载体与片段的摩尔比例如何计算

噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒，同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。噬菌粒具有以下令人瞩目的特征：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。

噬菌粒(phagemid)实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体,是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体,具有 ColE1 复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒,以及丝状体噬菌体的间隔区。 噬菌体颗粒就是噬菌体

没有与宿主细胞的染色体整合。噬菌粒（phagemid）是带有丝状噬菌体复制起始点的质粒。展示筛出来的质粒表达不出来是没有与宿主细胞的染色体整合还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。

【答案】：M13噬菌体载体是基于大肠杆菌M13丝状噬菌体基因组构建的载体，在M13噬菌体基因组基因间隔区中插入β-半乳糖苷酶N端一小段编码序列(内插入若干限制性内切酶的单一切点)及其调控序列。M13载体一般只能克隆300～400bp的外源DNA片段，常用于制备单链DNA探针、定位诱变模板，也可用于噬菌体展示。噬菌质粒是噬菌体M13的基因间隔区(内含有M13的复制起点)插入到细菌质粒载体中构建而成的质粒。噬菌粒在大肠杆菌细胞内以质粒的复制起点进行复制，产生双链DNA。当含噬菌粒的大肠杆菌被辅助噬菌体感染后，在辅助噬菌体基因产物作用下，噬菌粒基因间隔区特定位点被切开，然后以M13的复制起点进行复制，产生单链DNA，并利用辅助噬菌体提供的装配蛋白和外壳蛋白装配成重组噬菌体颗粒，释放至胞外。噬菌质粒载体本身分子小，约为3kb，便于分离和操作；可克隆10kb的外源DNA片段，克隆能力强于M13噬菌体载体。

虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区，能够合成单链DNA，但是它没有M13的功能基因，没有M13基因2的产物存在，所以不能合成单链DNA。而辅助噬菌体具有M13的所有功能基因，但是IG区是缺陷的，辅助噬菌体本身的DNA不能进行单链复制，于是就可以为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白。辅助噬菌体必需具备如下条件：(1)助噬菌体的DNA IG区必需失去功能，其本身的DNA不会被包装到成熟的噬菌体颗粒中；（2）由于辅助噬菌体的IG区失活，其本身的基因不能表达，要使辅助噬菌体的所有功能基因都能进行表达，必须在辅助噬菌体的基因组中导人新的复制起点；(3)辅助噬菌体的基因组中具有选择标记，便于识别和收集一定数量的辅助噬菌体。

在基因工程中最常用的载体是质粒，此外还有噬菌体、动植物病毒等。

载体连接体系是指将不同载体上的基因进行组合，以实现功能的编程。它是合成生物学和纳米技术领域的重要研究方向之一。在设计载体连接体系时，载体与片段的最佳比例应根据具体的应用需求来确定。这是因为不同的应用场景需要不同的载体和片段，不同的载体和片段也会对连接的比例产生不同的影响。举例来说，如果要构建一种病毒治疗系统，可以选择载体为病毒，将治疗相关的片段连接在其基因组中。在这种情况下，病毒的DNA/RNA构成了大部分载体体积，而治疗相关的片段则只需要占载体基因组的一小部分，因此载体与片段的比例应该是载体占多数，片段占少数。另一方面，如果要实现一种基因编辑系统，可以选择载体为质粒，将编码CRISPR-Cas9系统的片段连接在其上。在这种情况下，CRISPR-Cas9相关片段是实现基因编辑的关键，占据了载体基因组的大部分，因此载体与片段的比例应该是片段占多数，载体占少数。

有用。虱螨一喷净特性：本品为菊科植物除虫菊干燥花絮的有效成分提炼而成的天然产品，本品品质温和，可有效杀灭体外成虫、幼虫及虫卵，所以有用。虱螨目是最初的虱螨目和噬菌粒目，通常被称为虱螨或虱子。

载体:1、科学技术上指某些能传递能量或运载其他物质的物质。如工业上用来传递热能的介质，为增加催化剂有效表面，使催化剂附着的浮石、硅胶等都是载体。2、泛指能够承载其他事物的事物。如语言文字是信息的载体。BOY,对于你单指化学中的载体,我想应该是单纯地指待存在催化剂的反应条件以及反应场所吧(主要还是指反应场所吧).虽然化学催化剂效率远不及生物中的酶,但有异曲同工的性质,酶的活性和温度,湿度,空间等等等各种因素有关. 另外,主要还是生物中的载体比较广泛哈,在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。 　　运载体　　在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。　　作为运载体必须具有四个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③ 含有复制起始位点，能够独立复制；④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。中学阶段的主要要了解和掌握的载体就是质粒载体，噬菌体载体以及病毒,其他的都不需要了解哈~~BOY

材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞及菌株 HAb18为分泌抗人肝癌mAb的鼠杂交瘤细胞株，由陈志南建株〔4〕；正常肝细胞株QZG引自中国科学院上海细胞库。pCANTAB 5E克隆及表达载体，为Pharmacia公司产品。1.1.2 试剂 反转录系统为Promega公司产品；PCR引物： heavy chain primer 1和2(Pharmacia公司产品)，分别为重链5′端和3′端引物；light chain primer mix： 为10种轻链5′端和3′端引物的混合物，用来扩增鼠Ig VL基因；linker primer mix，为带有Linker序列(Gly4Ser)3的重链3′端和轻链5′端的引物，用来将VH，VL拼接成ScFv基因；RS primer mix，为带有SfiI位点的重链5′端引物和带有NotI位点的轻链3′端引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段并引入酶切位点。引物A，D分别为重链5′端引物(含EcoRI酶切位点)及轻链3′端引物(含SalI酶切位点)〔5〕。A，D引物的序列如下:引物A VH-1（正向）:5′ GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG 3′EcoRⅠ引物D VL-2（反向）:5′ CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC 3′SalⅠ1.2 方法1.2.1 总RNA提取、cDNA第1链合成及VH和VL基因的扩增 取对数生长期的HAb18细胞，用异硫氰酸胍变性法，提取细胞总RNA。参照Promega公司反转录系统的产品说明书，反转录合成cDNA第1链。将cDNA第1链合成反应物分为两份，分别加入VH和VL引物各2 μl进行PCR。1.2.2 ScFv基因的组装 回收的VH和VL基因片段与linker primer mix等摩尔混合，加入dNTP至终浓度为2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶5u，进行7次PCR循环(94℃ 1 min，63℃ 4 min)。将VH和VL基因拼接为ScFv基因。在上述反应体系中，加入RS primer mix，再进行30次PCR循环，可在ScFv基因的两端分别加入SfiI和NotI酶切位点。1.2.3 ScFv基因的克隆和筛选 上述加端PCR产物经1.8% 琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收后，用SfiI和NotI消化，并与以此两种酶双酶切的pCANTAB 5E噬菌粒DNA连接，转化E.coli HB2151，在SOBAG（含100 mg/L氨苄青霉素和2%葡萄糖的SOB培养基）琼脂板上筛选转化菌。从转化板上挑取单个菌落，用2×YTAG（含100 mg/L氨苄青霉素和2% 葡萄糖的2×YT培养液）于30℃培养过夜，以碱裂解法小量提取噬菌粒DNA，以引物A，D进行PCR扩增出ScFv基因片段，并克隆入pUC19载体。1.2.4 ScFv核苷酸序列的测定 以美国PE317-A型自动序列分析仪进行序列测定。1.2.5 可溶性ScFv基因的分泌型表达 将含ScFv基因的重组噬菌粒菌种接种于5 ml LB 培养基，过夜培养。加至50 ml SBAG(含100 mg/L氨苄青霉素和2%葡萄糖的SB培养液)中，30℃振荡培养1 h，5 000 r/min离心15 min，弃上清。将沉淀重悬于50 ml SBAI(含100 mg/L氨苄青霉素和1 mmol/L IPTG的SB培养液)中，37℃诱导3 h，离心同上。取沉淀悬于5 ml新配制的溶菌酶（1 g/L），20% (w/v)蔗糖，30 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)及 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液中，冰浴10 min，4℃以12000r/min离心5 min，上清即为外周质部分。将其冷冻干燥后，贮于-20℃。临用时以0.01 mol/L PBS溶解至500 μl。1.2.6 ScFv基因可溶性表达产物的鉴定 采用SDS-PAGE及Western blot(二抗为鼠抗-E-tag抗体)进行鉴定。1.2.8 流式细胞仪分析ScFv的活性 收集培养的肝癌细胞SMMC 7721，正常肝细胞QZG及胃癌细胞SCG 7901，用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度至5×106/L~1×107/L。每管加入40 μl细胞悬液，100 μl ScFv表达产物，再加入50 μl 1∶20灭活正常兔血清（用DPBS稀释），于4℃作用30 min，洗涤2次，以800 r/min离心5 min，弃上清。加入抗E-tag抗体8 μl(2.5 g/L)，4℃作用30 min，洗涤2次，弃上清。加入50 μl FITC标记的羊抗鼠抗体，充分振摇，4℃作用30 min，洗涤2次，加入500 μl固定液，以流式细胞仪进行分析。同时设正常肝细胞、胃癌细胞为阴性对照组，肝癌细胞加亲本抗体Hab18为阳性对照组。2 结 果2.1 VH和VL基因的PCR扩增及ScFv基因的拼接 VH和VL基因测序结果显示，VH为363 bp，VL为342 bp，与预期的VH和VL基因片段大小相符。将VH和VL基因用linker连接成ScFv基因（其中linker为45 bp）。以此为模板加入RS primer mix进行PCR扩增，所获扩增产物的大小约为730 bp，表明VH，VL及linker primer mix的浓度配合准确，并引入了SfiI和NotI酶切位点（图1，见第Ⅳ页）。2.2 ScFv基因的克隆 将ScFv基因克隆入pCANTAB 5E中，连接物转化E.Coli HB2151。在SOBAG固体培养基上筛选转化的菌落。然后随机挑选8个菌落，小量制备噬菌粒DNA，以Sfi I 和NotI双酶切鉴定。若含有外源插段者，应切出约730 bp大小的片段。结果表明，8个克隆均含插段。2.3 ScFv基因的序列测定 如图2所示，ScFv基因全长为726 bp，包括预期的VH，VL基因和linker序列。VH基因序列处于linker的上游，VL基因序列处于linker的下游。2.4 可溶性ScFv蛋白的鉴定 可溶性ScFv-E-tag融合蛋白，预期的Mr为29 000。E-tag可作为蛋白标签，通过鼠抗E-tag抗体来检测ScFv基因的表达。将阳性克隆以1 mmol/L IPTG诱导3 h，对IPTG诱导和未诱导的菌体进行裂解，经SDS-PAGE后，在(Mr为29 000处多出1条明显的新生蛋白带，与预计的ScFv-E-tag融合蛋白的大小Mr为29 000)相符（图3，见第Ⅳ页）。同时做与图3相同的SDS-PAGE并进行Western blot，在Mr为29 000处有显色条带，即为能与抗E-tag抗体特异性结合的可溶性ScFv蛋白（图4，见第Ⅳ页）。2.5 可溶性ScFv蛋白与肝癌细胞的结合活性 以可溶性 ScFv蛋白为一抗，抗E-tag抗体为二抗，FITC-抗鼠IgG为三抗，用流式细胞仪测定荧光标记细胞的阳性率(图5，见第Ⅳ页)。肝癌细胞组： 无关抗体(抗-CD3)为1.6%，亲本抗体为97.5%，ScFv 为30.9%；正常肝细胞+ScFv蛋白为2.6%，胃癌细胞+ScFv蛋白 为4.1%。表明可溶性ScFv蛋白能与肝癌细胞特异地结合，而不与正常肝细胞和胃癌细胞结合。荧光显微镜观察，可溶性ScFv蛋白与肝癌细胞的膜抗原相结合，在细胞膜上可见颗粒状的荧光(结果未显示)。3 讨 论 随着Ig基因结构与功能研究的不断深入，基因工程新技术的不断涌现和成熟，基因工程抗体的研究取得了很大进展。现获得的各种基因工程抗体已基本克服了鼠源性mAb的缺点，及制备人源性抗体的困难，使之在基础医学研究和临床疾病的诊断、治疗和预防等领域，特别是肿瘤的治疗中，得到了极为广泛地应用，有的已进入Ⅲ期临床应用。运用基因工程重组技术，将鼠源性抗体恒定区和可变区的框架区以人源性相应抗体片段取代，可降低抗体的免疫原性，有效地减轻免疫排斥反应〔6〕。利用基因突变技术改变抗体的某些结构，则可提高抗体的亲和力，延长其半衰期〔7〕。另外，还可将抗体基因与其它功能性基因相连接，赋予抗体新的功能。 近年发展起来的抗体库克隆技术，可无需进行细胞融合制备杂交瘤，甚至无需进行免疫，即可直接从基因水平上，获得所需的针对相应抗原的抗体。制备基因工程抗体的关键，是获得抗体可变区基因，拼接成单链抗体基因，并表达出有生物学活性的产物。 本文从分泌抗肝癌mAb的杂交瘤细胞(HAb18)中，用RT-PCR，克隆出抗体可变区基因，其关键是PCR引物的设计。大多数研究者设计合成的引物，通常是针对V区FR1 5′端（或信号肽）的保守序列和J基因3′端序列（或恒定区基因序列）而设计的，特异性不够强，不能有效地扩增某些目的基因。Pharmacia公司噬菌体呈现系统中的混合引物，系针对鼠Ig基因不同家族的序列而设计的。从理论上讲，适用于所有类型的Ig，每种可变区基因都可获得扩增，对全套抗体库的构建非常重要。 本研究所用pCANTAB 5E是Pharmacia公司的产品，含有氨苄青霉素抗性基因，plac启动子和M13噬菌体基因间隔区片段，在多克隆位点与gⅢ编码区之间，有1个c-myc tag序列和琥珀终止码TAG，IPTG可诱导外源基因的表达。在不含有琥珀抑制基因的菌株（如HB2151）中，E-tag后的终止码被识别，多肽链的翻译终止于此，从而可生成具有生物学活性带有13肽E-tag的可溶性ScFv蛋白，释放于细菌周质中。E-tag为源于人c-myc基因的一段序列，对ScFv基因的结构和活性均无影响，可作为可溶性ScFv蛋白的标签，用抗E-tag抗体来检测ScFv基因的表达并纯化其产物。我们用含有ScFv基因的重组噬菌粒载体转化大肠杆菌HB2151，经IPTG诱导获得可溶性表达产物。用抗E-tag抗体做Western blot证实，表达产物为ScFv-E-tag融合蛋白。流式细胞仪分析表明，此ScFv融合蛋白可与肝癌细胞结合，荧光标记细胞的阳性率为30.9%，而不与正常肝细胞及胃癌细胞相结合，表明此ScFv蛋白具有肝癌结合的特异性。参考文献1 顾方舟，陈妙兰，陆如山等. 肝癌研究概况与展望. 北京： 中国协和医科大学，北京医科大学联合出版社，1993: 1-32 Hoston JS，Levinson D，Mudgett HM et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in E.coli. Proc Natl Acad Sci USA，1988；85: 5879-58833 Kroesen BJ，Wellenberg GJ，Bakker A et al. The role of apoptosis in bispecific antibody-mediated T cell cytotoxicity. Br J Cancer，1996 ；73(6): 721-7274 陈志南，刘彦仿，杨继震等. 抗人肝细胞癌单克隆抗体的产生及其相应抗原的免疫组化定位研究. 单克隆抗体通讯，1989；5(2)： 33-365 杨安钢，吉昌华，韩 骅等. 抗人CD8单抗κ轻链可变区基因的克隆和序列测定. 生物化学与生物物理进展，1992；19（4）： 286-2886 Man SC，Jeanne BK，Bednarik EJ. Humanized anti-Lewis Y antibodies: in vitro properties and pharmacokinetics in rhesus monkeys. Cancer Research，1996；56: 1118-11257 Mats O，Henrik O，Michael M et al. Light chain shuffling of a high affinity antibody results in a drift in epitope recognition. Mol Immunol，1996；33(1): 47-56(收稿 1998-03-03 修回 1998-03-26)

构建基因组文库的步骤A 分离基因组DNA；B 用超声波或限制酶等进行基因组DNA部分或完全降解；C 将降解物进行分级得到所需大小DNA片段；D 将DNA片段与载体连接(一般用λ噬菌体载体)；E 将重组体导入宿主细胞；F 最后筛选鉴定重组子克隆。建立基因组文库的方法2—λ噬菌体基因组文库 可插入较大片段，最大可达23kb建立基因组文库的其他方法：cosmid基因组文库 YAC基因组文库 BAC基因组文库基因文库的质量标准：重组克隆的总数不宜过大， 以减轻筛选工作的压力；载体的装载量最好大于基因的长度， 避免基因被分隔克隆；克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域, 以利克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下,重组克隆能稳定保存、扩增、筛选建立cDNA文库的基本步骤 (1)隔离总RNA和净化mRNA (2)合成的双链互补脱氧核糖核酸适合插入一个克隆载体(3)克隆cDNA合适的向量(4)转移到合适的宿主细胞的重组载体(5)筛查阳性克隆cDNA克隆的策略(1)自身引导的第二链合成+同聚物加尾（2）cDNA克隆方法的改进。尾随第一链寡核苷酸（DC）允许使用寡核苷酸引物（ DG）将要开展的第二链（3）cDNA的定向克隆从基因文库中筛选分离目的基因克隆(1)制备核酸探针进行杂交筛选(2) 制备抗体进行免疫杂交筛选(3)根据生物大分子间的相互作用筛选目的基因(4)利用PCR技术筛选目的基因文库(5)利用噬菌体表面展示技术分离目的cDNA克隆：噬菌体展示(phage display)：是在噬菌体表面表达已融合到噬菌体外壳蛋白的重组蛋白或多肽的技术。应用噬菌体展示技术的关键是构建表达性基因文库，这种文库称为噬菌体展示文库(phage display library )。常用的构建噬菌体显示文库的表达载体有两类：丝状噬菌体和以这些噬菌体复制起始序列为基础构建的噬菌粒(phagemid)。mRNA差别显示技术原理：在 mRNA3′端的 poly (A)5"上游的 2个碱基只有 1 2种组合。与此相对应，共可人工合成12种不同的下游引物，用以反转录mRNA 合成cDNA第一条链。这种引物通常称为3"端锚定引物，它由Oligo-d T后面接上两个碱基 (如 5′T1 1 - 1 2 MN3′, M=G、C或 A; N=A、G、C或 T)构成。这样，每一种此类人工合成的寡核苷酸引物，都将能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。由此可知，使用5′T1 1 - 1 2 MN3′引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的但序列结构不同的12份亚群体。DDRT-PCR的主要步骤：Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3"锚定引物作为反转录的引物，合成第一链cDNA；Ⅱ.用5"随机引物和某个3"端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)；Ⅲ.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；Ⅳ.回收特异性差别条带；Ⅴ.用同一引物对扩增已回收的DNA条带；Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；Ⅶ.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。 DNA插入诱变法分离目的基因DNA插入诱变法主要用于植物目的基因的克隆分离研究。其基本原理是，当一段特定的DNA序列插入到植物基因的内部或其邻近位置时，一般会诱导该基因发生突变形成突变体植株，或者在插入位置产生一个新的基因。 如果该DNA插入序列是已知的，便可用它作为DNA分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选得到突变基因片段。然后利用此突变基因片段制备探针，从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。这样，插入的DNA序列相当于在植物基因上贴了一张标签，因此，DNA插入诱变法又叫DNA标签法(DNA tagging)。差别杂交和减法杂交技术分离目的基因差别杂交构建了基因文库后，如没有任何可供选择的探针进行筛选，或没有任何有关目的基因的核苷酸序列信息时，可以考虑用差别杂交法筛选目的基因片段。差别杂交(Differential hybridization)也称为差别筛选(Differential screening)法。特别适用于分离在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调控的基因，亦可有效地用来分离经特殊处理诱导表达的基因。差别杂交的技术原理：有目的基因能正常表达和不能表达的两个不同的细胞群体。在这种情况下，分别制备两种不同细胞群体的mRNA提取物，其中一个群体含有一定比例的目的基因mRNA ，另一个群体不含有目的基因mRNA。差别杂交的技术原理过程：以这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目的基因表达的mRNA群体为探针时，所有包含重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点;而以目的基因不表达的mRNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，变可以挑选出含有目的基因的菌落，供进一步研究用。差别杂交法的局限性：首先，差别杂交的灵敏度比较低，不适合低丰度mRNA的目的基因的分离。其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑，是一项十分耗时耗力的工作；第三，差别杂交重复性差。差别杂交涉及文库的滤膜影印，不同滤膜之间的DNA保有量往往不均一，杂交所得的信号强度也会不一致，需要重新进行点杂交，以做进一步的阳性克隆鉴定工作 。mRNA减法杂交基本原理：从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录成为cDNA，然后与无目的基因表达的组织中提取的mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成程cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍然保持单链状态，这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。基因突变技术分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又分两种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变(oligonucleotide-mediated mutagenesis)；第二类是利用PCR,以双链DNA为模板所进行的基因突变。寡核苷酸介导的定点诱变的原理 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子链的组成部分。因此，所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列。要求所设计的寡核苷酸引物除了所需的突变位点之外，与目的基因编码的区段完全互补。作为诱变剂的寡核苷酸序列，同待诱变的目的基因的互补序列之间，能形成一种稳定的唯一的双链结构。决定双链区段稳定性的主要因素是碱基的组分、核苷酸的错配以及寡核苷酸引物的长度等。寡核苷酸介导的定点诱变的基本步骤(a)将要进行突变的目标基因(或DNA片段)克隆于M13噬菌体载体或噬菌粒载体。(b)从重组的M13或噬菌粒中制备单链DNA。(c)将设计好的寡核苷酸突变引物的5"端用T4多核苷酸激酶进行磷酸化。(d)将上述突变引物与目标基因(单链的DNA模板)进行退火。(e)在存在DNA聚合酶和dNTP的情况下，使退火引物沿单链DNA模板延伸，然后新生链的末端用T4 DNA连接酶连接。(f)转染易感细菌。(g)筛选出带有突变的目标基因的噬菌斑。(h)从突变的重组噬菌体制备单链DNA，通过DNA序列分析确认突变位点的正确性。(i)从重组的M13噬菌体复制型双链DNA中回收突变的目标基因(DNA片段)。(j)将突变了的基因(DNA片段)重组入表达载体进行表达。第五章受体细胞应具备的条件(1)便于重组DNA分子的导入。如易形成感受态，具有较高的转化效率；(2) 能使重组体DNA分子稳定存在于细胞中。如限制性缺陷型； (3) 便于重组体的筛选。如具有与重组体互补的遗传性状； (4) 受体细胞遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长，能进行高密度培养；对动物细胞要可悬浮培养，对培养基适应性要好；(5)安全性高，无治病性，不会对外界环境造成生物污染：感染与寄生缺陷型；(6)蛋白水解酶少,利于外源蛋白在细胞内的积累。尤其是对枯草芽孢杆菌。(7) 受体细胞的密码子偏倚性要小；(8) 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 ▲糖蛋白不能在E.coli中表达；(9) 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值；(10)对于用于基因扩增或基因高效表达的受体要用重组整合缺陷型。第六章克隆基因高表达的相关因素1有效转录开始 关键的一步，并限制外源基因表达的一步！构建表达载体的同时，选择强的和可控制的启动子和相关终止序列。2有效延长和终止转录正确 3 mRNA的稳定性4有效地转录开始5遗传密码子偏向6核糖核酸处理过程7终止密码子8表达载体9重组蛋白Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA）；正调节因子 CAP；负调节因子 lac I Tac 表达系统 tac启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂合启动子。 调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平高于 trp 和 lacUV5启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。包涵体蛋白在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起，形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体(inclusion body, inclusive body)。包涵体主要由蛋白质组成，并且大部分为外源基因的表达产物，它们具有正确的氨基酸序列，但构像却是错误的，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。包涵体形成的原因主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。此外，还有以下原因：(1)表达量过高。(2) 重组蛋白的氨基酸组成(3)重组蛋白所处的环境：温度、pH(4)缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类(5)培养条件不佳酵母基因表达载体的种类 自主复制型质粒载体:含酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和克隆位点等关键元件。较高拷贝数，细胞分裂时不能平均分配到子细胞中。 整合型质粒载体:不含酵母基因组的DNA复制起始区，但含有整合介导区。 着丝粒型质粒载体:在自主复制型质粒载体基础上构建而成，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件，可保证平均分配到子细胞中。1-2拷贝/细胞。 酵母人工染色体:以线性双链DNA形式存在于酵母细胞，每个细胞只有单拷贝。

1、概念不同质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子。载体：某些能传递能量或运载其他物质的物质。2、存在不同质粒广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。载体只作为两个物质之间沟通的桥梁。扩展资料：分类1、根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。2、根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。3、根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。参考资料：百度百科-质粒百度百科-载体

那得看是什么的载体膜上用于主动运输的载体全是蛋白质。但是在基因工程上基因的运载体却可以是质粒（一种环状DNA），病毒也可作基因的运载体所以载体不都是蛋白质；如果你指膜上的载体，那就全是蛋白质。

根据信息载体不同分为：芯片卡，磁条卡。载体（Vector） ，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。在实际生活中，胰岛素就可以通过使用载体将已插入胰岛素基因片段的质粒放入大肠杆菌内。经过插入基因片段的质粒就称作载体。该质粒在细菌内可以进行自我复制，并且不会影响到生物原来的活动。载体按功能可分为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段。主要有质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，如启动子和终止子。为了实现外源基因在不同表达载体中进行复制和表达，基因工程操作中常使用穿梭载体( shuttle vector)。穿梭载体含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的细胞中复制，如既能在原核生物中复制也能在真核生物中复制的载体，不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列( ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。

（1）． 质粒文库 质粒是最早用于基因克隆的载体。现已有各种适用于不同工作的如克隆、表达、测序等专用商品质粒。但在构建基因文库上，由于质粒相对较小并只能容纳比自身更小的片段，因此它不能用于构建核基因组文库，通常只用来构建短序列的克隆文库。例如叶绿体DNA分子较小，可以用质粒构建叶绿体DNA文库。质粒载体可用于生物cDNA文库构建。但只适合于高丰度的mRNA。（2）． 噬菌体文库 目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体很多，如单链的M13噬菌体载体、λ噬菌体载体、P1噬菌体载体、噬菌粒(phagemid或phasmid)等。其中使用最多的是入噬菌体。 λ-DNA为双链结构，长49kb。线性分子两端各有一条12个核苷酸的黏性末端称cos位点。分子中有约15kb可去掉的非必要基因区，又称“填充区”， “填充区”两侧的序列含有其增殖所必需的全部基因，称为左、右臂。“填充区”可被外源DNA取代，构成重组体，这是它成为克隆载体的结构基础。由于噬菌体头部包装容量的限制，重组λ-DNA分子大小只能在39—52kb之间。（3）． 黏粒文库 黏粒(cosmid)也称柯斯质粒，是人工构建的由λ噬菌体的COS序列、质粒的复制子序列及抗生素抗性基因序列组合而成的一类特殊的质粒载体。COS序列是DNA包装进噬菌体颗粒所必须的。复制子通常是使用ColEl或pMBl的复制起始位点。黏粒具有λ噬菌体的某些性质，在克隆了大小合适的外源DNA片段并且在体外被包装成噬菌体颗粒后，能高效转导对入噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞。在宿主细胞内按λ噬菌体方式环化，但不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒(因分子中不具入噬菌体全部必要基因)。它也具有质粒载体的主要性质，在宿主细胞内可以像其他质粒一样复制，并与松弛型质粒相同，适量的氯霉素可促进扩增。因具抗生素基因，可以通过抗生素抗性筛选重组子。黏粒载体在构建时也加上了设在插入失活基因内的多克隆位点。黏粒载体的分子较小(2．8—24kb)，但克隆容量很高，对外源DNA长度的要求是30～45 kb，上限几乎是入噬菌体载体容量(23 kb)的2倍，所以黏粒载体在核基因组文库构建上具有相当的优势，可克隆包括3，和5"调控区在内的完整的植物基因。（4）．人工染色体文库 人工染色体载体是利用真核生物染色体或原核生物基因组的功能元件构建的能克隆大于50kbDNA片段的人工载体。其中有的载体既可用于克隆，又能直接转化，是进行基因功能研究的良好载体。近年来陆续发展起来的人工染色体文库有YAC库、BAC库、BIBAC库、PAC库及TAC库。

Aactivation domain 活化结构域adapters 连接物adenine 腺嘌呤adenosine 腺ADP (adenosine diphosphate) 腺二磷酸affinity column 亲和柱AFLP (amplified fragment length polymorphisms) 增值性断片长度多态现象agrobacterium 农杆菌属alanine 丙氨酸allele 等位基因amber mutation 琥珀型突变AMP (adenosine monophosphate) 腺一磷酸ampicillin 氨?青霉素anchor primer 锚状引物annealing 退火annealing temperature 退火温度anticodon 反密码子AP-PCR (arbitrarily primed PCR) 任意引物聚合?链反应arbitrary primer 任意引物ATP (adenosine triphosphate) 腺三磷酸autosome 常染色体Bbaculovirus 杆状病毒base pair 基对base sequence 基顺序beta-galactosidase β-半乳糖?beta-glucuronidase β-葡糖醛酸糖?bioluminescence 生物发光bioremediation 生物降解biotechnology 生物技术blotting 印迹法blue-white selection 蓝白斑筛选blunt end 平(整末)端Ccatalyst 催化剂cDNA library 反向转录DNA库centromere 着丝体centrosome 中心体chemiluminescence 化学发光chiasma 交叉chromomere 染色粒chromoplast 有色体chromosomal aberration 染色体畸变chromosomal duplication 染色体复制chromosomal fibre 染色体牵丝chromosome 染色体chromosome complement 染色体组chromosome map 染色体图chromosome mutation 染色体突变clone 克隆cloning 无性繁殖系化codon 密码子codon degeneracy 密码简并codon usage 密码子选择cohesive end 黏性末端complementary DNA (cDNA) 反向转录DNAcomplementary gene 互补基因consensus sequence 共有序列construct 组成cosmids 黏性质粒crossing over 互换cyclic AMP (cAMP) 环腺酸cytosine 胞嘧啶Ddark band 暗带deamination 脱氨基作用decarboxylation 脱羧基作用degenerate code 简并密码degenerate PCR 退化性聚合?链反应dehydrogenase 脱氢?denaturation 变性deoxyribonucleoside diphospahte 脱氧核糖核一磷酸deoxyribonucleoside monophospahte 脱氧核糖核二磷酸deoxyribonucleoside triphospahte 脱氧核糖核三磷酸deoxyribose 去(脱)氧核糖dicarboxylic acid 二羧酸digoxigenin 洋地黄毒diploid 二倍体DNA (deoxyribonucleic acid) 去(脱)氧核糖核酸DNA binding domain DNA结合性结构域DNA fingerprinting DNA指纹图谱DNA helicase DNA解螺旋?DNA kinase DNA激?DNA ligase DNA连接?DNA polymer DNA聚合物DNA polymerase DNA聚合?double helix 双螺旋double-strand 双链Eelectroporation 电穿孔endonuclease 内切核酸?enhancer 增强子enterokinase 肠激?episome 游离基因ethidium bromide 溴乙锭eukaryotic 真核生物的euploid 整倍体exonuclease 外切核酸?expressed-sequence tags 表达的序列标记片段extron 外含子FF factor F因子FAD (flavine adenine dinucleotide) 黄素腺嘌呤二(双)核酸feedback control 反馈控制feedback inhibition 反馈抑制feedback mechanism 反馈机制first filial (F1) generation 第一子代FISH (fluoresence in situ hybridization) 荧光原位杂交forward mutation 正向突变F-pilus F纤毛functional complementation 功能性互补作用fusion protein 融合蛋白Ggel electrophoresis 凝胶电泳gene 基因gene cloning 基因克隆gene conversion 基因转变gene duplication 基因复制gene flow 基因流动gene gun 基因枪gene interaction 基因相互作用gene locus 基因位点gene mutation 基因突变gene regulation 基因调节gene segregation 基因分离gene therapy 基因治疗geneome 基因组 / 染色体组genetic map 基因图genetic modified foods (GM foods) 基因食物genetics 遗传学genetypic ratio 基因型比 / 基因型比值genome 基因组 / 染色体组genomic library 基因组文库genotype 基因型giant chromosome 巨染色体globulin 球蛋白glucose-6-phosphate dehydrogenase 6-磷酸葡萄糖脱氢?GP (glycerate phosphate) 磷酸甘油酸脂GTP (guanine triphosphate) 鸟三磷酸guanine 鸟嘌呤Hhaploid 单倍体haploid generation 单倍世代heredity 遗传heterochromatin 异染色质Hfr strain 高频重组菌株holoenzyme 全?homologous 同源的housekeeping gene 家务基因hybridization 杂交Iimmunoglobulin 免疫球蛋白in vitro 在体外 / 在试管内in vivio 在体内independent assortment 独立分配induced mutation 诱发性突变induction 诱导initiation codon 起始密码子inosine 次黄insert 插入片段insertional inactivation 插入失活interference 干扰intergenic 基因间的interphase 间期intragenic 基因内的intron 内含子inversion 倒位isocaudarner 同尾酸isoschizomer 同切点?JKkanamycin 卡那毒素klenow fragment 克列诺夫片段Llac operon 乳糖操纵子ligase 连接?ligation 连接作用light band 明带linker 连接体liposome 脂质体locus 位点Mmap distance 图距离map unit 图距单位mature transcript 成熟转录物metaphase 中期methylase 甲基化?methylation 甲基化作用microarray 微列microinjection 微注射missense mutation 错差突变molecular genetics 分子遗传学monoploid 单倍体monosome 单染色体messenger RNA (mRNA) 信使RNAmultiple alleles 复(多)等位基因mutagen 诱变剂mutagenesis 诱变mutant 突变体mutant gene 突变基因mutant strain 突变株mutation 突变mutation rate 突变率muton 突变子NNAD (nicotinamide adenine dinucleotide) 烟醯胺腺嘌呤二核酸NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 烟醯胺腺嘌呤二核酸磷酸nicking activity 切割活性nonsense codon 无意义密码子nonsense mutation 无意义突变Northern blot Northern印迹法nuclear DNA 核DNAnuclear gene 核基因nuclease 核酸?nucleic acid 核酸nucleoside 核nucleoside triphosphate 核三磷酸nucleotidase 核酸?nucleotide 核酸nucleotide sequence 核酸序列Ooligonucleotide 寡核酸one gene one polypeptide hypothesis 一个基因一种?学说operon 操纵子oxidative decarboxylation 氧化脱羧作用oxidative phosphorylation 氧化磷酸化作用PPCR (polymerase chain reaction) 聚合?链反应peptide ?peptide bond ?键phagemids 噬菌粒phosphorylation 磷酸化作用physical map 物理图谱plasmid 质粒point mutation 点突变poly(A) tail poly(A)尾polymerase 聚合?polyploid 多倍体positional cloning 位置性无性繁殖系化primary transcript 初级转录物primer 引物probe 探针prokaryotic 原核的promoter 启动子protease 蛋白?purine 嘌呤pyrimidine 嘧啶QRrandom segregation 随机分离RAPD (rapid amplified polymorphic DNA) 快速扩增多态DNAreading frame 阅读码框recessive gene 隐性基因recombinant 重组体recombinant DNA technology 重组DNA技术recombination 重组regulator (gene) 调控基因replica 复制物 / 印模replica plating 复制平皿(板)培养法replication 复制replication origin 复制起点reporter gene 报道基因repression 阻遏repressor 阻遏物repressor gene 阻遏基因resistance strain 抗药性菌株restriction 限制作用restriction enzyme 限制性内切?restriction mapping 限制性内切?图谱retrovirus 反转录病毒reverse transcription 反转录作用RFLP (restricted fragment length polymorphisms) 限制性断片长度多态现象ribonucleotide 核糖核酸ribose 核糖ribosomal RNA (rRNA) 核糖体RNAribosome 核糖体RNA (ribonucleic acid) 核糖核酸RNA polymerase I RNA聚合?IRNA polymerase II RNA聚合?IIRNA polymerase III RNA聚合?IIIR-plasmid R质粒 / 抗药性质粒Ssecond filial (F2) generation 第二子代self-ligation 自我连接作用shuttle vectors 穿梭载体sigma factor σ因子single nucleotide polymorphism 单核酸多态性single-stranded DNA 单链DNAsister chromatid 姊妹染色单体sister chromosome 姊妹染色体site-directed mutagenesis 定点诱变somatic cell 体细胞Southern blot Southern印迹法splice 拼接star activity 星号活性stationary phase 静止生长期sticky end 黏性末端stop codon 终止密码子structural gene 结构基因supernatant 上层清液supressor 抑制基因Ttelophase 末期template 模板terminator 终止子tetracycline 四环素thymine 胸腺嘧啶tissue culture 组织培养transcription 转录作用transfer RNA (tRNA) 转移RNAtransformation 转化作用transgene 转基因translation 翻译 / 平移transmembrane 跨膜triplet 三联体triplet code 三联体密码triploid 三倍体UVvector 载体WWestern blot Western印迹法

(1)cDNA文库是指细胞全部mRNA通过逆转录得到cDNA后被克隆的总和。cDNA的组成特点是片段中不含基因的内含子和其他调控序列。cDNA文库构建基本步骤：①制备mRNA：全RNA提取与mRNA的分离提纯；②合成cDNA：oligo dT与mRNA3"端poly(A)杂交作为引物合成第一链，第二链合成是以第一链为模板，DNA聚合酶催化。常用RNase H切割mRNA-cDNA杂合链中的mRNA序列产生的小片段为引物合成第二链的片段，再连接成完整链；③制备载体DNA：由于cDNA分子的长度在0. 5～8kb，常用的质粒载体和噬菌体载体都可以，载体选择根据文库用途确定，如噬菌粒载体具有噬菌体的高效性和质粒载体系统可以利用蓝白斑筛选的便利；④cDNA的分子克隆：cDNA连入载体，转化重组体，扩增；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，评价文库质量。文库是否有价值主要从文库含量和插入片段的大小来评价，所构建文库必须有足够多的克隆数以确保基因组cDNA每一个序列至少有1个拷贝在文库内。(2)cDNA文库同基因组文库的差别主要在于基因组文库(尤其是真核生物的基因组文库)可能包含有非编码序列，含有更丰富的遗传信息。

一样。克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

载体（vector） ，能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。必备条件　　①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入③含有复制起始位点，能够独立复制；通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。⑤载体DNA分子大小应合适，以便操作。　基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体

1、性质不同。表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。 2、组成不同。表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

克隆载体（CloningVector）：通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。

克隆载体是能够通过限制性内切酶，将目的DNA片段整合进去，并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA。通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。

①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入。③含有复制起始位点，能够独立复制；通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。⑤载体DNA分子大小应合适，以便操作。基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体。

表达载体和克隆载体有什么不同?高粉答主4778表达载体和克隆载体的区别：1、性质不同表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。克隆载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。2、组成不同表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。克隆载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

克隆载体是能够通过限制性内切酶,将目的DNA片段整合进去,并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA.通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体,在载体上插入合适大小的外源DNA片段,并注意不能破坏载体的自我复制性质.将重组后的载体引入到宿主细胞中,并在宿主细胞中大量繁殖.常见的载体有质粒,噬菌粒,酵母人工染色体.对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖,而且最好要有较高的自主复制能力.②容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好.③容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制.这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点.④容易从宿主细胞中分离纯化出来, 这才便于重组操作.⑤有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来.

http://baike.baidu.com/view/184171.htm我从这个网址搜到的，你可以看看，是4声没问题载体　　　　载体：zài tǐ　　英文单词vector ，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。 　　运载体　　在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。　　作为运载体必须具有四个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③ 含有复制起始位点，能够独立复制；④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。　　　基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体

兰州大学很不错的，可以报考。兰州大学是教育部直属全国重点综合性大学，在国家高等教育格局中具有重要战略地位，在国内外具有重要影响和良好声誉。现有城关、榆中2个校区，校园面积3544.32亩。由国家国防科技工业局与教育部共建，世界一流大学建设高校（A类），“985工程”和“211工程”重点建设高校，入选“珠峰计划”、“强基计划”、“2011计划”、“111计划”。教学建设截至2021年3月，学校榆中、城关两个校区占地3544亩，下设42个教学科研单位、103个本科专业。有21个博士后科研流动站，25个一级学科博士点，1个专业学位博士点，47个一级学科硕士点，21个专业学位硕士点；有本科生20121人，硕士研究生12253人，博士研究生3161人；教学科研人员2250人。以上内容来源：兰州大学-校情概览

关闭Win10的自动更新需要在win10桌面找到“我的电脑”，选择“管理”。在“我的电脑”中右侧找到“服务和应用程序”点击“服务”。然后根据以下步骤点击“确定”，win10系统自动更新关闭完成。1、首先，在win10桌面找到“我的电脑”，右键点击“我的电脑”选择“管理”。2、然后在“我的电脑”中右侧找到“服务和应用程序”点击“服务”。3、然后在右侧目录中找到“Windows Update”，双击选中。4、然后在“Windows Update”中找到“常规”，启动类型选择“禁用”。5、然后在“恢复”位置“第一次失败”和“第二次失败”都改为“无操作”。6、然后点击“确定”，win10系统自动更新关闭完成。注意事项：1、在使用电脑的时候，要定时的对电脑文件进行备份，以防文件丢失。2、在使用电脑的过程中，要定时的对电脑进行清理。3、在使用电脑的过程中，一定要规范的操作电脑。4、在不知道问题所在的情况下，一定要第一时间联系专业的人员进行处理。

韩是仙剑2中魔尊的儿子，经仙剑ol剧情证实，仙剑2中魔尊死后其强大力量没有被完全销毁，其力量被封印在神魔之井（从这点看仙剑2魔尊被正名为魔），韩原名伐天，在很幼小时由于魔族被正派追杀其部下没有办法将其“灵”（忘了叫什么了就叫灵吧）送到小韩仲晰体内，就是说伐天进入了仲晰体内因此正派人士没有找到伐天，而韩仲晰恰被李逍遥所救，送个阿奴抚养。从此伐天的记忆一直在韩仲晰体内沉睡直到仙剑ol情节发生。后来伐天记忆觉醒想控制韩仲晰的身体，但是招到韩仲晰顽强抵抗，后来伐天想到和韩仲晰记忆融合就是谁也不把对方压倒同时拥有两个人的记忆，后来成功。于是新韩仲晰同时拥有伐天和韩仲晰得记忆。对忆如依然情深地固，但对李逍遥一样恨之入骨，定要报杀父之仇。最后魔族进入锁妖塔准备夺某样东西，由玩家和众位主角（忆如，月如，盖罗娇）进入锁妖塔阻止，最后见到新韩仲晰。忆如希望韩仲晰回心转意，但韩仲晰虽然对忆如情深但也不忘了自己是伐天，希望得到其父亲魔尊在神魔之井的强大力量而天下无敌。此时伐天力量觉醒7层。最后李逍遥和酒剑仙赶到，由于魔族部队在最后被大家（蜀山，仙霞，众主角，玩家，师叔）等人消灭（被消灭者包括魔族左使青凤和鼠王等），韩仲晰提出和李逍遥1对1单独战斗，虽然众人反对认为这样李逍遥过于危险，但李逍遥同意了韩仲晰的要求，并与韩仲晰在锁妖塔1对1单挑，两人中只有一人能活着离开，如果李逍遥死了，伐天离开锁妖塔后一样会被守在外边的正派人士杀死只是完成了他报仇的心愿。众人离开锁妖塔在外边焦急等待。过了很久很久，终于走出了一个人，那个人是李逍遥。忆如扑到李逍遥怀中痛哭不止——仙剑ol剧情结束。李逍遥为何被困交代不详，黑苗族水魔兽事件交代不详，沈家堡联合辽国事件交代不详。伐天是仙剑2魔尊的儿子不是孔麟的儿子。孔麟是魔族右使。

就是假的，我收到一瓶娇韵诗的红魔晶纤体精华是假的，我要退货，走秀就让我出具质检证明？算了，懒得折腾，就当花钱买教训，以后不会再买了，姐妹们擦亮眼睛，走秀网上不让顾客评论，坑一个是一个~~~~ 我早两天在走秀网上买了一瓶娇韵诗的红魔晶纤体精华，打开快递包装我就感觉不对劲了，外包装破烂不堪，瓶子外面没有塑封，就跟别人用过了的一样。瓶子上的字母还在掉漆，打开味道完全不对。因为原来一直在专柜买，用过很多瓶，我一看瓶子就知道是假的，正品的质地，气味，包装跟我收到的这瓶完全不一样。打电话投诉，要求退货，走秀网就 不断的强调他们的东西没问题，可能是进货渠道不一样。。。总之一堆屁话。我说我是老顾客了，在走秀网上买了几年了，也买了不少东西了，如果不是东西本身存在问题，我不会去要求退货，也不会无理取闹。他们所说的7天包退换就是扯谈，我说要退货，他们就说要去质监部门拿出证据才行？那当初走秀网你们卖东西的时候为什么不提供发票，质检证明？出了问题就死不承认。我买这瓶娇韵诗之前还特意在百度上搜了一下，看网友们评价怎么样？也有好多网友说买到假货的，因为自己平时也在走秀上买了很多东西，基本还算满意，加上这瓶娇韵诗比专柜上也就便宜了80块钱，我心想应该也不会有什么差别，收到后才发现自己中招了。说实话我真想拿去质检什么的？但这一瓶小小的东西，拿去折腾，耗不起这时间和精力。百度上中招的网友也有很多？？投诉无门，只能认栽么？？？难道真的就没有人出来管管么？？？ 我现在总算明白为什么走秀网上不让顾客评论了？？有的顾客不懂得辨别真假，走秀就是坑一个是一个？反正他不会退货，，买到假的只能认倒霉！！！！走秀你敢开放客户评论么？？？估计投诉的人会一大堆，好多吃了哑巴亏的，就这么算了。本来我觉得走秀挺好的，一直还挺满意，到现在都还有一个订单没收到货。这次的购物遭遇，让我特别失望，走秀的处理态度也跟他们承诺的完全不一样。总之我是不会再在走秀网上买东西了，现在跟原来比差太多了。走秀你以前搞代购挺好的，现在融资弄什么电商平台，供货商参差不齐，质量完全没法保障。 在此给打算在走秀网上买东西的网友们提个醒，擦亮自己的眼睛，像妆品这类的东西，最好还是去专柜上买，也没差多少钱，有条件的可以去香港和免税店买，或者让朋友带。妆品不比别的，假货不知道什么东西做的，用在自己身上，还真的有点不太放心。今天走秀客服给我来电话说半天都是说自己货没问题，如果我觉得是假货要退，必须要拿出质检证明。。。。。算了，我就自认倒霉，当花钱买教训了，其他姐妹们一定要慎重啊！！！

李忆如是将自己全部灵力瞬息传给小蛮，然后去世的。具体剧情：生下小蛮的六年后，韩仲晰因身体原因终究走到了最后一程。临终前，韩仲晰表示对不起忆如，为了他不能回家，甚至婶婆过世也没能看到她最后一面。忆如为了让他安心，表示她和他与小蛮在一起的日子，是她最珍贵的时光。韩仲晰交代完后事，便离世。忆如抱着小蛮哭得伤心，突然怀中的小蛮没有动作，忆如检查发现她昏迷。忆如带着小蛮前往蜀山，找草谷前辈为小蛮看病。草谷让忆如陪小蛮住下来，同时，请逍遥随她去抓药。忆如隐隐知道草谷是私下与父亲谈话，于是在药房外偷听。草谷诊断出小蛮因父母原因而真元缺损，若是普通孩子则可不用修行；但小蛮是女娲族人，随着成长要从母亲身上吸取女娲灵力，对小蛮而言是增加了负担。负担到小蛮承受不了会昏迷不醒，女娲族本能已开始毁掉小蛮的真元，女娲灵力返回给母亲。而解救方法是忆如将全部的女娲灵力瞬息给小蛮，重新塑造真元。只是忆如没有几日可活。忆如听完草谷的话，毅然将自己的女娲灵力全部传给了小蛮，没过几日忆如便去世。李忆如性格特点从小没有母亲陪伴，父亲也久久才能看到一次，但是在李大娘细心的教导与仙灵岛优良的环境下，养成了爽朗率直、胸襟宽大的个性，好奇心强，爱好和平，厌恶争斗，对人没戒心，是个调皮可爱、无心机的可爱女孩。从小就是众人手上的心肝宝贝，所以对长辈比较没大没小。又因为自小在仙灵岛水月宫长大，世面见得不多，相信人性本善，常幻想外边的世界，新鲜好玩。而不经大脑的调皮捣蛋、没有修饰的说话方式，有时叫人头疼。

好看难看是根据个人欣赏的，和购买的网站不一样如果你去专柜，不试就拿一条，也容易上身难看。李维斯和LEE也不是什么高端裤子，出现裤型难看的款很正常建议你下次购买的时候，找准适合自己的型号比如501是基本款，514很修身，505肥大

又双叒上热搜是一种什么体验？兰州大学可能深有体会！先是高颜值月饼喜提热搜，后是兰大学子把宿舍装成ins风惊艳全网，到如今兰大医学生手绘解刨图走红网络。这就是一所“宝藏大学”吧！现在带大家走进兰州大学，一探究竟。一、宿舍四人间标准化公寓上床下桌，有自习室，洗衣房，热水间；有阳台，物品柜。各类设施设备是非常齐全的，通向上铺楼梯同时也有储物的功能，但是也有上下铺的主要得看分配时的运气如何了。二、餐厅兰州大学为了“让学生吃好”可谓下足功夫，称之为“舌尖上的兰大”也不为过。除了网罗天南地北美食的常规操作，兰大经常做出一些出乎意料之举“火”上热搜。先是兰州大学推出的定制版月饼喜提“热搜”，随后《人民日报》发博称赞兰大在封校期间，推出移动烧烤车。看着这诱人的小黄车，感动的泪水从口边流出来了，难怪不少人@自己的学校来“抄作业”。三、教学楼因为校区占地面积比较大的原因，所以从宿舍到教学楼的距离相对来说就比较远，经过专业数据统计，多媒体教室75间、远程网络互动教室4间、双屏显示教室13间、多屏互动研讨教室2间、环形研讨教室1间、阶梯教室3间；主要是教学楼内基本都提供了万兆上联、千兆至桌面的高速有线网络（网速很快），可随时随地高速上网。四、图书馆目前，兰州大学有两座图书馆，分别被命名为积石堂和昆仑堂。这里藏书总量丰富，涵盖学科种类齐全，你想要的资料这里都能找到。其实，从文章实拍的图片来看，兰大学风浓厚，尤其晚上图书馆总是人员爆满。另外，兰州大学坐落于美丽的金城兰州。不同于刻板印象，这里冬无严寒，夏无酷暑，乃享誉中外的避暑胜地。换句话说，当身处南方的同学冬天取暖基本靠抖，夏天则要靠空调“续命”时，兰大的学子凭借一床凉被走四季。所以兰州大学是很值得报考的一所学校。

1、奢侈品购物网站——唯品会网址：www.vipshop.com网站标语定位：Vipshop名牌时尚最折扣网国内流量排名：279唯品会是国内大型时尚B2C电子商务网站，网站内商品价格较低，以时尚商品为主。网站内每天10点上架新品，拥有化妆品、包袋、服装等众多国内外知名品牌，并会推出1折限时限量抢购活动。2、奢侈品购物网站——佳品网网址：www.vipstore.com网站标语定位：顶级奢侈品折扣特卖会国内流量排名：1471VIPStore佳品网2009年成立于北京，2009年12月正式上线，经过2轮融资发展迅速。佳品网有独特的销售模式——限时抢购，全球品牌商品以1-7折的价格出售。而且佳品网具有强大的商品资源，与全球500多家国际奢侈品品牌商有合作，如LV、Dior、Coach等奢侈品牌。3、奢侈品购物网站——走秀网网址：www.xiu.com网站标语定位：全球时尚在线百货-奢侈品特卖国内流量排名：487走秀网是中国最大的时尚奢侈品电商企业，成立于2008年，网站内的产品包含了奢侈品、国内知名品牌在内的时尚百货，被艾瑞咨询评为“中国时尚电子商务第一名”。走秀网经过2轮投资，其中来自美国WarburgPincus的1亿美元投资是中国电子商务史上最大B轮融资纪录。4、奢侈品购物网站——第五大道网址：www.5lux.com网站标语定位：中国最大的奢侈品和商务礼品销售中心国内流量排名：1743第五大道于2009年初上线，由孙亚菲姊妹两人创立，是一家全球知名品牌网上折扣销售中心，而且在美国、发过及英国设有办公室，现已和国际20家顶级奢侈品牌达成战略合作，成为中国最大的在线销售奢侈品运营商。5、奢侈品购物网站——360Top网址：www.360top.com网站标语定位：京东商城旗下奢侈品官网国内流量排名：24742011年11月，京东商城正在把B2C触角伸向更多的领域：旗下奢侈品独立购物网站360Top正式上线。依靠京东商城这个强大的“后山”，360Top发展迅速，目前360Top已经上线诸多品类，如箱包皮具、名贵腕表、鞋靴配饰、珠宝首饰、美妆香氛等。

韩是仙剑2中魔尊的儿子，经仙剑ol剧情证实，仙剑2中魔尊死后其强大力量没有被完全销毁，其力量被封印在神魔之井（从这点看仙剑2魔尊被正名为魔），韩原名伐天，在很幼小时由于魔族被正派追杀其部下没有办法将其“灵”（忘了叫什么了就叫灵吧）送到小韩仲晰体内，就是说伐天进入了仲晰体内因此正派人士没有找到伐天，而韩仲晰恰被李逍遥所救，送个阿奴抚养。从此伐天的记忆一直在韩仲晰体内沉睡直到仙剑ol情节发生。后来伐天记忆觉醒想控制韩仲晰的身体，但是招到韩仲晰顽强抵抗，后来伐天想到和韩仲晰记忆融合就是谁也不把对方压倒同时拥有两个人的记忆，后来成功。于是新韩仲晰同时拥有伐天和韩仲晰得记忆。对忆如依然情深地固，但对李逍遥一样恨之入骨，定要报杀父之仇。最后魔族进入锁妖塔准备夺某样东西，由玩家和众位主角（忆如，月如，盖罗娇）进入锁妖塔阻止，最后见到新韩仲晰。忆如希望韩仲晰回心转意，但韩仲晰虽然对忆如情深但也不忘了自己是伐天，希望得到其父亲魔尊在神魔之井的强大力量而天下无敌。此时伐天力量觉醒7层。最后李逍遥和酒剑仙赶到，由于魔族部队在最后被大家（蜀山，仙霞，众主角，玩家，师叔）等人消灭（被消灭者包括魔族左使青凤和鼠王等），韩仲晰提出和李逍遥1对1单独战斗，虽然众人反对认为这样李逍遥过于危险，但李逍遥同意了韩仲晰的要求，并与韩仲晰在锁妖塔1对1单挑，两人中只有一人能活着离开，如果李逍遥死了，伐天离开锁妖塔后一样会被守在外边的正派人士杀死只是完成了他报仇的心愿。众人离开锁妖塔在外边焦急等待。过了很久很久，终于走出了一个人，那个人是李逍遥。忆如扑到李逍遥怀中痛哭不止——仙剑ol剧情结束。李逍遥为何被困交代不详，黑苗族水魔兽事件交代不详，沈家堡联合辽国事件交代不详。伐天是仙剑2魔尊的儿子不是孔麟的儿子。孔麟是魔族右使。求采纳

在经济全球化时代，正泰电器坚持国际化、科技化、产业化发展战略，大力开展制度创新、科技创新和管理创新，实现产品由中低档向中高档扩展，市场由国内向全球扩展，价值链由提供单体产品向提供系统解决方案扩展，经营由以线性为主向包括并购与资本运作在内的全面现代企业运营方向扩展，力争使正泰成为世界一流的低压电器全面解决方案提供商。日前，财富中文网公布2013年中国企业500强排行榜。浙江正泰电器股份有限公司上榜。该排行榜覆盖中国境内外上市的所有中国公司，依据数据为上市公司在各证券交易所正式披露信息。排行榜由北京中能兴业投资咨询有限公司与《财富》（中文版）合作编制完成。今年中国500强上榜的门槛继续提高到72.5亿元。正泰集团股份有限公司始创于1984年7月，现有员工23000余名，下辖8大专业公司、2000多家国内销售中心和特约经销处，并在国外设有50多家销售机构。产品覆盖高低压电器、输配电设备、仪器仪表、建筑电器、汽车电器、工业自动化和光伏电池及组件系统等七大产业，产品畅销世界90多个国家和地区。正泰集团是中国工业电器行业产销量最大的企业之一，综合实力连续多年名列中国民营企业500强前十位，年利税总额连续三年名列中国民营企业纳税百强前五名。正泰商标被认定为中国驰名商标，四大系列产品跻身中国名牌。其所生产的正泰牌万能式断路器、塑料外壳式断路器系列产品荣获中国名牌产品称号。公司于2004年荣获中国质量管理领域的最高奖——全国质量管理奖。

韩是仙剑2中魔尊的儿子，经仙剑ol剧情证实，仙剑2中魔尊死后其强大力量没有被完全销毁，其力量被封印在神魔之井（从这点看仙剑2魔尊被正名为魔），韩原名伐天，在很幼小时由于魔族被正派追杀其部下没有办法将其“灵”（忘了叫什么了就叫灵吧）送到小韩仲晰体内，就是说伐天进入了仲晰体内因此正派人士没有找到伐天，而韩仲晰恰被李逍遥所救，送个阿奴抚养。从此伐天的记忆一直在韩仲晰体内沉睡直到仙剑ol情节发生。后来伐天记忆觉醒想控制韩仲晰的身体，但是招到韩仲晰顽强抵抗，后来伐天想到和韩仲晰记忆融合就是谁也不把对方压倒同时拥有两个人的记忆，后来成功。于是新韩仲晰同时拥有伐天和韩仲晰得记忆。对忆如依然情深地固，但对李逍遥一样恨之入骨，定要报杀父之仇。最后魔族进入锁妖塔准备夺某样东西，由玩家和众位主角（忆如，月如，盖罗娇）进入锁妖塔阻止，最后见到新韩仲晰。忆如希望韩仲晰回心转意，但韩仲晰虽然对忆如情深但也不忘了自己是伐天，希望得到其父亲魔尊在神魔之井的强大力量而天下无敌。此时伐天力量觉醒7层。最后李逍遥和酒剑仙赶到，由于魔族部队在最后被大家（蜀山，仙霞，众主角，玩家，师叔）等人消灭（被消灭者包括魔族左使青凤和鼠王等），韩仲晰提出和李逍遥1对1单独战斗，虽然众人反对认为这样李逍遥过于危险，但李逍遥同意了韩仲晰的要求，并与韩仲晰在锁妖塔1对1单挑，两人中只有一人能活着离开，如果李逍遥死了，伐天离开锁妖塔后一样会被守在外边的正派人士杀死只是完成了他报仇的心愿。众人离开锁妖塔在外边焦急等待。过了很久很久，终于走出了一个人，那个人是李逍遥。忆如扑到李逍遥怀中痛哭不止——仙剑ol剧情结束。李逍遥为何被困交代不详，黑苗族水魔兽事件交代不详，沈家堡联合辽国事件交代不详。伐天是仙剑2魔尊的儿子不是孔麟的儿子。孔麟是魔族右使。

　　黑兔青龙其实是来自《推背图》中的预言，这是道士袁天罡和李淳风编写的，主要推算大唐的走向，而其中就有黑兔青龙这一说法，但是现在的很多人不知道这说的是什么意思，而有人说黑兔青龙有大事这又是何说法呢，一起来看下 推背图 里面的详解吧！ 　 　黑兔青龙有大事是什么意思 　　“黑兔走入青龙穴”有两层意思。1表示年份，由 兔年 到 龙年 。2，走入不是误入，走入是意进入，误入是无意迷入。黑兔吃了豹子胆走入龙穴，意在何为？所以此句揭示黑兔有篡位之意，是自不量力之举。“欲尽不尽不可说”一句表示此兔遭到囚禁，生死不由己，然而拒不交代，因为有不可说的秘密。 　　《 推背图》由来 　　《推背图》是中华预言第一奇书，传说它是唐太宗李世民为推算大唐国运，下令当时两位著名的道士袁天罡和李淳风编写的。 　　传说此袁李二人精通阴阳八卦奇门 术数 ，道术高深，并具有洞察未来的能力。因李淳风夜观天象，结合“武周代唐”之言，于是一时兴起，开始预言推算；李淳风以术数易卦推衍，一算起来就上了瘾，一发不可收拾，竟推算到唐朝以后两千年的历史。直到袁天罡推他的背，说道：“天机不可再泄，还是回去休息吧。”即第六十象所述，是以《推背图》之名由此而来。 　　《推背图》融合了易学、天文、诗词、谜语、图画为一体。预言了从唐木运开始、至明火运世程近两千年，一直到社会共产共和的世界大同，即将发生在重大社会历史事件。是中国历史上“最为经典”的未来学巨著。

其实医药代表是一个很正当的职业，有很明确的职责规定！但是现在很多人对它有一定的误解，因为一提到医药代表，往往让人想到“回扣”，灰色交易等等，甚至有的人还会说有潜规则什么的，特别是有一些女生选择这个职业的时候，不知详情经常劝她们不要从事医药代表职业！那么女孩适合做医药代表吗？女医药代表还是很常见的，在医院也会经常见到，年龄从十八九岁到五十岁的都有。其实女孩做医药代表要比男医药代表有些优势，更容易取得工作进展，因为她们有天然的亲和力，无论是与男大夫沟通还是女大夫沟通，都比男代表更容易一些，这是由于人的防备心里对男女销售员的抗拒程度不同产生的差别。其实各行各业，只要是不限制性别的职业，女性都会比男性更容易取得工作进步。比如女促销员，女服务员，老板娘（是不是没听说过老板爹），空姐（没听过空哥吧），女干部，女经理......仿佛都要比男士更容易取得工作进展！虽然女性的地位越来越重要（好像现在结婚大都是女方市场），但现在还是男权社会，在更多的重要岗位还是以男性为主！女医药代表如果能勤奋工作，提升自身的拜访技巧，比如“门诊拜访技巧”，“开发新科室/医生”，“病房拜访”，“邀约”，“夜访”等等，这方面建议在各大音频听听，医药代表实录，会很有帮助的！再加上向一些前辈代表虚心学习还是很容易取得优秀的业绩的，进而获得丰厚的回报，这样自身的价值也会升值，这对以后选择对象也会很有好处，最起码自己有丰厚的收入，不用看男方的脸色！作为女医药代表，可能最关心的还是传说中的“潜规则”了，其实现在大家认识当中的对女代表“潜规则”，在现实（电影里的除外）医药代表中几乎是不存在的！当然也有例外，什么事都不绝对，现在医生，医药代表都是一个庞大的群体，从业人员都很多，俗话说“鸟多了什么......”，或许也会有些开心的事情发生！但这种事情一个巴掌绝对拍不响，只要一方不愿意，也没法强迫!事情真的发生的时候，很可能是各取所需而已！

古代十大诡异奇书都是：《奇门遁甲》、《上下策》、《鲁班书》、《推背图》、《虞夏书》、《皇帝阴符经》、《山海经》、《金瓶梅》、《黄帝内经》、《孙子兵法》。1、《奇门遁甲》《奇门遁甲》是中国古代一部关于数术的伟大著作，相传其创始人是九天玄女，分三奇和八门，三奇和八门分别是乙、丙、丁，“门”是指八门即“开、休、生、伤、杜、景、死、惊。在古代传说中，传说的黄帝、姜太公、张良、诸葛亮、刘伯温等都是其代表人物。而《奇门遁甲》的格局反映了社会制度以及社会关系，对当代依然具有很高的研究价值。2、《上下策》《上下策》相传这是八十年代以前在民间传说中流传很广的两本书，而这部书也透着邪乎，说只能看上卷，下卷则不能看，否则将会带来祸端。3、《鲁班书》《鲁班书》是我国工匠鼻祖鲁班所作，鲁班原名公输班，《鲁班书》是他的一生心血和杰作。而了《鲁班书》其中的发明创作令人惊骇，有许多的发明现代人依然不知其解。而相传《鲁班书》下册是不能看的，看了以后必然断子绝孙，其中的真假不得而知。

额，不要买了大多数连都高仿不是 ，当然是奢侈品！你用数百元买来几十块的东西，而且没多大用处，有些还是别人用过的。

李忆如和韩仲晰生下了小蛮。自韩仲晰被父亲带往苗疆始，忆如时常与韩仲晰玩耍；随着年岁增长，忆如对韩仲晰产生了感情。由于韩仲晰被伐天元神侵入，不得不与父亲为敌，还危及锁妖塔封印，忆如便利用自己的灵力免除祸端，还分离韩仲晰和伐天。之后，忆如与韩仲晰成亲生女。李忆如性格特点从小没有母亲陪伴，父亲也久久才能看到一次，但是在李大娘细心的教导与仙灵岛优良的环境下，养成了爽朗率直、胸襟宽大的个性，好奇心强，爱好和平，厌恶争斗，对人没戒心，是个调皮可爱、无心机的可爱女孩。从小就是众人手上的心肝宝贝，所以对长辈比较没大没小。又因为自小在仙灵岛水月宫长大，世面见得不多，相信人性本善，常幻想外边的世界，新鲜好玩。而不经大脑的调皮捣蛋、没有修饰的说话方式，有时叫人头疼。

几年前大火的清宫穿越剧《宫》、《步步惊心》，将穿越这一词汇带入大众视野，一直都有人好奇人类到底能不能穿越，对穿越一事存在疑惑，毕竟中华有五千年历史，这五千年来，出现的奇人，发生的怪事，数不胜数，历史上曾经出现过三位疑似穿越的人，分别是王莽，李淳风，刘伯温。 一、李淳风、袁天罡【可能性70%】 这二人是师徒关系，都是大唐初年的预言家，享受国师的待遇，同时还是数学家和天文学家。两人合伙写下来的《推背图》是中华预言书里最著名的奇书，据说预测了中华文明一千多年后的历史，一直预言到公元2000多年。除此之外，李淳风单独写了《藏头诗》，也是预言书。 而他与袁天罡所合作而出的《推背图》则被称为是中国第一预言奇书。《推背图》一书将易学，诗词，谜语高度结合，全书共六十象，预测出了武则天称帝到清朝灭亡一千多年的历史大事，还预言了核战争爆发，外星人入侵等未来事件，书中的预言完全符合历史发展的顺序。 李国师，您也太显摆了吧？穿越者的身份暴露无遗啊！可以推断：李淳风是穿越者，袁天罡只是他在唐朝收的徒弟，但袁天罡知道李淳风是穿越者，并且从李淳风这里捞到了不少二十一世纪的知识，所以也成为了大预言家。从李淳风穿越后的表现看，他直接投靠了大唐说明他一开始就知道天下是属于大唐的，另外，他好像没有留下什么文学作品，也没有发明创造什么东西，就是对历史非常了解。由此可以再次推断：李淳风是21世纪某个学历史的学生，除历史外一无所长，既不懂理科知识也不懂文科知识，所以既不会发明创造也不会写诗写书， 二、刘伯温【可能性80%】 俗话说“三分天下诸葛亮，一统江山刘伯温”，这就说明了刘伯温比诸葛亮还要强。刘伯温是明朝开国元勋，天文地理、军事政治、文学艺术...都有很深的造诣，同时也会打仗，既是军事家也是政治家，既是开国功臣也是治世良臣——看到这里，我们的脑中忍不住浮出了“完人”这个词了。 这厮又是一个完人！这已经非常可疑了，但最大的铁证，还是因为刘伯温和诸葛亮、李淳风一样，完成大业后每天吃饱没事做，开始心灵空虚了，身为穿越者的秘密让他心里按捺不住，于是他也去干了同样的事情：写预言书！没错！刘伯温也写了预言书，而且还和诸葛亮、李淳风一样，都写了不止一本！和《推背图》齐名的《烧饼歌》就是刘伯温写的，除此之外他还写了《金陵塔碑文》，也是预言书。作为明朝人的刘伯温，预言到了1937年日本侵华、国共内战等20世纪的事情，说他不是穿越者都让人不相信了。由此可以推断：刘伯温其实是20世纪末或21世纪初的穿越者，而且基础知识要比诸葛亮和李淳风强得多，所以混得比诸葛亮和李淳风好多了。诸葛亮只能帮助刘备三分天下，而刘伯温则帮助朱元璋一统江山，李淳风只能靠着历史知识做国师和预言家来混饭吃，而刘伯温则真刀实枪地投身元朝末年的乱世并混到位极人臣的地位。所以说刘伯温是个正面教材，再次告诉了我们，学好知识再穿越是多么重要。u2193u2193u2193 上一页 0 /2 下一页

走秀网是中国比较大的奢侈品网购商城，质量没有问题的。应该都是正品吧。不过我都是先去惠拖网看看有没有券可以领，就算没有券至少还有返利 呵呵

简单明了的说和电有关的东西它都做，最牛逼的是它还收购了俩发电厂和入股了一个核电站。三峡大坝基本都是正泰昆仑系列。发电厂从发送电的电缆至变压器至家中断路器再至开关面板都可一体化。还有太阳能板 充电桩 路灯等

兰州大学挺好的，兰州大学坚守在深厚但又相对贫瘠的黄土地上，缺少许多得天独厚的优越条件，克服了许多别人没有的困难。然而自建校以来，兰州大学始终在中国高等教育占有一席之地。她的发展之路证明，一所好的大学，需要自身独特的精神、传统和风范。学校规模：学校榆中、城关两个校区占地3544.32亩，下设44个教学科研单位、103个本科专业。学校有21个博士后科研流动站，25个一级学科博士点，2个专业学位博士点，47个一级学科硕士点，24个专业学位硕士点，有本科生20146人，硕士研究生13297人，博士研究生3808人，教学科研人员2904人。以上内容参考：百度百科--兰州大学专业老师在线权威答疑 zy.offercoming.com

《仙剑奇侠传》系列都是电脑游戏，只有第一部和第三部拍了电视剧，仙剑二由于种种原因没有拍电视剧，所以就没有分集介绍了。仙剑二讲述的是仙剑一8年之后的故事。男主角王小虎：是李逍遥的邻居女主角苏媚：是8年前李逍遥和林月如杀死的蛇妖和狐妖的女儿女主角沈欺霜：沈青锋之女，姜婉儿的徒弟女主角李忆如：只有8岁，李逍遥和赵灵儿的女儿仙剑二的结局是：1.苏媚被打回原形，王小虎和沈欺霜终成眷属。2.林月如复活了，赵灵儿身形毁灭，但灵魂似乎还存在，李忆如由林月如带回林家堡抚养长大！仙剑二结束后的剧情：在仙剑二8年之后，李忆如爱上了阿奴的养子韩仲晰，他本是仙剑一中韩梦慈的弟弟，但他和李逍遥也是仇家，这段爱恨纠葛，该怎么办呢？

在走秀网买东西的消费者请注意！谨防上当受骗！走秀网CEO纪文泓被抓:涉嫌走私4亿奢侈品！支付联盟整理编辑去年12月底，小刘在花费4995元购买了一件大衣，十几天后，她被告知商品库存不足，于是办理了退款。但近5000元并没有退还到她的银行 卡，而是退到了她的走秀网账号。“这钱我既没办法消费，也没办法提现，什么时候能提现也是个未知数，相当于被冻结了。”晨报搜索发现，有多名消费 者都有类似遭遇。对此，走秀网客服表示，公司目前正在陆续给消费者退款，律师建议消费者向属地工商部门投诉。消费者：钱退账户无法提现小刘说，她去年12月27日从走秀网下单购买了一件青绿色羊毛大衣，购买后久久没等到发货。今年1月12日，客服称因大衣缺货，小刘将此订单取 消。“结果把钱自动退款到了走秀网的虚拟账户里，我既没办法提现，也没办法拿出来继续在网站消费。”小刘说，她几次电话客服人员，对方态度都很好，说会催 促尽快返款，但就是不见行动。“在这期间还出现乌龙，系统显示返款成功，但钱根本没有到账。”距离最初购物时间已经过去了3个多月，其他花费几百元买的衣 服都到了，就这件最贵的大衣没到，钱也不见回来，这让小刘很苦恼。记者搜索发现，有不少消费者都遇到了和小刘类似的经历。消费者王先生说，他第一次在走秀网购物，于1月20日花184元购买了三瓶漱口水， 同样在下单半个月后被告知无货，于是提交了退款申请。“它必须先审核退款再提现，当时审核用了两周时间，提现却遥遥无期。”小王说他也给客服打过几次电 话，但对方都未给一个明确的回复。客服：目前在逐步办理退款记者打开走秀网官网，发现网站可正常下单购物。在退款说明中看到，根据不同的下单路径会在1到15个工作日内退款，但又写了“退款周期仅供您参考，具体退款周期可能会受银行、支付机构等相关因素影响”，记者多次拨打走秀网总部电话及公关电话，均无人接听。随后，记者拨通其400客服询问此事，客服人员表示，因部分商品库存短缺，只能为消费者办理退款，但需要公司内部按流程进行审核。“因为最近退 款的人数有一点多，我们会尽快催促，但没办法保证什么时候能够退到。”客服人员表示，目前公司正在办理去年12月份及今年1月份的退款，对于部分延迟退款 的用户，公司会赠送代金券等以示安慰。记者了解到，目前，王先生已收到其退款。律师：可向属地工商部门投诉！！电话：12315京衡律师所律师余超表示，根据《网络交易管理办法》：第三方经营者应当建立平台内交易规则、交易安全保障、消费者权益保护、不良信 息处理等管理制度。就该案来看，走秀网迟迟不能将钱退给消费者，说明该平台没有建立“平台内交易规则、交易安全保障、消费者权益保护”等管理制度或有管理 制度而不遵守，该平台也不能提供必要、可靠的交易环境和交易服务。因此，消费者可以到平台所在的深圳属地工商行政管理部门投诉处理。（来源：北京晨报 文/康佳）

李回来了，把韩杀了。

win10电脑关闭自动更新需要右击计算机进入管理，点击服务和应用程序项目选择服务点击“Windowsupdate”，点击页面的“停止”即可，下面是具体的操作介绍：1、打开电脑，鼠标右击计算机，点击进入管理。2、点击服务和应用程序项目，选择服务进入。3、下拉找到并点击“Windowsupdate”。4、点击页面的“停止”即可关闭自动更新。以上就是小编今天的分享了，希望可以帮助到大家。win10系统关闭自动更新需要在设置中更改，方法如下：工具／原料：联想ThinkBook 14、Windows10、设置1.01、在Windows设置中点击更新和安全。2、在菜单中点击高级选项。3、点击自动下载更新后面的按钮，关闭即可。