dna测序

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。 基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3"末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。一、准备工作1. BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。2. pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2 g/L，试剂盒配套试剂。3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，试剂盒配套试剂。4. DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2 g/L，即200 ng/μl。5. 引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。6. 灭菌去离子水或三蒸水。7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 盖体分离。8. 3 mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100 ml，高压灭菌后分装。9. 70%乙醇和无水乙醇。10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml无水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。11. POP 6测序胶 。12. 模板抑制试剂(TSR) 。13. 10×电泳缓冲液 。14. 全自动DNA测序仪。15. PCR仪。16. 台式冷冻高速离心机。17. 台式高速离心机或袖珍离心机。二、PCR测序反应1. 取0.2 ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：所加试剂 测定模板管 标准对照管BigDye Mix 1 μl 1 μl待测的质粒DNA 1 μl －pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1 μl待测DNA的正向引物 1 μl －M13(-21)引物 － 1 μl灭菌去离子水 2 μl 2 μl总反应体积5 μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。2. 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2 min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。三、醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物1. 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5 ml EP管中。2. 加入25 μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗涤沉淀2次。12 000 r/min于4℃离心5 min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。四、电泳前测序PCR产物的处理1. 加入12 μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。2. 将溶液转移至盖体分离的0.2 ml PCR管中，稍离心。3. 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2 min)，冰中骤冷，待上机。五、上机操作 　　1. 按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。　　2. 仪器将自动灌胶至毛细管，1.2 kV预电泳5 min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下电泳2 h。　　3. 电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。　　4. 每一个样品电泳总时间为2.5 h。　　5. 电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。六、序列分析 　　仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。七、仪器清洗 　　测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。八、计算1. 测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%。2. 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。 SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外，SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5"OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP（7-deaza dGTP，或dITP）替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物（<500bp）得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03～2pmol模板DNA，随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA（dsDNA）模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板（如PCR反应产物）快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。一、试剂准备1. SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。2. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V）：95 g丙烯酰胺，5 g甲叉双丙烯酰胺溶于140 ml 双蒸水中，定容至250 ml，0.45 mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。3. 10%过硫酸铵，0.5 g过硫酸铵溶于4 ml水中，定容至5 ml，应新配新用。4. 10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris， 0.83mol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA）： 121.1 g Tris，51.35 g硼酸，3.72 g Na2EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。5. TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。6. TEMED7. 固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。8. 染色溶液：硝酸银2 g，甲醛3 ml，溶于2升超纯水中备用。9. 显影溶液：60 g碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3 ml 37%甲醛和40 ml硫代硫酸钠溶液（10 mg/ml）。10. 95%乙醇。11. 0.5%冰乙酸。12. Sigmacote （Sigma CAT. #SL-2）。二、测序反应1. 对于每组测序反应，标记四个0.5 ml eppendorf管（G、A、T、C）。每管加入2 ml适当的d/ddNTP混合物（d/ddNTP Mix）。各加入1滴（约20 μl）矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。2. 对于每组四个测序反应，在一个eppendorf管中混合以下试剂：（1） 样品反应：质粒模板DNA ：2.1 pmol5×测序缓冲液 ： 5 ml引物： 4.5 pmol无菌ddH2O 至终体积16 ml（2）对照反应pGEM-3Zf（+）对照DNA（4 mg） ：4.0 ml5×测序缓冲液： 5 mlpUC/M13正向引物（4.5 pmol） ：3.6 ml3. 在引物/模板混合物（以上第2步）中加入1.0 ml测序级Taq DNA聚合酶（5 μ/ml）。用吸液器吸动几次混匀。4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以【注意】中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3 μlDNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。【注意】（1）测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：模板种类/长度 模板量200 bp（PCR产物）：16 ng（120 fmol）3000～5 000 bp（超螺旋质粒DNA）： 4 mg（2 pmol）48 000 bp（λ,粘粒DNA）： 1 mg（31 fmol）由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。（2）计算与4.5 pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：4.5 pmol=1.5 ng×n，其中n为引物碱基数计算与1p mol相当的引物微克数可用以下一般公式：dsDNA：1 pmol=（6.6×10mg）×n，其中n为模板碱基对数ssDNA：1pmol=（3.3×10mg）×n，其中n为模板碱基数（3）为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%95℃ 2分钟，然后： 95℃ 30秒（变性），42℃ 30秒（退火），70℃ 1分钟（延伸）。模式2：适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。95℃ 2分钟，然后：95℃ 30秒（变性），70℃ 30秒（退火/延伸）。（4）在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。三、测序凝胶板的制备1. 玻璃板的处理银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高（棕色）。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。（1）短玻璃板的处理① 在1 ml95%乙醇，0.5%冰乙酸中加入5 ml粘合硅烷（Bind Silane），配成新鲜的粘合溶液。② 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板，整个板面都必须擦拭。③ 4～5分钟后，用95%乙醇单向擦玻璃板，然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程，每次均须换用干净的纸，除去多余的粘合溶液。【注意】① 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷，使凝胶不能很好地粘附。② 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。③ 防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的，否则将导致凝胶撕裂。（2）长玻璃板的处理：① 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。② 5～10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。【注意】① 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10%NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染，用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开，如果出现交叉污染，以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。2. 凝胶的制备（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2 mm或0.4 mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%～8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2 ml，并用0.45 mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4～6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。（3）胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。【注意】① 使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。② 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。四、电泳1. 预电泳（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。（5）按30 V/cm的电压预电泳20～30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。【注意】① 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。② 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。2. 样品的制备当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1～3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4～6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4 mm。厚度小于0.4 mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。3. 上样及电泳关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30 V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40～60 V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55 cm长，0.2 mm厚的凝胶板，在2500 V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28 mA降至25 mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。【注意】① 上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。② 一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。五、测序凝胶的银染染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。2. 固定凝胶：将凝胶（连玻璃板）放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没，充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜（不振荡）。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出，当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10～20秒，使水流尽。4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。5. 凝胶显影（1）在显影溶液中加入甲醛（3 ml）和硫代硫酸钠溶液（400 μl）以完成显影液的配制。（2）从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5～10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5～10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长，可重复第五步用染色液浸泡。（3）立刻将凝胶转移至1升（总量的一半）预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带，把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2～3分钟或直至所有条带出现。6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应，固定凝胶。7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景（如纸）上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。【注意】测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响① 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水（NANOpureR或Milli-QR的水）或双蒸水可获得较好的效果，如果水中有杂质，则低分子量条带可能无法出现。② 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠（Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990），一般可获得较好的结果。③ 色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA，产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。④ 如果凝胶厚度超过0.4 mm或丙烯酰胺浓度高于4～6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4 mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。⑤ 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10～12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。六、EDF胶片显影使用EDF胶片可增强测序条带的对比度，如果测序胶上条带很淡，我们建议把数据转移至EDF胶片，银染胶在其影像转移至EDF胶片之后可增强条带可读性。1. 在暗室内，将染色过的粘于玻璃板的凝胶（胶面向上）置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板，亦可用白灯箱，为确保曝光时间，用一小条EDF胶片曝光不同时间，检查不同的曝光强度，一般曝光20～40秒可得较好结果。2. 在红灯下找到EDF胶片有缺刻的一角，然后把胶片置于凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的，因此必须确保缺口在左上角。3. 在EDF胶片上放置一干净、干燥的玻璃板，开亮灯箱约20秒。4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF胶片，可使用下列操作过程：（1） 在Kodak GBX显影液中显影1～5分钟；（2） 水洗1分钟；（3）在Kodak GBX定影液中定影3分钟；（4）水洗1分钟。【注意】① 进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作，以免印上指纹。同时注意EDF胶片不能用自动胶片处理器。② 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同，通过对一小条EDF胶片曝光不同时间以选择你所用光源的最佳曝光时间，参阅胶片说明书。③ 曝光时间短则EDF胶片影像较深，曝光时间长则有助于减弱背景。 “鸟枪法”是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA，并用Agarose凝胶电泳进行回收。二、对回收的大片段DNA用物理方法（如超声波等）进行切断处理，然后用T4DNAPolymerase对小片段DNA进行末端平滑化。三、进行Agarose电泳，切胶回收1kbp～2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3"端加上一个A碱基。四、把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。五、对阳性克隆（含1kbp～2kbpInsert）进行DNA测序。六、对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。

DNA测序的测序原理： DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。 其原理是化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。 另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

DNA测序技术 DNA sequencing technology 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。 Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、 A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。[编辑本段]一、概述： Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5"OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。 Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。 SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。 退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。 由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03-- 2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。[编辑本段]二、材料 待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。[编辑本段]三、设备 高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。[编辑本段]四、试剂 （1）SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。 （2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。 （3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。 （4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。 （5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。 （6）TEMED （7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。 （8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。 （9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。 （10）95%乙醇。 （11）0.5%冰乙酸。 （12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。[编辑本段]五、操作步骤 ： 成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点： （1） DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。 （2） 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。 （3） DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。 （一）测序反应： 1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。 2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂： （1） 样品反应： 质粒模板DNA 2.1pmol 5×测序缓冲液 5ml 引物 4.5pmol 无菌ddH2O 至终体积16ml （2）对照反应 pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 4.0ml 5×测序缓冲液 5ml pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml 无菌ddH2 O 至终体积 16 ml 3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。 4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。 5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。 6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。 7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。 [注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入： 模板种类/长度 模板量 200bp (PCR产物) 16ng(120fmol) 3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol) 48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol) 由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。 2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式： 4.5pmol=1.5ng×n,其中n为引物碱基数 计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式： dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数 ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数 3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。 模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50% 95℃ 2分钟。然后： 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)。 模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。 95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。 （二）、 测序凝胶板的制备 1、玻璃板的处理： 银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。 （1）短玻璃板的处理 A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。 B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。 C. 4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。 [注意] 1. 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。 2. 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。 3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。 (2)、长玻璃板的处理 A. 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。 B. 5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。 [注意] 1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。 2、凝胶的制备： （1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。 （2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的 TEMED和过硫酸铵。 凝胶终浓度 3 4 5 6 8 12 16 18 尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0 10×TBE缓冲液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 双蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0 10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40 (3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。 [注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。 2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。 （三）电泳： 1、预电泳 （1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。 （2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。 （3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。 （4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。 （5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。 [注意] （1）. 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。 （2）. 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。 2、样品的制备： 当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4- 6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。 3、上样及电泳 关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、 T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长， 0.2mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。 [注意] 1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。 2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。 （四）、 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 5. 凝胶显影： (1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。 (2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。 (3). 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。 6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。 7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。 8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。 [注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。 1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。 2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。 3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。 4. 如果凝胶厚度超过0.4mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。 5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。

就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

要看是什么型号的测序仪了现在有好几家生物公司的测序仪都可以达到1000bp了ABI3730XL好像就可以Sanger法测序的原理： 利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物,直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止,终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

这位是搞分子生物学的吗? DNA测序的方法有很多种. 目前最常见的是双脱氧终止法了. 在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了. 也许这样说你不一定明白. 举一个例子, 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下: 在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT. 所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段: GA, GATCCGA, 同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC, 在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG 在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT, 电泳时按分子量大小排列, A反应的片段长度为2, 7; C反应的为4, 5; G反应的为1, 6; T反应的为3, 8, 四个反应的产物分别电泳, 结果为 8 7 6 5 4 3 2 1 A | | C | | G | | T | | 我们可以从右向左读, 为GATCCGAT, 至此, 测序完成(上面这个图在百度知道中显示不正常, 因为百度知道的网页用的是比例字体, 你如果想看它, 拷贝到记事本中, 用等宽的字体来看).

第1 代测序技术——荧光标记的Sanger 法第一代就不说了。第2 代测序技术——循环阵列合成测序法述第2 代测序技术中, 序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的. 除了需要昂贵的光学监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像.这都使仪器的复杂性和成本增加. 依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用, 在目前测序成本中比例相当大. 直接读取序列信息, 不使用化学试剂, 对于进一步降低测序成本是非常可取的.在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内, 很难准确预测未来将发生什么.第3 代测序技术——直接测序将基因组DNA 随机切割成大约100 kb 左右的片段,制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交. 然后驱动结合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵列. 通过每个孔的离子电流均可独立测量. 追踪电流的变化确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位置. 利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因组片段文库排列起来, 建立一组完整的基因组探针图. 利用计算机算法, 获得完整的基因组序列.

DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法与Gilbert（1977）发明的化学降解法。这两种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。

第二代测序技术--以Illumina/Solexa Genome Analyzer 为例1.概述 DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。2.基本原理 Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成变测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。3.操作流程1）测序文库的构建（Library Construction） 首先准备基因组DNA（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insert size，以便在组装（Assembly）的时候获得更多的信息。2）锚定桥接（Surface Attachment and Bridge Amplification） Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。3）预扩增（Denaturation and Complete Amplification） 添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。4）单碱基延伸测序（Single Base Extension and Sequencing） 在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA 聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做Base Calling，Illumina公司Base Calling所用的软件是Illumina"s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。5）数据分析（Data Analyzing） 这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。（注：图片引自Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 9:387–402）4.讨论 目前Solexa测序的读长能达到75bp，这个大小比传统的Sanger测序要短得多，也比Applied Biosystems 公司的SOLID测序要短，但是Solexa测序的优势是能够获得海量的数据，并且价格低廉，按相同的数据量来算，Solexa测序要比其他测序技术便宜很多。75bp的长度肯定是不适合直接用来分析的，测序得到的reads需要拼接之后才能有实际的用途，这就要求有强大的生物信息学分析能力作为支撑。 和传统的测序技术相比，Solexa测序的错误率也相对较高，并且测序错误倾向于分布在read后面的碱基中，如何区分测序错误和真正的DNA多态性也是一个大问题。 尽管新一代测序技术还不尽如人意，但是它还是有着广泛的应用。目前一些模式生物的全基因组重测序、非模式生物的全基因组测序以及一些生物的转录组测序都采用了新一代测序技术，比如说前不久刚发表的熊猫的全基因组(Ruiqian Li et al,2009)测序就是用Solexa测序技术完成的。5.参考文献(1)Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 9:387–402(2)Jay Shendure, Hanlee Ji (2008) Next-generation DNA sequencing. nature biotechnology 6:1135-1145(3)Stephan C Schuster (2008) Next-generation sequencing transforms today"s biology. Nature Methods 5:16-18(4)Zhou DG, Zhao QG, Fu CG et al (2008) The Next Generation Sequencing and its Effect on the Rice Molecular Design Breeding. Molecular Plant Breeding 6: 619-630

DNA测序（DNAsequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。目前应用最广泛的是由FrederickSanger发明的Sanger双脱氧链终止法（ChainTerminationMethod）。新的测序方法，例如454生物科学的方法和焦磷酸测序法。Sanger测序法Sanger（桑格）双脱氧链终止法是FrederickSanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4种双脱氧核糖核酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个[2]。454生物科学和焦磷酸测序法454测序法由454生物科学发明，是一个类似焦磷酸测序法的新方法。2003年向GenBank提交了一个腺病毒全序列[3]，使得他们的技术成为Sanger测序法后第一个被用来测生物基因组全序列的新方法。454使用类似于焦磷酸测序的方法，有着相当高的读取速度，大约为5小时可以测两千万碱基对[4]。

第二代DNA测序法的原理能解释一下DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。基本原理Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

DNA测序技术，即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

第1 代测序技术荧光标记的Sanger 法—— 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。用于测序的技术主要有Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法，Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。第2 代测序技术循环阵列合成测序法—— 述第2 代测序技术中, 序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的. 除了需要昂贵的光学监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像.这都使仪器的复杂性和成本增加. 依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用, 在测序成本中比例相当大. 直接读取序列信息, 不使用化学试剂, 对于进一步降低测序成本是非常可取的.在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内, 很难准确预测未来将发生什么.第3 代测序技术直接测序——将基因组DNA 随机切割成大约100 kb 左右的片段,制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交. 然后驱动结合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵列. 通过每个孔的离子电流均可独立测量. 追踪电流的变化确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位置. 利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因组片段文库排列起来, 建立一组完整的基因组探针

1. 去除带有荧光染料的残余ddNTP，不然会有染料峰的干扰；2. 去除残留的酶等蛋白质，因为蛋白质带有苯环，也会对荧光信号的检测带来干扰；3. 毛细管电泳时，要有buffer来保持稳定的离子强度和pH,所以还要再测序前去除盐离子哪些样本不好测？ 当客户把成批的样品交给商业化的测序公司时，经常会被告知一些样本没有结果，或是测得不好，无法提供图谱。做为客户常常不清楚测序失败的原因，对于一些重要的样品只好改送另外的测序公司试试看。dna 测序失败的原因归纳起来有三种： 一是模板的原因，模板的质量很重要，加入反应里的模板“量”并不很严格，但是模板“纯度”要求很高。这就是为什么商业测序公司通常要自已提取模板的原因。控制好模板是提高测序成功率的关键因素。对于一个经过训练，实验操作稳定的人来说，使用商品化成套试剂盒处理的dna模板的质量会有保证。其次，dna模板不能被污染，也就是说在挑菌落，细菌培养过程要防污染。如果菌生长的不好，提出来的模版测序效果也不好。 如果dna模板的质量没问题，有一段区域总是测不通，那就要考虑模板本身存在“难通过”的结构了。基因组中一些高度重复序列，gc 富集序列，poly a/t 序列 通常都是测序的“难点”，相对于质粒模板，pcr 产物的测序效果要差很多。 二是引物的原因，测序的引物除了通用引物就是pcr 的特异引物了。测不出时考虑更换新的引物或者改换另一个方向来测。（注意：即使是同一个模板，正反引物测序的效果可能相差巨大）。虽然很多时候使用pcr 扩增引物来做测序引物，但是测序对引物的特异性要求很高。如果引物与模板的非特异退火，延伸会导致“套峰”样结果。测序失败。 三是测序反应条件的原因，目前dna测序的原理是基于“酶”促反应的sanger 法，如果模板与引物匹配性不好，自然不会延伸出dna 片段；如果反应条件不合适，同样没用反应结果。当商业测序公司使用一个反应条件来测所有的样本时，某些样本的失败就不足为奇了。

SangerDNA测序法的缺陷是（）。 A.测定碱基序列需要大量完全相同的DNA拷贝 B.只能测定碱基数目较大的DNA C.分辨率低 正确答案：A

第一代DNA测序：双脱氧终止法即sanger测序法。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。第二代DNA测序：边合成边测序在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。第三代DNA测序：单分子测序用一种聚合酶将DNA的复制限制在一个微小的间隙中，给各种碱基加上荧光示踪标记，当碱基合成DNA链时，这些荧光标记就会发出不同颜色的闪光，根据闪光颜色就可识别出不同的碱基。要具体理解测序原理，请自己查询更详细的资料，以上为大体框架，sanger测序法是最老的测序法，沿用了几十年，到目前依然没有过时。二代测序是目前市面上最流行的测序，与一代相比，具有高通量、廉价的特点。三代测序目前仍处于试验阶段，将比二代测序更高通量，更廉价。

DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。目前应用最广泛的是由Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法，DNA sequencing technology，在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。

DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。目前应用最广泛的是由Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）。新的测序方法，例如454生物科学的方法和焦磷酸测序法。Sanger测序法Sanger（桑格）双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4种双脱氧核糖核酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个[2]。 454生物科学和焦磷酸测序法454测序法由454生物科学发明，是一个类似焦磷酸测序法的新方法。2003年向GenBank提交了一个腺病毒全序列[3]，使得他们的技术成为Sanger测序法后第一个被用来测生物基因组全序列的新方法。454使用类似于焦磷酸测序的方法，有着相当高的读取速度，大约为5小时可以测两千万碱基对[4]。

Sanger法的原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物.直到掺入一种链终止核苷酸为止.每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP).

【答案】：双脱氧链终止法测序的基本原理是：以待测DNA片段为模板，利用酶法合成与待测片段互补的DNA链。在正常的合成体系中，分别加入4种3"位缺少羟基的双脱氧核苷酸底物，即ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP，制备出四套末端标记的DNA片段。由于ddNTPs一旦掺入合成的DNA链，其链的合成即被终止，这样得到一套长短不一的片段，而每套片段被打断的位置却位于同一碱基，4套片段分别打断在A、T、C、G处。当对这4个不同碱基产生的4套DNA片段进行变性胶电泳分离时，即可产生一个可以直接读出DNA顺序的梯状区带。

【答案】：Sanger法DNA顺序测定技术的基本原理，是在反应中加入一种2"，3"-二脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，此物质因没有3"-OH，所以不能进行脱氧核苷酸链的延长。整个测定的程序如下：(1)将被测DNA制成单链模板。分别加入4个反应管中。并在每个管中加入引物、DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种为32P标记)。(2)在4个管中分别加人ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddATP，保温。(3)反应结束后在4个管中分别形成一些全部具有相同5"-引物端和分别以ddT、ddC、ddG、ddA 残基为3"-端结尾的一系列长短不一的混合物。(4)每种混合物经变性聚丙烯酰胺电泳分离及放射自显影，可见4种混合物形成不同的电泳迁移条带。每一条带都代表着一段以ddNTP终止的片段。只要按照电泳条带出现的先后次序即可读出被测DNA的顺序。Sanger法从引物的3"-端开始能合成约300个核苷酸的排列顺序，是现今分子生物中最重要的手段之一。

BAC是细菌人工染色体意思，之所以有BAC文库的出现，是因为基因组序列太长，测序，以及筛选基因等没有办法完成，所以将基因组片段随机打断成片段，连到载体上构建成一系列的重组子，这样当你需要特定的序列，只需要筛选出自己要的那个bac重组子就行了。说的有点过于简单，不知道你能明白否？末端测序也是采用的双脱氧终止法的。双脱氧终止法的原理是；碱基之间是通过俩个碱基的5‘磷酸基团和3"羟基连接的，双脱氧终止法就是利用了这个3‘羟基，将3"羟基脱氧变成氢键，那么这样下一个碱基的5‘磷酸基团就没有办法连到前一个碱基上了。所以如果在做测序pcr的时候加一部分正常的dNTP(3号位为羟基),加一定量的ddNTP(2,3号位都是氢键)，那么在第一个碱基后如果接上去的是dNTP,那么就可以接着连第三个碱基，如果连得是ddNTP,那么就没有办法连下个碱基形成链终止，在测序pcr中，数以万计的反应，那么就会出现2个碱基后终止的链，也有可能出现3个，4个，N个碱基后终止的链，这样就形成了一系列从一个碱基到N个碱基的序列（其最后一个碱基都是三号位为氢键的，这个应该理解吧）。那么如果我们在连上去的ddNTP上连上个荧光基团(四种ddNTP连上不同的荧光基团)，那么将这一系列长度的链跑胶，会形成一系列的带，通过每条带最后一个碱基的荧光通过机器就能够区分是什么碱基，将这些碱基拼接好后就是你要的序列了。

因为技术达不到啊，如果技术上可行的话，完全可以在染色体水平上进行DNA测序；主要难点在于DNA实在太长了，序列太多了；因而人们要避开这一点，所以就想到了把DNA分解成片断来操作；但是该怎么分解，毕竟单独把一条染色体分解成小的DNA片断也是不合适的，因为DNA含量太小，太难操作；因此，既要保证DNA片断小，又要保证一定的DNA片断浓度。所以，派拉蒙公司发明了一种方法，即取得细胞样品后，提取细胞中的染色体DNA，利用基因枪等等方法把DNA打碎，这样就保证了DNA片断的小以及浓度的高。然后把这些DNA片断连到载体上，而这些DNA片断连到载体上的部位的载体序列（拗口）是已知的，因此，人们可以测出与载体相连的DNA片断的边缘序列是什么，从而使这些不同的DNA片断可以连在一起；同时，DNA片断的内部序列可以在又一轮的打断、连到载体上后进行测序，直到完全测出。直到最后，所有的序列都被测出。这是一项大工程，需要一个大数据库，呵呵。由大化小，又由小得大，妙啊。所以说DNA测序克隆到载体上是为了解决大片断DNA难以直接测定的问题，毕竟一次测定的DNA序列长度是有限的。就这些，呵呵。