启动子

①马铃薯总DNA的提取取马铃薯试管苗叶片，采用CTAB法翻提取马铃薯总DNA。② 目的片段的扩增在Genebank中查找已公布的马铃薯块茎patatin启动子序列并利用Oligo6．0软件设计PCR扩增引物命名为G1 (5′ GTGGAA CGG AGA CAT G IT ATC A 3 )、G2 (5′ CGCATC AAA TCA GAA ATA A1Tr GG 3 )： 以所提取的DNA为模板，G1、G2作引物，在25 μL的反应体系(含Taq酶缓冲液、dNTP、Taq酶)中，95℃ 5 min、95℃ 40 s、54℃50 S、72℃ 60 s扩增30个循环，72℃保温10 min。取5 μL PCR扩增产物进行电泳检测，将扩增的单一条带进行回收。③PCR产物与T载体的连接及鉴定取上述PCR回收产物与T载体连接．采用热激法转化大肠杆菌DH5α，并进行蓝白斑筛选，将经PCR鉴定的阳性质粒DNA用Sac I、Xho I进行双酶切鉴定，将所得阳性重组子命名为pGEM—TG，并送往上海生物工程公司测序。④序列分析序列同源性分析采用DNAman软件完成，启动子序列调控元件分析利用植物顺势调控元件数据库PLACE和PlantCaret完成。

这道题的关键在于二倍体I+P-O+Z+Y+/I-P+O+Z+，一条染色体上是I与P结合、OZY结合，另一条上是POZ结合，I是分开的。看懂了这个，这题就解决了。当乳糖存在的情况下，会启动乳糖操纵子，但是由于一条链上I与P结合，所以此链上的表达被阻遏了，因此只会产生Z半乳糖苷酶，不产生Y透性酶。乳糖不存在时，根本不会启动乳糖操纵子，因此这道题只能选A。 不知道你理解了没？不理解可以问我哦~^.^

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 （2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。 （4）lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子。lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物 cIts857。在低温(30℃)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(45℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。系统由于受cIts857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导PL启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体cI+溶源菌，并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。 （5）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体。

你还是没太明白lac operon的结构，你是不是看到的老版本的书，建议你去gene8上查一查具体内容。还有，启动子是promotor, 原版书上是lac operon。不大可能吧，它调控编码的repressor是不是也能和其他细菌的位点结合？那么凑巧的构象吻合不大可能。你可以再参考一下阿拉伯糖的调控。

启动子是一段位于结构基因5"端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。有实验表明，对许多启动子来说，RNA聚合酶与之相结合的速率至少比布朗运动中的随机碰撞高100倍。转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用：启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?显然启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区“TTGACA”，-10区“TATATT”。大多数启动子均有共同顺序（consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。 启动子区是RNA聚合酶的结合区，其结构直接关系到转录的效率。关于其结构特点，Pribnow设计了一个实验，他把RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNase l水解DNA，然后用酚抽提，沉淀纯化DNA后得到一个被RNA聚合酶保护的DNA片段，约有41～44个核苷酸对。他先后分离了fd噬菌体、T7噬菌体的A2及A3启动子、h噬σ菌体的PR启动子及大肠杆菌乳糖操纵子的UV5启动子等5段被酶保护的区域，并进行了序列分析，以后又有人做了50多个启动子的序列分析后发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，称为Pribnow区（Pribnow box），这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为-10区。许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：RNA聚合酶同启动子结合的区域称为启动子区。将各种原核基因同RNA聚合酶全酶结合后，用DNase I水解DNA，最后得到与RNA聚合酶结合而未被水解的DNA片段，这些片段有一个由5个核苷酸（TATAA）组成的共同序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框(Pribnow box），这个框的中央位于起点上游10bp处，所以又称-10序列（-10 sequence），后来在-35 bp处又找到另一个共同序列（TTGACA）。Hogness等在真核基因中又发现了类似Pribnow框的共同序列，即位于-25～-30 bp处的TATAAAAG，也称TATA框（TATA box）。TATA框上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element，UPE）或上游激活序列(uptream activating sequence，UAS）。另外在-70～-78 bp处还有一段共同序列CCAAT，称为CAAT框（CAAT box）。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribrow区的Hogness区（Hogness box），这是位于转录起始点上游-25~-30 bp处的共同序列似TAAA，也称为TATA区。另外，在起始位点上游-70～-78 bp处还育另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中-35bp区相对应的序列．称为CAAT区（CAAT box）。 提纯被保护的片段后却发现，RNA聚合酶并不能重新结合或并不能选择正确的起始点，表明在保护区外可能还存在与RNA聚合酶对启动子的识别有关的序列。果然，科学家不久就从噬菌体的左、右启动子PL及PR和SY40启动子的-35 bp附近找到了另一段共同序列：TTGACA。经过数年的努力，分析了46个大肠杆菌启动子的序列以后．确证绝大部分启动子都存在这两段共同序列，即位于-10bp处（……T89A89T50A65A100……）的TATA区和-35 bp处（……T85T83G81A61C69A52……）的TTGACA区。现已查明，-10位的TATA区和-35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。原核生物中-10区同-35区之间核苷酸数目的变动会影响基因转录活性的高低，强启动子一般为17±1 bp，当间距小于15 bp或大于20 bp时都会降低启动子的活性。以下是核苷出现的概率： 在真核基因中，有少数基因没有TATA框。没有TATA框的真核基因启动子序列中，有的富集GC，即有GC框；有的则没有GC框。GC框位于-80～-110bp处的GCCACACCC或GGGCGGG序列。TATA框的主要作用是使转录精确地起始；CAAT框和GC框则主要是控制转录起始的频率，特别是CAAT框对转录起始频率的作用更大。如在TATA框同相邻的UPE之间插入核苷酸，也会影响转录使之减弱。-10序列又称为Pribnow盒（原核生物）。在真核生物中相应的序列位于-35bp处，称为TATA盒，又称为Goldberg-Hogness box，是RNA聚合酶Ⅱ的结合部位。-10和-35这两个部位都很重要：【1】RNA聚合酶能和-35和-10序列中的碱基和DNA主链中的磷酸基相接触；【2】离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱；【3】最重要的是，破坏启动子功能的突变中有75%都是改变了共同顺序中的碱基，其余25%亦为离共同顺序较近的。-35和-10序列相距约20bp，即大致是双螺旋绕两圈的长度。因为这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，可见此酶是结合在双螺旋的一面。可以想像，它能感觉到每个结合区的沟底中碱基所产生的特异形状。原核生物亦有少数启动子缺乏这两个序列（-35和-10）之一。在这种情况下，RNA聚合酶往往不能单独识别这种启动子，而需要有辅助蛋白质的帮助。可能是这些蛋白质因子与邻近序列的反应可以弥补启动子的这个缺陷。在真核生物中，在转录起始位点上游70-80bp处有CAAT顺序，也称为CAAT盒。这一顺序也是比较保守的共同顺序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以识别一顺序。在对家兔β珠蛋白基因CAAT顺序的研究中发现，用人工方法诱导CAAT顺序发生突变使家兔β珠蛋白基因的转录水平降低。启动子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序。但是附近其他DNA顺序也能影响启动子的功能。例如，在核糖体RNA合成的起始位点的上游50到150核苷酸之间的顺序就是对启动子的完全活性所必需的。如果这一段DNA顺序缺失并由其他外来DNA所取代（例如克隆在质粒DNA中的rRNA基因），则转录起始的频率将降低10倍。同样，在其他情况下，远隔部位的富有AT的DNA顺序被认为能增进转录起始的频率。有时候上游顺序可以是某些能直接激活RNA聚合酶的激活蛋白的结合部位。但是，上游顺序往往有另外的功能。例如上游顺序可以吸引拓扑异构酶，后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的超螺旋状态。上游顺序所引起的DNA结构的微细变化可能在双螺旋上被传导到相当远的距离，因此上游顺序的变化可以影响到-10和-35区的DNA结构细节。 以下是从人类孟德尔遗传学（OMIM）证实与启动子故障有关，不论是因启动子序列直接突变或是转录因子或转录共激发因子的突变。而多种癌症都没有列下是因为从染色体易位产生嵌合基因：哮喘 β地中海贫血 鲁宾斯坦泰比综合症要留意的是在病原学上大部份的疾病都是异质的，而在分子层面上一种疾病往往是指多种疾病，纵然它们的病征及治疗方法一致。疾病对治疗有不同的反应，是因背后分子源头的差异，这会是药物遗传学的范畴。

启动子是一段位于结构基因5"端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。有实验表明，对许多启动子来说，RNA聚合酶与之相结合的速率至少比布朗运动中的随机碰撞高100倍。转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用：启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?显然启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区“TTGACA”，-10区“TATATT”。大多数启动子均有共同顺序（consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。 启动子区是RNA聚合酶的结合区，其结构直接关系到转录的效率。关于其结构特点，Pribnow设计了一个实验，他把RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNase l水解DNA，然后用酚抽提，沉淀纯化DNA后得到一个被RNA聚合酶保护的DNA片段，约有41～44个核苷酸对。他先后分离了fd噬菌体、T7噬菌体的A2及A3启动子、h噬σ菌体的PR启动子及大肠杆菌乳糖操纵子的UV5启动子等5段被酶保护的区域，并进行了序列分析，以后又有人做了50多个启动子的序列分析后发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，称为Pribnow区（Pribnow box），这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为-10区。许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：RNA聚合酶同启动子结合的区域称为启动子区。将各种原核基因同RNA聚合酶全酶结合后，用DNase I水解DNA，最后得到与RNA聚合酶结合而未被水解的DNA片段，这些片段有一个由5个核苷酸（TATAA）组成的共同序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框(Pribnow box），这个框的中央位于起点上游10bp处，所以又称-10序列（-10 sequence），后来在-35 bp处又找到另一个共同序列（TTGACA）。Hogness等在真核基因中又发现了类似Pribnow框的共同序列，即位于-25～-30 bp处的TATAAAAG，也称TATA框（TATA box）。TATA框上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element，UPE）或上游激活序列(uptream activating sequence，UAS）。另外在-70～-78 bp处还有一段共同序列CCAAT，称为CAAT框（CAAT box）。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribrow区的Hogness区（Hogness box），这是位于转录起始点上游-25~-30 bp处的共同序列似TAAA，也称为TATA区。另外，在起始位点上游-70～-78 bp处还育另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中-35bp区相对应的序列．称为CAAT区（CAAT box）。 提纯被保护的片段后却发现，RNA聚合酶并不能重新结合或并不能选择正确的起始点，表明在保护区外可能还存在与RNA聚合酶对启动子的识别有关的序列。果然，科学家不久就从噬菌体的左、右启动子PL及PR和SY40启动子的-35 bp附近找到了另一段共同序列：TTGACA。经过数年的努力，分析了46个大肠杆菌启动子的序列以后．确证绝大部分启动子都存在这两段共同序列，即位于-10bp处（……T89A89T50A65A100……）的TATA区和-35 bp处（……T85T83G81A61C69A52……）的TTGACA区。现已查明，-10位的TATA区和-35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。原核生物中-10区同-35区之间核苷酸数目的变动会影响基因转录活性的高低，强启动子一般为17±1 bp，当间距小于15 bp或大于20 bp时都会降低启动子的活性。以下是核苷出现的概率： 在真核基因中，有少数基因没有TATA框。没有TATA框的真核基因启动子序列中，有的富集GC，即有GC框；有的则没有GC框。GC框位于-80～-110bp处的GCCACACCC或GGGCGGG序列。TATA框的主要作用是使转录精确地起始；CAAT框和GC框则主要是控制转录起始的频率，特别是CAAT框对转录起始频率的作用更大。如在TATA框同相邻的UPE之间插入核苷酸，也会影响转录使之减弱。-10序列又称为Pribnow盒（原核生物）。在真核生物中相应的序列位于-35bp处，称为TATA盒，又称为Goldberg-Hogness box，是RNA聚合酶Ⅱ的结合部位。-10和-35这两个部位都很重要：【1】RNA聚合酶能和-35和-10序列中的碱基和DNA主链中的磷酸基相接触；【2】离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱；【3】最重要的是，破坏启动子功能的突变中有75%都是改变了共同顺序中的碱基，其余25%亦为离共同顺序较近的。-35和-10序列相距约20bp，即大致是双螺旋绕两圈的长度。因为这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，可见此酶是结合在双螺旋的一面。可以想像，它能感觉到每个结合区的沟底中碱基所产生的特异形状。原核生物亦有少数启动子缺乏这两个序列（-35和-10）之一。在这种情况下，RNA聚合酶往往不能单独识别这种启动子，而需要有辅助蛋白质的帮助。可能是这些蛋白质因子与邻近序列的反应可以弥补启动子的这个缺陷。在真核生物中，在转录起始位点上游70-80bp处有CAAT顺序，也称为CAAT盒。这一顺序也是比较保守的共同顺序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以识别一顺序。在对家兔β珠蛋白基因CAAT顺序的研究中发现，用人工方法诱导CAAT顺序发生突变使家兔β珠蛋白基因的转录水平降低。启动子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序。但是附近其他DNA顺序也能影响启动子的功能。例如，在核糖体RNA合成的起始位点的上游50到150核苷酸之间的顺序就是对启动子的完全活性所必需的。如果这一段DNA顺序缺失并由其他外来DNA所取代（例如克隆在质粒DNA中的rRNA基因），则转录起始的频率将降低10倍。同样，在其他情况下，远隔部位的富有AT的DNA顺序被认为能增进转录起始的频率。有时候上游顺序可以是某些能直接激活RNA聚合酶的激活蛋白的结合部位。但是，上游顺序往往有另外的功能。例如上游顺序可以吸引拓扑异构酶，后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的超螺旋状态。上游顺序所引起的DNA结构的微细变化可能在双螺旋上被传导到相当远的距离，因此上游顺序的变化可以影响到-10和-35区的DNA结构细节。 以下是从人类孟德尔遗传学（OMIM）证实与启动子故障有关，不论是因启动子序列直接突变或是转录因子或转录共激发因子的突变。而多种癌症都没有列下是因为从染色体易位产生嵌合基因：哮喘 β地中海贫血 鲁宾斯坦泰比综合症要留意的是在病原学上大部份的疾病都是异质的，而在分子层面上一种疾病往往是指多种疾病，纵然它们的病征及治疗方法一致。疾病对治疗有不同的反应，是因背后分子源头的差异，这会是药物遗传学的范畴。

本质不同启动子的本质都百是DNA上的碱基对，起始密码子的本质是mRNA上相邻的三个碱基。启动子和起始密码子并无共同点。启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，启动子本身不被转录。作用不同启动子：活化RNA聚合酶。起始密码子：作为多肽链合成的起始信号，同时编码一种氨基酸；既编码甲硫氨酸，又作为多肽链合成的起始信号。起始密码子就是从这个碱基开始决定蛋白质合成，蛋白质是由许多氨基酸组成的，而组成蛋白质的第一个氨基酸就是有起始密码子决定的（你可以这样理解）。

启动子连接RNA聚合酶。RNA聚合酶是负责合成RNA链的酶。在转录过程中，RNA聚合酶结合到启动子的序列上，并开始合成RNA。启动子是基因的调控区域，位于基因的上游区域，用于启动基因转录过程。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。（1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。（4）lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子。lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物 cIts857。在低温(30℃)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(45℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。系统由于受cIts857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导PL启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体cI+溶源菌，并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 （2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。 （4）lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子。lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物 cIts857。在低温(30℃)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(45℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。系统由于受cIts857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导PL启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体cI+溶源菌，并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。 （5）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等.（1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子,是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列,由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成.Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控.正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子,促使转录进行.负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白,该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录.乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物,使其构型改变,不能与O基因结合,从而解除这种阻遏,诱导转录发生.（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子,其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性.当缺乏色氨酸时,该启动子开始转录.当色氨酸较丰富时,则停止转录.b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合,解除阻遏蛋白的活性,促使trp启动子转录.（3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子,受Lac阻遏蛋白的负调节,它的启动能力比Lac和trp都强.其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成,Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区,加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成.Tac启动子受IPTG的诱导.（4）lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子,是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子.lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物 cIts857.在低温(30℃)时,cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录.在高温(45℃)时,cIts857蛋白失活,阻遏解除,促使PL启动子转录.系统由于受cIts857作用,尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物,缺点是温度转换不仅可诱导PL启动子,也可诱导热休克基因,其中有一些热休克基因编码蛋白酶.如果用l噬菌体cI+溶源菌,并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导,可缓解这一矛盾.（5）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子,具有高度的特异性,只有T7RNA聚合酶才能使其启动,故可以使克隆化基因独自得到表达.T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右,它能使质粒沿模板连续转录几周,许多外源终止子都不能有效地终止它的序列,因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列.这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因.但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶.应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶,它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体.

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lpl(l噬菌体的左向启动子)、t7噬菌体启动子等。（1）lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是dna分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(laci)、启动基因(p)、操纵基因(o)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过cap(catabolitegeneactivationprotein)因子和camp来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生lacz阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如iptg可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与o基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）tac启动子：tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比lac和trp都强。其中tac1是由trp启动子的－35区加上一个合成的46bpdna片段(包括pribnow盒)和lac操纵基因构成，tac12是由trp的启动子-35区和lac启动子的-10区，加上lac操纵子中的操纵基因部分和sd序列融合而成。tac启动子受iptg的诱导。（4）lpl启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子。lpl启动子受控于温度敏感的阻遏物cits857。在低温(30℃)时，cits857阻遏蛋白可阻遏pl启动子转录。在高温(45℃)时，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl启动子转录。系统由于受cits857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导pl启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体ci+溶源菌，并用丝裂霉素c或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）t7噬菌体启动子：它是来自t7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有t7rna聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。t7rna聚合酶的效率比大肠杆菌rna聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有t7rna聚合酶。应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lpl(l噬菌体的左向启动子)、t7噬菌体启动子等。（1）lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是dna分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(laci)、启动基因(p)、操纵基因(o)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过cap(catabolitegeneactivationprotein)因子和camp来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生lacz阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如iptg可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与o基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）tac启动子：tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比lac和trp都强。其中tac1是由trp启动子的－35区加上一个合成的46bpdna片段(包括pribnow盒)和lac操纵基因构成，tac12是由trp的启动子-35区和lac启动子的-10区，加上lac操纵子中的操纵基因部分和sd序列融合而成。tac启动子受iptg的诱导。（4）lpl启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子。lpl启动子受控于温度敏感的阻遏物cits857。在低温(30℃)时，cits857阻遏蛋白可阻遏pl启动子转录。在高温(45℃)时，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl启动子转录。系统由于受cits857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导pl启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体ci+溶源菌，并用丝裂霉素c或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）t7噬菌体启动子：它是来自t7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有t7rna聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。t7rna聚合酶的效率比大肠杆菌rna聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有t7rna聚合酶。应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lpl(l噬菌体的左向启动子)、t7噬菌体启动子等。（1）lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是dna分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(laci)、启动基因(p)、操纵基因(o)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过cap(catabolitegeneactivationprotein)因子和camp来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生lacz阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如iptg可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与o基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）tac启动子：tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比lac和trp都强。其中tac1是由trp启动子的－35区加上一个合成的46bpdna片段(包括pribnow盒)和lac操纵基因构成，tac12是由trp的启动子-35区和lac启动子的-10区，加上lac操纵子中的操纵基因部分和sd序列融合而成。tac启动子受iptg的诱导。（4）lpl启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子。lpl启动子受控于温度敏感的阻遏物cits857。在低温(30℃)时，cits857阻遏蛋白可阻遏pl启动子转录。在高温(45℃)时，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl启动子转录。系统由于受cits857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导pl启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体ci+溶源菌，并用丝裂霉素c或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）t7噬菌体启动子：它是来自t7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有t7rna聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。t7rna聚合酶的效率比大肠杆菌rna聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有t7rna聚合酶。应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。

启动子(promoter)DNA模板上专一地与RNA聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，也决定基因的转录效率。生物中有许多启动子，如大肠杆菌约有2000个启动子。各启动子的效率可不相同，大肠杆菌的强启动子每2秒钟启动一次转录，而弱启动子每10分钟才启动一次，从百多个大肠杆菌启动子结构的分析，得知两个强启动子的同源序列的中心在转录起始部位(基因编码链上第一个核苷酸) 5"侧约10和35个核苷酸处，弱启动子序列中往往有多处核苷酸被置换。许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：真核生物的启动子部位与原核生物不同，而且启动转录的活性，除需启动子外，还需某些外加序列

通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。1.准备工作(试剂配置和器材准备)1)操作流程示意图主要步骤操作①制备pET-32a(+)载体 用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收③插入片段克隆到pET-32a(+)载体 插入片段与pET连接，转化④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白⑥放大试验纯化目的蛋白 放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。2.操作步骤[1] 制备载体1)载体消化和胶纯化3μg pET载体3μl 10×限制性内切酶buffer10-20U 两种酶(是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%)3μl 1mg/ml乙酰BSA(根据需要补足水到30μl2)37℃温浴2-4h3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度4)消化完全后，加入0.05U小牛碱性磷酸酶，37℃ 30min5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳，切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。6)-20℃保存备用。[2]制备插入片段限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T-载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。[3]在pET32a载体中插入片段连接反应2μl 10×连接buffer2-5μl 50ng/μl 预制的pET32a载体1μl T4连接酶5-7μl 预制目标基因插入片段加水到20μl，枪头混匀，16℃反应2h-过夜[4]转化转化方法同T-载体转化大肠杆菌DH5α一样，既可转化BL21也可转化DH5α，若转化DH5α，需要重新抽提质粒，再转化BL21。筛选LB平板需含50μg/μl 卡那霉素。[5]pET重组子鉴定如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。[6]DE3溶原菌的诱导表达(1)、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。(2)、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM(T7启动子)或1 mM(T7lac启动子)，继续培养2-3小时。(3)、将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。(4)、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl (pH8.0)中，离心。(5)、除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析(1)、机械破碎细胞。一般用弗氏压碎法或超声波处理。(2)、裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。(3)100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上样buffer和水。85℃迅速加热3min使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。(4)若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。750μl20mMTris-HCl,pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min,除去上清重复洗涤。然后1.5ml 1%SDS上样buffer中重悬沉淀，重复(3)的步骤进行SDS-PAGE分析。3.总结(注意事项)(1)所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性;(2)根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。(3)构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。(4)长期保存的pET重组子在高浓度甘油(19%)中会导致质粒不稳定。(5)T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度(25uM-1mM之间)使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温(15-20℃)延长诱导时间(过夜)可以使溶解性蛋白的产量达到最大。(7)进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 （2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。 （4）lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子。lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物 cIts857。在低温(30℃)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(45℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。系统由于受cIts857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导PL启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体cI+溶源菌，并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。 （5）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体。

　　含有t7或sp6启动子质粒只能在大肠杆菌菌株中发挥作用的原因：　　T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。　　1、强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；　　2、诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；　　3、通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。

T7是启动子（T7 promoter），是来自于T7噬菌体的能够对T7RNA聚合酶有特异性反应的强启动子，是启动T7噬菌体基因转录的一段序列。T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。T7 RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其合成mRNA的速度比普通大肠杆菌的RNA聚合酶快5倍左右。扩展资料体外转录技术不断完善，已相继建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体pSP和pGEM，这类载体在多克隆位点两侧分别带有SP6启动子和T7启动子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以进行RNA转录，如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段，则可以此DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。参考资料来源：百度百科-强启动子参考资料来源：百度百科-T7RNA聚合酶参考资料来源：百度百科-RNA探针

从遗传学中心法则看，基因表达沉默无非从两个水平研究，先将具体方法总结如下1基因组DNA水平1.1 构建基因重组打靶载体 基因功能研究中出现最早最成熟的技术就是基因敲除. 他是根据同源重组的原理, 利用分子生物学技术增强和减弱甚至灭活某特定靶基因表达水平, 然后观察实验动物整体功能状态的变化, 推测靶基因的功能[1]. 基因敲除技术可在整体动物水平研究基因功能, 但是完全基因敲除使小鼠所有细胞基因组上都存在基因的缺失或突变, 有些重要的靶基因敲除或导入会严重影响动物胚胎的发育, 导致胚胎早期死亡或严重的发育缺陷, 使得突变无法传代, 不利于在小鼠各个发育阶段进行该基因功能的分析. 条件基因敲除技术(conditional gene knock out)的建立为此难题找到了解决的办法. 1994年, Gu et al [2]应用Cre/loxP重组酶系统实现了外源基因的时间特异性表达, 在此基础上条件基因敲除技术得以形成. 条件基因敲除技术是在基因敲除基础上结合Cre/loxP系统而形成的, 他可以做到在特定时间, 组织, 细胞中将靶基因敲除, 从而可以真实的反映特定组织或细胞中靶基因被敲除或修饰后的结果, 避免在发育早期所有细胞和组织中完全敲除目的基因后可能产生的胚胎早期死亡或严重的发育障碍[3-5]. 基因敲除的优点是基因灭活效果确切可靠, 缺点是技术复杂, 费时费力.1.2 反义寡核苷酸技术反义寡核苷酸技术是指采用一类经人工合成或构建的反义表达载体表达的寡核苷酸片段, 长度多为15-30个核苷酸, 导入细胞或者个体体内, 根据碱基互补原理, 通过与靶DNA或者mRNA结合形成双链杂交体激活核酸酶H, 裂解靶mRNA阻断蛋白质的翻译, 或者与DNA结合成三链结构或与单链DNA结合成双链结构以阻止靶基因的复制或转录, 以及与mRNA AP位点结合干扰其剪接、加工和运输, 在mRNA水平上发挥作用, 从而干扰其表达, 阻止其翻译成蛋白质[6]. 具体的作用机制目前尚未完全清楚. 反义寡核苷酸因为是针对特定的靶mRNA(DNA)的序列设计合成, 因此具有极高的特异性, 并且容易设计和体外大量合成. 另外反义寡核苷酸不含病毒序列, 不会产生免疫反应, 也不会整合入宿主染色体内, 这都为其作为药物应用于临床提供了可能. 1998年, 第1个反义药物Vitravene(Fomivirsen)被美国FDA批准通过, 用以治疗由巨细胞病毒(cytomegalovirus)引起的艾滋患者的视网膜炎[7]. 目前反义寡核苷酸技术在动物体内外的应用已经非常普遍[8-9]. 今后要注意的是, 如何对反义寡核苷酸进行更加有效的化学修饰以提高其稳定性, 延长其半衰期, 增加其作用时间和如何定点作用于特定部位, 使靶组织最大效率地吸收反义核酸, 提高其作用效果, 减轻毒副作用[10].1.3 甲基化寡核苷酸技术 表观遗传学(epigenetics)是与遗传学(genetics)相对应的概念. 遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化, 包括基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定性等;而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化, 包括DNA甲基化、组蛋白脱乙酰化和染色质构象变化等; 表观基因组学(epigenomics)则是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究, 以抑癌基因为代表的CpG岛甲基化所致基因转录失活已经成为肿瘤表观基因组学研究的重点内容[23-25]. 所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下, 基因组5"端CpG二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上共价结合一个甲基基团. 由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系, 特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活, DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容, 研究DNA甲基化与肿瘤的关系成为当前分子生物学的热点之一. 目前的研究已经表明: 肿瘤细胞和组织中存在异常的DNA甲基化状态, 表现为基因组整体甲基化水平降低, 导致遗传不稳定性增加;组织特异性基因的启动子区域出现从头甲基化从而导致基因被关闭; 原癌基因多为低甲基化或不充分甲基化, 低甲基化使原癌基因活化, 导致重新开放或异常表达, 形成突变热点, 增加染色体的不稳定性; 抑癌基因多为过度甲基化, 过度甲基化导致表达失活[26-27]. 这些因素综合起来导致基因表达异常, 引起细胞恶变, 最终导致肿瘤的发生[28-30].在哺乳动物中, 甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG). 通常细胞中CpG二核苷酸的甲基化分布并不是均一的, 大约50%的基因在启动子区域有CpG二核苷酸的富集现象, 一般该区域的长度从0.5-2 kb不等. 该区域与基因的转录有密切的关系, 通常处于非甲基化状态. 处于非甲基化状态的启动子, 环绕的染色质呈现为开放的构象, 允许转录因子和其他的激活物靠近. 此外, 转录因子的占据也使其他的转录抑制因子和染色质重塑蛋白等难以接近启动子, 最终表现为启动基因表达[31-33]. 相反, CpG岛高甲基化的启动子则呈现为关闭的构象, 不但使转录因子无法靠近, 而且还有助于甲基胞嘧啶结合蛋白﹑转录辅阻遏蛋白﹑DNA甲基转移酶等对转录有抑制作用的蛋白结合于启动子区, 启动子失去功能, 结果基因转录灭活而沉默[34-35]. 很多资料表明, 基因启动子异常高甲基化可以导致其转录灭活[36-39]. Zhu et al [40]通过甲基化寡核苷酸诱导ERβ基因启动子区和外显子区CpG岛特异性甲基化发现, 在前列腺癌细胞中, 是ERβ基因启动子区(而不是外显子区)CpG岛的高甲基化导致了ERβ基因转录失活. 去甲基化试剂作用前列腺癌细胞后, ERβ mRNA恢复表达.

表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因　　常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。　　表达载体（Expressionvectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

一般只要敲除编码区一小段（1/3-1/4基因全长）就可以达到目的，但是你干吗不全敲除了呢？留下那么一小段还会翻译出无活性蛋白片断或者副作用的什么产物，还浪fei细胞资源。启动子区域 能不能被敲除 要看这个基因是不是单独享用的这个启动子，一般在原核细胞是操纵子（多基因共用一个启动子），那可是万万不能敲除的哦。。。。道理你应该明白。