载体转运主动吸收；浓度高时，则以简单扩散形式吸收。 吸收的生物素经门脉循环，运送到肝、肾内贮存，其他细胞内也含有生物素，但量较少。 生蛋清中含有抗生物素蛋白，可与生物素结合而抑制生物素的吸收。胃酸缺乏者，可使生物素吸收减少。生物素转运到周围组织，需要生物素结合蛋白为载体。血浆中的生物素结合蛋白以生物素酶的形式存在，此酶有两个高亲和性的生物素结合位点。生物素主要经尿排出，乳汁中也有生物素排出，但量很少。1.是多种羟化酶的辅基 生物素是丙酮酸羟化酶、乙酰辅酶A羟化酶等的辅基，参与体内COu2082的固定和羧化过程，为脂肪和碳水化合物代谢所必需。表现如下：①帮助脂肪、肝糖和氨基酸在人体内进行正常的合成与代谢； ②促进汗腺、神经组织、骨髓、男性性腺、皮肤及毛发的正常运作和生长，减轻湿疹、皮炎症状； ③预防白发及脱发，有助于治疗秃顶； ④缓和肌肉疼痛； ⑤促进尿素合成与排泄、嘌呤合成和油酸的生物合成； ⑥用于动脉硬化、卒中、脂类代谢失常、高血压、冠心病和血液循环障碍性的疾病； ⑦药理剂量的生物素可降低1型糖尿病人的血糖水平。 2.可调节基因表达和组蛋白功能 生物素也参与细胞信号转导和基因表达，人基因组中含有2000多个依赖生物素的基因。生物素还可使组蛋白生物素化，从而影响细胞周期、转录和DNA损伤的修复。缺乏表现主要以皮肤症状为主，可见毛发变细、失去光泽、皮肤干燥、鳞片状皮炎、红色皮疹，严重者的皮疹可延伸到眼睛、鼻子和嘴周围。 此外，伴有食欲减退、恶心、呕吐、舌乳头萎缩、黏膜变灰、麻木、精神沮丧、疲乏、肌痛、高胆固醇血症及脑电图异常等。这些症状多发生在生物素缺乏10周后。在6个月以下婴儿，可出现脂溢性皮炎。生物素广泛存在于天然食物中。干酪、肝、大豆粉中含量最为丰富，其次为蛋类，在精制谷类、多数水果中含量较少。肠道细菌也能合成供人体需要，故一般很少出现缺乏症。但大量食用生鸡蛋清可引起生物素缺乏。另外，长期服用抗生素治疗，可抑制肠道正常菌群，也可造成生物素缺乏。

生物素（VH） 品名：生物素（Biotin）化学名：维生素H；辅酶R分子式：C10H16N2O3S分子量：244.31特性与用途：B族维生素之一。无色接近白色的结晶性粉末。熔点230~232℃。在空气中和受热时均稳定，不易氧化。遇强碱或氧化剂则分解。1g成品溶于25℃约5000ml水中以及约1300ml乙醇中。较易溶于热水和稀碱液。不溶于其他常用有机溶剂。主要用做营养增补剂。没有找到图片主要功能：　　* 帮助脂肪代谢　　* 协助代谢氨基酸及碳水化合物　　* 促进汗腺、精神组织、骨髓、男性性腺、皮肤及毛发的正常运作和生长　　* 预防白发及脱发，有助治疗秃头　　* 维持皮肤正常功能，减轻湿疹、皮肤发炎症状　　* 缓和肌肉疼痛　　缺乏症状：　　* 头皮屑多，容易掉发，少年白发　　* 肤色暗沉、面色发青，皮肤炎　　* 忧郁、郁闷、失眠、容易打瞌睡等神经症状　　* 容易疲倦、慵懒无力、肌肉涨痛，与缺乏其他B群维生素的症状相同　　* 少年白发或已有秃顶迹象者　　* 好吃生蛋者　　* 正服用抗生素或璜胺药剂者　　主要食物：　　* 牛肝、猪肝、猪肾、鸡肉、羊肉、蛋黄、牛奶、水果、糙米、小麦胚芽、啤酒酵母、酵母菌　　补给须知：　　* 生物素与维生素A、维生素B2、维生素B6、烟碱酸合并使用功效更佳　　* 生物素的补充剂为锭剂或胶囊，应整颗和水吞服，不可咬碎。此外，若非医生特别指示，否则应在用餐时或餐后立即服用，以降低对胃部的刺激。 　　需要人群　　1、好吃生鸡蛋和饮酒、喝咖啡的人需要补充生物素；　　2、服用抗生素或磺胺药剂的人每天至少要摄取25μg；　　3、头发稀疏的男性摄入生物素，防止脱发效果明显；　　4、在妊娠期间，生物素会明显流失，应在医师指导下合理补充。生理需要　　由于肠道细菌可合成生物素，因此不易准确确定生物素的需要量。　　1.成年人每日适宜摄入量为30微克。　　2.乳母每日适宜摄入量35微克。　　过量表现　　生物素的毒性很低，至今尚未见生物素毒性反应的报告。　　缺乏症　　生物素缺乏症主要表现多数以皮肤症状为主，可见毛发变细、失去光泽、皮肤干燥、鳞片状皮炎、红色皮疹，严重者的皮疹可延续到眼睛、鼻子和嘴周围。此外，伴有食欲减退、恶心、呕吐、舌乳头萎缩、粘膜变灰、麻木、精神沮丧、疲乏、肌痛、高胆固醇血症及脑电图异常等。这些症状多发生在生物素缺乏10周后。在6个月以下婴儿，可出现脂溢性皮炎。　　特殊作用　　生物素可能存在以下作用：　　1.帮助脂肪代谢。　　2.协助代谢氨基酸及碳水化合物。　　3.促进汗腺、神经组织、骨髓、男性性腺、皮肤及毛发的正常运作和生长，减轻湿疹、皮炎症状。　　4.预防白发及脱发，有助于治疗秃顶。　　5.维持皮肤正常功能，减轻湿疹、皮肤炎症。　　6.有助于机体某些生化反应的进行。　　7.缓和肌肉疼痛。

免疫组化原理 免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后用HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过与DAB显色剂反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。 免疫组化更多的意义在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western来实现。 免疫组化染色和HE染色的不同之处可能是HE染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变（数量）、也可检测细胞内细胞因子的转位，组织中一些特异性蛋白的表达的量改变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析）。 通俗的讲，HE仅仅是看大体病理改变，比如组织坏死，比如炎性渗出。免疫组化，看你的目的蛋白的表达情况。 免疫组化和****HE****染色的对比 DAB和HE一样也是一种染色剂，HE染色相对简单，能分辨出细胞中的嗜酸嗜碱性物质；DAB染色全称应该叫做免疫组化DAB染色，经过一系列复杂的生化反应后，DAB(二氨基联苯胺)染色剂能将辣根过氧化物酶染成棕色。 常用的免疫组化染色方法: 组化用HRP的话，信号不够强。通常用生物素标记HRP来增强信号。 1、 ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法） ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力特性，与生物素化二抗结合，形成抗原＋特异性抗体＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP复合物，最后DAB显色。 复合物配制：先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物。 2、 SP法（抗生物素蛋白链酶素-过氧化物酶复合物） 本身没有连接生物素，但有两个生物素亲和力极高的结合位点，可以与二抗上的生物素结合，敏感性高，复合物不需要使用前混合，更为简便。 3、 PAP法 4、 直接法 样本制备 免疫组化结果分析 免疫组化结果的判断原则： 1 、必须设阳性对照和阴性对照。 2 、 抗原表达必须在特定部位。 3 、 阴性结果不能视为抗原不表达。 免疫组化染色实验组与对照组结果分析表 从表可以看出只有6、7实验结果有意义。1-5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用Ab。 染色失败的几种情况及原因: 1、 所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。 2、 所有切片均呈阳性反应。 3、 所有切片背景过深。 4、 阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。 所有切片呈阳性反应，其原因: 1、 切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 2、 缓冲液配置中未加氯化纳和PH值不准确， 洗涤不彻底。 3、 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反 应时间过长。 4、 抗体温育的时间过长。 5、 H 2 O 2 浓度过高，呈色速度过快且粘附剂太厚。 所有切片背景过深，其原因: 1、 内源性过氧化酶没有完全阻断。 2、 切片或涂片过厚。 3、 漂洗不够。 4、 底物呈色反应过久。 5、 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。 6 、使用全血清抗体稀释不够。 阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。 最常见的原因:标本固定和处理不当。 注意事项： 1、 苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。 2、 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片。 3、 以下原因可能导致片子着色不均匀： ①脱蜡不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鲜的二甲苯中。 ②水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇。 ③抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂。④抗体孵育时，切片放倾斜。 ⑤抗体孵育后PBS冲洗不充分。 ⑥制片厚薄不均匀等问题。 ⑦染片盒不平，切片倾斜。 4、 一抗的清洗: 1、单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 2、温柔冲洗，防止切片的脱落，推荐用浸洗方式。 3、冲洗的时间要足够，才能彻底洗去 结合的物质。 5、 PBS的PH和离子强度的使用： 1、建议PH在7.4-7.6浓度是0.01 M。 2、中性及弱硷性条件（PH7-8）有利 于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利 于分解。 6、 拍照： 1、有条件的话应该立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。

植物病毒的外壳是一种核蛋白，在蛋白的表面带有抗原决定簇，当植物病毒进入动物体内时，即可产生与抗原相应的抗体，这种带有抗体的血清即为抗血清。相应的抗原抗体之间可产生专化性的结合，即抗体只能与其相应的抗原结合并产生一定的反应，此即血清反应。这种反应在植物体外也能进行，根据这种反应可以测定两种病毒间的关系。因而，血清学检测成为植物病毒的重要鉴定技术。常见的血清反应主要有以下几种：中和反应：使含有植物病毒的汁液与相应抗血清中的抗体充分结合，当抗体过量时，可将所有植物病毒抗原全部吸收掉，此时因植物病毒汁液中已没有病毒粒子存在而失去侵染性。此即为中和反应，不仅可对植物病毒进行定性，还可用于定量测定。沉淀反应：将一系列稀释度的抗原（病毒）和一系列稀释的抗体（抗血清）分别混合，在两者稀释比例适宜范围内可出现沉淀物，此即为沉淀反应。此类反应如：微量沉淀反应，琼脂双扩散反应，及免疫电泳等，都是在植物病毒检验中最常见的血清学技术。凝集反应：把病毒的抗体先吸于一种与免疫无关的颗粒表面，然后使其与相应的抗原结合而出现的凝集，即为凝集反应。常用于吸附抗体的颗粒有皂土、乳胶、炭末、血细胞、A蛋白等。抗体标记：对抗体用荧光素、酶或同位素等进行标记，然后通过对标记物的检测追踪抗原，常用的有酶联免疫吸附、荧光免疫、同位素免疫实验等，这类检测技术灵敏度极高，适于对微量抗原的检测。现将在植物检疫中常用的几种血清学技术介绍于下。1.微量沉淀反应在溶有抗原的溶液内按适当比例加入抗血清时，抗原与抗体互相结合而沉淀。其方法如下：（1）用蜡笔在培养皿底部各划8条横竖线形成方格。（2）取两排小试验管，每排7～8个，一排用于抗原，一排用于抗血清，每试管中加0.2ml的缓冲液。（3）制备1mg/ml纯化病毒原液，在抗原稀释排中加0.2ml原液于第一试管，用1ml的移液管再从中吸0.2ml移至第二管，然后再移0.2ml于第三管，一直移到最后一管，各管的稀释度分别为原液的1/2至1/128。（4）在小试管中加1.5ml含0.025%防腐剂NaN3的缓冲液，在缓冲液内混入0.1ml未稀释的抗血清，制备出1/16稀释度的抗血清作为原液；在第二排的第一试管中加0.2ml的原液，混合后移0.2ml至第二管，如此一直到最后一管，制备出1/32～1/2048的稀释系列的抗血清。（5）用微量移液管从抗血清最高稀释度（1/2048）开始，在培养皿的第七横排的每个方格滴加1滴，同样将1/1024稀释度的抗血清加到第六横排，这样将板上所有的方格均滴加各种稀释度的抗血清。（6）用另一移液管从最稀的抗原液开始，在第七纵排每方格内滴加1滴，按同样方法在第一至第七纵排各方格内滴加各种稀释度的抗原。在所有第八横排和纵排的方格内滴一滴缓冲液做对照。随后在反应液滴上复盖一层液体石蜡油防止蒸发。（7）将制备好的培养皿在室温湿润环境下孵育2h后，在暗室用双目解剖镜观察，然后在普通冰箱内过夜，第二天继续观察结果，此时沉淀已清晰可见。以最浓的沉淀为四，以下逐渐减弱的梯度分别记为三、二、一，以三为抗原最大稀释度和产生沉淀的最小血清用量，作为抗原抗体最适比例微量沉淀技术测定抗原抗体最适反应浓度表（8）实际测定时，用最适稀释度的抗血清与其相应的抗原和异种抗原进行反应，或用最适稀释度的抗原与其相应的抗血清和异种抗血清进行反应，均可观察它们间的血清学关系。如表0-4-2所示，微量沉淀技术测定多种抗原间血清学关系表各供试抗原的稀释度为1.56mg/ml，与1/4至1/1024的不同稀释度的抗血清反应结果表明，第一、二、五、六、七横排的抗原与抗血清的相应抗原是相同的，第三、四两排抗原与抗血清的相应抗原虽然不同，但有一定亲缘关系，第八、十排抗原则与抗血清的相应抗原有远缘关系或无血清学关系，第九排的抗原则完全无关。2.琼脂双扩散试验琼脂凝胶的含水量极高，允许分子质量20万u以下的大分子物质自由通过，绝大多数的抗原和抗体分子质量都在20万u以下，在琼脂凝胶中的运动所受阻力甚小，可自由扩散，免疫双扩散就是应用这一原理，在一块琼脂凝胶板上打几个小孔，分别置入抗原及其相应抗体，抗原与抗体分别向凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度最适比例处，形成肉眼可见的抗原抗体结合物的沉淀带，带的大小形状数量和密度决定于所测试的抗原抗体的特性。本法适于检测植物粗汁液、澄清液和高度纯化的抗原。试验时需设置健康植物汁液及标准抗原作为阴性和阳性对照。本法的特点是可同时检测一种抗原对多种抗体，或一种抗体对多种抗原间的血清学关系，对病毒的鉴别极为方便。缺点是灵敏度较低，抗血清用量大，检测时间长。具体检测技术如下：（1）称取琼脂加入适当的缓冲液中，用水浴或微波炉加热至琼脂溶解，按0.1%加叠氮化钠。置培养皿或玻璃平板于水平台面，当琼脂冷却至60℃时，倒适当量于板上厚2mm（50mm*9mm的板需9ml，100mm*13mm的板需26ml）。静置至凝固。（2）将模式图置于板下，用打孔器打孔，挑除孔中琼脂，孔的排列有多种形式，常用的排列，由一个中央孔和周围六个孔组成，孔的直径7mm，周围孔与中央孔的距离为3～4mm。（3）用缓冲液或生理食盐水在小试管中稀释抗原，在周围孔中加最适稀释度的抗原，在中央孔中加最适稀释度的抗血清。外围孔中加倍比稀释系列的抗原，中央孔加倍比稀释系列的抗血清，产生致密狭窄的沉淀线的组合为最适浓度。（4）将培养皿在保湿环境下进行孵育，次日在暗背景下观察沉淀线出现情况。在印有排列模式团的纸上，图记沉淀线的形式，沉淀线图形可用照相或染色保留。（5）结果的判断：根据沉淀线的形状分析抗原与抗体，及抗原互相间的关系。对长形病毒进行琼脂双扩散检测时，可在琼凝胶介质中加入十二烷基磺酸钠（SDS），此剂为一种阳离子表面活性剂，可将病毒裂解成具有抗原活性的可扩散的片断利于检测。3.对流免疫电泳在以琼脂凝胶为介质的情况下，免疫球蛋白带有微弱负电荷不能抵消电渗作用，故在电泳时向负极迁移，而一般抗原蛋白带有较强的负电荷，抵消电渗后仍向正极迁移。依此设计的对流免疫电泳是将琼脂电泳与免疫沉淀相结合的方法，将抗原病毒放在琼脂凝胶靠近阴极一侧，抗体放在靠近阳极一侧，在直流电场中，抗原迁向正极，免疫球蛋白迁向负极，相遇后形成免疫沉淀线。具体技术如下：（1）凝胶床的制备。取定量琼脂粉用蒸馏水浸泡2～3d，每日换水1～2次，用硼酸缓冲液配成1%～1.2%的琼脂液，加0.1%叠氮化钠。将玻璃放在水平台上用吸管将缓冲液琼脂注到板面，制成2mm厚的凝胶床并打孔。（2）将制好的凝胶床放在电泳槽内，加缓冲液（用配制琼脂凝胶的缓冲液稀释1倍）离床面2～4cm，在琼脂板阴极一端孔中加入抗原，在靠阳极一端孔中加入特异性抗血清，在琼脂床的两端用两层纱布使琼脂板与电泳槽中的缓冲液相连，进行电泳。（3）进行电泳时，电压、电流和时间，根据缓冲液离子强度、电泳床大小和抗原性质而有所不同。只要不使病毒抗原变性，尽量保持较高的电压，如电流超过2mA，电泳应在低温下进行。（4）电泳完毕后，将电泳板放在黑色背景处观察，也可将电泳完毕的琼脂凝胶板先浸在生理食盐水中30min，然后放在苦味酸溶液中20min，可将背景染成黄色，沉淀为白色，便于观察。免疫电泳与琼脂双扩散相比有三个优点，快速、灵敏并可用于在琼脂中扩散慢的长形病毒。4.乳胶凝集试验及A蛋白乳胶凝集试验用特异性抗血清提纯的免疫球蛋白，将其吸附在乳胶粒子上，制备抗体免疫球蛋白致敏乳胶。当与相应的抗原相遇时即可产生凝集反应。这是一种灵敏度高特异性强的血清学技术，但是每次都要特异性抗血清提取抗体γ球蛋白，制备手续繁杂不便应用，如直接用抗血清致敏乳胶则显著影响效果。其后Querfurth（1979）发现A蛋白可吸附免疫球蛋白且不影响与相应抗原结合。这样就可先使A蛋白与乳胶粒子结合，再与抗血清中的免疫球蛋白结合，形成A蛋白-乳胶-免疫球蛋白的复合体。这种乳胶凝集试验可简化致敏免疫球蛋白的过程，而获得同样效果。具体做法如下。（1）免疫球蛋白致敏乳胶的制备。将特异抗血清用33%饱和硫酸盐析法提取球蛋白，悬浮于0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl（含0.02%PVP）缓冲液内，取10%空白乳胶稀释15倍后与等量适宜浓度的球蛋白液混合，置室温2h后移入冰箱内过夜。经低速离心（7000r/min，20min）取沉淀悬浮于缓冲液内，经反复离心洗涤2次后将最后沉淀物悬浮于缓冲液内即可得抗体球蛋白的致敏乳胶。（2）A蛋白乳胶致敏抗体的制备。将市售A蛋白溶于0.1mol/L、pH8.2的甘氨酸缓冲液内，制成A蛋白溶液，与等量稀释15倍的空白乳胶液混合，置室温3h，移入冰箱过夜。低速离心（7000r/min20min）后将沉淀悬浮于甘氨酸缓冲液，反复离心洗涤2次，沉淀悬浮于甘氨酸缓冲液制备A蛋白乳胶溶液，与等量适宜稀释度的抗血清混合，置室温下3h后移入冰箱过夜。再反复离心洗涤2次，最后将沉淀悬浮于与抗血清等等量的甘氨酸缓冲液内，即可得A蛋白乳胶致敏抗体。（3）检测法。用0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液（含0.02%PVP，0.02%NaN3）按等倍比稀释抗原，制成20、40、80、160、320、640、1280的系列浓度，在一洁净玻璃板上，用笔画好方格，每格加2滴不同稀释度的抗原，然后再加1滴乳胶致敏抗体（或A蛋白乳胶致敏抗体）用微量血液振荡器以120r/min振荡混合后，用肉眼或10～25倍解剖镜观察结果。同时设空白乳胶液和健汁液对照。阳性反应表现有明显的絮状或颗粒状凝集物，背景清明透亮，阴性反应则仍为均匀的牛乳状液。也可用浊度计检测其凝集度。此法受健康植株蛋白的干扰较小，适于直接采自病株的澄清液，不但适合球状病毒，对杆菌状病毒，棒状病毒，线状病毒也适用，并有较高的灵敏度。但对效价低的抗血清或含有乳状胶体的植物不适用。5.酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验是一种固相吸附和免疫酶技术相结合的方法，将抗原或抗体包被在固相支持物上，使免疫反应在固体表面进行，并借助标记在抗体上的酶与底物所产生的颜色，检测相应的抗原。此法灵敏度高，特异性强，快速简便极适宜植物检疫应用。常用的检测方法有以下几种：（1）直接法。将待测样品抗原（病毒）加入聚乙烯多孔板内，保温后洗涤，使附着于壁上的抗原与加入的酶标抗体γ球蛋白反应，洗涤后保留与抗原结合的酶标γ球蛋白，加入酶的底物，用分光光度计进行检测。（2）间接法。先用抗兔球蛋白山羊抗体与酶结合制备酶标记抗体，将待检抗原包被于固相载体，经过孵育洗涤，加入特异性兔抗血清，孵育洗涤后加羊抗兔酶标记抗体，孵育洗涤后加入底物，观察结果。（3）双抗体夹心法。先将特异抗体免疫球蛋白包被于固相载体，保温洗涤后，加待测抗原，使与吸附于载体上的抗体反应，保温洗涤后再加入特异抗体的酶标记物，最后加底物观察反应结果。（4）A蛋白酶联法。将A蛋白用pH9.6的甘氨酸缓冲液稀释后包被微板，加入特异性抗血清，使其与已固定在微板上的A蛋白结合，再加入待测抗原使其与特异性抗体反应，再加入特异性抗体，使其与抗原反应，再加酶标记A蛋白，最后加酶的底物测其光密度值。（5）异种动物双抗体夹心法。先将第一抗体（兔血清抗体）包被微量反应板，加待测抗原后，加适宜浓度的第二抗体（鼠腹水抗体），再加入市售羊抗鼠酶标记物，最后加底物观察反应，一般8h即可得出结果。此法保持了双抗体夹心法快速准确灵敏度高的特点，对球状病毒、杆状病毒、线状病毒、棒状病毒均可应用。抗体不必纯化可直接使用（但未纯化的抗血清需先选择其最适工作浓度），使用市售酶标记物，可省去制备酶标记抗体的复杂手续，还可克服间接法非特异性反应干扰大的弱点。（6）生物素抗生物素酶联法。生物素具有很强的亲和力，是抗原抗体反应的1万倍，两者一旦结合就难以离解，且不受酸碱变性剂蛋白溶解酶及有机溶剂的影响，具有高度稳定性，生物素一经活化可与蛋白质呈偶联结合，即一个大分子可结合多个生物素分子，生物素又可大量结合在酶标记物上，使酶标记物成为多价，而抗生物素本身又是一个多价分子，每一亚基均可结合一个生物素分子，因此，这种方法可产生多级放大，使灵敏度提高10倍以上，并降低非特异性反应，把酶联免疫吸附技术又提高一步。具体方法如下：先将第一特异抗体（兔抗体或鼠腹水抗体）包被在固相载体，加待检抗原，加第二特异性抗体（鼠腹水抗体或兔抗体），再加入相应生物素化（羊抗鼠或羊抗兔）免疫球蛋白，再加抗生物素酶结合物，最后加入底物观察O.D.值。（7）膜上斑点酶联法。先用软铅笔在一张适宜大小的硝酸纤维素膜上划好边长1cm的方格网，把纤维素膜浸入TBS缓冲液漂洗30min，然后将膜放在两张滤纸之间，在室温下风干，用移液器将抗原抽提液滴在各方格中央，室温下风干，用TBS-T缓冲液（含0.5%Tween的TBS液）洗膜5min，取出后放在滤纸上至膜表面水滴消失，然后浸入封闭液（含1%牛血清蛋白，和2%聚乙烯吡咯烷酮的TBS-T液），在37℃下保温1h，取出晾干后，浸在用封闭液稀释的第一抗体溶液，在37℃下保温1h，用TBS-T液洗膜10次，每5min换液一次。将膜浸入稀释度1/200的酶联球蛋白，室温保温1h，用上法洗膜后，用碱性磷酸酯酶缓冲液冲洗两次，每次10min，将膜浸入酶底物溶液内，室温下避光5～15min，显色完全后弃去底物液，用终止液（10mmol/LTris-HCl，pH7.5，5mmol/LEDTA）洗膜30min，置膜于滤纸内彻底风干后观察结果。此法可克服塑料板的不足，只用目测就可对结果定性，不需要复杂的仪器，所需抗原抗体量均很少，灵敏度比常规酶联法高10倍以上，适合大量抗原的检测。6.免疫电镜电镜检测可快速确定病毒粒子的形状，是鉴定病毒不可缺少的技术，但有的样品浓度很低，用普通的电镜技术不易观察，如将病毒粒子包被后，抗体可把病毒粒子捕捉成聚集物便于观察。同时还可从病毒粒子与抗体的结合情况，观察两者间的血清学关系。通常使用的有以下几种方法：（1）叶片浸沾血清技术。把一滴稀释的抗血清，滴在有膜的铜网上，将叶片的新鲜切口浸入血清滴中1～2s，置于室温下5～10min，使血清与相应的病毒聚集并装饰起来，再进行负染检镜。（2）Derrick氏法。把火棉胶膜铜网在24℃下，置于按1∶10比例稀释于Tris缓冲液的抗血清内，然后将铜网用缓冲液冲洗后使用。把病毒的粗提液稀释于含HCl的Tris缓冲液内，将已用血清包被的铜网浮于0.1ml的病毒稀释液内1h（24℃），先用Tris-HCl液再用水冲洗，然后干燥喷镀。（3）聚集法。把抗血清用磷酸缓冲液稀释到1/100的浓度，取10μl滴于载玻片，将切成2mm见方的病叶在血清滴中压碎，在湿室中保湿15min，用镊子持有膜铜网蘸取液滴，用20倍磷酸缓冲液冲洗后，再用蒸馏水洗，最后用5滴醋酸氧铀染色观察。（4）修饰法。取2mm见方的病叶在载玻片上的10μl蒸馏水中压碎，持有膜铜网沾此液滴，将病毒粒子吸附于铜网上，然后将铜网用20滴的磷酸缓冲液冲洗，吸去水分后加1滴稀释成1/100的抗血清，在湿室中保湿15min后，将铜网用20滴磷酸缓冲液和30滴蒸馏水冲洗，最后用醋酸氧铀染色检镜。（5）诱捕修饰法。先将铜网用稀释1/10或1/100的特异性抗血清包被，再把病毒样品滴于铜网，保湿15min，用缓冲液及蒸馏水冲洗吸干，再加1滴稀释成1/100的特异性抗血清，孵育15min后，用缓冲液和蒸馏水冲洗，吸干染色检镜。（6）羊抗兔血清诱捕修饰法。在诱捕修饰法未染色以前，再加1滴稀释1/20的羊抗兔血清，孵育15min，洗涤后染色镜检。此法因病毒粒子外壳包被有两层血清，明显加粗，在2000倍的低倍电镜下即可清晰地看到病毒粒子。（7）A蛋白诱捕修饰法。在福尔马膜的铜网上滴1滴50mg/ml的A蛋白液，孵育后洗去多余的A蛋白，再包被稀释100倍的特异性抗血清，滴加抗原，再滴加特异性抗血清，最后染色镜检。此法比一般诱捕修饰法灵敏度高，能捕捉更多病毒粒子。

博凌科为-为你免疫-PCR主要由两个部分组成.第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验（ELISA）的抗原抗体反应.第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测.免 疫-PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体,用颜色反应来表明阳性或阴性结果,而免疫-PCR 则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体,用PCR扩增抗体所连接的DNA,并进行电泳检测,因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量.由于PCR 的高扩增能力,只要存在着极微量的抗原抗体反应,PCR都能大量扩增抗体所连接的DNA分子,再用电泳来表明实验结果.免疫-PCR的关键之处就在于用一 个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上,在抗原和DNA之间建立相对应关系,从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测.最初Sano等人建立的免疫 -PCR实验流程如下：（1）再包被缓冲液稀释抗原BSSA,并固定在微滴定板上.（2）微滴定板上加入相应的已稀释的单克隆抗体,并洗去未结合的抗体分 子.（3）加入稀释的已与生物素化PUC19的结合的链亲和素-蛋白A嵌合体（蛋白A能与抗体结合,而链亲和素可与生物素化PUC19中的生物素结合）, 并洗去未结合的嵌合蛋白-Puc19复合物.（4）PCR扩增抗体所连接的Puc19.（5）琼脂糖凝胶电泳,EB 显色检测Puc19. 运用这种方法,Sano等人可检测到600个BSA抗原分子.与用碱性磷酸酶作为标记物的ELISA方法相比,免疫-PCR的敏感度比 ELISA高106.在这免疫-PCR系统中,链亲和素-蛋白A嵌合体作为一个连接分子起着桥梁作用.它的两个独立结合位点蛋白A和链亲和素分别与IgG 的Fc段和生物素化DNA中的生物素结合,从而在蛋白质和核酸之间建立对应关系,通过PCR扩增,将抗原抗体反应的特异性高度放大.因此,免疫-PCR结 合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高度敏感性,成为一种极为敏感的抗体依赖的抗原检测技术.

亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链亲和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。

利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物

免疫检测方法大全2017 　　免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于有关免疫疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。如对传染病、免疫增殖性疾病、免疫缺损病、超敏反应、自身免疫病、移植排斥反应肿瘤的免疫学检测，对诊断、治疗均有很大帮助。此外在医学生物学研究中对抗原性物质或细胞的定性、定量检查不仅推动了对各种免疫学现象的研究，而且扩大免疫学与医学生物许多领域的联系。本章仅介绍常用免疫学检测方法的原理，简要过程和实用意义。下面是我为大家带来的关于免疫学检测法的知识，欢迎阅读。 　　第一节　抗原或抗体的检测 　　一、检测的原理 　　借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。 　　1.抗原与抗体的亲和力(affinity)抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反应，而是非共价键的可逆的结合。抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，则亲和力强。此外，反应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响，抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。 　　2.抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测比较简单，即用已知的抗体和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。 　　对抗原或抗体进行定量检测时，以反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。 　　(1)根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原(或抗体)的含量：在一定的反应条件下，加入的已知抗体(或抗原)的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原(或抗体)量成正比。也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原(或抗体)的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。 　　(2)抗原或抗体效价滴定的原理：当抗原抗体复合物形成多少不能反应抗原抗体反应强弱时，就不能以检测反应强度来对抗原或抗体进行定量。在实际工作中，把浓度低的反应成分(抗原或抗体)的浓度固定，把浓度高的另一种反应成分作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比较3只家兔产生抗体的多少，即滴定3只兔血清抗体效价，可用双向琼脂扩散法来滴定，例如将抗体浓度固定，将抗原作不同的稀释度，分别将抗原或抗体滴入琼脂的相应小孔中，观察免疫兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度(如甲兔的抗体效价为1/2000，而丙免的是1/8000则可比较出后者比前者产生抗体的效价要高)。也就是表示效价的稀释度越高，样品中所含待检成分越多。因人血清(抗原)和抗体(免疫兔血清)相比，浓度高，故应稀释抗原。 　　二、抗原或抗体检测的实用意义 　　1.抗体检测的意义检测抗体可用于评价人和动物免疫功能的指标。抗体用于临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。临床上检测病人的抗病原生物的抗体、抗过敏原的抗体、抗HLA抗原的抗体、血型抗体及各种自身抗体，对有关疾病的诊断有重要意义。 　　2.抗原检测的意义可做为抗原进行检测的物质可分为以下四类： 　　(1)各种微生物及其大分子产物：用于传染病诊断、微生物的分类及鉴定以及对菌苗、疫苗的研究。 　　(2)生物体内各种大分子物质：包括各种血清蛋白(如各类免疫球蛋白、补体的各种成分)、可溶性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚抗原等均可做为抗原进行检测。在对这些成分的生物学作用的研究以及各种疾病的诊断有重要意义。 　　(3)人和动物细胞的表面分子：包括细胞表面各种分化抗原(如CD抗原)、同种异型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相关抗原和肿瘤相关性情抗原等。检测这些抗原对各种细胞的分类、分化过程及功能研究、对各种与免疫有关的疾病的诊断及发病机制的研究，均有重要意义。 　　(4)各种半抗原物质：某些药物、激素和炎症介质等属于小分子的半抗原，可以分别将它们偶联到大分子的载体上，组成人工结合的完全抗原。用其免疫动物，制备出各种半抗原的抗体，应用于各种半抗原物质的检测，例如对某些病人在服用药物后进行血中药物浓度的监测。对运动员进行服用违禁药品的检测，都是应用半抗原检测的方法。 　　三、抗原或抗体检测的方法 　　由于各种检测方法中所用的抗原性状不同，出现结果的现象也不同。最广泛应用方法有下述几种： 　　(一)沉淀反应 　　可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物。在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应(precipitation neaction)。 　　1.环状沉淀试验　　先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径小于0.5cm的小试管底部。将稀释的含有可溶性抗原的材料重叠于上，让抗原与抗体在两液体的界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验(ring precipitationtest),此法简便易行，需用材料较多是其缺点。 　　2.单向免疫扩散试验　　单向免疫扩散试验(single immunodiffusion)是在凝胶中进行的沉淀反应。将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增加到一定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正相关。本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度(最低浓度)约为10～20u03bcg/ml，常用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺点是需1～2天才能看结果 　　3.免疫比浊法　 当抗体浓度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不见的小免疫复合物，它可使通过液体的光束发生散射，随着加入抗原增多，形成的免疫复合物也增多，光散射现象也相应加强。免疫比浊法(immunonephelomytry)就是在一定的抗体浓度下，加入一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计(nephelometry)测量反应液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。本法敏感、快速简便，可取代单向扩散法定量测定免疫球蛋白的浓度。 　　4，双向免疫扩散试验　 双免疫扩散试验(double immunodiffusion)是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。 　　5.对流免疫电泳　对流电泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观察结果。 　　6.免疫电泳　 免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法分成两个步骤，即先进行电泳，再进行琼脂扩散。先将样品加入琼脂中电泳，将抗原各成分依电泳速度不同而分散开。然后在适当的位置上沿电泳方向挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原混合抗体液，让各抗原成分与相应抗体进行双向免疫扩散，可形成多答卷沉淀线。常用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义 　　7.免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting)又称为Western印迹法，用于AIDS的血清抗体检测。第一步，为电泳分离HIV抗原，在电场中根据分子量大小不同病毒抗原各成分散开。第二步，将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上(电印迹)，然后将印迹有病毒抗原的硝酸纤维膜浸湿于病人血清中。如果病人血清中含有与一种或几种抗原相对应的抗体的话，则在该抗原印迹部位形成免疫复合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗体后，在膜上加标记的抗人免疫球蛋白的抗体，此抗体可以和病毒抗原与人抗体形成的免疫复合物发生反应，最后加入显色底物(如果抗人Ig是用酶标记的)或做放射自显影(抗人Ig用125Ⅰ标记)以显示结果 　　第一步：经电泳将HIV混合抗合抗原按分子量大小分离; 　　第二步：将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上; 　　第三步：将待检病人血清加入覆盖于硝酸纤维膜上; 　　第四步：加入标记的第二抗体使之覆盖膜上; 　　第五步：加入显色底物(或放射自显影)显现第二抗体 　　(二)凝集反应 　　细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等都是不溶性的颗粒抗原，当与相应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集反应(agglutination)。 　　1.直接凝集 　直接凝集(direct agglutination)是将细菌或红细胞与相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。可用于传染病诊断如肥达氏反应(Widal reaction)诊断伤寒病。或利用血细胞凝集现象检查血型。 　　2.间接凝集 　间接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。如用u03b3球蛋白包乳胶颗粒检测类风湿关节炎病人血清中的类风湿因子，用甲状腺球蛋白包被乳胶颗粒用于检测甲状腺球蛋的抗体。也可以将抗体吸附到乳胶颗粒上检查临床标本中的抗原，如细菌或真菌性脑膜炎抗体包被的乳颗粒，一旦与含有相应抗原的脑脊液混合，便可发生凝集，可进行快速诊断。故凝集反应即可测定抗原，也可测抗体，方法简便、敏感。 　　3.抗球蛋白试验 抗球蛋白试验(antiglobulin test,coombs test)的原理为间接凝集试验。例如应用于诊断自身免疫溶血性贫血症时，Rh+红细胞与抗Rh血清间的反应。因抗Rh抗体是IgG只有两个结合价，分子较小(不如IgM结合价多，分子大)很难直接引起Rh+红细胞凝集。如果加入抗IgG的抗体，就可帮助抗Rh的IgG的抗体凝集红细胞。也就是经抗Ig的作用提高凝集反应的"灵敏度。 　　(三)补体参与抗原抗体反应 　　这一类反应主要包括溶血反应(hemolytic assay)、补体介导的细胞毒试验(complement mediated cytotoxicuty test)及补体结合试验(complement fixation test)。 　　1.溶血反应 　抗体与红细胞表面抗原相遇，形成红细胞-抗体复合物即可使加入反应中的补体活化，导致红细胞溶解，此方法可用于红细胞的各种抗原或相应抗体的检测，此法比凝集反应敏感。溶血反应也是用于抗体分泌细胞即空斑形成细胞(PFC)检测的原理。 　　2.补体介导的细胞毒试验各种有核细胞与针对其表面抗原的抗体相遇，所形成的免疫复合物能活化反应中的补体，引起细胞膜穿孔，在一定时间内，细胞仍能维持一定的形态不破碎，加入水溶性染如伊红Y(eosin Y)或台盼蓝(trypan blue)后，染料即可进入被活化补体穿孔的细胞，不带相应抗原细胞膜保持完整的活细胞不着色。此方法可用于带各种抗原的细胞的检测，如进行细胞MHC抗原的鉴定，和进行淋巴细胞中T细胞总数或其亚类的计数。在一些免疫学实验中也可用这种方法，根据需要特异地消除带某种抗原的细胞。 　　3.补体结合试验当抗原(可溶性或颗粒性)与相应抗体结合，由于浓度低不出现可见反应时，应用补体结合试验可检出此抗原抗体反应，它比凝集反应或沉淀反应灵敏度高。本法包括两个抗原抗体系统。一为检测系统由待检样品与已知抗原(或抗体)组成;另一为指示系统，由绵羊红细胞(SRBC)和抗SRBC组成。另加入作为补体的新鲜豚鼠血清。试验时试管中先加入检测系统和补体，混合经37℃30分钟使抗原、抗体、补体形成复合物，再加入指示系统，如出现溶血现象，说明检测系统中没有相对应的抗原抗体，补体是游离的指示系统的SRBC和抗体结合而出现溶血，即为反应阴性。如不出现溶血，表明检测系统中有抗原抗体复合物并结合补体，则指示系统无多余的补体作用而没有溶血现象，即为阳性。 　　在敏感的抗原、抗体检测方法(如酶标方法)出现之前补体结合试验曾广泛用于检测各种细菌、病毒或螺旋体(如梅毒)的抗原或抗体，由于本试验影响因素多，结果不稳定现已被新检测方法所代替。 　　四、用标记抗体或抗原进行的抗原、抗体反应 　　用荧光素、同位素或酶标记抗体或抗原，用于抗原或抗体检测是目前广泛应用的敏感、可靠的方法。上述三种常用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不改变后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位检测。 　　1.免疫荧光技术　免疫荧光技术(immunofluorescence techni)是用化学方法使荧光素标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的相应抗原(或抗体)结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。 　　(1)直接荧光法：把荧光抗体加到待检的细胞悬液，细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体，将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在，此法可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞(如T细胞和B细胞)或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。本法的缺点是检查多种抗原，就需分别制备相应的多种标记抗体。 　　(2)间接荧光法：可克服直接法需制备多种荧光抗体的复杂操作。将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体(不标记荧光)结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，观察结果与直接法相同。间接法比直接法敏感性高，如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的免疫球蛋白荧光抗体 　　免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查抗原或抗体，如查出IgM抗体，可做为近期接触抗原的标志，所以使用荧光标记抗IgM可诊断近期感染。除微生物学方面的应用外，还可利用单克隆抗体鉴定淋巴细胞的亚类。使用流式细胞仪(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自动检测细胞的大小、荧光强度。针对细胞表面不同抗原，可以使用两种不同的荧光染料，如用异硫氰荧光素(FITC)发黄绿荧光，用罗丹明(TMRITC)发红色荧光。由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体，对同一细胞进行双标记染色。对淋巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。应用间接荧光法也用于自身免疫病的抗核抗体检查。 　　2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)应用竞争性结合的原理，应作放射性同素标记抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果，本方法可进行超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。 　　放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种： 　　(1)液相法：将待检标本(例如含胰岛素抗原)与定时的同位素标记的胰岛素(抗原)和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。在反应系统中，待检标本的胰岛素抗原与同位素标记的胰岛素竞争夺战　性与胰岛素抗体结合。非标记的抗原越多，标记抗原与抗体形成的复合物越少。非标记抗原含量与标记抗原抗体复合物的量呈一定的函数关系。预先用标准的非标记抗原作成标准曲线后，即可查出待检标本中胰岛素的含量 　　(2)固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体。测定固相载体的放射活性，常用的固相载体有溴化氰(CNBr)海豹化的纸片或聚苯乙烯小管 　　放射免疫分析法应用范围广泛，包括多种激素(胰岛素、生长激素、甲状腺素等)维生素、药物、IgE等。 　　3.酶联免疫分析法 酶联免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是当前应用最广泛的免疫检测方法。本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酶(alkaline phosphatase)等。它们与抗体结合不影响抗体活性。这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原;后者主要测定可溶性抗原或抗体。本法既没有放射性污染又不需昂贵的测试仪器，所以较放射免疫分析法更易推广。 　　(1)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是与上述固相RIA相似的原理，将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行政区。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。 　　(2)夹心法(sandwich assay):将已知的特异抗体包装在固相载体(塑料板凹孔或纸片上)，加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。 　　间接法(indirecr ELISA)常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本(可能含有相应抗体)，再加入酶标抗Ig的抗全(即第二抗体)，经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。 　　(3)BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素(avidin)分子可以结合4个生物素分子(biotin)。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。 ;

乳酸脱氢酶（LDH）是催化乳酸和丙酮相互转化的同工酶，属于氢转移酶。该酶存在于所有动物的组织中，在肝脏中活性最高，其次为心脏、骨骼肌、肾脏，在肿瘤组织及白血病细胞中也能检测到。在大多数动物组织中，它是由两种肽链按一定比例组成的5种四聚体。它的每条肽链各由一个基因编码，经转录、翻译、修饰加工等过程，最后成为有生物学活性的物质。不同的动物，不同的组织或器官在不同的发育阶段或不同的生活周期均有其特异性的同工酶酶谱。自然界中存在L和D两种乳酸脱氢酶 。 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗D-LDH抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗D-LDH抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的D-LDH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板（Assay plate ）：一块（96孔）。2. 标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。3. 样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。4. 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。6. 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。9. 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10. 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的试剂和器材1. 标准规格酶标仪2. 高速离心机3. 电热恒温培养箱4. 干净的试管和Eppendof管5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器6. 蒸馏水，容量瓶等 实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60分钟。3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。 1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。3. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。7. 底物请避光保存。8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。乳酸脱氢酶偏高怎么办血清中乳酸脱氢酶偏高主要有恶性肿瘤，肝炎、肝硬化等疾病引起的，乳酸脱氢酶检查偏高常见于急性肝炎、阻塞性黄疸、心肌炎、恶性肿瘤、肝硬化、肝癌、运动肌肉营养不良、急性白血病及恶性贫血等病症。临床医学实践表明，80%以上患者体内的血清乳酸脱氢酶升高是由肝脏疾病引起的，尤其是急性乙肝、肝硬化、肝癌等。因此，若患者发现乳酸脱氢酶在血清中的含量不再正常范围之内，应及时到肝病医院进行检测，在医生的指导下进行有针对性的治疗。

ABC法是ABC免疫酶染色法的简称，又称卵白素-生物素-酶复合物染色法，是目前最敏感的免疫组织化学染色法之一。其基本原理是将特异性一抗与组织细胞相应抗原结合后，通过生物素化二抗与一抗结合，借助卵白素与生物素的天然亲和性将生物素化辣根过氧化物酶链接为复合物，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。

影响反应效率。当生物素化抗体和酶结合底物加反了会影响反应效率。底物加入后，就相当于底物一定，随着酶的加入反应速度加快，呈正相关。

商品化抗体一般都是生物素标记的在做western blot或免疫组化时我们常使用一抗二抗来放大、显示抗原,用酶或荧光标记二抗.生物素化的抗体,是在抗体上连接生物素（biotin）,生物素能和亲和素（avitin）特异性高亲和性结合,亲和力是抗原抗体结合的一万倍,而且一个avitin可以结合四个biotin,这样又起到级联放大的作用.所以能更加灵敏的显示微量抗原.这种方法也叫亲和免疫组化.

【答案】：AABC为亲和素-生物素化酶复合物技术；LAB为标记亲和素-生物素的方法；直接法为生物素化第一抗体；间接法BAS为生物素化第二抗体。

BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。BAS用于检测的基本方法可分为三大类。第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。 第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为桥联亲和素-生物素法(BRAB)。 第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。 亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。生物素-亲和素系统可以与亲和层析的方法结合，大大提高纯化蛋白质的纯度，或者为已知配体寻找受体。步骤是首先将生物素共价结合到配体蛋白上，再将生物素化后的配体蛋白加入含有受体蛋白的混合物，然后将此混合物通过预先固定了亲和素的层析柱，这时配体受体复合物就通过生物素-亲和素系统停留在层析柱上，最后通过选择性洗脱获得此受体配体蛋白复合物或者仅有受体。这一方法被广泛运用于药物研发行业，当人们发现某种药物分子具有疗效但是又不清楚它具体作用于哪种蛋白质时，可以将其生物素化然后把靶蛋白从成千上万种蛋白质中“抓”出来。生物素-亲和素系统还可以用相似的方法分离DNA.方法是在DNA探针的一端挂上生物素，然后用其获得目的DNA片段，再利用固定化的亲和素回收这些DNA。 传统的基因探针是由带放射性的磷酸碱基合成的，我们可以用被生物素标记的磷酸碱基合成基因探针，避免了实验过程中放射性物质可能造成的伤害。

免疫组化检测小鼠组织抗原表达情况时，采用免疫组化用纯化抗体（小鼠）进行抗原抗体反应，纯化小鼠抗体通常有多个表位，除去和抗原反应的表位外，还可以有一个表位结合羊抗小鼠IgG，在羊抗小鼠IgG上面连上生物素，可以通过SABC法进行生物素显色，根据显色情况来判断抗原的表达水平，属于间接检测法。该方法比较灵敏，但是实验过程条件太多，容易出现假阳性……

生物素化的抗体和生物素化的酶可以直接结合上亲和素化的磁珠，也就是Biotin-Avidin的亲和结合，具有高度特异性和可逆性等特点。

其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素-过氧化物酶复合物(ABC或SABC)。当其与检测反应体系中的生物素化抗体(直接法)或生物素化第二抗体(间接法)相遇时，ABC(或SABC)中未饱和的亲和素(或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应体系与ABC(或SABC)标记体系连成一体进行检测。

Elisa Kit使用方法（以人IL-4 ELISA KIT为例）：检测原理:本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可 通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。试剂盒组成：1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6）2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支）3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml）4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支）5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支）7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）8．浓缩洗涤液 20× （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml）9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）11．封板胶纸（6/3 张）12．产品说明书（1 份）标本收集:1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。注意事项:1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后 再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻 融。5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试 验结果。9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时， 请按国家生物试验室安全防护条列执行。检测前准备工作:1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。3. 标准品: 加入标准品/标本稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。复溶标准品原液（1000 pg/ml）若未用完请分装后放入-20℃以下电冰箱内保存，保存两个月。已稀释的标准品请废弃。4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致生物素化 抗体量不足，可向我们公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以酶结合物稀释液稀释浓 缩酶结合物(1:30) 成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足， 可向我们公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号）洗涤方法:1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350ul，注入与吸出间隔15－30秒。洗板5次。2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。操作步骤:1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。4．洗板5次。5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。7．洗板5次。8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。10．洗板5次。11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。结果判断:1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。灵敏度、特异性和重复性:● 灵敏度：最小可测人IL-4达7pg/ml。● 特异性：不与IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反应。● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。IL-4简介：IL-4是一种由活化的T细胞产生的细胞因子，以往称为B细胞生长因子1。在B细胞生长的早期活化B细胞，并使被抗原、抗IgM或脂多糖活化的B细胞进入细胞周期G1期。IL-4增强MHCII类抗原的表达和CD23（FceRII）在B细胞上的表达，诱导同种型（isotype）转换，如促使小鼠B细胞从分泌IgM、IgG3、 IgG2b转变成分泌IgG1、IgG2a、IgA和IgE。也增强单个核吞噬细胞表达MHCII类抗原，但对炎症性细胞因子（如IL-1,TNF,IL-8）的释放和这些细胞的杀菌活性有抑制作用。IL-4 也活化细胞毒性 T细胞，它被认为是典型的由TH2细胞产生的细胞因子，对于T,B淋巴细胞的发育以及驱动体液免疫反应和抗体产生都是十分重要的。

（一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 （五）捕获法测IgM抗体 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 （六）应用亲和素和生物素的ELISA 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。 亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号

1.　ELISA的原理 　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记.结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性.在测定时,受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开.再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上.此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例.加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析.由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度. 操作步骤: 1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条,未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条,密封口袋,放回4℃. 2．空白孔加标准品和标本稀释液,其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔),用封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱孵育90分钟. 3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液. 4．洗板5次. 5．空白孔加生物素化抗体稀释液,其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔).用新封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱孵育60分钟. 6．提前20分钟准备酶结合物工作液.避光室温(22-25 ) ℃ 放置. 7．洗板5次. 8．空白孔加酶结合物稀释液,其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔).用新封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱,避光孵育30分钟. 9．打开酶标仪电源,预热仪器,设置好检测程序. 10．洗板5次. 11．加入显色底物(TMB)100ul/孔,避光36℃孵箱,避光孵育15分钟. 12．加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测量OD450值(3分钟内).在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果. 13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束. 建议保存酶标板框,以备下次或者今后试验使用.,10,检测原理: 本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，操作步骤: 1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和,1,1.　ELISA的原理 　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此...,1,

（一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质. （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物.洗涤除去其他未结合的物质. （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关. （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物.根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量. 根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体. （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时,如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体,则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）.这种双位点一步不但简化了操作,缩短了反应时间,如应用高亲和力的单克隆抗体,测定的敏感性和特异性也显著提高.单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平. 在一步法测定中,应注意钩状效应（hookeffect）,类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象.当标本中待测抗原浓度相当高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成夹心复合物,所得结果将低于实际含量.钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果. （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法.操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质. （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合,形成固相抗原抗体复合物.经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体.其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被洗去. （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合,从而使该抗体间接地标记上酶.洗涤后,固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量.例如欲测人对某种疾病的抗体,可用酶标羊抗人IgG抗体. （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量. 本法只要更换不同的固相抗原,可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体. （四）竞争法 竞争法可用于测定抗原,也可用于测定抗体.以测定抗原为例,受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比.操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接,形成固相抗体.洗涤. （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液,使之与固相抗体反应.如受检标本中无抗原,则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合.如受检标本中含有抗原,则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合,竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会,使酶标抗原与固相载体的结合量减少.参考管中只加酶标抗原,保温后,酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量.洗涤. （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多,故颜色最深.参考管颜色深度与待测管颜色深度之差,代表受检标本抗原的量.待测管颜色越淡,表示标本中抗原含量越多. （五）捕获法测IgM抗体 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在,后者会干扰IgM抗体的测定.因此测定IgM抗本多用捕获法,先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上,在去除IgG后再测定特异性IgM.操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上,形成固相抗人IgM.洗涤. （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获.洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分. （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合.洗涤. （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合.洗涤. （5）加底物显色：如有颜色显示,则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在,是为阳性反应. （六）应用亲和素和生物素的ELISA 亲和素是一种糖蛋白,可由蛋清中提取.分子量60kD,每个分子由4个亚基组成,可以和4个生物素分子亲密结合.现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）.生物素（biotin）又称维生素H,分子量244.31,存在于蛋黄中.用化学方法制成的衍生物,生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide,BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物.亲和素与生物素的结合,虽不属免疫反应,但特异性强,亲和力大,两者一经结合就极为稳定.由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置,可以连接更多的生物素化的分子,形成一种类似晶格的复合体.因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来,就可大提高ELISA的敏感度. 亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式,可用于间接包被,亦可用于终反应放大.可以在固相上先预包被亲和素,原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合,通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化.这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量,而且使其结合点充分暴露.另外,在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代,然后连接亲和素－酶结合物,以放大反应信号

酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）基本原理 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 （五）捕获法测IgM抗体 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 （六）应用亲和素和生物素的ELISA 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。 亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。 ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.

灵敏度生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。特异性亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。稳定性亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。普适性生物素-结合素系统的多功能性还能提供一套统一的研究方法。例如对于某待测分子，已经得到了对于该分子的生物素标记抗原，那么配合结合亲和素的胶体金可以在电镜下观测，配合结合荧光标记的亲和素可以使用流式细胞仪筛选，配合连接到酶的亲和素可以进行ELISA等免疫组化实验。

BAS在实际应用中所具有的巨大优越性，主要表现在以下几个方面。灵敏度生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。特异性亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。稳定性亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。普适性生物素-亲和素系统的多功能性还能提供一套统一的研究方法。例如对于某待测分子，已经得到了对于该分子的生物素标记抗原，那么配合结合亲和素的胶体金可以在电镜下观测，配合结合荧光标记的亲和素可以使用流式细胞仪筛选，配合连接到酶的亲和素可以进行ELISA等免疫组化实验。其他BAS可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂（如生物素化第二抗体等）适用于不同的反应体系，而且都可高度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是BAS与成本高昂的抗原特异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用．此外，由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性，尽管BAS的反应层次较多，但所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成

用亲和素可以检测生物素的标记效率BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。BAS用于检测的基本方法可分为三大类。第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为桥联亲和素-生物素法(BRAB)。第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。 亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。

【答案】：E亲和素-生物素-过氧化物酶复合物是ABC法中的ABC复合物。