细胞分离技术

在基础医学研究中涉及越来越多的如某一疾病状态组织中，多种基因或遗传变化，区别发展中的组织细胞群以及疾病状态组织细胞，将有助于了解疾病发生的分子机制。因此，在下一代的分子分析方法将需要进入微观世界及自动化程度高。对 某一特殊个体的切片进行遗传指纹图谱鉴定，将有助于诊断及指导治疗。 然而，即使是最经典、可靠的检测方法，也不可避免混杂多种状态细胞中DNA、RNA或蛋白质分子的干扰，因此，需要发展组织显微分离技术，以解决从混合细胞型组织中分离某单一群的细胞。最开始，研究者从冰冻的组织块中粗略地挖取富含某一类细胞类群的组织，或用激光破坏手工墨水标记的不需要部分，或手工工具针或刀机械地去除或刮取相应的组织。上述几种方法在操作过程中繁琐，不够精确，效率不能适应常规的临床分子诊断方法。为了解决上述问题，美国国立健康研究院肿瘤研究所病理研究室与生物医学设备组合作研发激光俘获显微切割技术，发展为Acturus 的PixCell II系统。在操作这套系统时，首先在组织切片上覆盖一层透明的膜，在显微镜下观察该组织切片，选择某一特殊细胞后，开启脉冲式红外激光束，使膜融化变得粘性很强(该膜的成份为 Ethylene Vinyl Acetate Polymer)，等到冷却后将该位置的细胞牢固地粘附在上面从而分离细胞。 该种方法较以往方法改进之处：首先，它简单，不需要移动任何切片部位，一步即可完成从组织中分离特殊细胞，这些在膜上的细胞依然保持其原有的形态，使用无菌、一次性的膜可最大限度地避免可能的污染。这对于后续进行PCR检测是尤为重要的。其次，使膜活化所需的激光能量很小(<50mW)，与常规显微配合是充足的，完全能够满足临床病理组织细胞显微分离的需要。再者，LCM技术分离细胞速度较以往方法有很大提高，例如，从肾组织切片中分离一个肾小球(Glomerulus)所需时间小于10秒，一小时内即可轻松地分离上百个肾小球。手工分离方法远远不能达到该速度。由于组织切片固定，操作者可以反过来确定所分离的细胞是正确的靶细胞。而手工机械显微分离可能会引起周围其它细胞一块松动，污染靶细胞。 一个新技术及伴随新技术诞生的仪器会对科学研究产生重要的影响。在NATURE MEDICINE u2022 VOLUME 5 u2022 NUMBER 1:117-112 u2022 JANUARY 1999 的研究论文中，作者将 LCM、 RNA扩增和基因芯片三种技术整合到分子神经生物学研究中.研究涉及一个神经组织：背根神经节(DRG).DRG位于脊髓两边,很小,大鼠的DRG只有1/3大米粒大.脑内和DRG有类似功能的组织是三叉神经节.DRG中有两类神经元:大神经元和小神经元. 国内科学家曾利用DD-PCR技术研究正常大鼠和接受伤害性刺激的大鼠的DRG的基因表达差异，筛选参与伤害性刺激相关基因,包括新基因和已知基因的新功能.目前认为DRG中与伤害性刺激有关的神经元是小神经元.研究者可能的苦恼是不能分别取出DRG中的大小神经元来进行研究。另一个苦恼是由于DRG很小, 所以为了提取足够使用的RNA,不得不杀大量大鼠,有时一次就杀上百只。而且从大鼠取DRG也不是一件很容易的解剖技术.还有一个苦恼就是DD-PCR要接触同位素,即在进行DD-PCR反应时加入同位素标记的dATP或dCTP，这样得到的PCR产物就标记上了同位素.产物进行PAGE,电泳后干胶仪器干胶.干胶曝X光片, 曝光后的X光片和胶对好位置,从胶中回收感兴趣的DNA片段。鉴于这些苦恼，研究者们可能希望:要是能把大小神经元分开该多好,要是能把RNA扩增该多好,要是做DD-PCR时能不用同位素该多好.如今看来,这些难题似乎可以迎刃而解了。即利用LCM技术取出感兴趣的细胞,利用Epicentre Ampliscribe T7 Transcription Kit把有限量组织中提出的有限量RNA扩增;进行DD-PCR反应时用红外荧光染料标记(的引物)技术取代同位素标记技术,经Odyssey Infrared Imaging System检测和定位,从而可以从胶中回收希望回收的片段。这个回收方案同样可以用于AFLP研究者回收他们感兴趣的DNA片段。 当前,在生命科学领域,和基因组学及蛋白组学一样热门的是神经科学,而且神经科学在国内外都正在成为最具挑战性和最具诱惑力的科学。因此,在国内外从事神经科学研究的科技工作者越来越多,国家对神经科学的资助也越来越大。神经系统由外周神经系统和中枢神经系统组成,中枢神经系统包括脑和脊髓.神经系统主要由两类细胞组成：神经元和胶质细胞.在脑内,不同解剖区域行使不同功能,这里所讲的解剖区域是指核团。核团在显微镜下才可以辨别,是相对集中在一个区域的可能行使一定功能的神经元和胶质细胞的集合体。把某个核团从脑内取出来是不太现实的。脑内核团数以百计,如果要想研究基因在脑内核团的表达水平, 在以前只能用原位杂交技术。如果要想研究蛋白质的表达水平或磷酸化等状态，只能用免疫组织化学技术。而这两个技术虽然能精确定位基因或蛋白质在脑内核团的表达情况,缺点是通量小。因此，如果研究者主要是为了研究很多种基因在特定核团的神经元或胶质细胞的表达情况,新的解决方案之一就是组合LCM技术、RNA扩增技术和基因芯片技术。即利用LCM技术将特定核团的神经元或胶质细胞取出,提取总RNA或mRNA,RNA反转录为cDNA并进行扩增.最后将cDNA标记为探针,和基因芯片杂交。如果研究的基因种类数不多,那么也可以只提取LCM获得的细胞的总RNA,利用定量RT-PCR技术来进行基因表达分析。

嗯，是的。流式可以分选计数或分选收集不同大小、不同表面抗原、不同标记等的各类细胞

可通过特定序列的探针检测样品中是否含有与之同源的核酸序列。基因克隆的筛选,酶切图谱制作,基因组中特定基因序列的定量和定性检测,基因突变分析,疾病的诊断、微生物病原体检测。根据杂交对象的不同可分为：DNA与DNA；RNA与DNA另外：Westernbl。

细胞分离技术包括离心技术、流式细胞术和细胞电泳。离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。细胞电泳是指在一定PH 值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动

⑴CD4 细胞的分离：将一定量的T 细胞悬液通过一根SephDdexC—10 柱，然后用少量的RPMll640 培养洗涤，收获的细胞悬液约含85%的CD4 细胞。⑵CD8 细胞分离：用Tris 缓冲液稀释羊抗鼠IgG（浓度为10μg/m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS 洗净。然后将已标记有抗CD8 单克隆抗体的T 细胞（细胞浓度为1×l07/m1)3m1 加入上述的平皿内，4℃放置2 小时，用PBS 轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS 吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640 培基中备用。CD4 细胞亦可用此法分离。 用微生态制剂提高免疫力的研究和使用由来已久。研究表明，以肠道双歧杆菌、乳酸杆菌为代表的有益菌群具有广谱的免疫原性，能刺激负责人体免疫的淋巴细胞分裂繁殖，同时还能调动非特异性免疫系统，去“吃”掉包括病毒、细菌、衣原体等在内的各种可致病的外来微生物，产生多种抗体，提高人体免疫能力。对于健康人来说，不妨“食疗”，多吃些乳酸菌饮料；而健康边缘人群，可以用微生态制剂来调节体内微生态平衡。能提高免疫力的食品 1.灵芝：灵芝可增强人体的免疫力，这是因为灵芝含有抗癌效能的多糖体，此外，还含有丰富的锗元素。锗能加速身体的新陈代谢，延缓细胞的衰老，能通过诱导人体产生干扰素而发挥其抗癌作用； 2.新鲜萝卜：因其含有丰富的干扰素诱导剂而具有免疫作用； 3.人参蜂王浆：能提高机体免疫力及内分泌的调节能力，并含具有防癌作用的蜂乳酸； 4.蘑菇、猴头菇、草菇、黑木耳、银耳、车养、百合等：都有明显增强免疫力的作用； 5.香菇：香菇所含的香菇多糖能增强人体免疫力。

离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min 的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kg者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。1、差速离心差速离心（differential centrifugation）是指在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器（图1）。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3 次效果会好一些。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。2、密度梯度离心密度梯度离心（density gradient centrifugation）是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图2）。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH 中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。2.1 速度沉降速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。2.2 等密度沉降等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10~100 倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤，而且停留在等密度介质中的细胞比处在移动中的细胞受到更大的损伤。因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。