腺相关病毒

病毒不具备细胞结构，不能独立生存，也不具备复制所需的酶系和原材料。必须寄生在细胞内，利用细胞的结构和原材料进行复制。

病毒不具备细胞结构，不能独立生存，也不具备复制所需的酶系和原材料。必须寄生在细胞内，利用细胞的结构和

只有当病毒启动子（一般基因工程都用CMV启动子）和目的基因一起整合，才能持续表达

1，通过尾静脉直接给小鼠注射荧光质粒，大约几个小时后，小鼠肝脏检测到这种荧光质粒的表达，大约8小时达到最高，以后随时间逐渐减弱。这种表达确实存在，已经有不少文章发表，相信你见到过。2，消除组织自身发光，可以使用动物分子影像系统（比较贵，国内尚未见到文章）或者使用冰冻切片。3，其他更好的检测方法就是使用动物分子影像系统，可以活体观测，数值准确，直观。并可检测表达量随时间变化的规律。但价格偏高100$-130$万之间。4 关于这方面的文献有一篇中文的可以参考。

病毒不具备细胞结构，不能独立生存，也不具备复制所需的酶系和原材料。必须寄生在细胞内，利用细胞的结构和原材料进行复制。

1. 治疗基因的长度不能过大。AAV的总容量4.7kb，还要包括AAV自身的ITR，启动区和RNA加尾信号；2. 基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；3. 长期表达目的基因，没毒副作用；4. 不需要目的基因立刻表达；5. 不需要基因高水平表达；6. AAV载体对靶细胞具有较高的转导效率。 本公司向客户提供三种rAAV载体--rAAV2、rAAV2/1载体的构建、扩增及纯化服务，包括了从实验设计到载体包装、生产、纯化、质量检定、分装等的一系列服务。为基础研究、临床前研究和早期临床研究提供高滴度、高纯度的rAAV载体。其中的对照病毒为携带GFP、LacZ和Luc标记。除了AAV2和AAV2/1之外，我们也提供AAV1、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9等。具体情况请电话咨询本公司技术支持。重组基因的启动子：mCMV、hCMV、PGK、CAG、HRE-miniCMV、hEF1α、AFP（大鼠）等。其中，CAG启动子为肝脏特异启动子。 实验室级别：适用于细胞实验、动物试验研究；临床试验用级别：适用于药物开发、临床前研究、临床样品申报、临床试验等。

腺病毒优点：感染效率高，很多细胞都能达到近 99%；纯化后的腺病毒可以直接进行动物活体注射

慢病毒：① 可以稳定整合至宿主基因组，整合位点随机；② 可以对分裂期及非分裂期细胞进行感染；③ 包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为108-109TU/mL，片段越大，滴度越低；④ 可以应用Tet-on等诱导表达系统，表达水平较高；腺病毒：① 不能整合至宿主基因组，仅能瞬时表达；② 可以对分裂期及非分裂期细胞进行感染；③ 包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1012TU/mL，片段越大，滴度越低；④ 表达水平较高；腺相关病毒：① 可以稳定整合至宿主基因组，可在特定基因产物存在的条件下整合至人类19号染色体中的特定位点；② 可以对分裂期及非分裂期细胞进行感染；③ 包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1013TU/mL，片段越大，滴度越低；④ 可以应用Tet-on等诱导表达系统，表达水平较高；

维基百科：A plaque-forming unit (PFU) is a measure used in virology to describe the number of virus particles capable of forming plaques per unit volume. It is a proxy measurement rather than a measurement of the absolute quantity of particles: viral particles that are defective or which fail to infect their target cell will not produce a plaque and thus will not be counted. For example, a solution of tick-borne encephalitis virus with a concentration of 1,000 PFU/μL indicates that 1 μL of the solution contains enough virus particles to produce 1000 infectious plaques in a cell mono-layer, but no inference can be made about the relationship of PFU to number of virus particles. The concept of plaque-forming units of virus is equivalent to the concept of colony-forming units of bacteria. 实时定量PCR法是一种简单的、高通量的测定病毒粗提裂解液和纯化病毒样本中腺病毒颗粒数量的方法。每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 infectious units per mL （IFU） Virology blog：Multiplicity of infection (MOI) is a frequently used term in virology which refers to the number of virions that are added per cell during infection. If one million virions are added to one million cells, the MOI is one. If ten million virions are added, the MOI is ten. Add 100,000 virions, and the MOI is 0.1. The concept is straightforward. 病毒感染复数（MOI, Multiplicity of infection）：传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。 一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。 滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。 Lentiviral titer is measured as Transduction Units per ml (TU/ml). One TU produces one integration event in target cells. To calculate the viral titer, it is first necessary to determine the number of Transduction Units (TU) used to infect the cells.

在辅助腺病毒存在下，AAV可以高效定点整合至人染色体中；而现在的AAV载体已经不需要腺病毒辅助，不插入宿主的基因组，而是游离于宿主细胞基因之外，呈卫星状稳定表达。腺相关病毒载体（AAV）体内的感染效率极高。不同血清型可以相对特异性的感染心脏，肝脏，骨骼肌等。腺相关病毒是RG1（最安全级别）的基因治疗载体，完全无具有潜在致病性。而腺病毒是RG2，慢病毒是RG2，逆转录病毒是RG3 。 AAV载体容量小，目前最多只能容纳4.7 kb外源DNA片段；野生型的AAV在40%-80%的成人中存在过感染，在腺病毒存在的情况下可能会引起免疫排斥。

腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒。

整合入基组整合细胞基组进行表达比腺病毒类表达载体；些质粒整合序列般表达质粒面自带polyA序列所产mRNA带polyA尾巴质粒转染细胞整合基组游离存要看用哪种质粒载体些质粒细胞进行表达

腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）。基因组两端为末端反向重复序列（ITR），中间基因组编码两个蛋白：Cap和Rep。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AAVS1位点。这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒。重组腺相关病毒载体（rAAV）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。优点在辅助腺病毒存在下，AAV可以高效定点整合至人染色体中；而现在的AAV载体已经不需要腺病毒辅助，不插入宿主的基因组，而是游离于宿主细胞基因之外，呈卫星状稳定表达。腺相关病毒载体（AAV）体内的感染效率极高。不同血清型可以相对特异性的感染心脏，肝脏，骨骼肌等。腺相关病毒是RG1（最安全级别）的基因治疗载体，完全无具有潜在致病性。而腺病毒是RG2，慢病毒是RG2，逆转录病毒是RG3 。缺点AAV载体容量小，目前最多只能容纳4.7 kb外源DNA片段；野生型的AAV在40%-80%的成人中存在过感染，在腺病毒存在的情况下可能会引起免疫排斥。

【答案】：AAV是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kh，无包膜。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。AAV能高效定点整合至人染色体中，避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性。