流式细胞仪

流式细胞技术 （Flow Cytometer, FCM）是细胞学的研究手段之一。其能在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。例如，采用双激光的方法，研究者可进行核型分析和鉴定，分离纯化某号染色体并构建染色体特异性DNA文库。流式细胞技术是当代最先进的细胞定量分析技术之一。 该技术依托 流式细胞仪 。其主要部件为光源、流动室、荧光检测部件、分选器。 （1）光源。通常是激光光源，目的是提供足够的荧光激光能量。 （2）流动室。其为流式细胞仪中最重要的部分。目的是使细胞流稳定流动，依次通过固定的检测区。其间一道加入还有鞘液（sheath fluid），使样品微粒之间相互分离，基于 鞘流原理 ，使微粒恒定处于同轴流动的中心位置。流动室的设计运用 液体聚焦原理 ，把激光激发点放在液流聚焦点上，该处是液流直径最小处，通常为10-20μm，做到了单个细胞进入检测区。 （3）荧光检测部件。染色细胞通过激光束时会发出荧光，检测系统将接收的这些荧光转换成与其量大小成正比的电压脉冲信号，该脉冲称为 峰值脉冲 ，分析系统根据这些来自不同方向的信号把不同的细胞群加以区分。散射光是围绕细胞360°散发的，所以检测装置里一般有90°散色光检测器（SSC，侧向散射光）和前向散射光检测器（FSC，前向角度散射光）。由于侧向散射光强度较弱，因此光电转换器件选用增益较大的 光电倍增管 。一般来说，6°以内的前向散射光为小角度散射光，可反映细胞体积的大小。大于6°的前向散射为大角度散射光，可提供细胞内的信息，特别是分叶核的信息，细胞质粒存在与否会明显改变前向大角度散射光的强度。由于前向散射光的强度较强，因此用光电二极管作 光电转换器 。 （4）分选器。细胞的分选是通过分离含有单细胞的滴液实现的。通过特异性识别与给液滴加电（2kV～6kV），施加静电场，来实现分离。 过程细节：被激光照射的染色细胞会产生散射光和激发荧光。这两种光信号同时被光电二极管和光电倍增管接收后转换成电脉冲信号。无论是散射光或荧光信号，检测的目的都是要分析不同的粒子。分析的方法有两种，一是测量粒子通过激光束的最大电压（与荧光强度成正比），二是测量脉冲的面积。再经过A/D 转换器将脉冲信号变换成二进制数字信号由计算机处理。光信号基本上反映了细胞体积的大小，荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度。这种属分析型流式细胞仪。分选型则是则是将液滴充电后送入上面描述的分选器中进行分离，目的是为了将所需的细胞做进一步的培养、观察和实验。 染色体倍性不同的细胞，染料吸附于染色体的量迥异，激发的荧光强度限定于一定区间。因此可以对染色体倍性实施鉴定。 总而言之，流式细胞仪能够对细胞的性质进行系列分析，是细胞学研究的重要工具。 [1] 何克健.流式细胞技术与流式细胞仪[J].医疗装备,2000(05):6-8. [2] 罗庆,高建有,李洁维,叶开玉,莫权辉,蒋桥生,查满荣,王发明,刘世彪.利用流式细胞仪对51份猕猴桃种质染色体倍性的鉴定[J/OL].生物学杂志:1-8[2022-06-02]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1081.Q.20220321.1515.00

流式细胞仪（Flow cytometry ）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。

我简单说一下：x0dx0a1.首先，机器吸取细胞混悬液，射入由鞘液（一般都是磷酸盐缓冲液）。由于鞘液的流速大，所以细胞混悬液通过轴流的形式在中央，一般是单个细胞排队的形式。x0dx0ax0dx0a2.然后细胞通过检测窗口。有激光束照射。一般细胞都经过荧光染色，被激光照射后，会有不同波长的激发光产生。机器设有检测器来探测激发光的强弱x0dx0ax0dx0a3.根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果（比如抗原量，DNA量，等等）

1、取得完全无血液残留的肺脏：实验前将大鼠全身血液放净，取得完全无血液残留的肺脏。2、消化肺组织：常用于细胞消化的酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分离上皮细胞的酶，现在一般用损伤性小的弹性蛋白酶来替代胰蛋白酶。但这种酶却有活性不稳定，有效作用时间短暂，容易自我降解等问题。Dobbs L G等认为弹性蛋白酶能更有选择性的消化分离上皮细胞[9]。胰蛋白酶消化没有选择性，会带来像内皮细胞和间质细胞等一些不能在后面的分离步骤中去除的杂质细胞，因此弹性蛋白酶更有助于提高上皮细胞的纯度和产量。与此相反，Cunningham A C等发现，与弹性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以获得更大产量的Ⅱ型上皮细胞[10]。胶原酶可以用来辅助消化细胞间质。用几种酶混合的方法比单一酶消化效果更好，但目前还没有文献定量描述最优化的酶消化方法。Finkelstein J N等发现可以通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺组织剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的实验中也证实了通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。3、分离纯化细胞：上皮细胞的分离纯化技术经过二三十年的发展日渐成熟，呈现多样化的特点。目前对细胞的分离纯化主要有以下几种方法：(1)密度梯度离心：密度梯度离心分离细胞的原理是不同细胞的沉降系数不同，在密度梯度离心中细胞所处的位置也相应不同。这是最早用于分离Ⅱ型上皮细胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不连续梯度离心，猪肺泡Ⅱ型细胞最终纯度可以达到70%-85%左右[11-12]。沉降系数与细胞的直径和天然密度有关。由于Ⅱ型细胞与其他细胞存在密度和大小的交叉(如巨噬细胞)，仅仅通过离心并不能有效去除杂细胞。Kikkawa(1974)让巨噬细胞吞噬一些重颗粒(如硫酸钡)，改变其密度，可以帮助区分巨噬细胞和上皮细胞。离心后的纯度达到94%,但产量明显减少[8]。上皮细胞的大小和密度变化范围较大，用密度梯度离心要丢掉和其他细胞重叠的细胞层，这必然会造成某些密度大的Ⅱ型细胞损失，产量大大降低。(2)滤膜分离：滤膜分离的原理是根据细胞的大小不同来进行分离。Ⅱ型上皮细胞约10μm，比巨噬细胞(约25μm)和Ⅰ型细胞(50μm-100μm)小，用150μm孔径的滤膜初滤除去大的组织碎片，30 μm ～40 μm孔径的滤膜除去全部Ⅱ型细胞和部分巨噬细胞[13]，采用15μm的滤膜精滤。用滤膜分离操作简单，它和其他分离方法联合使用可以提高纯度。(3)流式细胞技术：流式细胞技术分离的原理是根据不同细胞之间的荧光差异。根据不同种细胞的特征识别，用荧光物质标记筛选。上皮细胞内含有丰富的脂类物质，用亲脂性荧光素标记，可以得到纯度很高的细胞。Funkhouser J D等用抗Ⅱ型上皮细胞的单抗进行免疫荧光标记，再用流式细胞仪进行筛选，得到96%的Ⅱ型上皮细胞[14]。但荧光素对被标记细胞有害。Rochat T R等发现自然荧光和直角光散射可以区分巨噬细胞和单核细胞，这给不经荧光标记分离上皮细胞提供了可能[15]。流式技术分离细胞的产量很低，但纯度极高。这种技术经过完善在将来会更有吸引力。(4)免疫黏附：免疫黏附的原理是各种细胞的膜表面有不同的免疫活性物质。巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞表面都有IgG上的Fc片段的受体。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把细胞悬液置于板上，巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞因为含有Fc片段的受体而与IgG结合，吸附到板上，不黏附的Ⅱ型细胞被冲洗下来[16]。经过多年的摸索，这种方法近几年已开始应用，简便易行，可除去绝大多数的巨噬细胞，有效的提高上皮细胞的纯度。(5)贴壁选择：贴壁选择的原理是各种细胞完成贴壁的时间不同，这种特性用在培养时做筛选。根据最终目的，综合其中几种方法能达到较好的效果。例如先用滤膜过滤，再用IgG包被法。

1、取得完全无血液残留的肺脏：实验前将大鼠全身血液放净，取得完全无血液残留的肺脏。2、消化肺组织：常用于细胞消化的酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分离上皮细胞的酶，现在一般用损伤性小的弹性蛋白酶来替代胰蛋白酶。但这种酶却有活性不稳定，有效作用时间短暂，容易自我降解等问题。Dobbs L G等认为弹性蛋白酶能更有选择性的消化分离上皮细胞[9]。胰蛋白酶消化没有选择性，会带来像内皮细胞和间质细胞等一些不能在后面的分离步骤中去除的杂质细胞，因此弹性蛋白酶更有助于提高上皮细胞的纯度和产量。与此相反，Cunningham A C等发现，与弹性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以获得更大产量的Ⅱ型上皮细胞[10]。胶原酶可以用来辅助消化细胞间质。用几种酶混合的方法比单一酶消化效果更好，但目前还没有文献定量描述最优化的酶消化方法。Finkelstein J N等发现可以通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺组织剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的实验中也证实了通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。3、分离纯化细胞：上皮细胞的分离纯化技术经过二三十年的发展日渐成熟，呈现多样化的特点。目前对细胞的分离纯化主要有以下几种方法：(1)密度梯度离心：密度梯度离心分离细胞的原理是不同细胞的沉降系数不同，在密度梯度离心中细胞所处的位置也相应不同。这是最早用于分离Ⅱ型上皮细胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不连续梯度离心，猪肺泡Ⅱ型细胞最终纯度可以达到70%-85%左右[11-12]。沉降系数与细胞的直径和天然密度有关。由于Ⅱ型细胞与其他细胞存在密度和大小的交叉(如巨噬细胞)，仅仅通过离心并不能有效去除杂细胞。Kikkawa(1974)让巨噬细胞吞噬一些重颗粒(如硫酸钡)，改变其密度，可以帮助区分巨噬细胞和上皮细胞。离心后的纯度达到94%,但产量明显减少[8]。上皮细胞的大小和密度变化范围较大，用密度梯度离心要丢掉和其他细胞重叠的细胞层，这必然会造成某些密度大的Ⅱ型细胞损失，产量大大降低。(2)滤膜分离：滤膜分离的原理是根据细胞的大小不同来进行分离。Ⅱ型上皮细胞约10μm，比巨噬细胞(约25μm)和Ⅰ型细胞(50μm-100μm)小，用150μm孔径的滤膜初滤除去大的组织碎片，30 μm ～40 μm孔径的滤膜除去全部Ⅱ型细胞和部分巨噬细胞[13]，采用15μm的滤膜精滤。用滤膜分离操作简单，它和其他分离方法联合使用可以提高纯度。(3)流式细胞技术：流式细胞技术分离的原理是根据不同细胞之间的荧光差异。根据不同种细胞的特征识别，用荧光物质标记筛选。上皮细胞内含有丰富的脂类物质，用亲脂性荧光素标记，可以得到纯度很高的细胞。Funkhouser J D等用抗Ⅱ型上皮细胞的单抗进行免疫荧光标记，再用流式细胞仪进行筛选，得到96%的Ⅱ型上皮细胞[14]。但荧光素对被标记细胞有害。Rochat T R等发现自然荧光和直角光散射可以区分巨噬细胞和单核细胞，这给不经荧光标记分离上皮细胞提供了可能[15]。流式技术分离细胞的产量很低，但纯度极高。这种技术经过完善在将来会更有吸引力。(4)免疫黏附：免疫黏附的原理是各种细胞的膜表面有不同的免疫活性物质。巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞表面都有IgG上的Fc片段的受体。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把细胞悬液置于板上，巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞因为含有Fc片段的受体而与IgG结合，吸附到板上，不黏附的Ⅱ型细胞被冲洗下来[16]。经过多年的摸索，这种方法近几年已开始应用，简便易行，可除去绝大多数的巨噬细胞，有效的提高上皮细胞的纯度。(5)贴壁选择：贴壁选择的原理是各种细胞完成贴壁的时间不同，这种特性用在培养时做筛选。根据最终目的，综合其中几种方法能达到较好的效果。例如先用滤膜过滤，再用IgG包被法

其实这个检查的临床意义不大。不能说明什么问题，也不能指导治疗。CD3 是总T淋巴细胞的标志。T的百分率正常。CD4是Th（也就是辅助细胞的标志），问题是这个细胞还分两群，Th1和Th2，功能是不同的，要看免疫力，这个分类都没做，太不像话CD8 也不是抑制性T细胞，而是细胞毒T细胞，功能是杀伤病毒感染和其他异常的细胞，你孩子反复呼吸道感染，这个增高也很符合。B细胞室负责产生抗体的，你B细胞数目正常，但是没有测Ig的水平。如果抗体的水平比较低，这也可能是为啥会反复感染的原因。病毒在感染细胞前，健康的人都会有抗体将病毒中和清除，抗体低的话，那就容易感染了。还有呼吸道的反复感染，不一定是免疫力低导致的，空气污染也是罪魁祸首之一。这个和免疫力就无关了。

这个是可以的，但必须是抗凝的。就算是新鲜血液，抗凝后保存于4度冰箱过夜后也可以检测

当然能导出了。有几个方法。如果你用的是BD的Diva软件，在记录所有数据后。在Experiment栏目上点右键，会有一个batchanalysis的选项。点击后，会有几个结果输出选项，包括PDF打印。统计数据输出等等。你可以根据需要选择，并指定文件路径。就可以得到数据了。

最常见的是分析CD4， CD8亚群。先在FSC， SSC散点图上划出淋巴细胞gate。然后在此gate基础上选取T细胞标志染色阳性的细胞群（一般是CD3）。在把CD34阳性的细胞根据CD4 和CD8染色情况形式为散点图，得到CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, 以及双阳性的比率。如果还有其他细胞标志的染色，再进一步分析。

检测CD4和CD8，应该还要同时染色CD3. 先选中CD3阳性的细胞（T细胞），然后把T细胞在CD4/CD8的散点图上再显示，可以分为四个象限。分别代表CD4阳性，CD8阳性，双阳性，和无染色的。正常情况下，是不应该有双阳性和未染色的，也就是说你的细胞应该只显示在4个象限的其中的两个。其他的两个最多只是一些背景的杂信号。代表T细胞的两个亚群。

基因组大小（sizeofgenome）是指单倍体细胞核中的所含的DNA的总量。在可以进行基因组测序之前，生物学家是用质量来衡量不同生物之间基因组的大小。通常使用的单位为pg（10e-12），这个值简称为C-value。通过简单的换算就可以知道大概的碱基的数量。不过，对于已经测序的基因组，直接数数就可以了，如vihole所述。不过对于目前测序的基因组还是很少，估计在1千左右，而现存物种按照最保守的估计也有200万种（Ref1），因此C-value在估计基因含量和生物复杂度方面还是有非常大的应用潜力。关于动物的基因组含量可以在Animalgenomesize网站查到：Ref1：/releases/2003/05/030526103731.htm