质粒载体

先连接T载体是为了提高转化效率一般来说市面上出售的T载体都进行了优化，容易连接片段（也就是效率较高），因此构建表达载体时有时会先连接T载体。同时T载体的测序引物比较明确（商业化的缘故），因此测序也方便一些。更重要的是，T载体往往设计了蓝白斑筛选的功能，插入片段的载体会呈现白色，这样也容易区分验证，不用每个单菌落都拿去做colony PCR或提质粒酶切验证。当然也不是绝对的，我们实验室就经常直接把片段酶切后连接表达载体，不经过T载体这一步，其实影响并不大。如果你的情况比较特殊（比如片段较大，或是对应的表达载体拷贝数较低等），可以考虑连接T载体，不然的话不是非常必要。

克隆载体（CloningVector）：通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。

噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒，同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。噬菌粒具有以下令人瞩目的特征：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。

应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmid cloning）。这种技术的理论依据是，在线性λ噬菌体DNΑ分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端（cos位点）。在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specific cutting system），叫做末端酶（terminase）或Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。只有在被作用的λDNA分子具有两个cos位点，而且它们之间的距离保持在38～54kb的条件下，Ter体系才能对它们发生作用。应用柯斯质粒作载体进行基因克隆的一般程序是：将外源DNA片段与柯斯质粒线性DNA分子进行体外连接反应。由此形成的连接产物群体中，有一定比例的分子是两端各有一个cos位点的长度为40kb左右的真核DNA片段，而且这两个cos位点在取向上是一样的，可作为λ噬菌体Ter功能的一种适用底物。当加入λ噬菌体的包装连接物时，它能把这些分子包装进λ噬菌体的头部，可以用来感染大肠杆菌 柯斯克隆技术的优点主要有两方面：首先，由于柯斯载体兼具了质粒和λ噬菌体两方面的特性，提高了克隆外源DNA片段的能力，可达45kb左右，因此对于构建真核生物基因文库是一种特别有用的克隆载体；其次，应用柯斯质粒作克隆载体，所形成的非重组体的克隆本底比较低，从而提高了筛选具外源DNA的重组体质粒的几率。 1.由于经核酸内切酶切割作用产生的线性的柯斯质粒载体，彼此间会通过分子内重组形成多聚体分子。2.由于经核酸内切酶做局部消化的折合基因组产生出来的DNA片段，在随后的连接反应中，往往会出现两个或数个片段随机连接在一起的情况。

质粒载体、噬菌体载体 理想质粒载体条件：1. 具有复制起始点2. 具有两种以上易被检测的选择性标记3. 在选择标记上具有多种限制酶的单一切点4. 具有尽可能小的相对分子质量5. 应属于松弛复制型6. 应为非传递性质粒理想值粒载体例子：（一） pBR22质粒载体：1. 相对分子质量较小2. 具有一个复制起始点，属松弛复制性载体3. 含四环素抗性和氨苄青霉素抗性基因，便于作为选择性标记4. 有24种单一限制酶识别位点，有利于检测重组转化子（二） pUC质粒载体1. 具有很小的相对分子质量和很高的拷贝数2. 适合用于组织化学方法检测重组体3. 具有多克隆位点MCS区段。可使具两种不同粘性末端的多种外源DNA片段无需借助其它操作而直接定向克隆到pUC质粒载体上。