流式细胞仪

一般来说都是将细胞悬液离心并弃上清后加入固定液，我们加的是70%的冰乙醇，加的量根据你细胞的多少。你这个涉及的测蛋白，那么加多聚甲醛的量和时间可能要控制得严一些才能保证最低限度不破坏a-SMA的结构。如果单测细胞凋亡和周期的话固定液多一点和固定时间长一点都影响不是太大。其实无论是做细胞周期的乙醇固定，还是做蛋白染色的多聚甲醛固定，固定液加1mL就可以了，一般每个样品的细胞数都在106左右。固定液太少了不好，因为固定液的实际作用浓度一定程度上受弃上清后管内残留液体量的影响，但太多了也没有意义。也正是这个原因，实际上多聚甲醛的浓度用4%的多一些，而且因其有挥发性，时间长浓度会有所降低。至于固定时间，一般4度30min固定作用就已经比较完全了，但是也可以放置过夜，这样有时有利于时间安排。

左上象限为坏死细胞，左下象限为正常细胞，右上象限为早期凋亡细胞，右下象限为晚期凋亡细胞。

只要有特异性的细胞可以被标记（细胞群，或者特异性的细胞），就可以用流式细胞仪。比如白血病，骨髓瘤，艾滋病治疗的监测（看CD4细胞的水平）等等。

如需此技术服务者，请在线提前预约！流式细胞仪测定的标本，不论是外周血细胞、培养细胞或组织来源细胞，首先要保证是单细胞悬液，对不同来源的细胞制备成单细胞悬液有不同的处理程序。单细胞悬液的保存 常用的处理方法有三种： 1.深低温保存法。 2.乙醇或甲醇保存法。 3.甲醛或多聚甲醛固定法。血液抽取之后，建议当天上机检测流式，如当天不能上机检测的，请用抗体固定好保存即可。 如是是人血小板、单核细胞上白细胞表面分化抗原的量，在采集全血时用什麽抗凝剂，？需要多少毫升全血？收集的全血在进行流式细胞仪检测前是否可以冻存？如果可以冻存，在冻存前需要怎样的处理？冻存的温度是多少度？ 采血时最好采用EDTA防凝，国内有文献报道过，使用桔橼酸钠、肝素等抗凝效果均不如EDTA。需要的血量要依据使用的管数、采用的单抗标记物数量不同而不同，一般5ml足够。用于流式细胞学检测的全血绝对不可以冻存，室温（18~25度）保存。

当然是三激光的好。每一种荧光染料的激发光都是一个范围，在这个范围内敏感度不同。一般的2激光配置，都是红蓝 ，5 种在蓝色激发光，3种位于红色通道（5-3）和(4-2）没有本质上的区别。到底采用什么配置，取决于你们实验室要做什么实验。配了用不到的是浪费，没有要要用到的也是浪费。所以建议你们把要经常检测的荧光种类，所要使用的通道都事先统计一下，再做决定。如果经常要做多种颜色分析，建议购买4激光的机器，比如LSRII。你还有什么问题尽管问，我是流式细胞仪实验中心的经理，有多年的经验。

请看维基百科相关记述：流式细胞术维基百科，自由的百科全书(重定向自流式细胞仪)Jump to: navigation, searchImage:03wiki-zn-frontpage-icon.gif流式细胞术正在翻译。目前已翻译90%，原文在en:flow cytometry。希望您积极翻译与修订。流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。目录[隐藏] * 1 原理 * 2 流式细胞仪(flow cytometer) * 3 应用 * 4 参见[编辑]原理一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。可以检测的参数有： * 细胞的体积和形态复杂程度 * 细胞中的色素 * DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等） * RNA * 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染） * 蛋白质 * 细胞表面抗原（CD标记） * 胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等） * 核抗原 * 酶活性 * pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势 * 膜流动性 * 细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化） * 细胞存活能力 * 监测细胞电通透性 * 氧爆作用(oxidative burst) * 研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) * 谷胱甘肽 * 各种组合（DNA/表面抗原等等）这个列表非常长，而且在不断地扩展。[编辑]流式细胞仪(flow cytometer)流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。流式细胞仪和显微镜比较像，但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。固体组织需要在检测前制备成单细胞的悬浮液。一个流式细胞仪包括五个组成部分： * 细胞流动系统：液流（鞘液(sheath fluid)）携带细胞，使颗粒以串流形式通过光束。 * 光源：有通常的灯（汞或氙）、高功率水冷的激光源（氩、氪、染料激光）、低功率气冷激光（氩(488nm)，红氦氖(633nm)，绿氦氖，氦镉(紫外)）、偶极激光（蓝、绿、红、紫）。 * 检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统：产生前散射、旁散射光和荧光的信号。 * 放大系统，线性或对数放大。 * 计算机，用于分析信号。早期的流式细胞仪主要是实验设备，但目前仪器和相关的试剂有了很广的市场。不同厂商的仪器特性也不同，主要的厂商和品牌如下： * Beckman-Coulter (ex-Coulter): Epics XL/XL-MCL; Epics Altra (Hypersort) (IBM-PC compatible platforms) * Becton, Dickinson: (FACS"s): FACSCAlibur, FACScan, FACSort, FASCSVantage (Mac OS platform) FACS Canto, LSRII, Aria, DiVa (PC PLatform) * Cytomation: MoFlo, Cyan (IBM-PC platform) * Partec/Dako: Galaxy; PAS; CCA; PA (IBM-PC compatible platforms)[编辑]应用流式细胞术在很多领域中都有应用，包括分子生物学、病理学、免疫学和海洋生物学等。在分子生物学中，它主要用于荧光标记的抗体。特异性的抗体与靶细胞上的抗原结合，能够通过流式细胞仪研究这些细胞的特别信息。这在医学（尤其是器官移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、遗传学）中具有很广泛的应用。现代的流式细胞仪具有多个激光和荧光检测器（目前商业用仪器的记录是4个激光和14个检测器），可以用于多个抗体标记，以便在表现型中更准确地区别某个靶群体。流式细胞仪也是很有用的分选仪器。当细胞/颗粒通过时，可以被选择性地加上某种电荷，并在通过电磁场后偏转，从不同出口流出。这样就可以从一个混合物中高速（理论上可达到每秒大约9万个细胞）准确地分离开四类细胞。由流式细胞仪得到的数据可以画成一维的柱状图或者二位或者三维的散点图。The data coming from flow-cytometers can be plotted in 1-D to produce histograms or seen in 2D as dot plots or in 3D with newer software. The regions on these plots can be sequentially separated by a series of subset extractions which are termed gates. Specific gating protocols exist for diagnostic and clinical purposes especially in relation to haematology. The plots are often made on logarithmic scales. Because of overlaping fluorescent dyes, emission spectrum generated interfering signals by detectors signals have to be compensated electronically.海洋中主要的光合生物之一——占海洋浮游生物总细胞数将近1/3的原绿球藻(Prochlorococcus)就是通过流式细胞术发现的。因为其细胞小，叶绿素含量少，在通常的荧光观察中被迅速漂白(bleach)，但由于在流式细胞术中细胞通过光束的时间极短，胞内叶绿素的荧光可被观察到。[编辑]参见 * 荧光显微镜 * 荧光活化细胞分选取自"http://wikipedia.cnblog.org/wiki/%E6%B5%81%E5%BC%8F%E7%B4%B0%E8%83%9E%E8%A1%93"页面分类: 待翻译文章 | 细胞生物学 | 实验室技术 | 解剖病理学 | 血液学 | 医学检验

横坐标代表的是PE的荧光强度。每个细胞在通过激光束的时候，机器会记录一个信号。这个信号可以用一个曲线来标示。曲线的高度H，代表了最高的强度，曲线的宽度W，代表了通过的时间（细胞的大小），曲线下面积A，是这个信号的综合体现。PE-A，就是把每个信号的曲线下面积（A）记录作图得到的。

主要分为2类，一类是用来校准机器的。每一批号的beads在每个通道都有相对固定的检测期望值。上机后，机器也使用相应的设置检测出相应的信号。如果信号发生偏移，或者需要大幅度改变设置才能检测到预期信号，就说明机器出问题了。另外一类是代替细胞做compensation的。可以模拟细胞，一部分吸附抗体，另一部分不吸附。还有一些beads，可以用来检测溶液中的蛋白。比如流式细胞仪检测细胞因子的array beads。

不管哪家的流式，每种激光都可以配置一定数量的检测通道（也就是对应的颜色数量）。同样是八色，配置了三个激光的肯定是明显优于两个激光的。两个激光配八色通道，已经是两个激光的极限了，没有进一步升级的可能，而且所选的颜色限制很大，实际并不能同时检测8色。而三色激光，配置8个通道，还有升级的空间，被检颜色的选择范围也要大的多。

流式细胞仪技术成熟度是根据流式抗体的丰富性和数据的直观性来描述的。流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。

先用低渗缓冲液破膜，得到细胞核。然后标记。上机分选。细胞核比细胞的尺寸小。要设置好机器阈值的下限

【答案】：C流式细胞仪主要由4部分组成：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。

正确答案:E解析：细胞分选对于流式细胞仪要求较高，要求包括：分选速度、分选纯度、分选收获率、分选得率。其中，分选收获率指设定通过测量点的分选细胞与实际收获的分选细胞之间的比率。分选得率指的是从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，在经过分选后获得目的细胞的实际得率。

　　流式细胞仪不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少（分辨率为零），推荐核酸蛋白检测仪。　　1、流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置，它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说它的细节分辨率为零。　　2、HD-97-1 21C-A 核酸蛋白检测仪（紫外检测仪）是液相色谱仪的一种紫外检测装置。核酸蛋白检测仪（紫外检测仪）是根据生命科学的发展对于现代色谱仪器的要求而改进设计的一种新型紫外检测仪。该仪器在创新方面的主要特点为：　　（1）核酸蛋白检测仪除了配有10mV记录仪输出信号外，还同时配有适合于计算机积分仪的输出接口﹙HD–21C–B型﹚，这样很方便于构成色谱工作站系统﹙可同时进行计算机和记录仪信号输出，亦可省去记录仪﹚。　　（2）核酸蛋白检测仪的数字显示设计为固定光吸收A显示和可变量程光吸收A显示两种可选模式，这样可方便于规范化读数﹙特别是可应用于药品生产的GMP工艺规范化管理﹚，同时亦可根据科研需要进行可变量程的高灵敏度读数，这样可方便于对低浓度样品检测﹙HD–21C–B型﹚。　　（3）核酸蛋白检测仪采用新型进口R212光电倍增管和改进型电路结构﹙HD–97–1)光电倍增管为1P28型﹚，仪器全部采用数字显示2个OD值表，用户可直接读出光密度A值，从而使仪器灵敏度高、峰值重复性好、漂移低、性能稳定、质量可靠、使用方便等优点。　　该仪器配上层析柱、恒流泵、自动部分收集器等，即组成一套完整的液相色谱分离层析系统。它可应用于现代生物学研究、药物测定、农业科研、化工、食品及医疗科研单位对具有紫外吸收的样品做分析定性、定量、分离分析检测。　　3、核酸蛋白检测仪主要技术性能：　　（1）核酸蛋白检测波长范围：254nm、280nm﹙214nm﹚。　　（2）量程范围：0-100℅T、0-2A、0-1A、0-0.5A、0-0.2A、0-0.1A、0-0.05A、0-0.02A。　　（3）记录仪输出：10mV 。　　（4）流式样品池：容积100微升、光程3毫米。　　（5）微量样品池：容积30微升、光程10毫米 。　　（6）数显模式：固定A量程读数（0-2.0A）：可变A量程读数（0-2.0A、0-1.0A、0-0.5A、0-0.2A、0-0.1A、0-0.05A、0-0.02A、HD-21C-B型）。　　（7）量程在0.05A档时：噪音≦0.002A。　　（8）工作环境温度：0～35℃。　　（9）仪器可连续、仪器工作时不受到任何震动，周围不受磁场干扰。　　（10）电源：220VAC±10%50HZ 。　　（11）主机重量：5kg。

流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量:①前向角(即0角)散射(FSC);②侧向散射(SSC)，又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大;对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系;对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。荧光信号主要包括两部分:①自发荧光，即不经荧光染色，细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光;②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高，自发荧光越强;培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强;细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

横坐标是DNA染料PI收到波长为488nm的激光激发后所放出的荧光强度。流式细胞仪（Flow cytometry ）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。

推荐贝克曼库尔特品牌的流式细胞仪。作为第一家提供基于阻抗的流式细胞仪的公司（1953 年），贝克曼库尔特坚定地努力成为并保持在研究流式细胞仪领域的全球领导者。对我们来说，这一切都是为了推进科学和突破流式细胞术的可能性。 我们不断创新，为您提供解决方案，帮助您了解其他平台无法实现的功能。CytoFLEX 科研型全自动流式细胞仪平台这一创新系统带来了无与伦比的激发与检测性能，极大限度地降低光信号的损失，从而带来优异的仪器灵敏度。该科研型全自动流式细胞仪平台包括三种不同的型号——CytoFLEX、CytoFLEX S 和 CytoFLEX LX——均在紧凑、易于使用的细胞分析仪器中提供强大的性能。

问题一：流式细胞仪结果图如何看 流式细胞仪检测的都是相对荧光强度，因此一般都是用来比较两个或以上样本的荧光强度的差异。而荧光强度则是由荧光标记抗体或者其他荧光染料根据不同目的来选用的。 你可以贴一组具体的图来，我可以给你一些指导。 问题二：怎样看流式细胞仪淋巴细胞分析结果 最常见的是分析CD4， CD8亚群。 先在FSC， SSC散点图上划出淋巴细胞gate。然后在此gate基础上选取T细胞标志染色阳性的细胞群（一般是CD3）。在把CD34阳性的细胞根据CD4 和CD8染色情况形式为散点图，得到CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, 以及双阳性的比率。如果还有其他细胞标志的染色，再进一步分析。 问题三：如何分析流式细胞仪显示的数据 （一）单参数直方图　　单参数直方图是一维数据用得最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X-Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横坐标可以是线性标度或对数标度。用信道来表示，实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵坐标一般表示的是细胞的相对数。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。　（二）双参数直方图　　双参数直方图是一种细胞数与双测量参数的图形。常见有以下三种：　　1.二维点图：能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横坐标和纵坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于两个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。　　2.二维等高图：类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数越多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。　　3.假三维图：是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐坐标-细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的。假三维图列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存储方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。（三）三参数直方图　　目前，由于计算机软件的发展，很多商品化的软件均提供三参数直方图功能，意指这一类直方图的三维坐标均为参数而非细胞数。这种立体图以点图为显示方式，同样可以作全方位旋转以便仔细观察。（四）流式细胞仪的多参数分析　　当细胞标记了多色荧光在流式细胞仪上被激光激发后，所得到的荧光信号和散射信号可以根据需要组合分析以获得所需的信息，这就是流式细胞仪的多参数分析。 问题四：流式细胞术图像如何分析 那些方框叫做圈门，旁边的数字说的是门里面所占的百分比，后面那2张图是计数，右上计数的是48%那群的，下图是计数45%那个门里面的， 整张图的横坐标左边是阴性，右边是阳性 问题五：流式细胞仪检测细胞分型结果分析 你要问什么问题呢？可以具体些吗？ 问题六：流式细胞仪检测图怎么看flowjo Flowjo可以读取FCS格式的文件，一般的流式细胞仪都产生这个格式的文件。把FCS文件导入Flowjo后，双击导入的文件，默认打开的是FSC，SSC 点状图，你可以根据具体的使用更换坐标，或者设定gate 问题七：根据流式细胞仪的数据，如何分析？ 假设你在这个图前面的步骤都是对的，包括设置gate，单细胞的gate等等。 这两个图不具备可比性，第一个的图记录了超过1万个数据，而第二个只有2千多个。相差的很远。这是最大的错误。从现有的百分率来看，G1, G2的百分率也很接近。所以是看不出差别来的。你如果要做的是看你的实验手段是否一直细胞周期。做这个实验是不行的。必须做BrdU或者EdU加PI的双染实验。在不同时间点取对照组和实验组做，才能得出结论细胞周期是否有抑制。 这样的PI单染实验，只能得出各个周期的百分率有没有改变，就算有改变，也不能说是有抑制。至于凋亡，就更加不可靠了。这个实验的特异性非常差。 问题八：流式细胞仪结果分析,急求 你必须把你具体怎么做的都详细的写一下，光凭这个图很混乱。 你CD45和CD105都是FITC染色的，是在同一个样本吗，如果不是，为啥只有一个散点图。如果是的，那就重新做实验吧

可以.这个是流式细胞仪一个常见的应用.上流式细胞仪以前,需注意的是1.细胞打散到单细胞的悬液,没有聚团成块.如果有顾虑的话用纱网过滤一次才用.2.细胞悬液的浓度不能过高和过低.详请参考你的仪器说明建议值.我的经验每毫升一百万足足够了.少些读取慢些也没有大问题,一支样品少过十万的话,就很容易得不到足够的数据.太多则读取过快,准确性可能降低,更多更危险,可能造成仪器管道堵塞.3.如果上机时间能保证,细胞直接打散均匀在PBS里面就可以上机了,除了贴壁细胞需要的胰酶处理按照普通传代步骤来做,之后洗一次,没有什么其他处理.如果细胞悬液制好后可能需要等待（超过半小时）,则用1-2%多聚甲醛或福尔马林溶液保存细胞.注意避光避免丢失荧光信号.这样保存放4度冰箱一两个礼拜之后也还是可以上机,误差不大.

所谓的门，在流式细胞仪检测的时候术语叫做gate。流式细胞仪是针对细胞（后者颗粒）的群来做研究的。往往是先选中感兴趣的一个细胞群，再分析下一步的染色，可以进行很多分级。比如先从所有细胞中画出淋巴细胞，可以在FSC-SSC散点图上画出淋巴细胞的群，比如一个方框，或者任意曲线的gate，也就是所谓的门。把淋巴细胞括在内。然后在另外一个散点图上只显示这个gate里的细胞，但是把横坐标和纵坐标改为其他荧光标记。总之，门就是一个选择细胞群的手段。

MFI 可以有几个意思，比如Mean Fluorescence Intensity或者Median Fluorescence Intensity。根据你样本的分布，如果样本是正态分布，平均荧光强度和中位荧光强度应该是一致的。但是在非正态分布的样本，这两个值是不一样的。具体用哪一个，要看具体样本的分布。

流式细胞仪（Flow cytometry ）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。

intracellular CD3的缩写，也就是细胞内部的CD3。是细胞表面的CD3-TCR被胞吞后进入细胞内部的。

流式细胞仪液体清洗液瓶管路堵塞方法如下：1、使用针筒反冲。GIF动画，大约1.8兆，请在Wifi下加载。2、使用细金属丝。里面用到的是一种叫CleaningStylus的细金属丝。

你的图呢，先贴一下图吧，不然只能猜了。检测CD4和CD8，应该还要同时染色CD3. 先选中CD3阳性的细胞（T细胞），然后把T细胞在CD4/CD8的散点图上再显示，可以分为四个象限。分别代表CD4阳性，CD8阳性，双阳性，和无染色的。正常情况下，是不应该有双阳性和未染色的，也就是说你的细胞应该只显示在4个象限的其中的两个。其他的两个最多只是一些背景的杂信号。代表T细胞的两个亚群。

用流式细胞仪检测巨噬细胞可以使用以下的表面标记：cd14,cd11b,f4/80(鼠)/emr1(人),cd68和mac-1/mac-3

是非常正常的。流式细胞仪丢弃率高是此仪器的老毛病了，是非常正常的，此仪器是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理。

一般常规的流式细胞仪都是采用荧光激发和探测来检测信号的。基本的原理如下：荧光的产生。荧光素再受到光线（激发光，一般是激光）的照射后，会释放出波长较长的光线。发出的释放光通过光纤维传到检测区域。检测区域，不同的机器构造有所差异。基本的原理就是先通过各种滤镜的组合，来控制相应波长的光线可以到达指定的检测器。流式机器的检测器一般都是光电倍增管（PMT）。PMT可以有效的把微弱的光信号转变为电信号，并且放大，这样最终变为计算机可以读取的数据。PMT是不能区分颜色的。那种颜色的光到达哪个PMT，由滤镜组合来决定。

用流式细胞仪检测巨噬细胞可以使用以下的表面标记：CD14, CD11b, F4/80 (鼠)/EMR1 (人), CD68 和 MAC-1/MAC-3

流式细胞仪用于临床诊断：白血病，淋巴瘤等血液科和肿瘤科的疾病艾滋病的治疗检测，这个属于传染科免疫科，移植科的免疫细胞检测，抗体筛选，自体免疫疾病的诊断。可溶性小分子的检测肿瘤科的肿瘤细胞的DNA定量

一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。二、注意事项1、必须活细胞检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。2、特殊细胞的染色方法：在消化或吹打时，有些细胞（如神经元细胞）很容易受到损伤，导致晚期凋亡或坏死比例非常高，不能反映真实结果。实验的解决方法：先低速离心，吸取细胞培养板中的液体，留少许液体，加入适量PI和Annexin-V染色10min后，将漂浮细胞吸至离心管中，离心洗涤两次，用PBS漂洗贴壁细胞两次，加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中，离心洗涤，再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例，增加早期凋亡细胞比例。3、由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大，因而在消化细胞时，建议一般不采用含EDTA的消化液。4、必须设置阴性对照和补偿对照（分别单染）。

流式细胞术是有ABC三种功能，但能否分选还要看流式细胞仪的类型，有些是没有分选功能的，如贝克曼-库尔特EPICS-XL型等。流式细胞仪有大型机和小型机，小型机一般为单激发光源488nm，可测定的荧光波长范围也比较少，一般为四色：如525nm,575nm,625nm等，且多无分选功能。大型机多为科研用，有多个激发光波长，能检测的荧光波长广，多达十几色，有分选功能。.

Dip表示二倍体，总的二倍体含量是100%，其中包括DipG1，DipG2和DipS。其实就是分裂间期，G1期基本都是二倍体，所以其含量高，S期只少有一半是二倍体。而G2期则很少有二倍体。为什么会这样，是因为这是软件所定义的检测时间，在这个时间段内称为细胞周期的某一期，而去检测该时间有多少细胞和它的DNA 含量，所以当然不是百分百的G2期没有二倍体细胞，当然，这个时间段并不是真的存在，只是用软件去拟合所有检测事件，从而拟合出最静态的结果。

贝克曼库尔特品牌。在流式细胞术领域，无论是常规的细胞检测，还是高复杂性的流式细胞术应用，贝克曼库尔特都致力于通过给客户提供需要的技术来获得最准确、可重复的结果从而帮助客户达到实验目标，如流式细胞分析试剂等产品及技术。对于要求低耗材高成果的诊断型实验室，贝克曼库尔特的解决方案简化了工作流程，同时避免了耗时且易出现高成本失误的手工操作步骤。同时，贝克曼库尔特的技术支持和售后服务网络遍及全球，营销达至130多个国家，为您提供及时可靠的技术支持和售后保障。目前贝克曼库尔特公司的流式细胞仪包括：临床型流式细胞仪、科研型流式细胞仪、细胞分选仪等；具体型号包括:CytoFLEX系列和MoFlo系列。

可以，这个和western定量的原理类似，需要有标准品来作比对。不过很难。因为流式主要是用来最相对量的比较的。细胞内的蛋白，用荧光标记的单克隆抗体识别后，用流式可以测出每个细胞的相对荧光强度。有一种特异性的微球，可以吸附一系列不同定量分子数的抗体。这种微球吸附同样的荧光抗体，可以做出荧光强度和所吸附抗体分子数量的标准曲线。然后拿细胞检测的荧光强度和这个标准曲线对比，得到细胞内所结合的抗体数。因为单克隆抗体只结合相同的抗原表位，所以可以推算出细胞内蛋白的分子数量了。解释结果的时候要考虑到抗体的特异性和染色的效果等影响因素。

流式细胞仪是通过激光对通过激光束的颗粒进行计数。当颗粒或者细胞通过激光束的时候，会对光线产生折射和反射。这个折射和反射的信号被探测器记录下来。每通过一个细胞，就会产生一个峰值，最后记录峰值的个数，就可以计数了

流式细胞仪不能检测游离的Ig，但是如果细胞表面结合有IgG或者IgM等免疫球蛋白，则这些免疫球蛋白可以被抗免疫球蛋白的抗体识别。如果这些二抗被荧光染料标记，就可以用流式细胞仪来检测细胞表面是否有免疫球蛋白附着了。

这个要看你是怎么看的了。流式细胞仪检测的都是相对值和百分比。CD3是T细胞的表面标记，一般认为CD3+的淋巴细胞就是T细胞。 正常人T细胞占到淋巴细胞的60-90%。T细胞一般有分为CD4+ 和CD8+这两种，两者的比例正常范围是0.9-6.

流式可以检测的样本很多：细胞表面的蛋白，通过荧光抗体直接标记细胞内部的蛋白，细胞固定，通透后再用荧光抗体识别细胞内部的DNA含量，细胞固定，通透后加DNA染料细胞内部钙离子浓度，直接加钙离子浓度荧光染料染色细胞内部线粒体膜电位，比如JC-1，罗丹明染料使用微球阵列，可以同时检测溶液中数十种可溶性蛋白的浓度

　（一）单参数直方图 　　单参数直方图是一维数据用得最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X-Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横坐标可以是线性标度或对数标度。用"信道"来表示，实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵坐标一般表示的是细胞的相对数。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。 　（二）双参数直方图 　　双参数直方图是一种细胞数与双测量参数的图形。常见有以下三种： 　　1.二维点图：能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横坐标和纵坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于两个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。 　　2.二维等高图：类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数越多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。 　　3.假三维图：是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐坐标-细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的。假三维图列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存储方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。 （三）三参数直方图 　　目前，由于计算机软件的发展，很多商品化的软件均提供三参数直方图功能，意指这一类直方图的三维坐标均为参数而非细胞数。这种立体图以点图为显示方式，同样可以作全方位旋转以便仔细观察。 （四）流式细胞仪的多参数分析 　　当细胞标记了多色荧光在流式细胞仪上被激光激发后，所得到的荧光信号和散射信号可以根据需要组合分析以获得所需的信息，这就是流式细胞仪的多参数分析。

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可以的，目前根据机器的型号不同，可以有两种方法。比较常用的是用计数微球。比如临床上的CD4细胞绝对计数，就是采用这个方法。试管内事先已经有固定数目的计数微球和染色抗体。按要求加入固定体积的抗凝血液，裂解红细胞后上机。记录一千个微球，同时就会得到不同染色区域细胞的数量。这样就可以算出单位体积血液内CD4细胞的绝对数目了。这样的计数微球也可以另外购买。浓度是固定的。在你已知体积的细胞悬液中加入一定体积的微球后上机，记录一千个微球的数据，细胞的计数也会同时记录。根据微球的浓度就可以推算出细胞的浓度，从而得出绝对计数了另外一个方法是有些流式细胞仪是使用微泵加样，而不是连续吸取样本，这样样本的体积是已知的，记录一次就是所有样本的数量，可以算出细胞浓度

流式检测DNA含量，是通过DNA荧光染料，比如PI染色，然后和已知DNA含量的商品化标准品（比如鸡红细胞）比对，得到含量。比如下面这个图，做的是肝癌患者活检后的检查。横坐标代表的是DNA染色后的相对荧光强度，纵坐标是细胞计数。第一个峰是鸡红细胞，第二个峰是正常的肝细胞。第三个峰是DNA含量多于正常细胞（也就是癌细胞，是正常细胞的1.2倍），最后一个峰，是正在分裂的正常细胞处于G2期，所以有两倍的DNA

【答案】：E透镜的作用是将激光和荧光变成平行光，同时去除离散的室内光。滤片包括长通、短通和带通滤片，分别允许不同波长的光通过。

随时使用。据公开数据查询到，流式细胞仪是一个仪器，可以随时使用。流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节分辨率为零。

流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。

　　原理：　　流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。　　在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。　　在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。　　荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。　　减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。操作过程：①打开电源，对系统进行预热；②打开气体阈，调节　压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的 基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选 择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭 气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；⑧将所需结果打印出来。

　　流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。　　在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。　　在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。　　荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。　　减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。　　样品分选原理流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。　　稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度，d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。　　（50）数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。　　①数据显示：FCM的数据显示方式包括单参数直方图、二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。　　直方图是一维数据用作最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，坐标可以是线性标度或对数标度，用“道数”来表示，实质上是所测的荧光或散射光的强度。坐标一般表示的是细胞的相对数。图10-2给出的是直方图形式。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。　　二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。坐标和坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于二个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。　　二维点图二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。图10-4给出了二维等高图的样式。　　假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐坐标—细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节　，这无疑是有助于对数据进行分析的。　　假三维图列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。可用ListMode中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如，“一调二”就是在一维图上调出二维图来；“二调一”就是从二维图中调出一维图来。图10-6给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。　　图10-6　从二维图设窗调出直方图示意上面简要地介绍了几种数据显示形式，在实际应用中，可根据需要选择匹配，以便了解和获得尽可能多的有用信息。　　②数据分析：数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组，方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的DNA含量时，可以获取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测量得到的分布形状不需要做任何假设，即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单，只需要直观观测频数分布；也可能很复杂，要对两个或多个直方图逐道地进行比较。　　逐点描图（或用手工，或用描图仪、计算机系统）是大家常用的数据分析的重要手段。我们常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最终结果等。事实上，不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数值分析。从这一点来看，非参数分析是参数分析的基础。　　逐道比较工作量较大，但用直观法很容易发现明显的差异，特别是对照组和测试组。考虑到FCM的可靠性，要注意到对每组测量，都要有对照组，对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等，具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。顺便指出，进行比较时对曲线的总细胞数进行归一化处理，甚至对两条曲线逐道相减而得到“差结果曲线”往往是适宜的。　　因为数据分析往往和结果解释关系十分密切，也就是说和生物学背景相关，因此具体的分析法和原理将在后面结合实例再介绍。

细菌计数与投国外期刊跟用不用NB仪器无关。流式细胞仪好像不能分别技术，除非你的菌大小差异很大，估计你的菌大小差异不大，所以不行。流式细胞仪理论上可以计数细菌数。计数细菌，我不建议用流式细胞仪，他有很多情况要考虑。比如说，你用什么染色？染色机理是什么？很多染色剂其实不能很好说明活菌和死菌的区别。我认为菌有4种状态，不能简单分死活两种。普通的倒平板其实很好！！！

左下为正常细胞，右下为早期凋亡细胞左上为坏死细胞，右上为晚期凋亡细胞望采纳！

贝克曼库尔特安装要求一、 实验室空间要求1.实验室主入口门宽不小于80cm，门高不小于198cm。2.机房占地面积至少需要达到3×3=9平方米。主机周边至少留有0.5米的空间，方便日后维护。Gallios/Navios主机（宽X 深X高=102cm x 70cm x 61cm，重量=109公斤）Gallios/Navios气泵箱（宽X 深X高=71cm x 58cm x 46cm，重量=59公斤）二、 实验室电源要求1.实验室需购置3KVA在线式不间断电源，推荐山特牌UPS。2.仪器安装至少需要使用220V、16A插座1个、10A插座2个，分别安装在仪器后面墙面上。3.仪器必须确保良好接地，零地线电压低于1VAC，地线对地阻抗小于4欧姆。4.配备二个高质量市售多功能接线板，供配套设备使用。三、 实验室温度要求15.5 ~ 32°C，温度变化不得超过±2°C，空调不得与仪器共用同一电源线路。四、 实验室湿度要求20%至80%，无冷凝。五、 实验室配套设施1. 需要二张稳固的台面，一张放置仪器主机，另一张放置电脑，显示器和打印机。台面尺寸：1.5米(宽度)×0.8米（深度）×0.8米（高度）2. 准备至少1L蒸馏水或“Milli Q”级的净化水。

　　很简单的啊。　　流式细胞仪数据分析　　5.1 数据采集及显示　　光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。 流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。　　根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。 4参数（FSC,SSC,FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB.　　数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。 图5-1 流式数据分析图　　双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。3维图通过X,Y,Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。　　习题：数据采集及显示　　1 在直方图中横轴和纵轴分别表示 .　　2 二维点图用于显示 参数。　　3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表 .　　5.2 设门　　通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC,SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。 图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图　　习题：设门　　1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对 错）　　5.3 细胞亚群的数据分析　　数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据，然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。 如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。　　图5-3 选定淋巴细胞亚群设门　　门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。 我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。 直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。　　图5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002） 图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%.　　图5-5 直方图统计结果　　二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。　　图5-6 阴性对照组（NORM001）和CD3 FITC/CD19 PE双染样本（NORM002） 如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%.　　图5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%.　　图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图 图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果　　这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。 为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。　　图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比　　5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析　　这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。 如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2,5和20（从左至右）。　　图5-11 单细胞株分析图 除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析。　　QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。 图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数 我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析。因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。　　图5-13 细胞周期的DNA直方图　　习题：数据分析　　1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？　　2 见图5-4和图5-5,CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。　　3 LL象限代表双阳性细胞亚群。（对 错）　　4 见图5-6和图5-7,淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。　　5 只能使用矩形设定细胞区域范围。（对 错）　　6 使用区域设定法分析样本有哪些不足。　　7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么。　　8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。　　5.5 CellQuest和CellQuest Pro软件使用　　CellQuest和CellQuest Pro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。它运行于苹果电脑上，优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro时的强大功能及视觉质感。CellQuest和CellQuest Pro软件主安装在BD FACSCalibur型流式细胞仪上。　　1.软件数据流程　　在CellQuest和CellQuest Pro软件的数据流分为二个部分：方案和数据包。方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系。可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。每个采集方案分析样本后会生成数据包，该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值，格式为FCS2.0或FCS3.0.　　数据包必须由方案文件打开，无法单独显示，或者可由第三方软件进行分析，如WinMDI.　　2.软件与仪器的连接　　流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。　　1、x09先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。　　2、x09在苹果菜单下点击CellQuest和CellQuest Pro软件。　　3、x09从Aquire菜单下选择connet to cytometer.　　3.方案与数据之间的关系　　CellQuest和CellQuest Pro软件的方案与数据相互独立保存，数据包可以由任一方案文件进行分析，分析后不改变数据包中的任何数据。CellQuest和CellQuest Pro软件中方案内的直方图或散点图有三种状态：Acquire,Analysis和Acquire-Analysis.　　当图的属性为Acquire时，此图只限于采集下用，即只当进行检测时它才能显示颗粒；　　当图的属性为Analysis时，此图只限于分析已保存的数据包，它不能用于采集数据。　　当图的属性为Acquire-Analysis时，此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。　　所以方便起见，我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis属性。　　CellQuest Pro CellQuest　　4.方案的建立　　A选择实验参数　　默认情况下，FACSCalibur流式细胞仪开机后只打开一根激光器，及五个参数供选择使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3.当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项，仪器自动打开633nm激光器。　　B,建立散点图或直方图，命名坐标　　CellQuest Pro软件主要工作界面，软件类似于Office word的工作面，可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。　　在CellQuest软件下，需在选择Plot菜单，选择Format来打开图的属性对话框，其中包括了关于该图所有选项。　　建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4.　　在菜单上选择Acquire栏目，选择Parameter Description,可出现关于文件存储和参数命名的对话框。在这个对话框中用P字母来代表每个参数，并在此对每个采集参数进行命名，FL1为CD3FITC,FL2为CD4PE……　　C,设门并建立门与图之间的关系　　R与G的关系　　R是Region的首个字母，Region一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和圆形区。区域与区域之间可以进行逻辑运算，如AND、OR、NOT等关系。当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：　　Gate实际了个代数式，简称G,其运算式默认如下：　　G1 = R1,或G2=R2　　当我们要进行逻辑运算时，可变更为G1=R1 AND R2.此时G1就成了一个算术结果了。　　G1=R1 AND R2　　G2=R1 NOT R2　　G3=R1 OR R2　　Region List管理门，可以重命名或删除门。Gate List是对门进行逻辑运算和标识颜色的工具。　　建立门与图之间的关系　　打开要编辑的直方图或散点图的属性对话框，选择Gate选项，选择门即可。　　D,显示统计参数　　5.仪器的操作　　当计算机与流式细胞仪联机后便会出现以下采集控制框：　　在有关仪器操作所有控制选项框都在Cytometer下拉菜单下，同时按住“苹果”键及1、2、3、4便可调取所有控制框：　　6.文件的保存及调用　　实验或分析过程中所建的方案可以保存下来，通File下拉菜单可以保存这些方案文件：　　如要打开这些分析方案只需双建方案图标即可；方案可以分析以往的数据包（前提是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性），有两种方案打开以往的数据：　　方法一：选择直方图或散点图，打开该图的属性框（Plot-》Format），见下图：　　在以上红色框标注的地方选择要分析的数据包。　　方法二：选中方案中所有的直方图或散点图，打开Plots菜单，选择Chang Data File,打开要分析的数据包。

请看维基百科相关记述： 流式细胞术 维基百科，自由的百科全书 (重定向自流式细胞仪) Jump to: navigation, search Image:03wiki-zn-frontpage-icon.gif流式细胞术正在翻译。 目前已翻译90%，原文在en:flow cytometry。希望您积极翻译与修订。 流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。 目录 [隐藏] * 1 原理 * 2 流式细胞仪(flow cytometer) * 3 应用 * 4 参见 [编辑] 原理 一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。 可以检测的参数有： * 细胞的体积和形态复杂程度 * 细胞中的色素 * DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等） * RNA * 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染） * 蛋白质 * 细胞表面抗原（CD标记） * 胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等） * 核抗原 * 酶活性 * pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势 * 膜流动性 * 细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化） * 细胞存活能力 * 监测细胞电通透性 * 氧爆作用(oxidative burst) * 研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) * 谷胱甘肽 * 各种组合（DNA/表面抗原等等） 这个列表非常长，而且在不断地扩展。 [编辑] 流式细胞仪(flow cytometer) 流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。 现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。 流式细胞仪和显微镜比较像，但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。固体组织需要在检测前制备成单细胞的悬浮液。 一个流式细胞仪包括五个组成部分： * 细胞流动系统：液流（鞘液(sheath fluid)）携带细胞，使颗粒以串流形式通过光束。 * 光源：有通常的灯（汞或氙）、高功率水冷的激光源（氩、氪、染料激光）、低功率气冷激光（氩(488nm)，红氦氖(633nm)，绿氦氖，氦镉(紫外)）、偶极激光（蓝、绿、红、紫）。 * 检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统：产生前散射、旁散射光和荧光的信号。 * 放大系统，线性或对数放大。 * 计算机，用于分析信号。 早期的流式细胞仪主要是实验设备，但目前仪器和相关的试剂有了很广的市场。不同厂商的仪器特性也不同，主要的厂商和品牌如下： * Beckman-Coulter (ex-Coulter): Epics XL/XL-MCL; Epics Altra (Hypersort) (IBM-PC compatible platforms) * Becton, Dickinson: (FACS"s): FACSCAlibur, FACScan, FACSort, FASCSVantage (Mac OS platform) FACS Canto, LSRII, Aria, DiVa (PC PLatform) * Cytomation: MoFlo, Cyan (IBM-PC platform) * Partec/Dako: Galaxy; PAS; CCA; PA (IBM-PC compatible platforms) [编辑] 应用 流式细胞术在很多领域中都有应用，包括分子生物学、病理学、免疫学和海洋生物学等。在分子生物学中，它主要用于荧光标记的抗体。特异性的抗体与靶细胞上的抗原结合，能够通过流式细胞仪研究这些细胞的特别信息。这在医学（尤其是器官移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、遗传学）中具有很广泛的应用。 现代的流式细胞仪具有多个激光和荧光检测器（目前商业用仪器的记录是4个激光和14个检测器），可以用于多个抗体标记，以便在表现型中更准确地区别某个靶群体。 流式细胞仪也是很有用的分选仪器。当细胞/颗粒通过时，可以被选择性地加上某种电荷，并在通过电磁场后偏转，从不同出口流出。这样就可以从一个混合物中高速（理论上可达到每秒大约9万个细胞）准确地分离开四类细胞。 由流式细胞仪得到的数据可以画成一维的柱状图或者二位或者三维的散点图。 The data coming from flow-cytometers can be plotted in 1-D to produce histograms or seen in 2D as dot plots or in 3D with newer software. The regions on these plots can be sequentially separated by a series of subset extractions which are termed gates. Specific gating protocols exist for diagnostic and clinical purposes especially in relation to haematology. The plots are often made on logarithmic scales. Because of overlaping fluorescent dyes, emission spectrum generated interfering signals by detectors signals have to be compensated electronically. 海洋中主要的光合生物之一——占海洋浮游生物总细胞数将近1/3的原绿球藻(Prochlorococcus)就是通过流式细胞术发现的。因为其细胞小，叶绿素含量少，在通常的荧光观察中被迅速漂白(bleach)，但由于在流式细胞术中细胞通过光束的时间极短，胞内叶绿素的荧光可被观察到。 [编辑] 参见 * 荧光显微镜 * 荧光活化细胞分选 取自"http://wikipedia.cnblog.org/wiki/%E6%B5%81%E5%BC%8F%E7%B4%B0%E8%83%9E%E8%A1%93"

检测cd4和cd8，应该还要同时染色cd3.先选中cd3阳性的细胞（t细胞），然后把t细胞在cd4/cd8的散点图上再显示，可以分为四个象限。分别代表cd4阳性，cd8阳性，双阳性，和无染色的。正常情况下，是不应该有双阳性和未染色的，也就是说你的细胞应该只显示在4个象限的其中的两个。其他的两个最多只是一些背景的杂信号。代表t细胞的两个亚群。

耗材：流式的试管细胞滤网加样的吸管枪头试剂：染色的各种染料，标记好的荧光抗体染色所需要的缓冲液，封闭液，PBS最终由于上样的缓冲液

激光功率都不低于50mW。流式细胞仪在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而FCM中的校准具有双重功能：仪器的准直调整和定量标度。

1、通道是：利用Miltenyi或其他公司的磁珠对目的细胞做预纯化或清洗可提高分拣效率。当然，仅仅利用一轮或多轮磁珠筛选而不用流式细胞仪，许多研究也能开展起来，但这不是本文讨论的重点。Amnis 公司已将流式细胞仪射流与荧光显微镜和数字成像整合在一起。其结果是一系列单个细胞的图像能够显示荧光团的分布，而非简单的平均荧光指数（MFI）。2、目前有33种不同的金属可被同时检测。该仪器被Time of Flight 称为"Cytof" [1] 。考虑购买该仪器的研究人员应该确保他们有这一深度的细胞分析需要。此外，细胞在等离子体中会被汽化，所以用于研究的细胞不能恢复。蒸汽分拣仪硬件设备简单，检测点与收集装置间距离较短，检测样品的激光数多。而流动细胞分拣系统通过比色皿提供层流和增强的样品聚焦。3、然而，流动细胞长度有限，而且激光光学装置需要足够空间避免不同通道间的串扰。对于敏感性来说，流动细胞系统明显占优，但蒸汽系统没有保持细胞清洁的问题，并且能提供额外的激光束。需要指出的是，有些激光束本身对细胞有毒害作用。

这个要看指的是什么。在流式上，有两个地方要用到Filter，但是中文意思完全不同。第一个，在机器内部的PMT前方，荧光素被激发后所释放的荧光通过光导纤维传到各个检测器（PMT），PMT的前放一般装有long pass filter 和band pass filter。这些是用来控制可以到达PMT光线的波长的。本质是光学滤片。第二个要用到的是单细胞悬液在上机前，需要使用filter过滤，以去除杂质。这里filter就是滤网的意思了。

左下为正常细胞，左上为坏死细胞；右上为晚期凋亡细胞，右下为早期凋亡细胞。检测CD4和CD8，应该还要同时染色CD3. 先选中CD3阳性的细胞（T细胞），把T细胞在CD4/CD8的散点图上再显示，可以分为四个象限。分别代表CD4阳性，CD8阳性，双阳性，和无染色的。正常情况下，是不应该有双阳性和未染色的，也就是说你的细胞应该只显示在4个象限的其中的两个。其他的两个最多只是一些背景的杂信号。代表T细胞的两个亚群。流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。以上内容参考：百度百科-流式细胞仪

流式细胞仪是通过激光对通过激光束的颗粒进行计数。当颗粒或者细胞通过激光束的时候，会对光线产生折射和反射。这个折射和反射的信号被探测器记录下来。每通过一个细胞，就会产生一个峰值，最后记录峰值的个数，就可以计数了

可以，这个和western定量的原理类似，需要有标准品来作比对。不过很难。因为流式主要是用来最相对量的比较的。细胞内的蛋白，用荧光标记的单克隆抗体识别后，用流式可以测出每个细胞的相对荧光强度。有一种特异性的微球，可以吸附一系列不同定量分子数的抗体。这种微球吸附同样的荧光抗体，可以做出荧光强度和所吸附抗体分子数量的标准曲线。然后拿细胞检测的荧光强度和这个标准曲线对比，得到细胞内所结合的抗体数。因为单克隆抗体只结合相同的抗原表位，所以可以推算出细胞内蛋白的分子数量了。解释结果的时候要考虑到抗体的特异性和染色的效果等影响因素。

贝克曼库尔特品牌。在流式细胞术领域，无论是常规的细胞检测，还是高复杂性的流式细胞术应用，贝克曼库尔特都致力于通过给客户提供需要的技术来获得最准确、可重复的结果从而帮助客户达到实验目标，如流式细胞分析试剂等产品及技术。对于要求低耗材高成果的诊断型实验室，贝克曼库尔特的解决方案简化了工作流程，同时避免了耗时且易出现高成本失误的手工操作步骤。同时，贝克曼库尔特的技术支持和售后服务网络遍及全球，营销达至130多个国家，为您提供及时可靠的技术支持和售后保障。

　（一）单参数直方图 　　单参数直方图是一维数据用得最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X-Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横坐标可以是线性标度或对数标度。用"信道"来表示，实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵坐标一般表示的是细胞的相对数。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。 　（二）双参数直方图 　　双参数直方图是一种细胞数与双测量参数的图形。常见有以下三种： 　　1.二维点图：能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横坐标和纵坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于两个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。 　　2.二维等高图：类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数越多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。 　　3.假三维图：是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐坐标-细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的。假三维图列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存储方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。 （三）三参数直方图 　　目前，由于计算机软件的发展，很多商品化的软件均提供三参数直方图功能，意指这一类直方图的三维坐标均为参数而非细胞数。这种立体图以点图为显示方式，同样可以作全方位旋转以便仔细观察。 （四）流式细胞仪的多参数分析 　　当细胞标记了多色荧光在流式细胞仪上被激光激发后，所得到的荧光信号和散射信号可以根据需要组合分析以获得所需的信息，这就是流式细胞仪的多参数分析。

临床诊断类或者叫体外诊断医疗器械

侧向角散射(side scatter,SSC)，流式细胞仪依靠激光器照射细胞所携带的不同荧光物质所产生的不同的荧光进行检测。由于散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。侧向角散射是指与激光束正交90°方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 另外还有前向角散射(forward scatter，FSC)，前向角散射与被测细胞的大小有关，确切地说，它与细胞直径的平方值密切相关。通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。利用这两个参数可以对细胞进行分群，通过设门就可以将具有一定ssc和fsc的细胞群从大量细胞中区分出来。所说的设门，是指在进行检测时，所设的选择区域，可以用“门”选择感兴趣的细胞群。具体说，是指在某一张选定参数的直方图上,根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群,并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门,矩形门,圆形门,多边形门,任意形状门和十字门。流式细胞这门技术比较复杂，染色和上机都需要操作人员有一定的经验这里说到的根据CD61 vs SSC设门，应该就是说通过对CD61分子的染色和ssc参数设门，从而得到CD61分子阳性，并具有一定ssc值即有一定物理参数的细胞的数据。由于CD61是血小板的表面分子，因此可以得到血小板的相关数据。

一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。二、注意事项1、必须活细胞检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。2、特殊细胞的染色方法：在消化或吹打时，有些细胞（如神经元细胞）很容易受到损伤，导致晚期凋亡或坏死比例非常高，不能反映真实结果。实验的解决方法：先低速离心，吸取细胞培养板中的液体，留少许液体，加入适量PI和Annexin-V染色10min后，将漂浮细胞吸至离心管中，离心洗涤两次，用PBS漂洗贴壁细胞两次，加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中，离心洗涤，再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例，增加早期凋亡细胞比例。3、由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大，因而在消化细胞时，建议一般不采用含EDTA的消化液。4、必须设置阴性对照和补偿对照（分别单染）。

流式细胞仪技术 流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。其优点如下： 1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。 2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。 3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。 一、样品的制备 流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号，因此，细胞必须做成单个细胞悬浮状态，不能聚集，也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异（如特异单抗），而且不允许渗透至载液中。 标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系，要经Ficoll分离，作单细胞分离处理，但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等)，化学法（EDTA、EGTA和柠檬酸盐）消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS，柠檬酸盐的浓度为40μmol/L，并同时采用机械分散法，将经消化处理的膨松组织，用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重悬，最好过一下尼龙或不锈钢网筛100μm和20μm。细胞浓度要保证在1-2×106/mL 若标本用于测定单个细胞，需加入1～5 mg/L的DNAase，将有助于阻止破碎细胞释放的DNA造成细胞再聚集，但是若分离的细胞要作DNA含量测定之用时，则切勿加DNAase。 二、悬浮细胞的固定 上述制备的活细胞即可用于流式细胞仪分析，如果染色和流式分析要拖后进行，或为了提高染色效果，则要将细胞预固定。乙醇固定是常用的方法。 1、固定方法： (1)甲醛法：在细胞悬液中加入等量的8%甲醛(用Hank"S液配)4℃下固定12-18小时。 (2)乙醇法：细胞悬于PBS中，缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇，使终浓度为70%，冰浴30分钟。 (3)丙酮法：于细胞悬液中，缓慢加入冷丙酮，使终浓度为85%。 2、实例： (1)用预冷的无钙、镁含0.5mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液，将细胞制成1×106细胞的悬液。 (2)在4℃下逐滴加入3倍体积的95% 乙醇，连续搅拌使乙醇终浓度达70%。 126 (3)该细胞可在4℃下保存数日。 (4)分析前先用1000r/min离心10分钟，弃去乙醇，再将细胞悬于PBS中或要求的试剂中。 三、流式细胞仪分析的应用 (一)非染色细胞的光散射 一个粒子(如细胞)出现在一束光线中，立即会干扰该光束，造成该光束入射光的重分布，该细胞所获能量则以衍散、折射、反射等复杂的参数形式重新发射出来，这些参数与细胞体积、表面构象、内部结构形成函数关系，可测低角前面约10°的光散射及90°的光散射。 一般认为，90°位置的光散射值主要受细胞内部结构所致的光反射和折射影响，而低角前面10°位置的光散射则主要代表细胞大小。光散射测量方法如下： (1)将细胞悬浮于HBSS中，浓度介于1×106～2×106/mL浓度之间。 (2)以悬浮细胞平衡盐溶液(HBSS)充满含鞘液的细胞贮藏池。 (3)设定细胞流量为500个/S(秒)，以获得最佳测定结果。 (二)染色法 1 细胞的碘化丙锭(propiolium iodide PI)染色 PI和EB(溴化乙锭)为同类物质，与EB一样，PI嵌入DNA双螺旋中，可使荧光强度增加约20倍，PI的荧光强度约为EB染色的1.8倍，以488nm波长激发，DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。 1.1 小鼠Lewis肺癌细胞(3LL)DNA含量测定方法 (1)从C57BL/6小鼠上切除肿块，在培养皿内用PBS冲洗； (2)去除结缔组织及脂肪，剪碎肿块； (3)小碎片移入1.20×38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。 (4)将200～300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL)，染色3LL细胞，于4℃存放20～30分钟。 (5)测定580～750nm之间的发射荧光，以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。 注：PI染色液：0.1%柠檬酸钠1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。 1.2 培养细胞DNA的流式细胞仪分析 (1)从培养皿中吸去培养基，以HBSS冲洗二次； (2)加入PI5mL于培养皿中，在4℃放10分钟； (3)用吸管反复次打细胞，使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。 1.3 完整细胞DNA的PI染色 (1)70%乙醇固定的细胞悬液，离心，去固定液； (2)室温条件下加入PI染色一批细胞（10～10细胞/mL），时间为30分钟，然后行流式细胞仪分析。 1.4 光辉霉素和PI的DNA染色 在荧光抗生素光辉霉素和PI联合染色过程中，光辉霉素的供体分子被PI的受体分子接受产生能量转移，该染色技术主要用于实体肿瘤组织，精子细胞及妇科标本，同时 127 56 也适用于体外培养的细胞。 (1)分离制备的细胞悬液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。 (2)以PI/光辉霉素染色，4℃1小时（PI为10 mg/L、光辉霉素为10 mg/L）。 (3)染色后进样，以100W汞灯作为激光光源，使用BG123nm阻断滤片，叠加K590型高通滤法(one seep filter)。 2、DNA和RNA的鉴别染色 利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下： (1)试剂： 溶液A：低温保存，稳定期约2周。 Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL 1mol/L NacL 15ml蒸馏水76mL，PH1.5（100mL） 溶液B：稳定期数月，最好除菌以后(高压或过滤)贮存。 0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL 0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL 蒸馏水24mL，总体积为99mL pH6.0 吖啶橙母液： 用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物，应小心)，吖啶橙应用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀释。 注意：仪器鞘流系统应保持4℃。 氩激光激发波488nm，红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA或单链DNA(F>530nm) (2)方法 ①用含15%血清的PBS配制细胞悬液，取0.2mL(8×106细胞/mL)，加入0.4mL溶液A，4℃放置45～60秒。 ②加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室温2分钟。 ③应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。 注意：①细胞数保持恒定；②核酸与吖啶橙的比例；③染色时间及温度。 (三)染色法的应用 1、变性及双链DNA的鉴别染色 (1)试剂： HBSS内含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl pH1.35 吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4缓冲液，pH2.6。 ①2×10细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。 ②37℃温育1小时。 ③将0.2mL细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混匀，20℃ 30分钟。 128 6 ④加2mL吖啶橙染色2分钟。 ⑤绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。 2、DNA与癌基因探针双标记测定 这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物，然后用PI标记DNA，现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤： (1)制备白血病细胞悬液，用100%甲醇在-20℃固定10分钟。 (2)取50μl50 mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体，可特异性地直接与N-ras，Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编码的21Kd蛋白相结合)，4℃作用30～45分钟。 (3)用PB离心洗涤2次，重悬浮于50μL HBSS中(含0.1%叠氮钠和2%小牛血清)。 (4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分钟。 (5)同(3)洗涤后加入50μL 1:40的FITC标记的羊抗兔IgG，4℃反应30～45分钟。 (6)同(3)洗涤后，细胞用RNA酶消化，室温20～30分钟。 (7)同(3)洗涤后，用PI染液染20分钟。 (8)同(3)洗涤后，用488nm激发波长测定。FITC染色显示ras癌基因表达产物，PI染色显示DNA含量。 注意事项： ①制备样品时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失和凝集； ②细胞固定时间不宜过长，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂； ③为了降低本底，应将细胞表面未结合的荧光染料洗净； ④进行双标记沉淀时，应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。 3、以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。 (1)试剂： 用培养基配制33 mg/L Brdu及脱氧细胞苷26.4g/mL。 染色液：Hoechst33258溶于PBS，细胞染色24小时后进行分析，据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。 (2)方法： ①将Brdu溶液按1:10加入细胞培养液中。 ②根据细胞周期时间不同，选择不同时间培养的细胞。 ③孵育后，摇散细胞以传代培养。 ④直接用染液重悬细胞，进入流式细胞仪分析。 Hoechst33258荧光值在410～580nm之间，需用330～360nm紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此，不仅特异性标记DNA，亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时，在与细胞孵育过程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态，并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰，此项 技术可用于直接测定细胞G2期及分裂时间。 4、Hoechst33342染色活细胞DNA (1)试剂：Hoechst 33342,用蒸馏水配成0.25mol/L。 (2)方法： 129 ①制备106/m细胞悬液，以Hoechst33342染色，浓度为5～10 mg/L ，室温下20分钟。 ②分析前切勿洗涤细胞。 Hoechst33342可用作细胞DNA的活体染料，据信可在保持细胞活性的同时，呈现出相当好的DNA化学计量关系，激发波在紫外范围350～363nm之间，发射波则在450nm处。 5、以异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyante FIFC）染色蛋白质。 (1)试剂：异硫氰酸荧光素(FIFC)用含40 mg/L RNase的PBS配成0.1～1.0 mg/L浓度。 (2)方法： ①染色前用终浓度70%乙醇固定细胞，至少18小时。 ②离心固定细胞，弃去固定液。 ③室温下用FIFC染色细胞蛋白，30分钟。 ④流式细胞仪分析，使用氩激光，激发波长488nm，荧光发射波长515～535nm。 也可于固定细胞中，以18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分钟以上可对DNA和蛋白质双重染色，分别呈现红色荧光（DNA）和绿色荧光（蛋白质）。 6、荧光素抗体的应用 该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞，可用荧光素或若丹明标记单克隆抗体处理上述细胞；也可用于测定胞浆中的蛋白质(如凋亡BCL-2蛋白，抗病毒蛋白MXA等)，后者在细胞凋亡章节中已介绍从略。 用磷酸盐缓冲液Eagle"s MEM稀释FIFC连接的抗体内含0.1%叠氮钠、2%牛血清。为判定FIFC抗体的最适度的稀释浓度，向微量滴定板的细胞中加入50μL不同浓度的稀释液，再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人LEU-I抗体分析时，应稀释成5 mg/L或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在2×10浓度时其存活率应在90%以上。 方法： (1)于微量滴定板加入50μL抗体稀释度，再加入50μL细胞悬液，混匀。 (2)冰浴45分钟，离心滴定板（1500r/min 10分钟）。 (3)弃上清，以培养基100μL洗涤细胞沉淀2次，每次洗涤后用1500r/min 10分钟，弃上清。 (4)以1ml预冷的培养基配成1×106细胞/mL的已染色细胞悬液，进样前持续保持冷环境(4℃)。 目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应用。 ①细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。 ②肿瘤学：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。 130 7 ③免疫学：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。 ④血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。 ⑤药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。 2. 匀浆的制备 剪碎法：取心肌组织0.5g放人平皿，用含EDTA的冷PBS缓冲液洗涤。加入少量PBS,用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10 ml PBS；用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；离心沉淀1500 prm×3 min，弃上层。再用PBS洗3次，每次以500 prm短时低速离心除去细胞碎片，以300目尼龙网过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为(2～5)×10/ml。 研磨法：先将组织在200目滤网上研磨，并加入PBS过滤；所得的细胞悬液，2000 prm×5 min，吸去上清，加PBS 1 ml，轻轻吹打成细胞悬液，调整细胞浓度为5×10～10个。再2O00prm×5 min，吸去上清，加PBS 1 ml，轻轻吹打成细胞悬液，经300目滤网过滤，再离心、加PBS吹打，重复2～3次后，调整细胞浓度为 106/ml。 3 流式细胞仪检测细胞凋亡—Annexin V/PI双染色法 Annexin V/PI标记染色：取500u1心肌缓冲液，轻轻混匀细胞后加5ul FITC一Amexin V和5ul PI试剂，置冰浴10min后，流式细胞仪(光源为488nm氨离子激光，预先用Flow-Check调整光路)计数10以上的细胞，用FITC/PI双色分析程序测得心肌凋亡细胞(Annexin V＋/PI—)的百分率。 4 566 131

流式细胞仪检测原理如下：流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标。经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300~400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。样品分选原理。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是:由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中;其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。充电电压一般选+150V，或-150V；;偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。

CD11B: 单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，NK细胞等；CD11C：树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞。流式细胞术是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术。其测量速度快，最快可在1秒钟内检测上万个细胞。可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量。具有明显的统计学意义，提供细胞群体的均值和分布情况。扩展资料：流式细胞技术的应用：1、其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；2、能准确地进行DNA倍体分析；3、借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；4、快速进行细胞分选和细胞收集；5、医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析（心血管疾病），流式细胞术与分子生物学研究；6、应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。参考资料：百度百科-流式细胞技术

　　原理：根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果。 　　1、将待测细胞染色后，制成单细胞悬液。 　　2、用一定压力将待测样品压人流动室，同时不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 　　3、流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光信号和荧光信号。

在2019年的三月份我正式开始做单细胞相关研究工作，有趣的同时也是朋友我们经常误会的是：你是不是用流式细胞术？而我在得知自己要做这单细胞（single cell ）的研究时，在Google搜关键词（single cell ），居然有不少是介绍流式细胞术的。流式细胞术应用到高通量测序领域就变成了微流控技术。可见，把生命科学的视界拉倒单细胞水平的比高通量测序更早的是流式细胞术。 那么在单细胞测序技术出现之前，人们在研究单细胞的时候都是怎么做的呢，都有哪些分析点呢？单细胞测序技术给单细胞研究带来了哪些新的视角？这一切的答案都要求我们对流式细胞术有一个基本的了解。 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 （1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统 激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光） 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。 流式细胞仪(FCM)是集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。 ①细胞生物学 ：细胞凋亡研究；定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。 [详细] ②肿瘤学 ：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。 [详细] ③免疫学 ：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。 [详细] ④血液学 ：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。 [详细] ⑤药物学 ：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。 [详细] 细胞凋亡研究 ：细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。 [详细] ** 细胞分选**：流式细胞仪能够分选某一亚群细胞,分选纯度＞95%。目前细胞分选主要用于研究，临床应用较少。利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞，只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记。 [详细] ** 细胞因子的检测**：随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。本文主要对胞内细胞因子流式细胞技术作介绍。 [详细] ** 血液学应用**：本文向您介绍流式细胞仪在血液研究领域的应用，包括DNA倍体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，NK和LAK细胞活性测定，造血干/祖细胞测定等。 [详细]

我简单说一下：x0dx0a1.首先，机器吸取细胞混悬液，射入由鞘液（一般都是磷酸盐缓冲液）。由于鞘液的流速大，所以细胞混悬液通过轴流的形式在中央，一般是单个细胞排队的形式。x0dx0ax0dx0a2.然后细胞通过检测窗口。有激光束照射。一般细胞都经过荧光染色，被激光照射后，会有不同波长的激发光产生。机器设有检测器来探测激发光的强弱x0dx0ax0dx0a3.根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果（比如抗原量，DNA量，等等）

【答案】：流式细胞仪由三部分构成：1.传感系统，包括样本递送系统、样品池、检测系统、电子传感器和激光源等。2.计算机系统。3.电路、光路和水路系统，有电源、光学传导和滤片、鞘液循环和回收部分等。

流式细胞仪是一种用于分析细胞的仪器。它通过将单个细胞通过一束激光束，并测量从细胞中反射或散射的光来检测细胞的物理和化学特性。通过调节激光的颜色和强度，可以检测细胞的大小、形状、表面标记和细胞内成分等特性。流式细胞仪还可以分离出不同类型的细胞，因为不同类型的细胞在大小、表面标记和细胞内成分等方面有所不同。

激光配置:配置488nm、638nm激光器,488nm、638nm激光功率都不低于50mW。流式细胞仪在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节　气体压力大小以获得稳定的液流速度。测量区光路调节　：这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而FCM中的校准具有双重功能：仪器的准直调整和定量标度。

按需选择。首先明确您要流式细胞仪的目的是什么，比如用来做哪些检测。然后根据这些需求看市场上有多少符合您需求的。您可以查看各项指标、操作界面和数据处理等方面是不是符合您的要求，和现有的条件是否配套。推荐您选择贝克曼库尔特公司的流式细胞仪，贝克曼库尔特自1953年推出世界上第一台流式细胞分析仪后，对技术革新一直执着追求，成为细胞研究领域的领跑者，正为科研人员提供各式各样的流式分析分选产品产品。自动操作技术和低含量目标细胞的分析分选技术完美结合，引导科研人员进入一个新的研究里程碑。目前贝克曼库尔特公司的流式细胞仪包括：临床型流式细胞仪、科研型流式细胞仪、细胞分选仪等；具体型号包括:CytoFLEX系列和MoFlo系列。

流式细胞仪工作的原理是使悬浮在液体中分散的细胞或微粒一个个地依次通过样品池，细胞的流速可达9米/秒，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图、直方图和假三维结构图像进行分析。

流式细胞仪的工作原理：借鉴了荧光显微镜技术，将激发光改为激光，使具有更好的单色性；利用荧光染料与单克隆抗体技术，提高特异性与灵敏度；将固定的标本台改为流动的单细胞悬液，并用计算机进行信号的数据处理分析，能同时从一个细胞上获得多种参数资料。

1、通道是：利用Miltenyi或其他公司的磁珠对目的细胞做预纯化或清洗可提高分拣效率。当然，仅仅利用一轮或多轮磁珠筛选而不用流式细胞仪，许多研究也能开展起来，但这不是本文讨论的重点。Amnis 公司已将流式细胞仪射流与荧光显微镜和数字成像整合在一起。其结果是一系列单个细胞的图像能够显示荧光团的分布，而非简单的平均荧光指数（MFI）。2、目前有33种不同的金属可被同时检测。该仪器被Time of Flight 称为"Cytof" [1] 。考虑购买该仪器的研究人员应该确保他们有这一深度的细胞分析需要。此外，细胞在等离子体中会被汽化，所以用于研究的细胞不能恢复。蒸汽分拣仪硬件设备简单，检测点与收集装置间距离较短，检测样品的激光数多。而流动细胞分拣系统通过比色皿提供层流和增强的样品聚焦。3、然而，流动细胞长度有限，而且激光光学装置需要足够空间避免不同通道间的串扰。对于敏感性来说，流动细胞系统明显占优，但蒸汽系统没有保持细胞清洁的问题，并且能提供额外的激光束。需要指出的是，有些激光束本身对细胞有毒害作用。

高通量流式细胞仪推荐德国赛多利斯。不错的