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流式细胞仪技术
流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。其优点如下：
1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
一、样品的制备
流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号，因此，细胞必须做成单个细胞悬浮状态，不能聚集，也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异（如特异单抗），而且不允许渗透至载液中。
标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系，要经Ficoll分离，作单细胞分离处理，但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等)，化学法（EDTA、EGTA和柠檬酸盐）消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS，柠檬酸盐的浓度为40μmol/L，并同时采用机械分散法，将经消化处理的膨松组织，用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重悬，最好过一下尼龙或不锈钢网筛100μm和20μm。细胞浓度要保证在1-2×106/mL
若标本用于测定单个细胞，需加入1～5 mg/L的DNAase，将有助于阻止破碎细胞释放的DNA造成细胞再聚集，但是若分离的细胞要作DNA含量测定之用时，则切勿加DNAase。
二、悬浮细胞的固定
上述制备的活细胞即可用于流式细胞仪分析，如果染色和流式分析要拖后进行，或为了提高染色效果，则要将细胞预固定。乙醇固定是常用的方法。
1、固定方法：
(1)甲醛法：在细胞悬液中加入等量的8%甲醛(用Hank"S液配)4℃下固定12-18小时。
(2)乙醇法：细胞悬于PBS中，缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇，使终浓度为70%，冰浴30分钟。
(3)丙酮法：于细胞悬液中，缓慢加入冷丙酮，使终浓度为85%。
2、实例：
(1)用预冷的无钙、镁含0.5mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液，将细胞制成1×106细胞的悬液。
(2)在4℃下逐滴加入3倍体积的95% 乙醇，连续搅拌使乙醇终浓度达70%。
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(3)该细胞可在4℃下保存数日。
(4)分析前先用1000r/min离心10分钟，弃去乙醇，再将细胞悬于PBS中或要求的试剂中。
三、流式细胞仪分析的应用
(一)非染色细胞的光散射
一个粒子(如细胞)出现在一束光线中，立即会干扰该光束，造成该光束入射光的重分布，该细胞所获能量则以衍散、折射、反射等复杂的参数形式重新发射出来，这些参数与细胞体积、表面构象、内部结构形成函数关系，可测低角前面约10°的光散射及90°的光散射。
一般认为，90°位置的光散射值主要受细胞内部结构所致的光反射和折射影响，而低角前面10°位置的光散射则主要代表细胞大小。光散射测量方法如下：
(1)将细胞悬浮于HBSS中，浓度介于1×106～2×106/mL浓度之间。
(2)以悬浮细胞平衡盐溶液(HBSS)充满含鞘液的细胞贮藏池。
(3)设定细胞流量为500个/S(秒)，以获得最佳测定结果。
(二)染色法
1 细胞的碘化丙锭(propiolium iodide PI)染色
PI和EB(溴化乙锭)为同类物质，与EB一样，PI嵌入DNA双螺旋中，可使荧光强度增加约20倍，PI的荧光强度约为EB染色的1.8倍，以488nm波长激发，DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。
1.1 小鼠Lewis肺癌细胞(3LL)DNA含量测定方法
(1)从C57BL/6小鼠上切除肿块，在培养皿内用PBS冲洗；
(2)去除结缔组织及脂肪，剪碎肿块；
(3)小碎片移入1.20×38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。
(4)将200～300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL)，染色3LL细胞，于4℃存放20～30分钟。
(5)测定580～750nm之间的发射荧光，以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。
注：PI染色液：0.1%柠檬酸钠1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。
1.2 培养细胞DNA的流式细胞仪分析
(1)从培养皿中吸去培养基，以HBSS冲洗二次；
(2)加入PI5mL于培养皿中，在4℃放10分钟；
(3)用吸管反复次打细胞，使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。
1.3 完整细胞DNA的PI染色
(1)70%乙醇固定的细胞悬液，离心，去固定液；
(2)室温条件下加入PI染色一批细胞（10～10细胞/mL），时间为30分钟，然后行流式细胞仪分析。
1.4 光辉霉素和PI的DNA染色
在荧光抗生素光辉霉素和PI联合染色过程中，光辉霉素的供体分子被PI的受体分子接受产生能量转移，该染色技术主要用于实体肿瘤组织，精子细胞及妇科标本，同时 127 56
也适用于体外培养的细胞。
(1)分离制备的细胞悬液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。
(2)以PI/光辉霉素染色，4℃1小时（PI为10 mg/L、光辉霉素为10 mg/L）。
(3)染色后进样，以100W汞灯作为激光光源，使用BG123nm阻断滤片，叠加K590型高通滤法(one seep filter)。
2、DNA和RNA的鉴别染色
利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下：
(1)试剂：
溶液A：低温保存，稳定期约2周。
Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL
1mol/L NacL 15ml蒸馏水76mL，PH1.5（100mL）
溶液B：稳定期数月，最好除菌以后(高压或过滤)贮存。
0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL
0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL
蒸馏水24mL，总体积为99mL pH6.0
吖啶橙母液：
用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物，应小心)，吖啶橙应用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀释。
注意：仪器鞘流系统应保持4℃。
氩激光激发波488nm，红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA或单链DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制细胞悬液，取0.2mL(8×106细胞/mL)，加入0.4mL溶液A，4℃放置45～60秒。
②加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室温2分钟。
③应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。
注意：①细胞数保持恒定；②核酸与吖啶橙的比例；③染色时间及温度。
(三)染色法的应用
1、变性及双链DNA的鉴别染色
(1)试剂：
HBSS内含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4缓冲液，pH2.6。
①2×10细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。
②37℃温育1小时。
③将0.2mL细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混匀，20℃ 30分钟。
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④加2mL吖啶橙染色2分钟。
⑤绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。
2、DNA与癌基因探针双标记测定
这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物，然后用PI标记DNA，现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤：
(1)制备白血病细胞悬液，用100%甲醇在-20℃固定10分钟。
(2)取50μl50 mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体，可特异性地直接与N-ras，Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编码的21Kd蛋白相结合)，4℃作用30～45分钟。
(3)用PB离心洗涤2次，重悬浮于50μL HBSS中(含0.1%叠氮钠和2%小牛血清)。
(4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分钟。
(5)同(3)洗涤后加入50μL 1:40的FITC标记的羊抗兔IgG，4℃反应30～45分钟。
(6)同(3)洗涤后，细胞用RNA酶消化，室温20～30分钟。
(7)同(3)洗涤后，用PI染液染20分钟。
(8)同(3)洗涤后，用488nm激发波长测定。FITC染色显示ras癌基因表达产物，PI染色显示DNA含量。
注意事项：
①制备样品时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失和凝集；
②细胞固定时间不宜过长，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂；
③为了降低本底，应将细胞表面未结合的荧光染料洗净；
④进行双标记沉淀时，应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。
3、以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。
(1)试剂：
用培养基配制33 mg/L Brdu及脱氧细胞苷26.4g/mL。
染色液：Hoechst33258溶于PBS，细胞染色24小时后进行分析，据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。
(2)方法：
①将Brdu溶液按1:10加入细胞培养液中。
②根据细胞周期时间不同，选择不同时间培养的细胞。
③孵育后，摇散细胞以传代培养。
④直接用染液重悬细胞，进入流式细胞仪分析。
Hoechst33258荧光值在410～580nm之间，需用330～360nm紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此，不仅特异性标记DNA，亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时，在与细胞孵育过程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态，并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰，此项
技术可用于直接测定细胞G2期及分裂时间。
4、Hoechst33342染色活细胞DNA
(1)试剂：Hoechst 33342,用蒸馏水配成0.25mol/L。
(2)方法：
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①制备106/m细胞悬液，以Hoechst33342染色，浓度为5～10 mg/L ，室温下20分钟。
②分析前切勿洗涤细胞。
Hoechst33342可用作细胞DNA的活体染料，据信可在保持细胞活性的同时，呈现出相当好的DNA化学计量关系，激发波在紫外范围350～363nm之间，发射波则在450nm处。
5、以异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyante FIFC）染色蛋白质。
(1)试剂：异硫氰酸荧光素(FIFC)用含40 mg/L RNase的PBS配成0.1～1.0 mg/L浓度。
(2)方法：
①染色前用终浓度70%乙醇固定细胞，至少18小时。
②离心固定细胞，弃去固定液。
③室温下用FIFC染色细胞蛋白，30分钟。
④流式细胞仪分析，使用氩激光，激发波长488nm，荧光发射波长515～535nm。 也可于固定细胞中，以18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分钟以上可对DNA和蛋白质双重染色，分别呈现红色荧光（DNA）和绿色荧光（蛋白质）。
6、荧光素抗体的应用
该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞，可用荧光素或若丹明标记单克隆抗体处理上述细胞；也可用于测定胞浆中的蛋白质(如凋亡BCL-2蛋白，抗病毒蛋白MXA等)，后者在细胞凋亡章节中已介绍从略。
用磷酸盐缓冲液Eagle"s MEM稀释FIFC连接的抗体内含0.1%叠氮钠、2%牛血清。为判定FIFC抗体的最适度的稀释浓度，向微量滴定板的细胞中加入50μL不同浓度的稀释液，再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人LEU-I抗体分析时，应稀释成5 mg/L或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在2×10浓度时其存活率应在90%以上。
方法：
(1)于微量滴定板加入50μL抗体稀释度，再加入50μL细胞悬液，混匀。
(2)冰浴45分钟，离心滴定板（1500r/min 10分钟）。
(3)弃上清，以培养基100μL洗涤细胞沉淀2次，每次洗涤后用1500r/min 10分钟，弃上清。
(4)以1ml预冷的培养基配成1×106细胞/mL的已染色细胞悬液，进样前持续保持冷环境(4℃)。
目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应用。
①细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。
②肿瘤学：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。
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③免疫学：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。
④血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。
⑤药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。
2. 匀浆的制备
剪碎法：取心肌组织0.5g放人平皿，用含EDTA的冷PBS缓冲液洗涤。加入少量PBS,用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10 ml PBS；用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；离心沉淀1500 prm×3 min，弃上层。再用PBS洗3次，每次以500 prm短时低速离心除去细胞碎片，以300目尼龙网过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为(2～5)×10/ml。
研磨法：先将组织在200目滤网上研磨，并加入PBS过滤；所得的细胞悬液，2000 prm×5 min，吸去上清，加PBS 1 ml，轻轻吹打成细胞悬液，调整细胞浓度为5×10～10个。再2O00prm×5 min，吸去上清，加PBS 1 ml，轻轻吹打成细胞悬液，经300目滤网过滤，再离心、加PBS吹打，重复2～3次后，调整细胞浓度为 106/ml。
3 流式细胞仪检测细胞凋亡—Annexin V/PI双染色法
Annexin V/PI标记染色：取500u1心肌缓冲液，轻轻混匀细胞后加5ul FITC一Amexin V和5ul PI试剂，置冰浴10min后，流式细胞仪(光源为488nm氨离子激光，预先用Flow-Check调整光路)计数10以上的细胞，用FITC/PI双色分析程序测得心肌凋亡细胞(Annexin V＋/PI—)的百分率。
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