噬菌粒和噬菌体颗粒的区别

噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒，同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。噬菌粒具有以下令人瞩目的特征：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。

没有与宿主细胞的染色体整合。噬菌粒（phagemid）是带有丝状噬菌体复制起始点的质粒。展示筛出来的质粒表达不出来是没有与宿主细胞的染色体整合还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。

【答案】：M13噬菌体载体是基于大肠杆菌M13丝状噬菌体基因组构建的载体，在M13噬菌体基因组基因间隔区中插入β-半乳糖苷酶N端一小段编码序列(内插入若干限制性内切酶的单一切点)及其调控序列。M13载体一般只能克隆300～400bp的外源DNA片段，常用于制备单链DNA探针、定位诱变模板，也可用于噬菌体展示。噬菌质粒是噬菌体M13的基因间隔区(内含有M13的复制起点)插入到细菌质粒载体中构建而成的质粒。噬菌粒在大肠杆菌细胞内以质粒的复制起点进行复制，产生双链DNA。当含噬菌粒的大肠杆菌被辅助噬菌体感染后，在辅助噬菌体基因产物作用下，噬菌粒基因间隔区特定位点被切开，然后以M13的复制起点进行复制，产生单链DNA，并利用辅助噬菌体提供的装配蛋白和外壳蛋白装配成重组噬菌体颗粒，释放至胞外。噬菌质粒载体本身分子小，约为3kb，便于分离和操作；可克隆10kb的外源DNA片段，克隆能力强于M13噬菌体载体。

虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区，能够合成单链DNA，但是它没有M13的功能基因，没有M13基因2的产物存在，所以不能合成单链DNA。而辅助噬菌体具有M13的所有功能基因，但是IG区是缺陷的，辅助噬菌体本身的DNA不能进行单链复制，于是就可以为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白。辅助噬菌体必需具备如下条件：(1)助噬菌体的DNA IG区必需失去功能，其本身的DNA不会被包装到成熟的噬菌体颗粒中；（2）由于辅助噬菌体的IG区失活，其本身的基因不能表达，要使辅助噬菌体的所有功能基因都能进行表达，必须在辅助噬菌体的基因组中导人新的复制起点；(3)辅助噬菌体的基因组中具有选择标记，便于识别和收集一定数量的辅助噬菌体。

在基因工程中最常用的载体是质粒，此外还有噬菌体、动植物病毒等。

载体连接体系是指将不同载体上的基因进行组合，以实现功能的编程。它是合成生物学和纳米技术领域的重要研究方向之一。在设计载体连接体系时，载体与片段的最佳比例应根据具体的应用需求来确定。这是因为不同的应用场景需要不同的载体和片段，不同的载体和片段也会对连接的比例产生不同的影响。举例来说，如果要构建一种病毒治疗系统，可以选择载体为病毒，将治疗相关的片段连接在其基因组中。在这种情况下，病毒的DNA/RNA构成了大部分载体体积，而治疗相关的片段则只需要占载体基因组的一小部分，因此载体与片段的比例应该是载体占多数，片段占少数。另一方面，如果要实现一种基因编辑系统，可以选择载体为质粒，将编码CRISPR-Cas9系统的片段连接在其上。在这种情况下，CRISPR-Cas9相关片段是实现基因编辑的关键，占据了载体基因组的大部分，因此载体与片段的比例应该是片段占多数，载体占少数。

有用。虱螨一喷净特性：本品为菊科植物除虫菊干燥花絮的有效成分提炼而成的天然产品，本品品质温和，可有效杀灭体外成虫、幼虫及虫卵，所以有用。虱螨目是最初的虱螨目和噬菌粒目，通常被称为虱螨或虱子。

载体:1、科学技术上指某些能传递能量或运载其他物质的物质。如工业上用来传递热能的介质，为增加催化剂有效表面，使催化剂附着的浮石、硅胶等都是载体。2、泛指能够承载其他事物的事物。如语言文字是信息的载体。BOY,对于你单指化学中的载体,我想应该是单纯地指待存在催化剂的反应条件以及反应场所吧(主要还是指反应场所吧).虽然化学催化剂效率远不及生物中的酶,但有异曲同工的性质,酶的活性和温度,湿度,空间等等等各种因素有关. 另外,主要还是生物中的载体比较广泛哈,在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。 　　运载体　　在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。　　作为运载体必须具有四个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③ 含有复制起始位点，能够独立复制；④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。中学阶段的主要要了解和掌握的载体就是质粒载体，噬菌体载体以及病毒,其他的都不需要了解哈~~BOY

材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞及菌株 HAb18为分泌抗人肝癌mAb的鼠杂交瘤细胞株，由陈志南建株〔4〕；正常肝细胞株QZG引自中国科学院上海细胞库。pCANTAB 5E克隆及表达载体，为Pharmacia公司产品。1.1.2 试剂 反转录系统为Promega公司产品；PCR引物： heavy chain primer 1和2(Pharmacia公司产品)，分别为重链5′端和3′端引物；light chain primer mix： 为10种轻链5′端和3′端引物的混合物，用来扩增鼠Ig VL基因；linker primer mix，为带有Linker序列(Gly4Ser)3的重链3′端和轻链5′端的引物，用来将VH，VL拼接成ScFv基因；RS primer mix，为带有SfiI位点的重链5′端引物和带有NotI位点的轻链3′端引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段并引入酶切位点。引物A，D分别为重链5′端引物(含EcoRI酶切位点)及轻链3′端引物(含SalI酶切位点)〔5〕。A，D引物的序列如下:引物A VH-1（正向）:5′ GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG 3′EcoRⅠ引物D VL-2（反向）:5′ CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC 3′SalⅠ1.2 方法1.2.1 总RNA提取、cDNA第1链合成及VH和VL基因的扩增 取对数生长期的HAb18细胞，用异硫氰酸胍变性法，提取细胞总RNA。参照Promega公司反转录系统的产品说明书，反转录合成cDNA第1链。将cDNA第1链合成反应物分为两份，分别加入VH和VL引物各2 μl进行PCR。1.2.2 ScFv基因的组装 回收的VH和VL基因片段与linker primer mix等摩尔混合，加入dNTP至终浓度为2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶5u，进行7次PCR循环(94℃ 1 min，63℃ 4 min)。将VH和VL基因拼接为ScFv基因。在上述反应体系中，加入RS primer mix，再进行30次PCR循环，可在ScFv基因的两端分别加入SfiI和NotI酶切位点。1.2.3 ScFv基因的克隆和筛选 上述加端PCR产物经1.8% 琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收后，用SfiI和NotI消化，并与以此两种酶双酶切的pCANTAB 5E噬菌粒DNA连接，转化E.coli HB2151，在SOBAG（含100 mg/L氨苄青霉素和2%葡萄糖的SOB培养基）琼脂板上筛选转化菌。从转化板上挑取单个菌落，用2×YTAG（含100 mg/L氨苄青霉素和2% 葡萄糖的2×YT培养液）于30℃培养过夜，以碱裂解法小量提取噬菌粒DNA，以引物A，D进行PCR扩增出ScFv基因片段，并克隆入pUC19载体。1.2.4 ScFv核苷酸序列的测定 以美国PE317-A型自动序列分析仪进行序列测定。1.2.5 可溶性ScFv基因的分泌型表达 将含ScFv基因的重组噬菌粒菌种接种于5 ml LB 培养基，过夜培养。加至50 ml SBAG(含100 mg/L氨苄青霉素和2%葡萄糖的SB培养液)中，30℃振荡培养1 h，5 000 r/min离心15 min，弃上清。将沉淀重悬于50 ml SBAI(含100 mg/L氨苄青霉素和1 mmol/L IPTG的SB培养液)中，37℃诱导3 h，离心同上。取沉淀悬于5 ml新配制的溶菌酶（1 g/L），20% (w/v)蔗糖，30 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)及 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液中，冰浴10 min，4℃以12000r/min离心5 min，上清即为外周质部分。将其冷冻干燥后，贮于-20℃。临用时以0.01 mol/L PBS溶解至500 μl。1.2.6 ScFv基因可溶性表达产物的鉴定 采用SDS-PAGE及Western blot(二抗为鼠抗-E-tag抗体)进行鉴定。1.2.8 流式细胞仪分析ScFv的活性 收集培养的肝癌细胞SMMC 7721，正常肝细胞QZG及胃癌细胞SCG 7901，用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度至5×106/L~1×107/L。每管加入40 μl细胞悬液，100 μl ScFv表达产物，再加入50 μl 1∶20灭活正常兔血清（用DPBS稀释），于4℃作用30 min，洗涤2次，以800 r/min离心5 min，弃上清。加入抗E-tag抗体8 μl(2.5 g/L)，4℃作用30 min，洗涤2次，弃上清。加入50 μl FITC标记的羊抗鼠抗体，充分振摇，4℃作用30 min，洗涤2次，加入500 μl固定液，以流式细胞仪进行分析。同时设正常肝细胞、胃癌细胞为阴性对照组，肝癌细胞加亲本抗体Hab18为阳性对照组。2 结 果2.1 VH和VL基因的PCR扩增及ScFv基因的拼接 VH和VL基因测序结果显示，VH为363 bp，VL为342 bp，与预期的VH和VL基因片段大小相符。将VH和VL基因用linker连接成ScFv基因（其中linker为45 bp）。以此为模板加入RS primer mix进行PCR扩增，所获扩增产物的大小约为730 bp，表明VH，VL及linker primer mix的浓度配合准确，并引入了SfiI和NotI酶切位点（图1，见第Ⅳ页）。2.2 ScFv基因的克隆 将ScFv基因克隆入pCANTAB 5E中，连接物转化E.Coli HB2151。在SOBAG固体培养基上筛选转化的菌落。然后随机挑选8个菌落，小量制备噬菌粒DNA，以Sfi I 和NotI双酶切鉴定。若含有外源插段者，应切出约730 bp大小的片段。结果表明，8个克隆均含插段。2.3 ScFv基因的序列测定 如图2所示，ScFv基因全长为726 bp，包括预期的VH，VL基因和linker序列。VH基因序列处于linker的上游，VL基因序列处于linker的下游。2.4 可溶性ScFv蛋白的鉴定 可溶性ScFv-E-tag融合蛋白，预期的Mr为29 000。E-tag可作为蛋白标签，通过鼠抗E-tag抗体来检测ScFv基因的表达。将阳性克隆以1 mmol/L IPTG诱导3 h，对IPTG诱导和未诱导的菌体进行裂解，经SDS-PAGE后，在(Mr为29 000处多出1条明显的新生蛋白带，与预计的ScFv-E-tag融合蛋白的大小Mr为29 000)相符（图3，见第Ⅳ页）。同时做与图3相同的SDS-PAGE并进行Western blot，在Mr为29 000处有显色条带，即为能与抗E-tag抗体特异性结合的可溶性ScFv蛋白（图4，见第Ⅳ页）。2.5 可溶性ScFv蛋白与肝癌细胞的结合活性 以可溶性 ScFv蛋白为一抗，抗E-tag抗体为二抗，FITC-抗鼠IgG为三抗，用流式细胞仪测定荧光标记细胞的阳性率(图5，见第Ⅳ页)。肝癌细胞组： 无关抗体(抗-CD3)为1.6%，亲本抗体为97.5%，ScFv 为30.9%；正常肝细胞+ScFv蛋白为2.6%，胃癌细胞+ScFv蛋白 为4.1%。表明可溶性ScFv蛋白能与肝癌细胞特异地结合，而不与正常肝细胞和胃癌细胞结合。荧光显微镜观察，可溶性ScFv蛋白与肝癌细胞的膜抗原相结合，在细胞膜上可见颗粒状的荧光(结果未显示)。3 讨 论 随着Ig基因结构与功能研究的不断深入，基因工程新技术的不断涌现和成熟，基因工程抗体的研究取得了很大进展。现获得的各种基因工程抗体已基本克服了鼠源性mAb的缺点，及制备人源性抗体的困难，使之在基础医学研究和临床疾病的诊断、治疗和预防等领域，特别是肿瘤的治疗中，得到了极为广泛地应用，有的已进入Ⅲ期临床应用。运用基因工程重组技术，将鼠源性抗体恒定区和可变区的框架区以人源性相应抗体片段取代，可降低抗体的免疫原性，有效地减轻免疫排斥反应〔6〕。利用基因突变技术改变抗体的某些结构，则可提高抗体的亲和力，延长其半衰期〔7〕。另外，还可将抗体基因与其它功能性基因相连接，赋予抗体新的功能。 近年发展起来的抗体库克隆技术，可无需进行细胞融合制备杂交瘤，甚至无需进行免疫，即可直接从基因水平上，获得所需的针对相应抗原的抗体。制备基因工程抗体的关键，是获得抗体可变区基因，拼接成单链抗体基因，并表达出有生物学活性的产物。 本文从分泌抗肝癌mAb的杂交瘤细胞(HAb18)中，用RT-PCR，克隆出抗体可变区基因，其关键是PCR引物的设计。大多数研究者设计合成的引物，通常是针对V区FR1 5′端（或信号肽）的保守序列和J基因3′端序列（或恒定区基因序列）而设计的，特异性不够强，不能有效地扩增某些目的基因。Pharmacia公司噬菌体呈现系统中的混合引物，系针对鼠Ig基因不同家族的序列而设计的。从理论上讲，适用于所有类型的Ig，每种可变区基因都可获得扩增，对全套抗体库的构建非常重要。 本研究所用pCANTAB 5E是Pharmacia公司的产品，含有氨苄青霉素抗性基因，plac启动子和M13噬菌体基因间隔区片段，在多克隆位点与gⅢ编码区之间，有1个c-myc tag序列和琥珀终止码TAG，IPTG可诱导外源基因的表达。在不含有琥珀抑制基因的菌株（如HB2151）中，E-tag后的终止码被识别，多肽链的翻译终止于此，从而可生成具有生物学活性带有13肽E-tag的可溶性ScFv蛋白，释放于细菌周质中。E-tag为源于人c-myc基因的一段序列，对ScFv基因的结构和活性均无影响，可作为可溶性ScFv蛋白的标签，用抗E-tag抗体来检测ScFv基因的表达并纯化其产物。我们用含有ScFv基因的重组噬菌粒载体转化大肠杆菌HB2151，经IPTG诱导获得可溶性表达产物。用抗E-tag抗体做Western blot证实，表达产物为ScFv-E-tag融合蛋白。流式细胞仪分析表明，此ScFv融合蛋白可与肝癌细胞结合，荧光标记细胞的阳性率为30.9%，而不与正常肝细胞及胃癌细胞相结合，表明此ScFv蛋白具有肝癌结合的特异性。参考文献1 顾方舟，陈妙兰，陆如山等. 肝癌研究概况与展望. 北京： 中国协和医科大学，北京医科大学联合出版社，1993: 1-32 Hoston JS，Levinson D，Mudgett HM et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in E.coli. Proc Natl Acad Sci USA，1988；85: 5879-58833 Kroesen BJ，Wellenberg GJ，Bakker A et al. The role of apoptosis in bispecific antibody-mediated T cell cytotoxicity. Br J Cancer，1996 ；73(6): 721-7274 陈志南，刘彦仿，杨继震等. 抗人肝细胞癌单克隆抗体的产生及其相应抗原的免疫组化定位研究. 单克隆抗体通讯，1989；5(2)： 33-365 杨安钢，吉昌华，韩 骅等. 抗人CD8单抗κ轻链可变区基因的克隆和序列测定. 生物化学与生物物理进展，1992；19（4）： 286-2886 Man SC，Jeanne BK，Bednarik EJ. Humanized anti-Lewis Y antibodies: in vitro properties and pharmacokinetics in rhesus monkeys. Cancer Research，1996；56: 1118-11257 Mats O，Henrik O，Michael M et al. Light chain shuffling of a high affinity antibody results in a drift in epitope recognition. Mol Immunol，1996；33(1): 47-56(收稿 1998-03-03 修回 1998-03-26)

构建基因组文库的步骤A 分离基因组DNA；B 用超声波或限制酶等进行基因组DNA部分或完全降解；C 将降解物进行分级得到所需大小DNA片段；D 将DNA片段与载体连接(一般用λ噬菌体载体)；E 将重组体导入宿主细胞；F 最后筛选鉴定重组子克隆。建立基因组文库的方法2—λ噬菌体基因组文库 可插入较大片段，最大可达23kb建立基因组文库的其他方法：cosmid基因组文库 YAC基因组文库 BAC基因组文库基因文库的质量标准：重组克隆的总数不宜过大， 以减轻筛选工作的压力；载体的装载量最好大于基因的长度， 避免基因被分隔克隆；克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域, 以利克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下,重组克隆能稳定保存、扩增、筛选建立cDNA文库的基本步骤 (1)隔离总RNA和净化mRNA (2)合成的双链互补脱氧核糖核酸适合插入一个克隆载体(3)克隆cDNA合适的向量(4)转移到合适的宿主细胞的重组载体(5)筛查阳性克隆cDNA克隆的策略(1)自身引导的第二链合成+同聚物加尾（2）cDNA克隆方法的改进。尾随第一链寡核苷酸（DC）允许使用寡核苷酸引物（ DG）将要开展的第二链（3）cDNA的定向克隆从基因文库中筛选分离目的基因克隆(1)制备核酸探针进行杂交筛选(2) 制备抗体进行免疫杂交筛选(3)根据生物大分子间的相互作用筛选目的基因(4)利用PCR技术筛选目的基因文库(5)利用噬菌体表面展示技术分离目的cDNA克隆：噬菌体展示(phage display)：是在噬菌体表面表达已融合到噬菌体外壳蛋白的重组蛋白或多肽的技术。应用噬菌体展示技术的关键是构建表达性基因文库，这种文库称为噬菌体展示文库(phage display library )。常用的构建噬菌体显示文库的表达载体有两类：丝状噬菌体和以这些噬菌体复制起始序列为基础构建的噬菌粒(phagemid)。mRNA差别显示技术原理：在 mRNA3′端的 poly (A)5"上游的 2个碱基只有 1 2种组合。与此相对应，共可人工合成12种不同的下游引物，用以反转录mRNA 合成cDNA第一条链。这种引物通常称为3"端锚定引物，它由Oligo-d T后面接上两个碱基 (如 5′T1 1 - 1 2 MN3′, M=G、C或 A; N=A、G、C或 T)构成。这样，每一种此类人工合成的寡核苷酸引物，都将能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。由此可知，使用5′T1 1 - 1 2 MN3′引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的但序列结构不同的12份亚群体。DDRT-PCR的主要步骤：Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3"锚定引物作为反转录的引物，合成第一链cDNA；Ⅱ.用5"随机引物和某个3"端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)；Ⅲ.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；Ⅳ.回收特异性差别条带；Ⅴ.用同一引物对扩增已回收的DNA条带；Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；Ⅶ.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。 DNA插入诱变法分离目的基因DNA插入诱变法主要用于植物目的基因的克隆分离研究。其基本原理是，当一段特定的DNA序列插入到植物基因的内部或其邻近位置时，一般会诱导该基因发生突变形成突变体植株，或者在插入位置产生一个新的基因。 如果该DNA插入序列是已知的，便可用它作为DNA分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选得到突变基因片段。然后利用此突变基因片段制备探针，从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。这样，插入的DNA序列相当于在植物基因上贴了一张标签，因此，DNA插入诱变法又叫DNA标签法(DNA tagging)。差别杂交和减法杂交技术分离目的基因差别杂交构建了基因文库后，如没有任何可供选择的探针进行筛选，或没有任何有关目的基因的核苷酸序列信息时，可以考虑用差别杂交法筛选目的基因片段。差别杂交(Differential hybridization)也称为差别筛选(Differential screening)法。特别适用于分离在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调控的基因，亦可有效地用来分离经特殊处理诱导表达的基因。差别杂交的技术原理：有目的基因能正常表达和不能表达的两个不同的细胞群体。在这种情况下，分别制备两种不同细胞群体的mRNA提取物，其中一个群体含有一定比例的目的基因mRNA ，另一个群体不含有目的基因mRNA。差别杂交的技术原理过程：以这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目的基因表达的mRNA群体为探针时，所有包含重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点;而以目的基因不表达的mRNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，变可以挑选出含有目的基因的菌落，供进一步研究用。差别杂交法的局限性：首先，差别杂交的灵敏度比较低，不适合低丰度mRNA的目的基因的分离。其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑，是一项十分耗时耗力的工作；第三，差别杂交重复性差。差别杂交涉及文库的滤膜影印，不同滤膜之间的DNA保有量往往不均一，杂交所得的信号强度也会不一致，需要重新进行点杂交，以做进一步的阳性克隆鉴定工作 。mRNA减法杂交基本原理：从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录成为cDNA，然后与无目的基因表达的组织中提取的mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成程cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍然保持单链状态，这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。基因突变技术分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又分两种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变(oligonucleotide-mediated mutagenesis)；第二类是利用PCR,以双链DNA为模板所进行的基因突变。寡核苷酸介导的定点诱变的原理 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子链的组成部分。因此，所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列。要求所设计的寡核苷酸引物除了所需的突变位点之外，与目的基因编码的区段完全互补。作为诱变剂的寡核苷酸序列，同待诱变的目的基因的互补序列之间，能形成一种稳定的唯一的双链结构。决定双链区段稳定性的主要因素是碱基的组分、核苷酸的错配以及寡核苷酸引物的长度等。寡核苷酸介导的定点诱变的基本步骤(a)将要进行突变的目标基因(或DNA片段)克隆于M13噬菌体载体或噬菌粒载体。(b)从重组的M13或噬菌粒中制备单链DNA。(c)将设计好的寡核苷酸突变引物的5"端用T4多核苷酸激酶进行磷酸化。(d)将上述突变引物与目标基因(单链的DNA模板)进行退火。(e)在存在DNA聚合酶和dNTP的情况下，使退火引物沿单链DNA模板延伸，然后新生链的末端用T4 DNA连接酶连接。(f)转染易感细菌。(g)筛选出带有突变的目标基因的噬菌斑。(h)从突变的重组噬菌体制备单链DNA，通过DNA序列分析确认突变位点的正确性。(i)从重组的M13噬菌体复制型双链DNA中回收突变的目标基因(DNA片段)。(j)将突变了的基因(DNA片段)重组入表达载体进行表达。第五章受体细胞应具备的条件(1)便于重组DNA分子的导入。如易形成感受态，具有较高的转化效率；(2) 能使重组体DNA分子稳定存在于细胞中。如限制性缺陷型； (3) 便于重组体的筛选。如具有与重组体互补的遗传性状； (4) 受体细胞遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长，能进行高密度培养；对动物细胞要可悬浮培养，对培养基适应性要好；(5)安全性高，无治病性，不会对外界环境造成生物污染：感染与寄生缺陷型；(6)蛋白水解酶少,利于外源蛋白在细胞内的积累。尤其是对枯草芽孢杆菌。(7) 受体细胞的密码子偏倚性要小；(8) 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 ▲糖蛋白不能在E.coli中表达；(9) 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值；(10)对于用于基因扩增或基因高效表达的受体要用重组整合缺陷型。第六章克隆基因高表达的相关因素1有效转录开始 关键的一步，并限制外源基因表达的一步！构建表达载体的同时，选择强的和可控制的启动子和相关终止序列。2有效延长和终止转录正确 3 mRNA的稳定性4有效地转录开始5遗传密码子偏向6核糖核酸处理过程7终止密码子8表达载体9重组蛋白Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA）；正调节因子 CAP；负调节因子 lac I Tac 表达系统 tac启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂合启动子。 调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平高于 trp 和 lacUV5启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。包涵体蛋白在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起，形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体(inclusion body, inclusive body)。包涵体主要由蛋白质组成，并且大部分为外源基因的表达产物，它们具有正确的氨基酸序列，但构像却是错误的，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。包涵体形成的原因主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。此外，还有以下原因：(1)表达量过高。(2) 重组蛋白的氨基酸组成(3)重组蛋白所处的环境：温度、pH(4)缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类(5)培养条件不佳酵母基因表达载体的种类 自主复制型质粒载体:含酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和克隆位点等关键元件。较高拷贝数，细胞分裂时不能平均分配到子细胞中。 整合型质粒载体:不含酵母基因组的DNA复制起始区，但含有整合介导区。 着丝粒型质粒载体:在自主复制型质粒载体基础上构建而成，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件，可保证平均分配到子细胞中。1-2拷贝/细胞。 酵母人工染色体:以线性双链DNA形式存在于酵母细胞，每个细胞只有单拷贝。

1、概念不同质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子。载体：某些能传递能量或运载其他物质的物质。2、存在不同质粒广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。载体只作为两个物质之间沟通的桥梁。扩展资料：分类1、根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。2、根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。3、根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。参考资料：百度百科-质粒百度百科-载体

那得看是什么的载体膜上用于主动运输的载体全是蛋白质。但是在基因工程上基因的运载体却可以是质粒（一种环状DNA），病毒也可作基因的运载体所以载体不都是蛋白质；如果你指膜上的载体，那就全是蛋白质。

根据信息载体不同分为：芯片卡，磁条卡。载体（Vector） ，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。在实际生活中，胰岛素就可以通过使用载体将已插入胰岛素基因片段的质粒放入大肠杆菌内。经过插入基因片段的质粒就称作载体。该质粒在细菌内可以进行自我复制，并且不会影响到生物原来的活动。载体按功能可分为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段。主要有质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，如启动子和终止子。为了实现外源基因在不同表达载体中进行复制和表达，基因工程操作中常使用穿梭载体( shuttle vector)。穿梭载体含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的细胞中复制，如既能在原核生物中复制也能在真核生物中复制的载体，不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列( ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。

载体与片段的摩尔比例计算：先算出载体和目的基因的浓度，（可以跟mark的亮度对比估算，也能用软件计算），再根据摩尔质量比和基因的大小算出质量比，再算出体积比就行。载体与插入片段比例一般是1:10，通过测定DNA浓度来调整。单酶切片段插入时，载体一定要去磷酸化，载体易自连；双酶切二者比例要适当，比例不对，载体也会自连，因为微生物有自己的修护系统。载体按功能可分为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段。主要有质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，如启动子和终止子。为了实现外源基因在不同表达载体中进行复制和表达，基因工程操作中常使用穿梭载体( shuttle vector)。

（1）． 质粒文库 质粒是最早用于基因克隆的载体。现已有各种适用于不同工作的如克隆、表达、测序等专用商品质粒。但在构建基因文库上，由于质粒相对较小并只能容纳比自身更小的片段，因此它不能用于构建核基因组文库，通常只用来构建短序列的克隆文库。例如叶绿体DNA分子较小，可以用质粒构建叶绿体DNA文库。质粒载体可用于生物cDNA文库构建。但只适合于高丰度的mRNA。（2）． 噬菌体文库 目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体很多，如单链的M13噬菌体载体、λ噬菌体载体、P1噬菌体载体、噬菌粒(phagemid或phasmid)等。其中使用最多的是入噬菌体。 λ-DNA为双链结构，长49kb。线性分子两端各有一条12个核苷酸的黏性末端称cos位点。分子中有约15kb可去掉的非必要基因区，又称“填充区”， “填充区”两侧的序列含有其增殖所必需的全部基因，称为左、右臂。“填充区”可被外源DNA取代，构成重组体，这是它成为克隆载体的结构基础。由于噬菌体头部包装容量的限制，重组λ-DNA分子大小只能在39—52kb之间。（3）． 黏粒文库 黏粒(cosmid)也称柯斯质粒，是人工构建的由λ噬菌体的COS序列、质粒的复制子序列及抗生素抗性基因序列组合而成的一类特殊的质粒载体。COS序列是DNA包装进噬菌体颗粒所必须的。复制子通常是使用ColEl或pMBl的复制起始位点。黏粒具有λ噬菌体的某些性质，在克隆了大小合适的外源DNA片段并且在体外被包装成噬菌体颗粒后，能高效转导对入噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞。在宿主细胞内按λ噬菌体方式环化，但不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒(因分子中不具入噬菌体全部必要基因)。它也具有质粒载体的主要性质，在宿主细胞内可以像其他质粒一样复制，并与松弛型质粒相同，适量的氯霉素可促进扩增。因具抗生素基因，可以通过抗生素抗性筛选重组子。黏粒载体在构建时也加上了设在插入失活基因内的多克隆位点。黏粒载体的分子较小(2．8—24kb)，但克隆容量很高，对外源DNA长度的要求是30～45 kb，上限几乎是入噬菌体载体容量(23 kb)的2倍，所以黏粒载体在核基因组文库构建上具有相当的优势，可克隆包括3，和5"调控区在内的完整的植物基因。（4）．人工染色体文库 人工染色体载体是利用真核生物染色体或原核生物基因组的功能元件构建的能克隆大于50kbDNA片段的人工载体。其中有的载体既可用于克隆，又能直接转化，是进行基因功能研究的良好载体。近年来陆续发展起来的人工染色体文库有YAC库、BAC库、BIBAC库、PAC库及TAC库。

Aactivation domain 活化结构域adapters 连接物adenine 腺嘌呤adenosine 腺ADP (adenosine diphosphate) 腺二磷酸affinity column 亲和柱AFLP (amplified fragment length polymorphisms) 增值性断片长度多态现象agrobacterium 农杆菌属alanine 丙氨酸allele 等位基因amber mutation 琥珀型突变AMP (adenosine monophosphate) 腺一磷酸ampicillin 氨?青霉素anchor primer 锚状引物annealing 退火annealing temperature 退火温度anticodon 反密码子AP-PCR (arbitrarily primed PCR) 任意引物聚合?链反应arbitrary primer 任意引物ATP (adenosine triphosphate) 腺三磷酸autosome 常染色体Bbaculovirus 杆状病毒base pair 基对base sequence 基顺序beta-galactosidase β-半乳糖?beta-glucuronidase β-葡糖醛酸糖?bioluminescence 生物发光bioremediation 生物降解biotechnology 生物技术blotting 印迹法blue-white selection 蓝白斑筛选blunt end 平(整末)端Ccatalyst 催化剂cDNA library 反向转录DNA库centromere 着丝体centrosome 中心体chemiluminescence 化学发光chiasma 交叉chromomere 染色粒chromoplast 有色体chromosomal aberration 染色体畸变chromosomal duplication 染色体复制chromosomal fibre 染色体牵丝chromosome 染色体chromosome complement 染色体组chromosome map 染色体图chromosome mutation 染色体突变clone 克隆cloning 无性繁殖系化codon 密码子codon degeneracy 密码简并codon usage 密码子选择cohesive end 黏性末端complementary DNA (cDNA) 反向转录DNAcomplementary gene 互补基因consensus sequence 共有序列construct 组成cosmids 黏性质粒crossing over 互换cyclic AMP (cAMP) 环腺酸cytosine 胞嘧啶Ddark band 暗带deamination 脱氨基作用decarboxylation 脱羧基作用degenerate code 简并密码degenerate PCR 退化性聚合?链反应dehydrogenase 脱氢?denaturation 变性deoxyribonucleoside diphospahte 脱氧核糖核一磷酸deoxyribonucleoside monophospahte 脱氧核糖核二磷酸deoxyribonucleoside triphospahte 脱氧核糖核三磷酸deoxyribose 去(脱)氧核糖dicarboxylic acid 二羧酸digoxigenin 洋地黄毒diploid 二倍体DNA (deoxyribonucleic acid) 去(脱)氧核糖核酸DNA binding domain DNA结合性结构域DNA fingerprinting DNA指纹图谱DNA helicase DNA解螺旋?DNA kinase DNA激?DNA ligase DNA连接?DNA polymer DNA聚合物DNA polymerase DNA聚合?double helix 双螺旋double-strand 双链Eelectroporation 电穿孔endonuclease 内切核酸?enhancer 增强子enterokinase 肠激?episome 游离基因ethidium bromide 溴乙锭eukaryotic 真核生物的euploid 整倍体exonuclease 外切核酸?expressed-sequence tags 表达的序列标记片段extron 外含子FF factor F因子FAD (flavine adenine dinucleotide) 黄素腺嘌呤二(双)核酸feedback control 反馈控制feedback inhibition 反馈抑制feedback mechanism 反馈机制first filial (F1) generation 第一子代FISH (fluoresence in situ hybridization) 荧光原位杂交forward mutation 正向突变F-pilus F纤毛functional complementation 功能性互补作用fusion protein 融合蛋白Ggel electrophoresis 凝胶电泳gene 基因gene cloning 基因克隆gene conversion 基因转变gene duplication 基因复制gene flow 基因流动gene gun 基因枪gene interaction 基因相互作用gene locus 基因位点gene mutation 基因突变gene regulation 基因调节gene segregation 基因分离gene therapy 基因治疗geneome 基因组 / 染色体组genetic map 基因图genetic modified foods (GM foods) 基因食物genetics 遗传学genetypic ratio 基因型比 / 基因型比值genome 基因组 / 染色体组genomic library 基因组文库genotype 基因型giant chromosome 巨染色体globulin 球蛋白glucose-6-phosphate dehydrogenase 6-磷酸葡萄糖脱氢?GP (glycerate phosphate) 磷酸甘油酸脂GTP (guanine triphosphate) 鸟三磷酸guanine 鸟嘌呤Hhaploid 单倍体haploid generation 单倍世代heredity 遗传heterochromatin 异染色质Hfr strain 高频重组菌株holoenzyme 全?homologous 同源的housekeeping gene 家务基因hybridization 杂交Iimmunoglobulin 免疫球蛋白in vitro 在体外 / 在试管内in vivio 在体内independent assortment 独立分配induced mutation 诱发性突变induction 诱导initiation codon 起始密码子inosine 次黄insert 插入片段insertional inactivation 插入失活interference 干扰intergenic 基因间的interphase 间期intragenic 基因内的intron 内含子inversion 倒位isocaudarner 同尾酸isoschizomer 同切点?JKkanamycin 卡那毒素klenow fragment 克列诺夫片段Llac operon 乳糖操纵子ligase 连接?ligation 连接作用light band 明带linker 连接体liposome 脂质体locus 位点Mmap distance 图距离map unit 图距单位mature transcript 成熟转录物metaphase 中期methylase 甲基化?methylation 甲基化作用microarray 微列microinjection 微注射missense mutation 错差突变molecular genetics 分子遗传学monoploid 单倍体monosome 单染色体messenger RNA (mRNA) 信使RNAmultiple alleles 复(多)等位基因mutagen 诱变剂mutagenesis 诱变mutant 突变体mutant gene 突变基因mutant strain 突变株mutation 突变mutation rate 突变率muton 突变子NNAD (nicotinamide adenine dinucleotide) 烟醯胺腺嘌呤二核酸NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 烟醯胺腺嘌呤二核酸磷酸nicking activity 切割活性nonsense codon 无意义密码子nonsense mutation 无意义突变Northern blot Northern印迹法nuclear DNA 核DNAnuclear gene 核基因nuclease 核酸?nucleic acid 核酸nucleoside 核nucleoside triphosphate 核三磷酸nucleotidase 核酸?nucleotide 核酸nucleotide sequence 核酸序列Ooligonucleotide 寡核酸one gene one polypeptide hypothesis 一个基因一种?学说operon 操纵子oxidative decarboxylation 氧化脱羧作用oxidative phosphorylation 氧化磷酸化作用PPCR (polymerase chain reaction) 聚合?链反应peptide ?peptide bond ?键phagemids 噬菌粒phosphorylation 磷酸化作用physical map 物理图谱plasmid 质粒point mutation 点突变poly(A) tail poly(A)尾polymerase 聚合?polyploid 多倍体positional cloning 位置性无性繁殖系化primary transcript 初级转录物primer 引物probe 探针prokaryotic 原核的promoter 启动子protease 蛋白?purine 嘌呤pyrimidine 嘧啶QRrandom segregation 随机分离RAPD (rapid amplified polymorphic DNA) 快速扩增多态DNAreading frame 阅读码框recessive gene 隐性基因recombinant 重组体recombinant DNA technology 重组DNA技术recombination 重组regulator (gene) 调控基因replica 复制物 / 印模replica plating 复制平皿(板)培养法replication 复制replication origin 复制起点reporter gene 报道基因repression 阻遏repressor 阻遏物repressor gene 阻遏基因resistance strain 抗药性菌株restriction 限制作用restriction enzyme 限制性内切?restriction mapping 限制性内切?图谱retrovirus 反转录病毒reverse transcription 反转录作用RFLP (restricted fragment length polymorphisms) 限制性断片长度多态现象ribonucleotide 核糖核酸ribose 核糖ribosomal RNA (rRNA) 核糖体RNAribosome 核糖体RNA (ribonucleic acid) 核糖核酸RNA polymerase I RNA聚合?IRNA polymerase II RNA聚合?IIRNA polymerase III RNA聚合?IIIR-plasmid R质粒 / 抗药性质粒Ssecond filial (F2) generation 第二子代self-ligation 自我连接作用shuttle vectors 穿梭载体sigma factor σ因子single nucleotide polymorphism 单核酸多态性single-stranded DNA 单链DNAsister chromatid 姊妹染色单体sister chromosome 姊妹染色体site-directed mutagenesis 定点诱变somatic cell 体细胞Southern blot Southern印迹法splice 拼接star activity 星号活性stationary phase 静止生长期sticky end 黏性末端stop codon 终止密码子structural gene 结构基因supernatant 上层清液supressor 抑制基因Ttelophase 末期template 模板terminator 终止子tetracycline 四环素thymine 胸腺嘧啶tissue culture 组织培养transcription 转录作用transfer RNA (tRNA) 转移RNAtransformation 转化作用transgene 转基因translation 翻译 / 平移transmembrane 跨膜triplet 三联体triplet code 三联体密码triploid 三倍体UVvector 载体WWestern blot Western印迹法

(1)cDNA文库是指细胞全部mRNA通过逆转录得到cDNA后被克隆的总和。cDNA的组成特点是片段中不含基因的内含子和其他调控序列。cDNA文库构建基本步骤：①制备mRNA：全RNA提取与mRNA的分离提纯；②合成cDNA：oligo dT与mRNA3"端poly(A)杂交作为引物合成第一链，第二链合成是以第一链为模板，DNA聚合酶催化。常用RNase H切割mRNA-cDNA杂合链中的mRNA序列产生的小片段为引物合成第二链的片段，再连接成完整链；③制备载体DNA：由于cDNA分子的长度在0. 5～8kb，常用的质粒载体和噬菌体载体都可以，载体选择根据文库用途确定，如噬菌粒载体具有噬菌体的高效性和质粒载体系统可以利用蓝白斑筛选的便利；④cDNA的分子克隆：cDNA连入载体，转化重组体，扩增；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，评价文库质量。文库是否有价值主要从文库含量和插入片段的大小来评价，所构建文库必须有足够多的克隆数以确保基因组cDNA每一个序列至少有1个拷贝在文库内。(2)cDNA文库同基因组文库的差别主要在于基因组文库(尤其是真核生物的基因组文库)可能包含有非编码序列，含有更丰富的遗传信息。

一样。克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

载体（vector） ，能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。必备条件　　①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入③含有复制起始位点，能够独立复制；通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。⑤载体DNA分子大小应合适，以便操作。　基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体

1、性质不同。表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。 2、组成不同。表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

克隆载体（CloningVector）：通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。

克隆载体是能够通过限制性内切酶，将目的DNA片段整合进去，并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA。通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。

①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入。③含有复制起始位点，能够独立复制；通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。⑤载体DNA分子大小应合适，以便操作。基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体。

表达载体和克隆载体有什么不同?高粉答主4778表达载体和克隆载体的区别：1、性质不同表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。克隆载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。2、组成不同表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。克隆载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

克隆载体是能够通过限制性内切酶,将目的DNA片段整合进去,并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA.通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体,在载体上插入合适大小的外源DNA片段,并注意不能破坏载体的自我复制性质.将重组后的载体引入到宿主细胞中,并在宿主细胞中大量繁殖.常见的载体有质粒,噬菌粒,酵母人工染色体.对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖,而且最好要有较高的自主复制能力.②容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好.③容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制.这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点.④容易从宿主细胞中分离纯化出来, 这才便于重组操作.⑤有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来.

http://baike.baidu.com/view/184171.htm我从这个网址搜到的，你可以看看，是4声没问题载体　　　　载体：zài tǐ　　英文单词vector ，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。 　　运载体　　在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。　　作为运载体必须具有四个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③ 含有复制起始位点，能够独立复制；④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。　　　基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体

在我国的历史上，有许许多多的有名的风水大师比如诸葛亮和明朝时期的刘伯温。在这么多的预言家中，我觉得最厉害的便是袁天罡。袁天罡来自唐代，他是唐朝最有名的预言师和风水师。他一生曾做出了很多的预言。这些预言到最后都被历史所证明。他也是被后人认为最后可能是后人穿越到古代的人之一。我认为这其中最厉害的预言便是袁天罡对一天女皇武则天所做出的的预言。袁天罡的时候喜欢周游天下，四处为世人解答疑惑。曾经一次偶然的遇到了武则天的生母，当时候的武则天还是一位小婴儿。袁天罡觉得很是有缘，便为这小婴儿做了预言，由于袁天罡不知道婴儿是什么性别的孩子，他指着小婴儿说：“若这个孩子是女子，以后一定是一位天子。”多年之后，这句预言变成了现实，中国的第一位女皇帝登上了历史的舞台。在武则天统治的这段时期，虽然江山易主，但是百姓安居乐业。除此之外，我觉得更加让人难以让人相信的是袁天罡和和李淳风推算过大唐国运，一直推算了两千多年。将身后两千对年的事情都做出了预言，并且把这些预言编成了《推背图》。这本书上详细得记述了两千年之后中国是什么样子。这本《推背图》有些内容到现在，我国的学者还没有搞明白是什么样子。不过在唐朝之后的两千年中，历史似乎是按着《推背图》所发展的。

去年9月份，中国证监会发审委发布2009年第97次工作会议公告，将于9月23日对浙江正泰电器股份有限公司首发申请进行审核。 　　正泰电器招股书（申报稿）显示，其保荐人为国泰君安，拟发行1.05亿股，募集资金将用于温州的年产6000万套智能电器建设项目和上海的诺雅克节能型控制及配电电器产品生产基地建设项目，分别将达约5.49亿元和约5.54亿元。据了解，正泰电器若在9月23日成功闯关“过会”(即首发募集股票申请审核)，那将可在30天左右启动正式上市程序。　　据资料显示，正泰电器的上市计划开始于五六年前，是温州最早一批筹备上市的民企之一，但其通过辅导期后迟迟未见迈出实质性的一步，即使在2006年至2007年间的A股大牛市，也未有进一步的计划。“此前，正泰一直没有上市，主要是资金充沛，并不需要上市融资。”一熟悉正泰集团的人士称。　　成立于1997年8月的正泰电器注册资本9亿元人民币，其母公司正泰集团持有其中的73％股份，此次发行股票后该公司的总股本将达到10.05亿股。相关资料显示，正泰集团的创始人南存辉是正泰电器的实际控制人，占公司26.6479%股份，股份占比远远超过其他自然人股东。　　从正泰电器公布的财务数据看，正泰电器今年上半年净利润近3.72亿元，已接近去年全年近4.37亿元的净利润。招股书显示，正泰电器发行前每股净资产1.53元，发行后的每股收益为0.38元。相关人士表示，正泰电器有较好的财务数据，并在去年的金融危机后业绩迅速复苏，主要是由于其在行业内处于龙头地位，2008年占有中国低压电器市场约10％份额。　　“2007年前后，温州大批企业开始筹备上市事宜，经过两三年的准备已符合上市要求。”市金融办一位人士表示，“政府部门将制订一些措施鼓励企业上市，相关措施计划在年内出台。”据了解，目前温州有40多家企业在排队上市。相关人士表示，此举预示着温州企业将大规模上市。　　按照市金融办计划，今年力争正泰电器与拟登陆创业板的金龙机电成功上市，2010年将努力使3家至4家的温州企业登陆A股，而目前排队上市的40多家企业中的绝大部分力争在未来5年内成功上市。

主要讲了黄继光在上甘岭战役中主动请战，接受艰难而繁重的任务。为了朝鲜人民的解放不顾自身的安危。用自己的胸膛堵住了敌人猛烈的枪口。最后壮烈牺牲的英勇事迹。表现了他爱国主义和国际主义的精神。立下不朽的功勋。

你好，电视剧《仙剑奇侠传》、《仙剑奇侠传三》改编自电脑单机游戏。《仙剑奇侠传》系列都是游戏，游戏就是原著。《仙剑奇侠传》：李逍遥、赵灵儿、林月如、阿奴《仙剑客栈》（不算有剧情的游戏）《仙剑奇侠传二》：王小虎、苏媚、沈欺霜、李忆如《仙剑奇侠传三》：景天、唐雪见、龙葵、紫萱、徐长卿、重楼、花楹《仙剑奇侠传三外传·问情篇》：南宫煌、温慧、王蓬絮、星璇、雷元戈《仙剑奇侠传四》：云天河、韩菱纱、慕容紫英、柳梦璃《仙剑Online》（网游）：李忆如、韩仲晰、李逍遥、赵灵儿、林月如、阿奴后来，有个笔名叫楚国的作家根据游戏，把《仙剑奇侠传》、《仙剑奇侠传二》改写成小说，这是官方小说，不过仙剑2没写完。重楼、飞蓬是游戏《仙剑奇侠传三》中的人物，在后作《仙剑奇侠传三外传·问情篇》中也有出现和提及。

浙江温州正泰集团董事长 南存辉性 别: 男 国 籍: 中国 出生日期: 1963年 学 历: 硕士 行 业: 制造业 1974年，南存辉在柳市一小读书。 1978年初中毕业后13岁的南存辉从事修鞋行当。 1984年南存辉把自家的房屋折价5万元作为投资，与胡成中一起创办乐清县求精开关厂。 21岁时就开始创业，与几个朋友一起投资了5万元，从事低压电器开关的生产。 1991年做低压电器的南存辉手里已经有100万的资本了，他通过与美国一个亲戚合作成立中美合资温州正泰电器有限公司；并招入9位家族成员入股，将自己100万股金所占的100%的股权一下稀释到40%多。 2000年在北京完成硕士研究生学业。 南存辉是2001年度“中国十大杰出青年”称号的获得者。 南存辉是在福布斯中国富人50强和中国(内地)私营企业纳税50强(2000年度)同时上榜的四位富人之一。 南存辉先后荣获“中国十大杰出青年”、“2000年世界青年企业家杰出成就奖”、“浙江省劳动模范”等称号，并被推选为全国工商联常委、中国电器工业协会副理事长、中国质量协会副会长、浙江省工商联副会长，当选为九届全国人大代表。 今年6月，正泰出资1000万元，率先发起设立“浙江省大学生助学奖金”，为贫困辍学学子提供援助；以实际行动参加“信用温州”、“信用浙江”活动，连续多年被国家、省、市工商管理局评为“重合同、守信用”单位。 在温州，人们都知道南存辉的个人签名含金量最高，凭个人的签名可以获得数亿元的授信贷款额度。不少研究正泰经营理念的学者认为：正泰在创造物质文明的同时，也在着力建设精神文明，塑造了企业家和员工的精神风貌，塑造了一种新型的社会生产、生活方式和做人方式。 南存辉持有正泰集团28%的股份。个人资产3.7亿元。

当然是GTX750好，无论是从显卡散热方面还是从显卡性能方面，GTX750都比GTS450好很多，这两张显卡根本就不是一个级别的东西了。顺便给你一张最新显卡天梯图参考一下：希望对你有用

黄继光（1931年1月8日－1952年10月19日），原名黄际广，生于四川省中江县，中国人民志愿军的一名士兵。1952年10月19日在朝鲜上甘岭地区597.9高地阵亡。根据战地目击者的描述，黄继光在中国人民志愿军的进攻部队受到机枪巢火力压制的时候负责爆破任务，他投掷了一枚手雷但是未能完成任务。最终他用身体挡住了机枪枪口使得后续部队能够攻下高地。黄继光被中国人民志愿军领导机关追记特等功，并授予“特级英雄”称号（另一特级英雄是杨根思）；所在部队党委追认他为中国共产党正式党员；朝鲜政府授予他“朝鲜民主主义人民共和国英雄”称号。有人认为靠身体根本无法堵住机枪的火力，而且梅花堡有多支机枪同时发射，所以虽然黄继光的牺牲是事实，但认为是靠他堵住的枪眼而使得后续部队能够攻克高地，则有悖常理。当时的新闻报道亦被后人认为是夸大其词----------------------------------1952年12月21日，新华社发出了一篇长篇通讯《马特洛索夫式的英雄黄继光》，写的是抗美援朝上甘岭战役中，黄继光去爆破敌人的火力点。稿件这样写道，在他中弹倒下后，“他回过头来望了望，看见他的两个战友都一声不响地躺在那里，爆破的任务就完全落在他的身上”，“一阵的冷雨落在黄继光的颈子上，敌人的机枪仍然嘶叫着，他从极度的疼痛中醒来了。他每一次轻微的呼吸都会引起胸膛剧烈的疼痛。他四肢无力地瘫痪在地上。”“四十分钟的期限快到了，而我们的突击队还在敌人的火力压制下冲不上来。后面坑道里营参谋长在望着他，战友们在望着他，祖国人民在望着他，他的母亲也在望着他，马特洛索夫的英雄行为在鼓舞他。这时，战友们看见黄继光突然从地上一跃而起，他像一支离弦的箭，向火力点猛扑过去。用自己的胸膛抵住了正在喷吐着火焰的两挺机关枪。”这篇通讯当时在全国引起了强烈的反响，黄继光的英雄事迹、伟大的牺牲精神鼓舞了正在建设新中国的全国人民。然而，当人们冷静下来之后，就有人提出质疑，既然黄继光已经牺牲了，他在扑向敌人的火力点之前内心的想法和感受，记者是怎样采访到的？很有意思的是，新华社当天还发了一则编者按，说“十一月二十日发《马特洛索夫式的英雄黄继光》，系前线通讯员在战斗仓卒写成，与实际战斗情节略有出入。此稿是经各方仔细核实最后判明的情节。” 正是“此地无银三百两”，再怎么核实，也不可能核实到黄继光牺牲前怎么想的了。

本来是要让她老公姓丁的，结果网游仙剑OL弄出来个韩仲晰，还和忆如搞cp，网游不算正史，但是官方不想公然打OL的脸，就没交代。漫画《忆相逢》里用的是韩仲晰，官方暂时默认韩仲晰，但是如果以后仙剑单机游戏交代李忆如老公是其他人，仍以单机游戏为准。

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仙剑客栈《仙剑客栈》是一款由大宇资讯旗下北京软星开发的单机经营模拟游戏，于2001年8月31日上市。本作借用了《仙剑奇侠传》中的人物、地名、背景等，内容独立于系列中的正式作品，综合经营模拟、角色扮演、恋爱养成等多方面要素，玩家将扮演李逍遥，和赵灵儿、林月如、阿奴一起管理客栈，并有多位著名武侠作品人物前来串场。游戏含两条线索——经营线和感情线，根据两条线索的分值来触发不同的经营结局和感情结局。 基本信息 仙剑客栈 官方图英文名称PAL Inn 主题无中国台湾首发时间 2001年08月31日 主角李逍遥；赵灵儿；林月如；阿奴研发团队 软星科技（北京）有限公司 仙剑客栈仙剑Online《仙剑Online》（英文名称：Chinese Paladin Online）采用Renderware 3D引擎，游戏画面风格偏向于俊美写实，着重剧情是《仙剑Online》特色之一。仙剑OL已于2009年1月16日12点公测。 游戏主线故事发生在《仙剑奇侠传2》八年以后，李忆如与魔尊之子韩仲晰之间发生的一段爱恨情仇的故事。正义与邪恶的较量再次升华，何为善，何为恶，善恶难分爱恨愁。 《仙剑Online》基本信息 仙剑Online 官方图剧情主角 李忆如，韩仲晰，李逍遥，赵灵儿，林月如，阿奴 主题乐曲 情缠；蝶恋 主题歌曲 黄韵玲，林俊逸- 蝶恋 公测年份 2009年 研发公司 大宇资讯股份有限公司台湾总部研发二部 研发地区 台北县（今新北市） 仙剑OL更新表： 2009.1.9 中国大陆 公测，仙剑系列首款网络游戏震撼公测 2009.4.16 港澳台 公测，繁体字版出现又一首真人演唱主题歌《蝶恋》 2010.1.27 港澳台 仙剑Online2.0，改进并且完善《仙剑Online》 2011.6.24 中国大陆 仙剑Online2.0 2011年 中国台湾 仙剑Online：月神谭(Ver. 3) 仙剑奇侠传：逍遥游《仙剑奇侠传：逍遥游》是由软星科技（北京）有限公司推出的仙剑官方卡牌桌面游戏。该桌游是一款以组队冒险、合作竞争、挑战怪物、收集宠物为核心的桌上卡牌类游戏，可供2-8人参与。李逍遥、赵灵儿、王小虎、唐雪见、紫萱、重楼、南宫煌、星璇、云天河、韩菱纱、龙幽等《仙剑奇侠传》系列中的主要人物角色悉数在该桌游中登场亮相，还包括历代著名的六界生灵、道具法术等等，并特别引入“倾慕”系统，贴合《仙剑奇侠传》游戏的传统“爱情”主题。于2012年3月15日正式上市。 仙剑奇侠传五：剑傲丹枫《仙剑奇侠传五：剑傲丹枫》为《仙剑奇侠传五》的iOS衍生作品，本作重战斗，轻剧情。剧情的部份涵盖了PC版前段情节，从苍木山上的山贼小伙子，因缘际会下解救了被魔猿袭击的黄衫女子，在后续的冒险途中，又邂逅了苗族少女小蛮与神秘魔族青年龙幽结为伙伴，到一行人为了追查疫情来到丹枫谷寻觅真相为止。本作于2012年02月23日上市，游戏平台为iPhone、iPad。 仙剑客栈SNS《仙剑客栈SNS》是软星科技（北京）有限公司制作的网络社交游戏，基本传承了单机游戏的内容，比如同样融合了经营与RPG两个类型，做出了一些更适合社交平台改变和新内容。在游戏中，玩家可以与仙剑系列中出现的众多角色互动。仙剑客栈SNS已于2012年12月中旬在腾讯旗下朋友网上展开删档内测，2013年1月31日正式上线。 新仙剑奇侠传Online《新仙剑奇侠传Online》由大宇正版授权，姚壮宪监制，骏梦游戏研发的运用Unity3D引擎开发的中国风MMORPG。《新仙剑奇侠传Online》融合仙剑奇侠传1到5单机版中所有经典角色、场景、剧情、道具等，已于2013年7月18日上线。 仙剑奇侠传：幻璃镜《仙剑奇侠传：幻璃镜》是由重组回归的上海软星制作的一款仙剑衍生游戏作品。 授权手游版本 名称信息《仙剑奇侠传》官方手游上线时间：2014年11月24日 研发公司：腾讯和大宇资讯简介：游戏中集合了从仙剑一至仙剑五的全套剧情，并可由玩家自主搭配组合，创建出最为强力的仙剑队伍。仙剑系列中大名鼎鼎的“锁妖塔”，也成为了该游戏中的重点玩法，玩家可在锁妖塔中展开探索、冒险，寻找更为丰富的宝藏，并有机会触发各类奇遇，为游戏体验倍添趣味。 《新仙剑奇侠传》3D重置版上线时间：2015年4月9日 研发公司：中国手游（CMGE）和大宇资讯简介：《新仙剑奇侠传》的3D化重置作品——《新仙剑奇侠传》。研发方引入3D渲染技术和网络支持，不但为玩家带来高清细腻的游戏画面，还能够利用移动网络体验到互动玩法。 《仙剑奇侠传五前传》手游上线时间：预计为2015年暑期 研发公司：搜狐畅游和大宇资讯简介：《仙剑奇侠传5前传》手游沿用了原作的世界观、人设和主要剧情，但整个画面更显Q版风格，主角夏侯瑾轩、瑕、姜承等也采用了Q版人物造型。在玩法方面，游戏采用了即时制战斗方式，玩家可操作角色任意移动，系统默认为自动攻击怪物。玩家则可以点击角色头像释放“大招”。另外还包括了原作中的“连携技”设定，不同角色组合搭配释放大招，可触发相应的连携技。 《仙剑客栈》手游上线时间：2015年6月 研发公司：大宇资讯、数字天空和奥尔资讯简介：由仙剑之父姚壮宪亲自参与设计，是一款主打原创内容的全明星作品，游戏汇集了目前仙剑历史上最全面的明星阵容，所有的仙剑主角及人气配角都能在手游里找到身影，而“仙剑全明星”的独特定位也让开发团队可以将更多的仙剑故事以及剧情脉络植入《仙剑客栈》。这款游戏格外强调阵型走位、移动战斗，是不折不扣的非回合制策略RPG游戏。 《仙剑奇侠传Online》手游上线时间：未知 研发公司：腾讯魔方工作室简介：在本次的仙剑故事中，玩家将不再同以往的单机版那样，去扮演仙剑世界观中的主线人物。而是以一名身处六界五行中的普通小角色的视角出发，通过串联历代仙剑故事中的经典剧情桥段，和衔接各部主要角色间的人物关系，来推动整体剧情的发展。当然，在此过程中，由玩家所控制的角色也会随着故事的深入，因自身的种种选择而对游戏的整体剧情产生一定的影响。战斗模式上采用了即时手动操作与系统自动战斗两种模式共存的方式，且二者间可以随时切换。这样一来，玩家既可以享受自由施放技能的乐趣，又将不再苦恼于迷宫中的繁琐遇敌，同时满足了追求休闲娱乐与紧张刺激的两类玩家的不同需求。 仙剑奇侠传电视剧《仙剑奇侠传》是根据同名单机游戏改编的古装玄幻电视剧，同时也是中国第一部由电玩游戏改编的电视剧，由上海唐人电影制作有限公司、云南电视台、上海影视有限公司等联合出品，李国立执导，由胡歌、刘亦菲、安以轩、刘品言、彭于晏等主演。该剧讲述了渔村的店小二李逍遥与女娲的后人赵灵儿以及林家堡大小姐林月如等人之间的恩爱情仇、拯救苍生的古装神话故事，并于2005年1月播出。之后，出版了根据电视剧改编的同名小说。 仙剑奇侠传三电视剧《仙剑奇侠传三》是根据同名国产单机游戏改编的古装玄幻电视剧，由李国立执导，胡歌、霍建华、杨幂、刘诗诗、唐嫣、黄志玮等联袂主演，于2010年2月14日（大年初一）在江苏卫视首轮上星。 该剧讲述了渝州城永安当的小伙计景天和唐门大小姐雪见受到两人随身玉佩的彼此吸引，他们二人“热闹而又尴尬”地相识了，成了一对欢喜冤家。其实雪见和景天正是彼此的有缘人，而他们都来历不凡，身藏几世的秘密，随着雪见家族的剧变，二人阴差阳错地步入了江湖的血雨腥风之中，并结识了徐长卿、紫萱和龙葵等，等待他们的是更加惊险的前程和重大的责任。仙剑奇侠传五电视剧：云之凡《云之凡》是根据单机游戏《仙剑奇侠传五》改编的武侠玄幻电视剧，已于2015年7月10日开机。该剧由郑伟文、徐惠康、何振华执导，韩东君、古力娜扎、郑元畅、小彩旗、金晨、耿乐等联袂主演。 仙剑奇侠传舞台剧《仙剑奇侠传》舞台剧是大宇资讯授权、上海染空间剧团和华亿传媒集团联合出品的舞台剧，由文卓、屠画、黄曦、倪言、高胜武、龙女、刘令飞等出演。舞台剧以一代游戏为主题，融合投影技术的舞台声光呈现，定于2015年4月15日首次演出。 仙剑奇侠传三舞台剧《仙剑奇侠传三》舞台剧由大宇资讯授权、上海染空间剧团出品的舞台剧，讲究故事的戏剧性，浓缩提纯游戏中的经典情节。舞台剧定于4月14日在上海文化广场举行首演。 仙剑客栈网络剧《仙剑客栈》网络剧是大宇资讯授权、优酷出品与北京亿奇娱乐影视文化有限公司联合出品的古装跨次元互动网络剧，由吴磊、孙雪宁、徐悦、童可可、刘帅良、刘骐、苑琼丹等联袂主演。同时，由大宇、数字天空和奥尔资讯联合研发、数字天空自主发行大陆地区的《仙剑客栈》手游与网剧联动开启。该剧于2015年6月16日在优酷网独家播出。 仙剑奇侠传电影2015年4月9日，大宇资讯在北京举办企业战略发布会，宣布与唐人电影合作拍摄电影版《仙剑奇侠传》。此次发布会上，蔡艺侬称唐人电影在2015年会启动开拍电影版《仙剑奇侠传》，希望圆制作方跟仙剑迷的十年之约，也希望《仙剑奇侠传》和《仙剑奇侠传三》两作电视剧的原班人马能在电影版中重聚。 仙剑奇侠传：前尘一梦（声优剧）《仙剑奇侠传：前尘一梦》为国内一线配音团队“光合积木”策划，剧空间、软星科技声协力，仙剑原作配音演员声音出演的声优剧，演绎出不一样的故事。演出嘉宾：姜广涛、张杰、季冠霖、乔诗语、刘校妤（刘露）、白雪岑、边江、唐小喜和宝木中阳等。该声剧于2015年7月3、4日在北京剧空间演出。 仙剑奇侠传漫画版1999年，《仙剑奇侠传》推出漫画版，由台湾青年漫画家易水翔麟（本名汤翔麟）编绘，姚壮宪先生担任监制，小鱼协力。繁体版漫画共9卷，在台湾地区一经推出便一举打破电玩类漫画单行本之销量记录。2001年1月，获得简体版授权的上海依星电脑软件有限公司在大陆发行简体中文版，共8卷。 新仙剑奇侠传官方小说《新仙剑奇侠传》小说版是作者楚国以《新仙剑奇侠传》为蓝本而改编的小说。小说基本保留了游戏的故事结构，但是又在情节的处理上对人物进行了新的塑造，并于2002年发行第1册，共5册。 仙剑奇侠传二漫画版《仙剑奇侠传二》漫画版改编自同名单机游戏，由台湾漫画家陈志隆编绘，共4卷；上市日期不明。 仙剑奇侠传三漫画版《仙剑奇侠传三》漫画版改编自同名单机游戏，由易水翔麟编绘，共6卷。仙剑奇侠传五漫画版《仙剑奇侠传五》同名漫画是改编自同名电脑单机角色扮演游戏的漫画作品，由IP君绘制，并在《天漫》杂志上连载。仙剑奇侠传系列小说《仙剑奇侠传》系列小说是由磨铁图书发行、大宇授权作家管平潮进行撰写的根据历代单机游戏进行改编的作品。至2015年4月为止，系列小说已出版至第五本。

公司高度重视产品质量，已斥巨资投入产品研发和设备引进，有三层共挤高压交联线、德国SIKORA公司在线测偏仪等先进生产设备，把影响产品质量的“人、机、料、法、环”等因素均纳入控制范围，建立了具有国内先进水平的中心试验室，引进美国HIPO公司局部放电检测系统，严格按照GB和IEC标准的试验要求和方法进行测试，满足了从原材料进厂到产品出厂各个环节的监控。公司产品已覆盖全国各地，部分产品远销至俄罗斯、捷克和斯洛伐克、尼日利亚等国家和地区。随着全球经济一体化进程的发展，公司依托正泰集团强大的实力，将一如既往地使自己在技术、工艺及设备上处于同行业领先水平，为振兴中国民族电力事业做出更多贡献。

有的，显卡天梯图分台式机显卡天梯图和笔记本显卡天梯图，如果看错了，那是看不到的。gt840m属于入门级移动显卡，算是8系列中低端显卡，主流游戏能运行，但是开高效估计有点费劲，这里的840m，8是指8系列，40是显卡定位，1般数字越大，显卡性能越好，m是指移动平台。显卡(Video card，Graphics card)全称显示接口卡，又称显示适配器，是计算机最基本配置、最重要的配件之一。显卡作为电脑主机里的一个重要组成部分，是电脑进行数模信号转换的设备，承担输出显示图形的任务。显卡接在电脑主板上，它将电脑的数字信号转换成模拟信号让显示器显示出来，同时显卡还是有图像处理能力，可协助CPU工作，提高整体的运行速度。

仙剑客栈2这款游戏有很多结局，那么所有结局的触发条件都是什么呢?想必大家还不太清楚，下面一起来看仙剑客栈2全结局动画触发一览。仙剑客栈2结局达成条件汇总CP结局：CP好感200并且触发指引中的约会任务(指引会提示时间)，就有相应的结局，分别是李逍遥、赵灵儿：执子之手李逍遥、林月如：归家谢沧行、暮菖兰：同行星璇、王蓬絮：云游四海李忆如、韩仲晰：归隐山林龙溟、凌音：与子成说紫萱、徐长卿：连理唐雪见、景天：欢喜冤家云天河、韩菱纱：寻仙云天河、柳梦璃：返乡仙剑四全主角：绝佳伙伴小蛮：灯火阑珊小蛮、阿奴：师徒龙葵、景天：倾心龙葵、景天、唐雪见：新安当月清疏、修吾：携手白茉晴、桑游：相伴其他结局：没钱发工资破产结局：门可罗雀正常结局：南柯—梦全女角色收集结局：温泉之路全男角色收集结局：林野溯溪全人物收集结局：聚义堂全御灵收集结局：御灵客栈全菜品满级结局：食神降临全客人小游戏胜利结局：冠军客栈客栈等级达到25：天下第一客栈

总部在乐清柳市镇 地址：浙江省乐清市柳市镇工业区正泰大楼正泰建筑电器有限公司地址：浙江温州柳市正泰工业园 温州大桥这边 高速大转盘下边总机电话是021-67777777 有问题打电话询问！！！给我加分吧 谢谢

搭配双通道高频（1866及以上）内存的情况下，这颗APU核显的显卡性能在独显R7 240到R7 250之间，相当于NVIDIA显卡的GT730K GDDR5左右。其他问题：1、侧透加厚炫彩机箱花形图案灯光照房顶，16年10月新出的四核cpu,amda107860k，最新核显支持dx12，航嘉电源，华硕主板，威刚ddr4代高频内存2133，像上一代4590不支持4代高频内存，威刚固态128g，开机12秒，主板已激活win10，不用显卡用核显玩英雄联盟稳定最高画质都在fps60以上，另外我买的篮宝石7770最高频显卡可以玩大型单机游戏要的话加300。

简介：浙江正泰电缆有限公司是正泰电气股份有限公司专业制造电线电缆产品的生产公司。公司创建于2003年9月，是正泰集团公司“融入长三角、接轨大上海”重大战略举措的重要项目之一。2005年12月，为实现正泰电线电缆产业的跨越式发展，正泰电气股份有限公司以资本运做的方式对原正泰电气电线电缆公司和浙江南湖电缆有限公司进行了重组，注册成立了具有独立法人实体的浙江正泰电缆有限公司，并将电缆产业的生产基地移师长三角的中心地带——浙江嘉兴。浙江正泰电缆有限公司现有总资产2.5亿元，注册资本1亿元，公司占地面积6万多㎡，建筑面积3万多㎡；主要生产布电线、电力电缆、橡套电缆、低烟低卤和低烟无卤、耐火、阻燃系列电力电缆、计算机电缆，预分支电缆、特种电缆及电缆附件等二十多个系列产品，规格达26000多种；员工260人左右，其中大专以上的工程技术人员占15%，中级技术职称人员占10%，高级职称及研究生学历的管理人员占3%。法定代表人：陈成剑成立时间：2001-08-07注册资本：20000万人民币工商注册号：152701000021201企业类型：其他有限责任公司公司地址：嘉兴市大桥(南湖工业区内)

不是。 正泰电工是浙江正泰建筑电器有限公司简称简称， 地址：浙江省温州市乐清市柳市镇柳白路。 公司始创于 1997 年，主要生产经营墙壁开关、插座等建筑电器附件及其智能化产品等 10 多个系列、 1500 多个品种不同规格的产品。 浙江正泰建筑电器有限公司是正泰集团旗下与高低压电器、输变电、仪器仪表并列的四大支柱产业之一，也是建筑电器领域内唯一一家被建设部确定为“国家住宅产业化基地”的龙头企业。 正泰电器是正泰集团股份有限公司的简称，公司地址：浙江省乐清市北白象镇正泰工业园正泰路1号。 公司始创于1984年7月，现有员工23000余名，下辖8大专业公司、2000多家国内销售中心和特约经销处，并在国外设有50多家销售机构。产品覆盖高低压电器、输配电设备、仪器仪表、建筑电器、汽车电器、工业自动化和光伏电池及组件系统等七大产业，产品畅销世界90多个国家和地区。正泰集团是中国工业电器行业产销量最大的企业之一，综合实力连续多年名列中国民营企业500强前十位，年利税总额连续三年名列中国民营企业纳税百强前五名。"正泰"商标被认定为中国驰名商标，四大系列产品跻身"中国名牌"。。

正泰集团地址：浙江省乐清市柳市镇工业区正泰大楼网址：www.chint.com浙江正泰建筑电器有限公司地址：浙江温州柳市正泰工业园网址：www.chintelc.com

黄继光（1931年1月8日－1952年10月19日），原名黄际广，生于四川省中江县，中国人民志愿军的一名士兵。1952年10月19日在朝鲜上甘岭地区597.9高地阵亡。 根据战地目击者的描述，黄继光在中国人民志愿军的进攻部队受到机枪巢火力压制的时候负责爆破任务，他投掷了一枚手雷但是未能完成任务。最终他用身体挡住了机枪枪口使得后续部队能够攻下高地。 黄继光被中国人民志愿军领导机关追记特等功，并授予“特级英雄”称号（另一特级英雄是杨根思）；所在部队党委追认他为中国共产党正式党员；朝鲜政府授予他“朝鲜民主主义人民共和国英雄”称号。 有人认为靠身体根本无法堵住机枪的火力，而且梅花堡有多支机枪同时发射，所以虽然黄继光的牺牲是事实，但认为是靠他堵住的枪眼而使得后续部队能够攻克高地，则有悖常理。当时的新闻报道亦被后人认为是夸大其词 ---------------------------------- 1952年12月21日，新华社发出了一篇长篇通讯《马特洛索夫式的英雄黄继光》，写的是抗美援朝上甘岭战役中，黄继光去爆破敌人的火力点。稿件这样写道，在他中弹倒下后，“他回过头来望了望，看见他的两个战友都一声不响地躺在那里，爆破的任务就完全落在他的身上”，“一阵的冷雨落在黄继光的颈子上，敌人的机枪仍然嘶叫着，他从极度的疼痛中醒来了。他每一次轻微的呼吸都会引起胸膛剧烈的疼痛。他四肢无力地瘫痪在地上。”“四十分钟的期限快到了，而我们的突击队还在敌人的火力压制下冲不上来。后面坑道里营参谋长在望着他，战友们在望着他，祖国人民在望着他，他的母亲也在望着他，马特洛索夫的英雄行为在鼓舞他。这时，战友们看见黄继光突然从地上一跃而起，他像一支离弦的箭，向火力点猛扑过去。用自己的胸膛抵住了正在喷吐着火焰的两挺机关枪。”这篇通讯当时在全国引起了强烈的反响，黄继光的英雄事迹、伟大的牺牲精神鼓舞了正在建设新中国的全国人民。然而，当人们冷静下来之后，就有人提出质疑，既然黄继光已经牺牲了，他在扑向敌人的火力点之前内心的想法和感受，记者是怎样采访到的？很有意思的是，新华社当天还发了一则编者按，说“十一月二十日发《马特洛索夫式的英雄黄继光》，系前线通讯员在战斗仓卒写成，与实际战斗情节略有出入。此稿是经各方仔细核实最后判明的情节。” 正是“此地无银三百两”，再怎么核实，也不可能核实到黄继光牺牲前怎么想的了。记得采纳啊

笔记本显卡GTX860m与GTX850m差距在30%左右的，差距还是比较大，同品牌的笔记本电脑一般在价位上差距在700块左右。GTX860M的性能还是非常不错的，和台式机的GTX750TI性能都差不多了，玩网游是非常好的，下面是两款显卡的参数信息和性能对比：显存容量：GTX850M为2048MB，GTX860M为2048MB。流处理量：GTX850M为640个，GTX860M为1152个。核心频率：GTX850M为954MHz，GTX860M为1020MHz。显存位宽：GTX850M为128bit，GTX860M为128bit。显存带宽：GTX850M为80.2GB/s ，GTX860M为80.2GB/s。

黄继光（1931年1月8日－1952年10月19日），原名黄际广，生于四川省中江县，中国人民志愿军的一名士兵。1952年10月19日在朝鲜上甘岭地区597.9高地阵亡。根据战地目击者的描述，黄继光在中国人民志愿军的进攻部队受到机枪巢火力压制的时候负责爆破任务，他投掷了一枚手雷但是未能完成任务。最终他用身体挡住了机枪枪口使得后续部队能够攻下高地。黄继光被中国人民志愿军领导机关追记特等功，并授予“特级英雄”称号（另一特级英雄是杨根思）；所在部队党委追认他为中国共产党正式党员；朝鲜政府授予他“朝鲜民主主义人民共和国英雄”称号。有人认为靠身体根本无法堵住机枪的火力，而且梅花堡有多支机枪同时发射，所以虽然黄继光的牺牲是事实，但认为是靠他堵住的枪眼而使得后续部队能够攻克高地，则有悖常理。当时的新闻报道亦被后人认为是夸大其词----------------------------------1952年12月21日，新华社发出了一篇长篇通讯《马特洛索夫式的英雄黄继光》，写的是抗美援朝上甘岭战役中，黄继光去爆破敌人的火力点。稿件这样写道，在他中弹倒下后，“他回过头来望了望，看见他的两个战友都一声不响地躺在那里，爆破的任务就完全落在他的身上”，“一阵的冷雨落在黄继光的颈子上，敌人的机枪仍然嘶叫着，他从极度的疼痛中醒来了。他每一次轻微的呼吸都会引起胸膛剧烈的疼痛。他四肢无力地瘫痪在地上。”“四十分钟的期限快到了，而我们的突击队还在敌人的火力压制下冲不上来。后面坑道里营参谋长在望着他，战友们在望着他，祖国人民在望着他，他的母亲也在望着他，马特洛索夫的英雄行为在鼓舞他。这时，战友们看见黄继光突然从地上一跃而起，他像一支离弦的箭，向火力点猛扑过去。用自己的胸膛抵住了正在喷吐着火焰的两挺机关枪。”这篇通讯当时在全国引起了强烈的反响，黄继光的英雄事迹、伟大的牺牲精神鼓舞了正在建设新中国的全国人民。然而，当人们冷静下来之后，就有人提出质疑，既然黄继光已经牺牲了，他在扑向敌人的火力点之前内心的想法和感受，记者是怎样采访到的？很有意思的是，新华社当天还发了一则编者按，说“十一月二十日发《马特洛索夫式的英雄黄继光》，系前线通讯员在战斗仓卒写成，与实际战斗情节略有出入。此稿是经各方仔细核实最后判明的情节。” 正是“此地无银三百两”，再怎么核实，也不可能核实到黄继光牺牲前怎么想的了。

应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmid cloning）。这种技术的理论依据是，在线性λ噬菌体DNΑ分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端（cos位点）。在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specific cutting system），叫做末端酶（terminase）或Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。只有在被作用的λDNA分子具有两个cos位点，而且它们之间的距离保持在38～54kb的条件下，Ter体系才能对它们发生作用。应用柯斯质粒作载体进行基因克隆的一般程序是：将外源DNA片段与柯斯质粒线性DNA分子进行体外连接反应。由此形成的连接产物群体中，有一定比例的分子是两端各有一个cos位点的长度为40kb左右的真核DNA片段，而且这两个cos位点在取向上是一样的，可作为λ噬菌体Ter功能的一种适用底物。当加入λ噬菌体的包装连接物时，它能把这些分子包装进λ噬菌体的头部，可以用来感染大肠杆菌 柯斯克隆技术的优点主要有两方面：首先，由于柯斯载体兼具了质粒和λ噬菌体两方面的特性，提高了克隆外源DNA片段的能力，可达45kb左右，因此对于构建真核生物基因文库是一种特别有用的克隆载体；其次，应用柯斯质粒作克隆载体，所形成的非重组体的克隆本底比较低，从而提高了筛选具外源DNA的重组体质粒的几率。 1.由于经核酸内切酶切割作用产生的线性的柯斯质粒载体，彼此间会通过分子内重组形成多聚体分子。2.由于经核酸内切酶做局部消化的折合基因组产生出来的DNA片段，在随后的连接反应中，往往会出现两个或数个片段随机连接在一起的情况。

黄继光（1931年1月8日－1952年10月19日），原名黄际广，生于四川省中江县，中国人民志愿军的一名士兵。1952年10月19日在朝鲜上甘岭地区597.9高地阵亡。根据战地目击者的描述，黄继光在中国人民志愿军的进攻部队受到机枪巢火力压制的时候负责爆破任务，他投掷了一枚手雷但是未能完成任务。最终他用身体挡住了机枪枪口使得后续部队能够攻下高地。黄继光被中国人民志愿军领导机关追记特等功，并授予“特级英雄”称号（另一特级英雄是杨根思）；所在部队党委追认他为中国共产党正式党员；朝鲜政府授予他“朝鲜民主主义人民共和国英雄”称号。有人认为靠身体根本无法堵住机枪的火力，而且梅花堡有多支机枪同时发射，所以虽然黄继光的牺牲是事实，但认为是靠他堵住的枪眼而使得后续部队能够攻克高地，则有悖常理。当时的新闻报道亦被后人认为是夸大其词----------------------------------1952年12月21日，新华社发出了一篇长篇通讯《马特洛索夫式的英雄黄继光》，写的是抗美援朝上甘岭战役中，黄继光去爆破敌人的火力点。稿件这样写道，在他中弹倒下后，“他回过头来望了望，看见他的两个战友都一声不响地躺在那里，爆破的任务就完全落在他的身上”，“一阵的冷雨落在黄继光的颈子上，敌人的机枪仍然嘶叫着，他从极度的疼痛中醒来了。他每一次轻微的呼吸都会引起胸膛剧烈的疼痛。他四肢无力地瘫痪在地上。”“四十分钟的期限快到了，而我们的突击队还在敌人的火力压制下冲不上来。后面坑道里营参谋长在望着他，战友们在望着他，祖国人民在望着他，他的母亲也在望着他，马特洛索夫的英雄行为在鼓舞他。这时，战友们看见黄继光突然从地上一跃而起，他像一支离弦的箭，向火力点猛扑过去。用自己的胸膛抵住了正在喷吐着火焰的两挺机关枪。”这篇通讯当时在全国引起了强烈的反响，黄继光的英雄事迹、伟大的牺牲精神鼓舞了正在建设新中国的全国人民。然而，当人们冷静下来之后，就有人提出质疑，既然黄继光已经牺牲了，他在扑向敌人的火力点之前内心的想法和感受，记者是怎样采访到的？很有意思的是，新华社当天还发了一则编者按，说“十一月二十日发《马特洛索夫式的英雄黄继光》，系前线通讯员在战斗仓卒写成，与实际战斗情节略有出入。此稿是经各方仔细核实最后判明的情节。” 正是“此地无银三百两”，再怎么核实，也不可能核实到黄继光牺牲前怎么想的了。

克隆载体可以在真核生物中作用，但是克隆速度比较慢，因为真核生物分裂速度很慢。原核生物分裂速度快，所以克隆载体一般用于原核生物，表达载体才用于真核生物。