为什么构建基因文库

噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒，同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。噬菌粒具有以下令人瞩目的特征：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。

噬菌粒(phagemid)实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体,是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体,具有 ColE1 复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒,以及丝状体噬菌体的间隔区。 噬菌体颗粒就是噬菌体

没有与宿主细胞的染色体整合。噬菌粒（phagemid）是带有丝状噬菌体复制起始点的质粒。展示筛出来的质粒表达不出来是没有与宿主细胞的染色体整合还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。

【答案】：M13噬菌体载体是基于大肠杆菌M13丝状噬菌体基因组构建的载体，在M13噬菌体基因组基因间隔区中插入β-半乳糖苷酶N端一小段编码序列(内插入若干限制性内切酶的单一切点)及其调控序列。M13载体一般只能克隆300～400bp的外源DNA片段，常用于制备单链DNA探针、定位诱变模板，也可用于噬菌体展示。噬菌质粒是噬菌体M13的基因间隔区(内含有M13的复制起点)插入到细菌质粒载体中构建而成的质粒。噬菌粒在大肠杆菌细胞内以质粒的复制起点进行复制，产生双链DNA。当含噬菌粒的大肠杆菌被辅助噬菌体感染后，在辅助噬菌体基因产物作用下，噬菌粒基因间隔区特定位点被切开，然后以M13的复制起点进行复制，产生单链DNA，并利用辅助噬菌体提供的装配蛋白和外壳蛋白装配成重组噬菌体颗粒，释放至胞外。噬菌质粒载体本身分子小，约为3kb，便于分离和操作；可克隆10kb的外源DNA片段，克隆能力强于M13噬菌体载体。

虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区，能够合成单链DNA，但是它没有M13的功能基因，没有M13基因2的产物存在，所以不能合成单链DNA。而辅助噬菌体具有M13的所有功能基因，但是IG区是缺陷的，辅助噬菌体本身的DNA不能进行单链复制，于是就可以为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白。辅助噬菌体必需具备如下条件：(1)助噬菌体的DNA IG区必需失去功能，其本身的DNA不会被包装到成熟的噬菌体颗粒中；（2）由于辅助噬菌体的IG区失活，其本身的基因不能表达，要使辅助噬菌体的所有功能基因都能进行表达，必须在辅助噬菌体的基因组中导人新的复制起点；(3)辅助噬菌体的基因组中具有选择标记，便于识别和收集一定数量的辅助噬菌体。

在基因工程中最常用的载体是质粒，此外还有噬菌体、动植物病毒等。

载体连接体系是指将不同载体上的基因进行组合，以实现功能的编程。它是合成生物学和纳米技术领域的重要研究方向之一。在设计载体连接体系时，载体与片段的最佳比例应根据具体的应用需求来确定。这是因为不同的应用场景需要不同的载体和片段，不同的载体和片段也会对连接的比例产生不同的影响。举例来说，如果要构建一种病毒治疗系统，可以选择载体为病毒，将治疗相关的片段连接在其基因组中。在这种情况下，病毒的DNA/RNA构成了大部分载体体积，而治疗相关的片段则只需要占载体基因组的一小部分，因此载体与片段的比例应该是载体占多数，片段占少数。另一方面，如果要实现一种基因编辑系统，可以选择载体为质粒，将编码CRISPR-Cas9系统的片段连接在其上。在这种情况下，CRISPR-Cas9相关片段是实现基因编辑的关键，占据了载体基因组的大部分，因此载体与片段的比例应该是片段占多数，载体占少数。

有用。虱螨一喷净特性：本品为菊科植物除虫菊干燥花絮的有效成分提炼而成的天然产品，本品品质温和，可有效杀灭体外成虫、幼虫及虫卵，所以有用。虱螨目是最初的虱螨目和噬菌粒目，通常被称为虱螨或虱子。

载体:1、科学技术上指某些能传递能量或运载其他物质的物质。如工业上用来传递热能的介质，为增加催化剂有效表面，使催化剂附着的浮石、硅胶等都是载体。2、泛指能够承载其他事物的事物。如语言文字是信息的载体。BOY,对于你单指化学中的载体,我想应该是单纯地指待存在催化剂的反应条件以及反应场所吧(主要还是指反应场所吧).虽然化学催化剂效率远不及生物中的酶,但有异曲同工的性质,酶的活性和温度,湿度,空间等等等各种因素有关. 另外,主要还是生物中的载体比较广泛哈,在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。 　　运载体　　在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。　　作为运载体必须具有四个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③ 含有复制起始位点，能够独立复制；④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。中学阶段的主要要了解和掌握的载体就是质粒载体，噬菌体载体以及病毒,其他的都不需要了解哈~~BOY

材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞及菌株 HAb18为分泌抗人肝癌mAb的鼠杂交瘤细胞株，由陈志南建株〔4〕；正常肝细胞株QZG引自中国科学院上海细胞库。pCANTAB 5E克隆及表达载体，为Pharmacia公司产品。1.1.2 试剂 反转录系统为Promega公司产品；PCR引物： heavy chain primer 1和2(Pharmacia公司产品)，分别为重链5′端和3′端引物；light chain primer mix： 为10种轻链5′端和3′端引物的混合物，用来扩增鼠Ig VL基因；linker primer mix，为带有Linker序列(Gly4Ser)3的重链3′端和轻链5′端的引物，用来将VH，VL拼接成ScFv基因；RS primer mix，为带有SfiI位点的重链5′端引物和带有NotI位点的轻链3′端引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段并引入酶切位点。引物A，D分别为重链5′端引物(含EcoRI酶切位点)及轻链3′端引物(含SalI酶切位点)〔5〕。A，D引物的序列如下:引物A VH-1（正向）:5′ GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG 3′EcoRⅠ引物D VL-2（反向）:5′ CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC 3′SalⅠ1.2 方法1.2.1 总RNA提取、cDNA第1链合成及VH和VL基因的扩增 取对数生长期的HAb18细胞，用异硫氰酸胍变性法，提取细胞总RNA。参照Promega公司反转录系统的产品说明书，反转录合成cDNA第1链。将cDNA第1链合成反应物分为两份，分别加入VH和VL引物各2 μl进行PCR。1.2.2 ScFv基因的组装 回收的VH和VL基因片段与linker primer mix等摩尔混合，加入dNTP至终浓度为2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶5u，进行7次PCR循环(94℃ 1 min，63℃ 4 min)。将VH和VL基因拼接为ScFv基因。在上述反应体系中，加入RS primer mix，再进行30次PCR循环，可在ScFv基因的两端分别加入SfiI和NotI酶切位点。1.2.3 ScFv基因的克隆和筛选 上述加端PCR产物经1.8% 琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收后，用SfiI和NotI消化，并与以此两种酶双酶切的pCANTAB 5E噬菌粒DNA连接，转化E.coli HB2151，在SOBAG（含100 mg/L氨苄青霉素和2%葡萄糖的SOB培养基）琼脂板上筛选转化菌。从转化板上挑取单个菌落，用2×YTAG（含100 mg/L氨苄青霉素和2% 葡萄糖的2×YT培养液）于30℃培养过夜，以碱裂解法小量提取噬菌粒DNA，以引物A，D进行PCR扩增出ScFv基因片段，并克隆入pUC19载体。1.2.4 ScFv核苷酸序列的测定 以美国PE317-A型自动序列分析仪进行序列测定。1.2.5 可溶性ScFv基因的分泌型表达 将含ScFv基因的重组噬菌粒菌种接种于5 ml LB 培养基，过夜培养。加至50 ml SBAG(含100 mg/L氨苄青霉素和2%葡萄糖的SB培养液)中，30℃振荡培养1 h，5 000 r/min离心15 min，弃上清。将沉淀重悬于50 ml SBAI(含100 mg/L氨苄青霉素和1 mmol/L IPTG的SB培养液)中，37℃诱导3 h，离心同上。取沉淀悬于5 ml新配制的溶菌酶（1 g/L），20% (w/v)蔗糖，30 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)及 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液中，冰浴10 min，4℃以12000r/min离心5 min，上清即为外周质部分。将其冷冻干燥后，贮于-20℃。临用时以0.01 mol/L PBS溶解至500 μl。1.2.6 ScFv基因可溶性表达产物的鉴定 采用SDS-PAGE及Western blot(二抗为鼠抗-E-tag抗体)进行鉴定。1.2.8 流式细胞仪分析ScFv的活性 收集培养的肝癌细胞SMMC 7721，正常肝细胞QZG及胃癌细胞SCG 7901，用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度至5×106/L~1×107/L。每管加入40 μl细胞悬液，100 μl ScFv表达产物，再加入50 μl 1∶20灭活正常兔血清（用DPBS稀释），于4℃作用30 min，洗涤2次，以800 r/min离心5 min，弃上清。加入抗E-tag抗体8 μl(2.5 g/L)，4℃作用30 min，洗涤2次，弃上清。加入50 μl FITC标记的羊抗鼠抗体，充分振摇，4℃作用30 min，洗涤2次，加入500 μl固定液，以流式细胞仪进行分析。同时设正常肝细胞、胃癌细胞为阴性对照组，肝癌细胞加亲本抗体Hab18为阳性对照组。2 结 果2.1 VH和VL基因的PCR扩增及ScFv基因的拼接 VH和VL基因测序结果显示，VH为363 bp，VL为342 bp，与预期的VH和VL基因片段大小相符。将VH和VL基因用linker连接成ScFv基因（其中linker为45 bp）。以此为模板加入RS primer mix进行PCR扩增，所获扩增产物的大小约为730 bp，表明VH，VL及linker primer mix的浓度配合准确，并引入了SfiI和NotI酶切位点（图1，见第Ⅳ页）。2.2 ScFv基因的克隆 将ScFv基因克隆入pCANTAB 5E中，连接物转化E.Coli HB2151。在SOBAG固体培养基上筛选转化的菌落。然后随机挑选8个菌落，小量制备噬菌粒DNA，以Sfi I 和NotI双酶切鉴定。若含有外源插段者，应切出约730 bp大小的片段。结果表明，8个克隆均含插段。2.3 ScFv基因的序列测定 如图2所示，ScFv基因全长为726 bp，包括预期的VH，VL基因和linker序列。VH基因序列处于linker的上游，VL基因序列处于linker的下游。2.4 可溶性ScFv蛋白的鉴定 可溶性ScFv-E-tag融合蛋白，预期的Mr为29 000。E-tag可作为蛋白标签，通过鼠抗E-tag抗体来检测ScFv基因的表达。将阳性克隆以1 mmol/L IPTG诱导3 h，对IPTG诱导和未诱导的菌体进行裂解，经SDS-PAGE后，在(Mr为29 000处多出1条明显的新生蛋白带，与预计的ScFv-E-tag融合蛋白的大小Mr为29 000)相符（图3，见第Ⅳ页）。同时做与图3相同的SDS-PAGE并进行Western blot，在Mr为29 000处有显色条带，即为能与抗E-tag抗体特异性结合的可溶性ScFv蛋白（图4，见第Ⅳ页）。2.5 可溶性ScFv蛋白与肝癌细胞的结合活性 以可溶性 ScFv蛋白为一抗，抗E-tag抗体为二抗，FITC-抗鼠IgG为三抗，用流式细胞仪测定荧光标记细胞的阳性率(图5，见第Ⅳ页)。肝癌细胞组： 无关抗体(抗-CD3)为1.6%，亲本抗体为97.5%，ScFv 为30.9%；正常肝细胞+ScFv蛋白为2.6%，胃癌细胞+ScFv蛋白 为4.1%。表明可溶性ScFv蛋白能与肝癌细胞特异地结合，而不与正常肝细胞和胃癌细胞结合。荧光显微镜观察，可溶性ScFv蛋白与肝癌细胞的膜抗原相结合，在细胞膜上可见颗粒状的荧光(结果未显示)。3 讨 论 随着Ig基因结构与功能研究的不断深入，基因工程新技术的不断涌现和成熟，基因工程抗体的研究取得了很大进展。现获得的各种基因工程抗体已基本克服了鼠源性mAb的缺点，及制备人源性抗体的困难，使之在基础医学研究和临床疾病的诊断、治疗和预防等领域，特别是肿瘤的治疗中，得到了极为广泛地应用，有的已进入Ⅲ期临床应用。运用基因工程重组技术，将鼠源性抗体恒定区和可变区的框架区以人源性相应抗体片段取代，可降低抗体的免疫原性，有效地减轻免疫排斥反应〔6〕。利用基因突变技术改变抗体的某些结构，则可提高抗体的亲和力，延长其半衰期〔7〕。另外，还可将抗体基因与其它功能性基因相连接，赋予抗体新的功能。 近年发展起来的抗体库克隆技术，可无需进行细胞融合制备杂交瘤，甚至无需进行免疫，即可直接从基因水平上，获得所需的针对相应抗原的抗体。制备基因工程抗体的关键，是获得抗体可变区基因，拼接成单链抗体基因，并表达出有生物学活性的产物。 本文从分泌抗肝癌mAb的杂交瘤细胞(HAb18)中，用RT-PCR，克隆出抗体可变区基因，其关键是PCR引物的设计。大多数研究者设计合成的引物，通常是针对V区FR1 5′端（或信号肽）的保守序列和J基因3′端序列（或恒定区基因序列）而设计的，特异性不够强，不能有效地扩增某些目的基因。Pharmacia公司噬菌体呈现系统中的混合引物，系针对鼠Ig基因不同家族的序列而设计的。从理论上讲，适用于所有类型的Ig，每种可变区基因都可获得扩增，对全套抗体库的构建非常重要。 本研究所用pCANTAB 5E是Pharmacia公司的产品，含有氨苄青霉素抗性基因，plac启动子和M13噬菌体基因间隔区片段，在多克隆位点与gⅢ编码区之间，有1个c-myc tag序列和琥珀终止码TAG，IPTG可诱导外源基因的表达。在不含有琥珀抑制基因的菌株（如HB2151）中，E-tag后的终止码被识别，多肽链的翻译终止于此，从而可生成具有生物学活性带有13肽E-tag的可溶性ScFv蛋白，释放于细菌周质中。E-tag为源于人c-myc基因的一段序列，对ScFv基因的结构和活性均无影响，可作为可溶性ScFv蛋白的标签，用抗E-tag抗体来检测ScFv基因的表达并纯化其产物。我们用含有ScFv基因的重组噬菌粒载体转化大肠杆菌HB2151，经IPTG诱导获得可溶性表达产物。用抗E-tag抗体做Western blot证实，表达产物为ScFv-E-tag融合蛋白。流式细胞仪分析表明，此ScFv融合蛋白可与肝癌细胞结合，荧光标记细胞的阳性率为30.9%，而不与正常肝细胞及胃癌细胞相结合，表明此ScFv蛋白具有肝癌结合的特异性。参考文献1 顾方舟，陈妙兰，陆如山等. 肝癌研究概况与展望. 北京： 中国协和医科大学，北京医科大学联合出版社，1993: 1-32 Hoston JS，Levinson D，Mudgett HM et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in E.coli. Proc Natl Acad Sci USA，1988；85: 5879-58833 Kroesen BJ，Wellenberg GJ，Bakker A et al. The role of apoptosis in bispecific antibody-mediated T cell cytotoxicity. Br J Cancer，1996 ；73(6): 721-7274 陈志南，刘彦仿，杨继震等. 抗人肝细胞癌单克隆抗体的产生及其相应抗原的免疫组化定位研究. 单克隆抗体通讯，1989；5(2)： 33-365 杨安钢，吉昌华，韩 骅等. 抗人CD8单抗κ轻链可变区基因的克隆和序列测定. 生物化学与生物物理进展，1992；19（4）： 286-2886 Man SC，Jeanne BK，Bednarik EJ. Humanized anti-Lewis Y antibodies: in vitro properties and pharmacokinetics in rhesus monkeys. Cancer Research，1996；56: 1118-11257 Mats O，Henrik O，Michael M et al. Light chain shuffling of a high affinity antibody results in a drift in epitope recognition. Mol Immunol，1996；33(1): 47-56(收稿 1998-03-03 修回 1998-03-26)

构建基因组文库的步骤A 分离基因组DNA；B 用超声波或限制酶等进行基因组DNA部分或完全降解；C 将降解物进行分级得到所需大小DNA片段；D 将DNA片段与载体连接(一般用λ噬菌体载体)；E 将重组体导入宿主细胞；F 最后筛选鉴定重组子克隆。建立基因组文库的方法2—λ噬菌体基因组文库 可插入较大片段，最大可达23kb建立基因组文库的其他方法：cosmid基因组文库 YAC基因组文库 BAC基因组文库基因文库的质量标准：重组克隆的总数不宜过大， 以减轻筛选工作的压力；载体的装载量最好大于基因的长度， 避免基因被分隔克隆；克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域, 以利克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下,重组克隆能稳定保存、扩增、筛选建立cDNA文库的基本步骤 (1)隔离总RNA和净化mRNA (2)合成的双链互补脱氧核糖核酸适合插入一个克隆载体(3)克隆cDNA合适的向量(4)转移到合适的宿主细胞的重组载体(5)筛查阳性克隆cDNA克隆的策略(1)自身引导的第二链合成+同聚物加尾（2）cDNA克隆方法的改进。尾随第一链寡核苷酸（DC）允许使用寡核苷酸引物（ DG）将要开展的第二链（3）cDNA的定向克隆从基因文库中筛选分离目的基因克隆(1)制备核酸探针进行杂交筛选(2) 制备抗体进行免疫杂交筛选(3)根据生物大分子间的相互作用筛选目的基因(4)利用PCR技术筛选目的基因文库(5)利用噬菌体表面展示技术分离目的cDNA克隆：噬菌体展示(phage display)：是在噬菌体表面表达已融合到噬菌体外壳蛋白的重组蛋白或多肽的技术。应用噬菌体展示技术的关键是构建表达性基因文库，这种文库称为噬菌体展示文库(phage display library )。常用的构建噬菌体显示文库的表达载体有两类：丝状噬菌体和以这些噬菌体复制起始序列为基础构建的噬菌粒(phagemid)。mRNA差别显示技术原理：在 mRNA3′端的 poly (A)5"上游的 2个碱基只有 1 2种组合。与此相对应，共可人工合成12种不同的下游引物，用以反转录mRNA 合成cDNA第一条链。这种引物通常称为3"端锚定引物，它由Oligo-d T后面接上两个碱基 (如 5′T1 1 - 1 2 MN3′, M=G、C或 A; N=A、G、C或 T)构成。这样，每一种此类人工合成的寡核苷酸引物，都将能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。由此可知，使用5′T1 1 - 1 2 MN3′引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的但序列结构不同的12份亚群体。DDRT-PCR的主要步骤：Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3"锚定引物作为反转录的引物，合成第一链cDNA；Ⅱ.用5"随机引物和某个3"端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)；Ⅲ.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；Ⅳ.回收特异性差别条带；Ⅴ.用同一引物对扩增已回收的DNA条带；Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；Ⅶ.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。 DNA插入诱变法分离目的基因DNA插入诱变法主要用于植物目的基因的克隆分离研究。其基本原理是，当一段特定的DNA序列插入到植物基因的内部或其邻近位置时，一般会诱导该基因发生突变形成突变体植株，或者在插入位置产生一个新的基因。 如果该DNA插入序列是已知的，便可用它作为DNA分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选得到突变基因片段。然后利用此突变基因片段制备探针，从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。这样，插入的DNA序列相当于在植物基因上贴了一张标签，因此，DNA插入诱变法又叫DNA标签法(DNA tagging)。差别杂交和减法杂交技术分离目的基因差别杂交构建了基因文库后，如没有任何可供选择的探针进行筛选，或没有任何有关目的基因的核苷酸序列信息时，可以考虑用差别杂交法筛选目的基因片段。差别杂交(Differential hybridization)也称为差别筛选(Differential screening)法。特别适用于分离在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调控的基因，亦可有效地用来分离经特殊处理诱导表达的基因。差别杂交的技术原理：有目的基因能正常表达和不能表达的两个不同的细胞群体。在这种情况下，分别制备两种不同细胞群体的mRNA提取物，其中一个群体含有一定比例的目的基因mRNA ，另一个群体不含有目的基因mRNA。差别杂交的技术原理过程：以这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目的基因表达的mRNA群体为探针时，所有包含重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点;而以目的基因不表达的mRNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，变可以挑选出含有目的基因的菌落，供进一步研究用。差别杂交法的局限性：首先，差别杂交的灵敏度比较低，不适合低丰度mRNA的目的基因的分离。其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑，是一项十分耗时耗力的工作；第三，差别杂交重复性差。差别杂交涉及文库的滤膜影印，不同滤膜之间的DNA保有量往往不均一，杂交所得的信号强度也会不一致，需要重新进行点杂交，以做进一步的阳性克隆鉴定工作 。mRNA减法杂交基本原理：从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录成为cDNA，然后与无目的基因表达的组织中提取的mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成程cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍然保持单链状态，这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。基因突变技术分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又分两种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变(oligonucleotide-mediated mutagenesis)；第二类是利用PCR,以双链DNA为模板所进行的基因突变。寡核苷酸介导的定点诱变的原理 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子链的组成部分。因此，所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列。要求所设计的寡核苷酸引物除了所需的突变位点之外，与目的基因编码的区段完全互补。作为诱变剂的寡核苷酸序列，同待诱变的目的基因的互补序列之间，能形成一种稳定的唯一的双链结构。决定双链区段稳定性的主要因素是碱基的组分、核苷酸的错配以及寡核苷酸引物的长度等。寡核苷酸介导的定点诱变的基本步骤(a)将要进行突变的目标基因(或DNA片段)克隆于M13噬菌体载体或噬菌粒载体。(b)从重组的M13或噬菌粒中制备单链DNA。(c)将设计好的寡核苷酸突变引物的5"端用T4多核苷酸激酶进行磷酸化。(d)将上述突变引物与目标基因(单链的DNA模板)进行退火。(e)在存在DNA聚合酶和dNTP的情况下，使退火引物沿单链DNA模板延伸，然后新生链的末端用T4 DNA连接酶连接。(f)转染易感细菌。(g)筛选出带有突变的目标基因的噬菌斑。(h)从突变的重组噬菌体制备单链DNA，通过DNA序列分析确认突变位点的正确性。(i)从重组的M13噬菌体复制型双链DNA中回收突变的目标基因(DNA片段)。(j)将突变了的基因(DNA片段)重组入表达载体进行表达。第五章受体细胞应具备的条件(1)便于重组DNA分子的导入。如易形成感受态，具有较高的转化效率；(2) 能使重组体DNA分子稳定存在于细胞中。如限制性缺陷型； (3) 便于重组体的筛选。如具有与重组体互补的遗传性状； (4) 受体细胞遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长，能进行高密度培养；对动物细胞要可悬浮培养，对培养基适应性要好；(5)安全性高，无治病性，不会对外界环境造成生物污染：感染与寄生缺陷型；(6)蛋白水解酶少,利于外源蛋白在细胞内的积累。尤其是对枯草芽孢杆菌。(7) 受体细胞的密码子偏倚性要小；(8) 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 ▲糖蛋白不能在E.coli中表达；(9) 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值；(10)对于用于基因扩增或基因高效表达的受体要用重组整合缺陷型。第六章克隆基因高表达的相关因素1有效转录开始 关键的一步，并限制外源基因表达的一步！构建表达载体的同时，选择强的和可控制的启动子和相关终止序列。2有效延长和终止转录正确 3 mRNA的稳定性4有效地转录开始5遗传密码子偏向6核糖核酸处理过程7终止密码子8表达载体9重组蛋白Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA）；正调节因子 CAP；负调节因子 lac I Tac 表达系统 tac启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂合启动子。 调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平高于 trp 和 lacUV5启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。包涵体蛋白在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起，形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体(inclusion body, inclusive body)。包涵体主要由蛋白质组成，并且大部分为外源基因的表达产物，它们具有正确的氨基酸序列，但构像却是错误的，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。包涵体形成的原因主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。此外，还有以下原因：(1)表达量过高。(2) 重组蛋白的氨基酸组成(3)重组蛋白所处的环境：温度、pH(4)缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类(5)培养条件不佳酵母基因表达载体的种类 自主复制型质粒载体:含酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和克隆位点等关键元件。较高拷贝数，细胞分裂时不能平均分配到子细胞中。 整合型质粒载体:不含酵母基因组的DNA复制起始区，但含有整合介导区。 着丝粒型质粒载体:在自主复制型质粒载体基础上构建而成，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件，可保证平均分配到子细胞中。1-2拷贝/细胞。 酵母人工染色体:以线性双链DNA形式存在于酵母细胞，每个细胞只有单拷贝。

1、概念不同质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子。载体：某些能传递能量或运载其他物质的物质。2、存在不同质粒广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。载体只作为两个物质之间沟通的桥梁。扩展资料：分类1、根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。2、根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。3、根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。参考资料：百度百科-质粒百度百科-载体

那得看是什么的载体膜上用于主动运输的载体全是蛋白质。但是在基因工程上基因的运载体却可以是质粒（一种环状DNA），病毒也可作基因的运载体所以载体不都是蛋白质；如果你指膜上的载体，那就全是蛋白质。

根据信息载体不同分为：芯片卡，磁条卡。载体（Vector） ，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。在实际生活中，胰岛素就可以通过使用载体将已插入胰岛素基因片段的质粒放入大肠杆菌内。经过插入基因片段的质粒就称作载体。该质粒在细菌内可以进行自我复制，并且不会影响到生物原来的活动。载体按功能可分为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段。主要有质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，如启动子和终止子。为了实现外源基因在不同表达载体中进行复制和表达，基因工程操作中常使用穿梭载体( shuttle vector)。穿梭载体含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的细胞中复制，如既能在原核生物中复制也能在真核生物中复制的载体，不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列( ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。

载体与片段的摩尔比例计算：先算出载体和目的基因的浓度，（可以跟mark的亮度对比估算，也能用软件计算），再根据摩尔质量比和基因的大小算出质量比，再算出体积比就行。载体与插入片段比例一般是1:10，通过测定DNA浓度来调整。单酶切片段插入时，载体一定要去磷酸化，载体易自连；双酶切二者比例要适当，比例不对，载体也会自连，因为微生物有自己的修护系统。载体按功能可分为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段。主要有质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，如启动子和终止子。为了实现外源基因在不同表达载体中进行复制和表达，基因工程操作中常使用穿梭载体( shuttle vector)。

Aactivation domain 活化结构域adapters 连接物adenine 腺嘌呤adenosine 腺ADP (adenosine diphosphate) 腺二磷酸affinity column 亲和柱AFLP (amplified fragment length polymorphisms) 增值性断片长度多态现象agrobacterium 农杆菌属alanine 丙氨酸allele 等位基因amber mutation 琥珀型突变AMP (adenosine monophosphate) 腺一磷酸ampicillin 氨?青霉素anchor primer 锚状引物annealing 退火annealing temperature 退火温度anticodon 反密码子AP-PCR (arbitrarily primed PCR) 任意引物聚合?链反应arbitrary primer 任意引物ATP (adenosine triphosphate) 腺三磷酸autosome 常染色体Bbaculovirus 杆状病毒base pair 基对base sequence 基顺序beta-galactosidase β-半乳糖?beta-glucuronidase β-葡糖醛酸糖?bioluminescence 生物发光bioremediation 生物降解biotechnology 生物技术blotting 印迹法blue-white selection 蓝白斑筛选blunt end 平(整末)端Ccatalyst 催化剂cDNA library 反向转录DNA库centromere 着丝体centrosome 中心体chemiluminescence 化学发光chiasma 交叉chromomere 染色粒chromoplast 有色体chromosomal aberration 染色体畸变chromosomal duplication 染色体复制chromosomal fibre 染色体牵丝chromosome 染色体chromosome complement 染色体组chromosome map 染色体图chromosome mutation 染色体突变clone 克隆cloning 无性繁殖系化codon 密码子codon degeneracy 密码简并codon usage 密码子选择cohesive end 黏性末端complementary DNA (cDNA) 反向转录DNAcomplementary gene 互补基因consensus sequence 共有序列construct 组成cosmids 黏性质粒crossing over 互换cyclic AMP (cAMP) 环腺酸cytosine 胞嘧啶Ddark band 暗带deamination 脱氨基作用decarboxylation 脱羧基作用degenerate code 简并密码degenerate PCR 退化性聚合?链反应dehydrogenase 脱氢?denaturation 变性deoxyribonucleoside diphospahte 脱氧核糖核一磷酸deoxyribonucleoside monophospahte 脱氧核糖核二磷酸deoxyribonucleoside triphospahte 脱氧核糖核三磷酸deoxyribose 去(脱)氧核糖dicarboxylic acid 二羧酸digoxigenin 洋地黄毒diploid 二倍体DNA (deoxyribonucleic acid) 去(脱)氧核糖核酸DNA binding domain DNA结合性结构域DNA fingerprinting DNA指纹图谱DNA helicase DNA解螺旋?DNA kinase DNA激?DNA ligase DNA连接?DNA polymer DNA聚合物DNA polymerase DNA聚合?double helix 双螺旋double-strand 双链Eelectroporation 电穿孔endonuclease 内切核酸?enhancer 增强子enterokinase 肠激?episome 游离基因ethidium bromide 溴乙锭eukaryotic 真核生物的euploid 整倍体exonuclease 外切核酸?expressed-sequence tags 表达的序列标记片段extron 外含子FF factor F因子FAD (flavine adenine dinucleotide) 黄素腺嘌呤二(双)核酸feedback control 反馈控制feedback inhibition 反馈抑制feedback mechanism 反馈机制first filial (F1) generation 第一子代FISH (fluoresence in situ hybridization) 荧光原位杂交forward mutation 正向突变F-pilus F纤毛functional complementation 功能性互补作用fusion protein 融合蛋白Ggel electrophoresis 凝胶电泳gene 基因gene cloning 基因克隆gene conversion 基因转变gene duplication 基因复制gene flow 基因流动gene gun 基因枪gene interaction 基因相互作用gene locus 基因位点gene mutation 基因突变gene regulation 基因调节gene segregation 基因分离gene therapy 基因治疗geneome 基因组 / 染色体组genetic map 基因图genetic modified foods (GM foods) 基因食物genetics 遗传学genetypic ratio 基因型比 / 基因型比值genome 基因组 / 染色体组genomic library 基因组文库genotype 基因型giant chromosome 巨染色体globulin 球蛋白glucose-6-phosphate dehydrogenase 6-磷酸葡萄糖脱氢?GP (glycerate phosphate) 磷酸甘油酸脂GTP (guanine triphosphate) 鸟三磷酸guanine 鸟嘌呤Hhaploid 单倍体haploid generation 单倍世代heredity 遗传heterochromatin 异染色质Hfr strain 高频重组菌株holoenzyme 全?homologous 同源的housekeeping gene 家务基因hybridization 杂交Iimmunoglobulin 免疫球蛋白in vitro 在体外 / 在试管内in vivio 在体内independent assortment 独立分配induced mutation 诱发性突变induction 诱导initiation codon 起始密码子inosine 次黄insert 插入片段insertional inactivation 插入失活interference 干扰intergenic 基因间的interphase 间期intragenic 基因内的intron 内含子inversion 倒位isocaudarner 同尾酸isoschizomer 同切点?JKkanamycin 卡那毒素klenow fragment 克列诺夫片段Llac operon 乳糖操纵子ligase 连接?ligation 连接作用light band 明带linker 连接体liposome 脂质体locus 位点Mmap distance 图距离map unit 图距单位mature transcript 成熟转录物metaphase 中期methylase 甲基化?methylation 甲基化作用microarray 微列microinjection 微注射missense mutation 错差突变molecular genetics 分子遗传学monoploid 单倍体monosome 单染色体messenger RNA (mRNA) 信使RNAmultiple alleles 复(多)等位基因mutagen 诱变剂mutagenesis 诱变mutant 突变体mutant gene 突变基因mutant strain 突变株mutation 突变mutation rate 突变率muton 突变子NNAD (nicotinamide adenine dinucleotide) 烟醯胺腺嘌呤二核酸NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 烟醯胺腺嘌呤二核酸磷酸nicking activity 切割活性nonsense codon 无意义密码子nonsense mutation 无意义突变Northern blot Northern印迹法nuclear DNA 核DNAnuclear gene 核基因nuclease 核酸?nucleic acid 核酸nucleoside 核nucleoside triphosphate 核三磷酸nucleotidase 核酸?nucleotide 核酸nucleotide sequence 核酸序列Ooligonucleotide 寡核酸one gene one polypeptide hypothesis 一个基因一种?学说operon 操纵子oxidative decarboxylation 氧化脱羧作用oxidative phosphorylation 氧化磷酸化作用PPCR (polymerase chain reaction) 聚合?链反应peptide ?peptide bond ?键phagemids 噬菌粒phosphorylation 磷酸化作用physical map 物理图谱plasmid 质粒point mutation 点突变poly(A) tail poly(A)尾polymerase 聚合?polyploid 多倍体positional cloning 位置性无性繁殖系化primary transcript 初级转录物primer 引物probe 探针prokaryotic 原核的promoter 启动子protease 蛋白?purine 嘌呤pyrimidine 嘧啶QRrandom segregation 随机分离RAPD (rapid amplified polymorphic DNA) 快速扩增多态DNAreading frame 阅读码框recessive gene 隐性基因recombinant 重组体recombinant DNA technology 重组DNA技术recombination 重组regulator (gene) 调控基因replica 复制物 / 印模replica plating 复制平皿(板)培养法replication 复制replication origin 复制起点reporter gene 报道基因repression 阻遏repressor 阻遏物repressor gene 阻遏基因resistance strain 抗药性菌株restriction 限制作用restriction enzyme 限制性内切?restriction mapping 限制性内切?图谱retrovirus 反转录病毒reverse transcription 反转录作用RFLP (restricted fragment length polymorphisms) 限制性断片长度多态现象ribonucleotide 核糖核酸ribose 核糖ribosomal RNA (rRNA) 核糖体RNAribosome 核糖体RNA (ribonucleic acid) 核糖核酸RNA polymerase I RNA聚合?IRNA polymerase II RNA聚合?IIRNA polymerase III RNA聚合?IIIR-plasmid R质粒 / 抗药性质粒Ssecond filial (F2) generation 第二子代self-ligation 自我连接作用shuttle vectors 穿梭载体sigma factor σ因子single nucleotide polymorphism 单核酸多态性single-stranded DNA 单链DNAsister chromatid 姊妹染色单体sister chromosome 姊妹染色体site-directed mutagenesis 定点诱变somatic cell 体细胞Southern blot Southern印迹法splice 拼接star activity 星号活性stationary phase 静止生长期sticky end 黏性末端stop codon 终止密码子structural gene 结构基因supernatant 上层清液supressor 抑制基因Ttelophase 末期template 模板terminator 终止子tetracycline 四环素thymine 胸腺嘧啶tissue culture 组织培养transcription 转录作用transfer RNA (tRNA) 转移RNAtransformation 转化作用transgene 转基因translation 翻译 / 平移transmembrane 跨膜triplet 三联体triplet code 三联体密码triploid 三倍体UVvector 载体WWestern blot Western印迹法

(1)cDNA文库是指细胞全部mRNA通过逆转录得到cDNA后被克隆的总和。cDNA的组成特点是片段中不含基因的内含子和其他调控序列。cDNA文库构建基本步骤：①制备mRNA：全RNA提取与mRNA的分离提纯；②合成cDNA：oligo dT与mRNA3"端poly(A)杂交作为引物合成第一链，第二链合成是以第一链为模板，DNA聚合酶催化。常用RNase H切割mRNA-cDNA杂合链中的mRNA序列产生的小片段为引物合成第二链的片段，再连接成完整链；③制备载体DNA：由于cDNA分子的长度在0. 5～8kb，常用的质粒载体和噬菌体载体都可以，载体选择根据文库用途确定，如噬菌粒载体具有噬菌体的高效性和质粒载体系统可以利用蓝白斑筛选的便利；④cDNA的分子克隆：cDNA连入载体，转化重组体，扩增；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，评价文库质量。文库是否有价值主要从文库含量和插入片段的大小来评价，所构建文库必须有足够多的克隆数以确保基因组cDNA每一个序列至少有1个拷贝在文库内。(2)cDNA文库同基因组文库的差别主要在于基因组文库(尤其是真核生物的基因组文库)可能包含有非编码序列，含有更丰富的遗传信息。

一样。克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

载体（vector） ，能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。必备条件　　①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入③含有复制起始位点，能够独立复制；通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。⑤载体DNA分子大小应合适，以便操作。　基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体

1、性质不同。表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。 2、组成不同。表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

克隆载体（CloningVector）：通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。

克隆载体是能够通过限制性内切酶，将目的DNA片段整合进去，并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA。通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。

①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入。③含有复制起始位点，能够独立复制；通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。⑤载体DNA分子大小应合适，以便操作。基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体。

表达载体和克隆载体有什么不同?高粉答主4778表达载体和克隆载体的区别：1、性质不同表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。克隆载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。2、组成不同表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。克隆载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

克隆载体是能够通过限制性内切酶,将目的DNA片段整合进去,并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA.通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体,在载体上插入合适大小的外源DNA片段,并注意不能破坏载体的自我复制性质.将重组后的载体引入到宿主细胞中,并在宿主细胞中大量繁殖.常见的载体有质粒,噬菌粒,酵母人工染色体.对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖,而且最好要有较高的自主复制能力.②容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好.③容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制.这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点.④容易从宿主细胞中分离纯化出来, 这才便于重组操作.⑤有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来.

http://baike.baidu.com/view/184171.htm我从这个网址搜到的，你可以看看，是4声没问题载体　　　　载体：zài tǐ　　英文单词vector ，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。 　　运载体　　在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。　　作为运载体必须具有四个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③ 含有复制起始位点，能够独立复制；④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。　　　基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体

没买过。不过我有个朋友是在里面上班的，我也有问过他们的货是不是正品，他说他们的货源是在国外很多买手代购的，是有报关的。网站我也没去看过，因为既然是这样的，那我还不如去香港买呢。听说淘宝就有帮走秀代销的。 我看中MJ家的一个包，是在国外看中，跟这朋友聊起，他们店才一万多，就是因为有点瑕疵。不过到现在还没敢下手。所。

南存辉，出生年月:1963年 籍贯:温州乐清 性别：男正泰集团股份有限公司董事长兼总裁，浙江温州人，北京商学院企业管理专业毕业，研究生学历。九届、十届全国人大代表、全国工商联常委、中美企业家协会副会长、中国机械工业联合会副会长、中国质量协会副会长、中国青年企业家协会副会长、中国国家认证机构认可委员会副主任、中国工业经济联合会主席团主席和浙江省工商联副会长，并获得“优秀中国特色社会主义事业建设者”、“中国十大杰出青年”、“世界青年企业家杰出成就奖”、“2002CCTV中国经济年度人物”、“中国十大创业领袖”、“首届中国优秀民营企业家”、“中国时代十大风云人物”、“全国乡镇企业家”、“第二届中华十大管理英才”、“中国优秀民营科技企业家”、“首届中国机械十大杰出企业家”、“97中国乡镇企业十大新闻人物”、“浙江省劳动模范”、“首届浙江商人年度风云人物资深贡献奖”、“浙江省突出贡献企业经营者”、“浙江省优秀企业家”、“浙江省功勋乡镇企业家”、“温州市改革开放十大风云人物”等称南存辉经历 1978年初中毕业后从事修鞋行当；1984年创办乐清县求精开关厂；1991年成立中美合资温州正泰电器有限公司；现任浙江正泰集团董事长、总裁鞋匠出身 眼前这个拥有几亿美元资产，目标成为国际电气巨头的南存辉，20年前初中没毕业就当上了小鞋匠。 南存辉回忆说，“我初二的时候，那时我13岁，离毕业还有15天，我父亲因为意外腿部骨折。”医生说，可能要休息一两年，而母亲身体一向虚弱，作为长子，照顾弟妹、养家糊口的生活重担就压在了南存辉的肩上。初中没毕业，南存辉就当上了小鞋匠。 回忆起当年的小鞋匠生活，南存辉说，“三年修鞋虽没赚到什么钱，但它使我懂得了诚实做人的道理，有质量便有市场。同时它也让我明白了，一个人要想有所作为，必须重视从一件件的平凡小事做起，而且任何小事要做好都是不易的。” 在修鞋的时候南存辉发现，柳市(浙江乐清市柳市镇有“中国电器之都”之称)很多供销员在全国各地揽了很多低压电器业务，开起了众多的前店后厂。“我发现这个行业发展非常快，能够赚钱，而且能够锻炼人，所以我就把修鞋停下来，转而搞起了电器行当。”南存辉说。 “开始就是你几十块、他几百块钱地投入，钱并不是很多。我和朋友4个人合伙摆了一个柜台，第一个月赚了35块钱，而且自己每天都干到凌晨5点钟，但我很高兴，第一个月就成功了，没有亏本。”南存辉说，“做事业的人不要妄想发横财，要靠心血和汗水来换取。” 艰难创业 1984年，南存辉发现，低压电器行业市场前景很大，但光靠个人力量不行，光靠一个小打小闹的门面更不行。这个时候，他的小学同学胡成中找到了他，想跟他一起合伙办厂，于是南存辉与胡成中一起投资5万元，办起了“乐清县求精开关厂”。 这个求精开关厂就是现在的正泰和德力西电气的前身。胡成中就是现在的德力西集团董事长。 “刚开始办厂其实很难，因为自己什么都不懂。技术不懂、质量不懂，市场在哪里又不知道。没有设备、没有技术、没有人、没有资金，万事开头难，让人伤透脑筋。”南存辉回忆说。 刚办企业时，南存辉在“借”字上大做文章，请人才、借脑袋，并利用人家的设备来生产自己的产品。当时技术上要靠上海，于是南存辉去请了几个工程师来指导。求精开关厂慢慢发展起来。 既然发展起来，为什么会出现一个正泰，一个德力西呢？ “有人说，民营企业难过但必须过的三关就是分银饷、排座次、轮荣辱。刚开始这种问题并不明显，但是企业有了知名度之后，地方政府为了鼓励发展经济，给企业领导人评个先进、给个奖励什么的，企业是两个人办的，给谁好呢？”南存辉笑着说，“于是最初，我们想出了‘厂长轮流做"的办法，我今年当厂长，你当法人代表，明年你当厂长，我当法人代表。较好地解决了这些问题。” 直到1990年，“求精开关厂”分为两个车间，总资产200万左右，产值做到1000多万，双方也各有亲戚、朋友进入管理层，南存辉与胡成中在一些经营决策问题上开始偶有争议。于是就分家了。 “正泰”问世 如果南存辉与胡成中不分家，会变成什么样子？南存辉笑着说：“那就不好说了。”但事实上，虽然分家了，正泰和德力西仍然脱离不了关系，因为他们是同业内最强的竞争对手。而现在，这两大巨头已经成为资产超过百亿的国内数一数二的民营企业。 分手后，南存辉与几个亲戚成立了一个家族企业，1991年，他又拿出其中的一部分与美商合资，建立了中外合资企业，“正泰”这一名称由此问世。 关于正泰的名称由来，南存辉说，“1991年求精厂分家那阵子，柳市电器企业无序竞争严重。有许可证没许可证的、质量好的质量差的混在一起，一

很确定的说一贫就是李逍遥，一贫仙缘散尽忆如梦中的剧情魔尊混天死后，魔族余众遭到人界修真门派（蜀山，仙霞，琼华，蓬莱······）的全力追杀。无奈魔族长老只好将魔尊幼子伐天的“魔天之灵”注入幼婴韩仲晰体内，以躲过正派的追杀。而韩仲晰恰好被李逍遥所救，并送给阿奴抚养。从此伐天的记忆一直在韩仲晰体内沉睡直到仙剑ol情节发生。韩仲晰的人生充满了曲折，他出生后即遭到遗弃，由蜀山掌门李逍遥捡回后，托付给白苗族长阿奴抚养长大。在白苗族的岁月，白苗族人都称呼韩仲晰为“少主”，而韩仲晰也和白苗族人们相处愉快，度过了一段欢乐的时光。后来在杭州的客栈中，韩仲晰认识了李逍遥之女李忆如，两人一见如故结伴同行。被李忆如称呼为“傻小子”、“韩大哥”的韩仲晰，在冒险的途中时刻伴随忆如左右，常常挺身而出搭救忆如，两人之间产生了懵懂的情愫……终于有一天，伐天的“魔天之灵”被唤醒，虽然韩仲晰对忆如还是一往情深但也不忘自己是伐天，更忘不了自己身为魔族少主的使命和李逍遥的杀父之仇。“伐天”希望得到其父亲魔尊在神魔之井的强大力量而天下无敌，并对人界进行疯狂的复仇报复。林月如死于这次“人魔之战”，而伐天的魔族最后被人界正派围困在蜀山之顶。为了部众韩仲晰提出和李逍遥1对1单打独战，如果自己取胜则只杀了李逍遥报杀父之仇，然后率魔族部众返回魔界永不踏入人间；如果自己死了，则请李掌门放过其他魔界生灵返回魔界。虽然众人反对这场决斗，怕伐天杀了李逍遥后继续挑动人魔两界的战斗，但李逍遥同意了韩仲晰的要求，并与韩仲晰在锁妖塔1对1单挑，两人中只能有一个人能活着离开。此时的李逍遥陷入了2难的境界，首先如果自己死了，就算伐天肯停战，那些魔族长老也会继续进攻人界，那时人界就将生灵涂炭，而自己就会对不起天下众生；如果自己取胜杀了伐天则就意味着自己杀死了自己的女婿，杀死了自己的义子，杀死了自己外孙女（小蛮）的父亲，就会对不起忆如，对不起忆如肚子里的骨肉。众人离开锁妖塔在外边焦急等待。过了很久很久，终于走出了一个人，那个人是李逍遥，忆如扑到李逍遥怀中痛哭不止。其实韩仲晰为了李逍遥不为难，为了李忆如不恨自己（如果自己杀了李逍遥，李忆如永远都不会原谅韩仲晰），为了给自己的魔族留点生灵，在和李逍遥决斗时手上留招最后胸口撞死在李逍遥的七星宝剑上。而李忆如在韩仲晰死后就渐渐憔悴，最后勉强生下女儿难产而亡（时年17岁）。李逍遥在丧失女儿女婿后，接连打击令其痛苦不堪，借酒消愁，将掌门之位传于剑圣孤独宇云的大弟子太武，自己则遁入空门，取名为一贫如洗中的“一贫”为道号，虔心修炼，不问世俗

历史上的记载有时候也是不完整的，有时候就会让我们对一些名人产生一定的误解，这个就不得不提李鸿章了，后人对李鸿章并不是特别了解，那么李鸿章和慈禧太后之间有哪些内幕呢？提到李鸿章大家的第一反应就是“卖国贼”，因为他签订了丧权辱国的《辛丑条约》，这是中国近代史上最不平等的条约，使中国完全沦为半殖民地半封建社会。除了《辛丑条约》，李鸿章这一辈子前前后后签订了三十多个不平等条约，所以李鸿章就成了“卖国贼”，人们对他也是恨得牙痒痒。这就是中国人先入为主的传统思想，在那个时代，被骂得最多的不是日本人而是李鸿章，但是我们抛开这一系列的条约，看看李鸿章这一辈子做出的贡献：李鸿章主持了洋务运动，魏源所提倡的“师夷长技以制夷”被他体现的淋漓尽致，创建了海军，创办了一系列近代化企业，主张引进国外先进技术。李鸿章一生都在为国家效力，但是毕竟只是个官员，他没有可以随意签订条约的权利，那么这个权利是谁给的呢？毫无疑问，是慈禧太后，慈禧太后的一生都极为奢侈，只考虑自己过得好不好，不会去考虑当时老百姓的生死，当时北洋水师全军覆没的一部分原因就是慈禧只顾着办大寿，导致北洋水师没有经费。慈禧太后在被八国联军打的抱头鼠窜的时候，烂摊子只能交给李鸿章去收拾，李鸿章是不得不签。他就是个彻头彻尾的“背锅侠”。作为一个大臣，一生都在为朝廷做贡献，到最后却落得个人人喊打的下场，也是很可悲了。不知道你们对于李鸿章有什么看法呢？

这个活动还有呢，我上次是在主题活动那个专栏里面看到的，呵呵！还参加了一次呢，用招行的卡在上面消费的，不过伤心的是，我抽奖没抽到奖品~~呜呜！朋友还抽到一个MP4呢。活动到8月31号才结束呢，现在还能参加的。

　　断路器其实就是一种开关装置，这种开关装置能够在规定的时间内承载和开断异常回路条件下的电流，是一种配电环节中十分必要的设备，断路器的分类也是十分广泛的，按断路器的使用范围可以分为高压断路器与低压断路器，我们一般将3kV以上断路器的称为高压电器，断路器的品牌也是十分繁多的，那么今天我们就挑选了一些品牌来为大家做一个具体的介绍。　　　　施耐德　　全球能效管理专家施耐德电气为100多个国家的能源以及基础设施、工业、数据中心以及网络、楼宇与住宅市场提供整体解决方案，其中在能源和基础设施、工业过程控制、楼宇自动化与数据中心与网络等市场处于世界领先的地位，在住宅应用领域也拥有强大市场能力。致力于为客户提供安全、可靠、高效能源，施耐德电气2010年销售额为196亿欧元，拥有110，000多名员工。　　　　ABB　　ABB集团位列全球500强企业之一，集团总部在瑞士苏黎世。ABB由两个历史100多年国际性企业瑞典阿西亚公司(ASEA)与瑞士布朗勃法瑞公司(BBCBrownBoveri)在1988年合并而形成的。两公司分别成立于1883年与1891年。ABB是电力与自动化技术领域的领导厂商。ABB技术可帮助电力、公共事业与工业客户提高业绩，同时降低对环境不良影响。ABB集团业务遍布了全球100多个国家，拥有13万名的员工，2010年销售额高达了320亿美元。　　　　正泰　　浙江正泰电器股份有限公司创立于1997年8月，是正泰集团核心的控股公司，也是中国低压电器行业产销量最大的企业。公司专业从事配电电器、控制电器、终端电器、电源电器与电力电子等100多个系列、10000多种规格低压电器产品的研发、生产和销售。公司荣获全国质量管理奖、首届浙江省政府质量奖、首届温州市市长质量奖，并于2010年1月21日在上海证券交易所成功的上市，成为中国第一家以低压电器为主业A股上市公司。　　　　在上文中，我们为大家介绍了有关断路器的品牌的一些信息，我们在这篇文章中一共为大家介绍了三个品牌的信息，这三个品牌分别是施耐德、ABB以及正泰，其实这三个品牌相信大家在生活中或多或少也有听说过，这三个品牌算得上是经验比较丰富且质量也值得大家信任的大品牌，如果大家有购买断路器的想法，不妨参考这三个品牌下面的产品，具体细节可以咨询商家。土巴兔在线免费为大家提供“各家装修报价、1-4家本地装修公司、3套装修设计方案”，还有装修避坑攻略！点击此链接：【https://www.to8to.com/yezhu/zxbj-cszy.php?to8to_from=seo_zhidao_m_jiare&wb】，就能免费领取哦~

朋友，这里你确实弄错了仙剑4中韩菱纱的大伯是叫 韩北旷以下是仙剑4中相关剧情的对话韩菱纱：你……把头抬起来，让我看一看好吗？慕容紫英：菱纱？划船人：……韩菱纱：你、你不敢吗？！你到底是谁？划船人：…………韩菱纱：……划船人：……唉，丫头，你还是这么精灵，真拿你没办法……韩菱纱：伯父，真的是你？！怎么可能？！慕容紫英：……！韩菱纱：伯父，为什么你会在这里？为什么你要装作不认识我？要不是、要不是我认出你的轮廓……韩北旷：丫头，你就当作没看见伯父好不好？韩菱纱：不好！我明明看见了！你都不知道，我有多想你，在转轮镜台的时候，我以为你已经转世去了，所以才不出现……韩北旷：傻丫头，我要是转世，今天不就救不了你了？韩菱纱：……伯父，你说什么救不了我？为什么你会在这里划船？韩北旷：……不止是我……几乎所有韩家人，死后都会在鬼界做苦役……我便是负责摆渡这青竹船，必要时往来人鬼两界……韩菱纱：苦役？那是什么？他们怎么能让你做这种事呢？！韩北旷：…………韩菱纱：伯父，你说嘛！告诉我好不好？韩北旷：丫头，我刚才不想与你相认，就是在犹豫要不要告诉你一些事，对你来讲，现在就知道这些，未免过于沉重了……韩菱纱：伯父，到底是怎么回事？！我要知道！韩北旷：唉……韩氏世代盗墓，总以为人已入土，墓中器皿当可拿来救助活人，但如今你来了鬼界，应该知晓，鬼也如活人一般，有自己的感情、自己的种种思念……韩北旷：我们一族惊扰死者，不仅生死薄上阳寿短暂，很多都只活到二三十岁，即便死后，也一样要做苦役来赎罪，待到罪孽偿清，才可再入轮回了……　韩菱纱：竟然、竟然这样……韩菱纱：也就是说……我一直在找的长生之法，根本没有用？不管我怎么努力，也不能让族人活得更长久一些……韩北旷：丫头，我知道你很努力了，但是有些东西，冥冥之中自有安排，不是你一个人能够争得过……韩菱纱：那，爹和娘呢？他们在哪？韩北旷：……自然也在鬼界的其他地方赎罪。韩菱纱：……韩北旷：丫头，你老实告诉我，你是不是一直很气自己爹娘？觉得他们待你不好？韩菱纱：我……韩北旷：唉，他们啊，知道自己多半命不长久，所以才故意对你冷淡，就是怕你依赖惯了，万一双亲离世，会太伤心，这世上又哪有爹娘不喜欢自己的孩子呢？韩菱纱：伯父，你说的、都是真的吗？！韩北旷：当然是真的！记得你还小的时候，你爹每天晚上非要在床边看你睡着了，他才肯睡，他就是有股傻劲，总觉得不多看几眼，多唤你几声名字，以后就没机会了……韩菱纱：……真是个傻爹爹，还有娘，也好笨！韩菱纱：人活一辈子，本来就够短暂了，他们还要在意这在意那，害我伤心了好多年……韩北旷：……丫头……你真的长大了，看事情有自己的想法了……韩北旷：……似乎、也结识了很好的朋友……旁边这两位都是吧？云天河：对啊，我和菱纱是很要好的朋友，呵呵。慕容紫英：晚辈慕容紫英，刚才多有失礼了。韩北旷：慕容？难道是大燕国的遗族？慕容紫英：……！前辈如何得知？韩北旷：唉，我也是脑中灵光一闪而过，想到很久以前有一对夫妇，前去轮回井投胎……眉目间和你很有几分神似……而且慕容这个姓可不多见，曾是燕国的大家之姓……韩北旷：你爹……是不是叫慕容承？慕容紫英：……正是家父。韩北旷：那就没错了。慕容紫英：…………原来……原来爹和娘都已经过世……这么久了……韩北旷：你也不用太过伤心，你爹和你娘神色平和，生前应该是过得很安泰。韩北旷：只是他们似乎有些遗憾，没能在死之前再见自己的小儿子一面，说是因为那孩子年幼时体弱，家里不但请来道士替他批命取名，更是将他送去了仙山上修行，但愿他能活得长命百岁。慕容紫英：……爹、娘…………韩菱纱：（紫英……）韩北旷：鬼界有种说法，叫作生前种种隔世抛，与其一直挂念，不如在心里希望过世的亲人朋友，投胎以后能够一生顺遂……慕容紫英：……多谢前辈指点，晚辈……晚辈都明白……韩菱纱：（哪有那么容易看透，紫英你又在逞强了……不然为什么要露出那种悲伤的神情……）韩北旷：唉，是我该谢谢你们，一直照顾我家丫头。韩菱纱：伯父，你说什么呢……旁边这个倒也罢了，后面的那个啊，可是我一直在照顾他呀！韩北旷：哈哈，不管怎样，伯父今天能见到你，觉得很高兴……韩菱纱：我也是……伯父，你先别走，再多和我说些话好不好？韩北旷：……时候差不多，你们该回阳间了。韩菱纱：伯父，我会告诉族人，让他们别再去惊扰死者了……不过有机会的话，我还是要去找长生之法。韩北旷：丫头，别总那样辛苦，多为自己想想吧。韩北旷：你出落得这么漂亮，记得找个好相公嫁了！我看你身后两个都不错啊！哈哈！韩菱纱：伯父！++++++++++++++++++++++++++++++++++++至于韩仲晰，是仙剑OL中的角色按照仙剑OL的说明，是仙剑2中在五华山被李逍遥杀死的魔尊的儿子以下是其相关信息姓名：韩仲晰（灵为伐天）种族：人族（伐天与真正的韩仲晰融合后为魔族）年龄：未知父亲：韩医仙（真正韩仲晰的父亲）、仙二魔尊（非重楼，伐天的父亲）姐姐：韩梦慈（真正韩仲晰的姐姐）姐妹：月柔霞（伐天的姐妹，仙二魔尊之女，她与伐天的年龄大小未知。）姐夫（也可能为妹夫）：姜清（月柔霞的丈夫）外甥女：姜婉儿（清柔师太，仙霞派掌门，月柔霞与姜清之女）养母：阿奴（韩仲晰称其为姑姑，仙五海棠夫人）武器：魔刀喜欢：李忆如两个根本就不是一个人至于小蛮，也只能确认是李忆如的女儿姑且不谈仙剑OL不被姚仙认可的事情，单说其中，也只说了李忆如与韩仲晰的一段感情，并没有结果祝你玩得愉快!!!

还不错的哦。

win10关闭自动更新的方法：工具：win10系统1、对于Windows10专业版及其以上版本的操作系统，可以通过组策略编辑器来控制Windows10系统的更新功能，那么先按下Windows徽标键+R键，打开运行窗口命令，在窗口命令中输入“gpedit.msc”。2、打开组策略编辑器以后，先依次点击计算机配置-管理模板-Windows组件菜单选项。3、接下来，在Windows组件菜单窗口中，点击选择“Windows更新”子菜单项，然后在右侧的配置选项中找到“配置自动更新”。4、双击右侧的“配置自动更新”选项，在打开的页面中默认是未配置选项，如果想关闭自动更新功能，要在左侧选项中选择“已禁用”，然后点击确定按钮，这样便可以顺利关闭Windows10系统的自动更新功能。注：系统更新是提升性能的，关闭了自动更新，自己要记得更新系统。

正泰的发展史，既是一家民营企业的创业史，更是一部中国自主品牌的成长史。二十余年励精图治，正泰一步步向国际化迈进。 起步与积累阶段（1984年～1990年） 1984年7月创立“求精开关厂”（正泰集团与德力西集团的前身）。从5万元起家，本着“精益求精”的精神，依靠质量和信誉求得生存，完成原始资本积累，为企业的发展奠定了基础。 定向发展阶段（1991年～1993年） 1991年建立中美合资正泰电器有限公司，引进国外先进技术和设备，充分利用合资企业的优惠政策，发展壮大企业实力，并确立了电器专业化发展方向。标志性的事件是1993年9月正泰首栋办公大楼落成，提出“重塑温州电器新形象”的口号。 规模扩张与集团化经营阶段（1994年～1996年） 1994年2月，成立国内低压电器行业第一家企业集团。以资本为纽带，以市场为导向，以产品为龙头，以品牌为中心，横向联合，走上规模经济之路，使企业迅速发展壮大。 集团化向控股（集团）公司过渡阶段（1997年～2002年） 1997年7月21日，集团内首家规范的股份有限公司“浙江正泰电器股份有限公司”经浙江省人民政府批准成立。以此为契机，对集团所属企业进行股份制改造，组建股份有限公司和有限责任公司，按照现代企业制度的要求发展企业，并向国际化企业迈进。 提升与跨越阶段（2003年至今） 确立“打造国际性电气制造基地”目标，逐步形成柳市为低压、仪表和建筑电器制造基地，上海为高压输配电设备制造基地、嘉兴为输配电配套设备基地，杭州为工业自动化和太阳能生产基地的“长三角布局”。自主创新成为企业发展主旋律，先后获得各种国内外专利200多项，领衔和参与制订各种行业标准30多项。同时，加快企业上市工作，推进资本经营与产品、产业经营同步发展，互为促进。

没有小蛮不幸福小蛮娘是忆如，这是肯定的，但是小蛮父亲倒地是谁，一直也没个定论。其实关于忆如的故事，大部分是在09年的仙剑ol里面。不过姚仙当初说过，仙剑ol的故事大家可以当同人看，和电视剧一样处理就好了。那么小蛮她爹倒地是谁，李忆如嫁给了何人，这就成了仙剑史上最大的谜团。先说下小蛮她爹不会是韩仲晰的原因。先推测李忆如年龄。剑OL剧情，李忆如和韩仲晰相遇，李忆如16岁。仙剑五，李逍遥至少58岁，仙剑五前结局时，李逍遥38岁。仙剑一剧情开始，逍遥19岁，结局时，差不多过了一年，赵灵儿怀胎十月，差不多就是一年，逍遥20岁。那么，逍遥大忆如20岁，因此，五前结局，忆如18岁。五前结局，雨柔出生，雨柔大小蛮四岁，雨柔出生四年后，小蛮出生，此时忆如22岁。忆如不可能怀胎6年除非出现类似紫萱那样封印女儿的特殊情况。然后，如果小蛮的父亲是韩仲晰，由于韩仲晰是魔族，所以小蛮应该也有魔族血统。但是根据仙剑五剧情，主角一行人来到神魔之井大门前面，守门的两位魔将只允许姜云凡和龙幽通过，却不允许小蛮和雨柔通过。可见，小蛮无魔族血统，其父不可能是魔族。结论：小蛮之父，忆如的丈夫不是韩仲晰。最后，虽然可以得出结论小蛮的父亲不是韩仲晰，但是也不知道小蛮的父亲到底时谁？唯一能得出结论是忆如22岁才生的小蛮~那么小蛮的父亲到底是谁呢，求姚仙给解释啊。

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韩是仙剑2中魔尊的儿子，经仙剑ol剧情证实，仙剑2中魔尊死后其强大力量没有被完全销毁，其力量被封印在神魔之井（从这点看仙剑2魔尊被正名为魔），韩原名伐天，在很幼小时由于魔族被正派追杀其部下没有办法将其“灵”（忘了叫什么了就叫灵吧）送到小韩仲晰体内，就是说伐天进入了仲晰体内因此正派人士没有找到伐天，而韩仲晰恰被李逍遥所救，送个阿奴抚养。从此伐天的记忆一直在韩仲晰体内沉睡直到仙剑ol情节发生。后来伐天记忆觉醒想控制韩仲晰的身体，但是招到韩仲晰顽强抵抗，后来伐天想到和韩仲晰记忆融合就是谁也不把对方压倒同时拥有两个人的记忆，后来成功。于是新韩仲晰同时拥有伐天和韩仲晰得记忆。对忆如依然情深地固，但对李逍遥一样恨之入骨，定要报杀父之仇。最后魔族进入锁妖塔准备夺某样东西，由玩家和众位主角（忆如，月如，盖罗娇）进入锁妖塔阻止，最后见到新韩仲晰。忆如希望韩仲晰回心转意，但韩仲晰虽然对忆如情深但也不忘了自己是伐天，希望得到其父亲魔尊在神魔之井的强大力量而天下无敌。此时伐天力量觉醒7层。最后李逍遥和酒剑仙赶到，由于魔族部队在最后被大家（蜀山，仙霞，众主角，玩家，师叔）等人消灭（被消灭者包括魔族左使青凤和鼠王等），韩仲晰提出和李逍遥1对1单独战斗，虽然众人反对认为这样李逍遥过于危险，但李逍遥同意了韩仲晰的要求，并与韩仲晰在锁妖塔1对1单挑，两人中只有一人能活着离开，如果李逍遥死了，伐天离开锁妖塔后一样会被守在外边的正派人士杀死只是完成了他报仇的心愿。众人离开锁妖塔在外边焦急等待。过了很久很久，终于走出了一个人，那个人是李逍遥。忆如扑到李逍遥怀中痛哭不止——仙剑ol剧情结束。李逍遥为何被困交代不详，黑苗族水魔兽事件交代不详，沈家堡联合辽国事件交代不详。伐天是仙剑2魔尊的儿子不是孔麟的儿子。孔麟是魔族右使。

　　黑兔青龙其实是来自《推背图》中的预言，这是道士袁天罡和李淳风编写的，主要推算大唐的走向，而其中就有黑兔青龙这一说法，但是现在的很多人不知道这说的是什么意思，而有人说黑兔青龙有大事这又是何说法呢，一起来看下 推背图 里面的详解吧！ 　 　黑兔青龙有大事是什么意思 　　“黑兔走入青龙穴”有两层意思。1表示年份，由 兔年 到 龙年 。2，走入不是误入，走入是意进入，误入是无意迷入。黑兔吃了豹子胆走入龙穴，意在何为？所以此句揭示黑兔有篡位之意，是自不量力之举。“欲尽不尽不可说”一句表示此兔遭到囚禁，生死不由己，然而拒不交代，因为有不可说的秘密。 　　《 推背图》由来 　　《推背图》是中华预言第一奇书，传说它是唐太宗李世民为推算大唐国运，下令当时两位著名的道士袁天罡和李淳风编写的。 　　传说此袁李二人精通阴阳八卦奇门 术数 ，道术高深，并具有洞察未来的能力。因李淳风夜观天象，结合“武周代唐”之言，于是一时兴起，开始预言推算；李淳风以术数易卦推衍，一算起来就上了瘾，一发不可收拾，竟推算到唐朝以后两千年的历史。直到袁天罡推他的背，说道：“天机不可再泄，还是回去休息吧。”即第六十象所述，是以《推背图》之名由此而来。 　　《推背图》融合了易学、天文、诗词、谜语、图画为一体。预言了从唐木运开始、至明火运世程近两千年，一直到社会共产共和的世界大同，即将发生在重大社会历史事件。是中国历史上“最为经典”的未来学巨著。

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在经济全球化时代，正泰电器坚持国际化、科技化、产业化发展战略，大力开展制度创新、科技创新和管理创新，实现产品由中低档向中高档扩展，市场由国内向全球扩展，价值链由提供单体产品向提供系统解决方案扩展，经营由以线性为主向包括并购与资本运作在内的全面现代企业运营方向扩展，力争使正泰成为世界一流的低压电器全面解决方案提供商。日前，财富中文网公布2013年中国企业500强排行榜。浙江正泰电器股份有限公司上榜。该排行榜覆盖中国境内外上市的所有中国公司，依据数据为上市公司在各证券交易所正式披露信息。排行榜由北京中能兴业投资咨询有限公司与《财富》（中文版）合作编制完成。今年中国500强上榜的门槛继续提高到72.5亿元。正泰集团股份有限公司始创于1984年7月，现有员工23000余名，下辖8大专业公司、2000多家国内销售中心和特约经销处，并在国外设有50多家销售机构。产品覆盖高低压电器、输配电设备、仪器仪表、建筑电器、汽车电器、工业自动化和光伏电池及组件系统等七大产业，产品畅销世界90多个国家和地区。正泰集团是中国工业电器行业产销量最大的企业之一，综合实力连续多年名列中国民营企业500强前十位，年利税总额连续三年名列中国民营企业纳税百强前五名。正泰商标被认定为中国驰名商标，四大系列产品跻身中国名牌。其所生产的正泰牌万能式断路器、塑料外壳式断路器系列产品荣获中国名牌产品称号。公司于2004年荣获中国质量管理领域的最高奖——全国质量管理奖。

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又双叒上热搜是一种什么体验？兰州大学可能深有体会！先是高颜值月饼喜提热搜，后是兰大学子把宿舍装成ins风惊艳全网，到如今兰大医学生手绘解刨图走红网络。这就是一所“宝藏大学”吧！现在带大家走进兰州大学，一探究竟。一、宿舍四人间标准化公寓上床下桌，有自习室，洗衣房，热水间；有阳台，物品柜。各类设施设备是非常齐全的，通向上铺楼梯同时也有储物的功能，但是也有上下铺的主要得看分配时的运气如何了。二、餐厅兰州大学为了“让学生吃好”可谓下足功夫，称之为“舌尖上的兰大”也不为过。除了网罗天南地北美食的常规操作，兰大经常做出一些出乎意料之举“火”上热搜。先是兰州大学推出的定制版月饼喜提“热搜”，随后《人民日报》发博称赞兰大在封校期间，推出移动烧烤车。看着这诱人的小黄车，感动的泪水从口边流出来了，难怪不少人@自己的学校来“抄作业”。三、教学楼因为校区占地面积比较大的原因，所以从宿舍到教学楼的距离相对来说就比较远，经过专业数据统计，多媒体教室75间、远程网络互动教室4间、双屏显示教室13间、多屏互动研讨教室2间、环形研讨教室1间、阶梯教室3间；主要是教学楼内基本都提供了万兆上联、千兆至桌面的高速有线网络（网速很快），可随时随地高速上网。四、图书馆目前，兰州大学有两座图书馆，分别被命名为积石堂和昆仑堂。这里藏书总量丰富，涵盖学科种类齐全，你想要的资料这里都能找到。其实，从文章实拍的图片来看，兰大学风浓厚，尤其晚上图书馆总是人员爆满。另外，兰州大学坐落于美丽的金城兰州。不同于刻板印象，这里冬无严寒，夏无酷暑，乃享誉中外的避暑胜地。换句话说，当身处南方的同学冬天取暖基本靠抖，夏天则要靠空调“续命”时，兰大的学子凭借一床凉被走四季。所以兰州大学是很值得报考的一所学校。

好看难看是根据个人欣赏的，和购买的网站不一样如果你去专柜，不试就拿一条，也容易上身难看。李维斯和LEE也不是什么高端裤子，出现裤型难看的款很正常建议你下次购买的时候，找准适合自己的型号比如501是基本款，514很修身，505肥大

李忆如是将自己全部灵力瞬息传给小蛮，然后去世的。具体剧情：生下小蛮的六年后，韩仲晰因身体原因终究走到了最后一程。临终前，韩仲晰表示对不起忆如，为了他不能回家，甚至婶婆过世也没能看到她最后一面。忆如为了让他安心，表示她和他与小蛮在一起的日子，是她最珍贵的时光。韩仲晰交代完后事，便离世。忆如抱着小蛮哭得伤心，突然怀中的小蛮没有动作，忆如检查发现她昏迷。忆如带着小蛮前往蜀山，找草谷前辈为小蛮看病。草谷让忆如陪小蛮住下来，同时，请逍遥随她去抓药。忆如隐隐知道草谷是私下与父亲谈话，于是在药房外偷听。草谷诊断出小蛮因父母原因而真元缺损，若是普通孩子则可不用修行；但小蛮是女娲族人，随着成长要从母亲身上吸取女娲灵力，对小蛮而言是增加了负担。负担到小蛮承受不了会昏迷不醒，女娲族本能已开始毁掉小蛮的真元，女娲灵力返回给母亲。而解救方法是忆如将全部的女娲灵力瞬息给小蛮，重新塑造真元。只是忆如没有几日可活。忆如听完草谷的话，毅然将自己的女娲灵力全部传给了小蛮，没过几日忆如便去世。李忆如性格特点从小没有母亲陪伴，父亲也久久才能看到一次，但是在李大娘细心的教导与仙灵岛优良的环境下，养成了爽朗率直、胸襟宽大的个性，好奇心强，爱好和平，厌恶争斗，对人没戒心，是个调皮可爱、无心机的可爱女孩。从小就是众人手上的心肝宝贝，所以对长辈比较没大没小。又因为自小在仙灵岛水月宫长大，世面见得不多，相信人性本善，常幻想外边的世界，新鲜好玩。而不经大脑的调皮捣蛋、没有修饰的说话方式，有时叫人头疼。

就是假的，我收到一瓶娇韵诗的红魔晶纤体精华是假的，我要退货，走秀就让我出具质检证明？算了，懒得折腾，就当花钱买教训，以后不会再买了，姐妹们擦亮眼睛，走秀网上不让顾客评论，坑一个是一个~~~~ 我早两天在走秀网上买了一瓶娇韵诗的红魔晶纤体精华，打开快递包装我就感觉不对劲了，外包装破烂不堪，瓶子外面没有塑封，就跟别人用过了的一样。瓶子上的字母还在掉漆，打开味道完全不对。因为原来一直在专柜买，用过很多瓶，我一看瓶子就知道是假的，正品的质地，气味，包装跟我收到的这瓶完全不一样。打电话投诉，要求退货，走秀网就 不断的强调他们的东西没问题，可能是进货渠道不一样。。。总之一堆屁话。我说我是老顾客了，在走秀网上买了几年了，也买了不少东西了，如果不是东西本身存在问题，我不会去要求退货，也不会无理取闹。他们所说的7天包退换就是扯谈，我说要退货，他们就说要去质监部门拿出证据才行？那当初走秀网你们卖东西的时候为什么不提供发票，质检证明？出了问题就死不承认。我买这瓶娇韵诗之前还特意在百度上搜了一下，看网友们评价怎么样？也有好多网友说买到假货的，因为自己平时也在走秀上买了很多东西，基本还算满意，加上这瓶娇韵诗比专柜上也就便宜了80块钱，我心想应该也不会有什么差别，收到后才发现自己中招了。说实话我真想拿去质检什么的？但这一瓶小小的东西，拿去折腾，耗不起这时间和精力。百度上中招的网友也有很多？？投诉无门，只能认栽么？？？难道真的就没有人出来管管么？？？ 我现在总算明白为什么走秀网上不让顾客评论了？？有的顾客不懂得辨别真假，走秀就是坑一个是一个？反正他不会退货，，买到假的只能认倒霉！！！！走秀你敢开放客户评论么？？？估计投诉的人会一大堆，好多吃了哑巴亏的，就这么算了。本来我觉得走秀挺好的，一直还挺满意，到现在都还有一个订单没收到货。这次的购物遭遇，让我特别失望，走秀的处理态度也跟他们承诺的完全不一样。总之我是不会再在走秀网上买东西了，现在跟原来比差太多了。走秀你以前搞代购挺好的，现在融资弄什么电商平台，供货商参差不齐，质量完全没法保障。 在此给打算在走秀网上买东西的网友们提个醒，擦亮自己的眼睛，像妆品这类的东西，最好还是去专柜上买，也没差多少钱，有条件的可以去香港和免税店买，或者让朋友带。妆品不比别的，假货不知道什么东西做的，用在自己身上，还真的有点不太放心。今天走秀客服给我来电话说半天都是说自己货没问题，如果我觉得是假货要退，必须要拿出质检证明。。。。。算了，我就自认倒霉，当花钱买教训了，其他姐妹们一定要慎重啊！！！

韩是仙剑2中魔尊的儿子，经仙剑ol剧情证实，仙剑2中魔尊死后其强大力量没有被完全销毁，其力量被封印在神魔之井（从这点看仙剑2魔尊被正名为魔），韩原名伐天，在很幼小时由于魔族被正派追杀其部下没有办法将其“灵”（忘了叫什么了就叫灵吧）送到小韩仲晰体内，就是说伐天进入了仲晰体内因此正派人士没有找到伐天，而韩仲晰恰被李逍遥所救，送个阿奴抚养。从此伐天的记忆一直在韩仲晰体内沉睡直到仙剑ol情节发生。后来伐天记忆觉醒想控制韩仲晰的身体，但是招到韩仲晰顽强抵抗，后来伐天想到和韩仲晰记忆融合就是谁也不把对方压倒同时拥有两个人的记忆，后来成功。于是新韩仲晰同时拥有伐天和韩仲晰得记忆。对忆如依然情深地固，但对李逍遥一样恨之入骨，定要报杀父之仇。最后魔族进入锁妖塔准备夺某样东西，由玩家和众位主角（忆如，月如，盖罗娇）进入锁妖塔阻止，最后见到新韩仲晰。忆如希望韩仲晰回心转意，但韩仲晰虽然对忆如情深但也不忘了自己是伐天，希望得到其父亲魔尊在神魔之井的强大力量而天下无敌。此时伐天力量觉醒7层。最后李逍遥和酒剑仙赶到，由于魔族部队在最后被大家（蜀山，仙霞，众主角，玩家，师叔）等人消灭（被消灭者包括魔族左使青凤和鼠王等），韩仲晰提出和李逍遥1对1单独战斗，虽然众人反对认为这样李逍遥过于危险，但李逍遥同意了韩仲晰的要求，并与韩仲晰在锁妖塔1对1单挑，两人中只有一人能活着离开，如果李逍遥死了，伐天离开锁妖塔后一样会被守在外边的正派人士杀死只是完成了他报仇的心愿。众人离开锁妖塔在外边焦急等待。过了很久很久，终于走出了一个人，那个人是李逍遥。忆如扑到李逍遥怀中痛哭不止——仙剑ol剧情结束。李逍遥为何被困交代不详，黑苗族水魔兽事件交代不详，沈家堡联合辽国事件交代不详。伐天是仙剑2魔尊的儿子不是孔麟的儿子。孔麟是魔族右使。

关闭Win10的自动更新需要在win10桌面找到“我的电脑”，选择“管理”。在“我的电脑”中右侧找到“服务和应用程序”点击“服务”。然后根据以下步骤点击“确定”，win10系统自动更新关闭完成。1、首先，在win10桌面找到“我的电脑”，右键点击“我的电脑”选择“管理”。2、然后在“我的电脑”中右侧找到“服务和应用程序”点击“服务”。3、然后在右侧目录中找到“Windows Update”，双击选中。4、然后在“Windows Update”中找到“常规”，启动类型选择“禁用”。5、然后在“恢复”位置“第一次失败”和“第二次失败”都改为“无操作”。6、然后点击“确定”，win10系统自动更新关闭完成。注意事项：1、在使用电脑的时候，要定时的对电脑文件进行备份，以防文件丢失。2、在使用电脑的过程中，要定时的对电脑进行清理。3、在使用电脑的过程中，一定要规范的操作电脑。4、在不知道问题所在的情况下，一定要第一时间联系专业的人员进行处理。