DNA

DNA中每个脱氧核苷酸在每条单链的大多数含有2个磷酸基团，但在3端位置最后一个脱氧核苷酸只含一个磷酸基团。

1、作用不同E.coliDNA 连接酶是生物体内重要的酶，其所催化的反应在DNA 的复制和修复过程中起着重要的作用。T4-DNA连接酶即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5"-P末端和3"-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。2、连接条件不同用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。扩展资料：粘性末端DNA片段的连接DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。平末端DNA片段的连接常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。同聚物加尾法这种方法的核心部分是，利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。末端脱氧核苷酸转移酶是从动物组织中分离出来的一种异常的DNA聚合酶，它能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。由核酸外切酶处理过的DNA，以及dATP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3′-OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段，称之为poly（dA）尾巴。反过来，如果在反应混合物中加入的是dTTP，那么DNA分子的3′-OH末端将会形成poly（dT）尾巴。因此任何两条DNA分子，只要分别获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。这种连接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴连接法（homopolymertail-joining），简称同聚物加尾法。衔接物连接法所谓衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。衔接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是我们便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。DNA接头连接法DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。参考资料来源：百度百科-DNA连接酶参考资料来源：百度百科-T4DNA连接酶参考资料来源：百度百科-T4-DNA连接酶

DNA测序的测序原理： DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。 其原理是化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。 另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

DNA测序技术，即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

DNA片段应选择哪一种测序方式测序有DNA测序和RNA测序，之前比较早的测序是以芯片为基础，现在常用的是二代测序，全基因组的测序以及RNA-seq，目前比较高级的还有单细胞测序。随之而来的是第三代测序技术， 第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术,这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本。DNA测序的测序原理：DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。其原理是化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

因为pcr利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。DNA模板纯度不纯的时候，会对PCR起抑制作用。PCR反应中，模板只要1ng就可以，所以模板浓度不要太高。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。扩展资料：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下。根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。参考资料来源：百度百科-DNA测序

DNA测序技术 DNA sequencing technology 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。 Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、 A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。[编辑本段]一、概述： Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5"OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。 Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。 SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。 退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。 由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03-- 2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。[编辑本段]二、材料 待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。[编辑本段]三、设备 高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。[编辑本段]四、试剂 （1）SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。 （2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。 （3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。 （4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。 （5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。 （6）TEMED （7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。 （8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。 （9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。 （10）95%乙醇。 （11）0.5%冰乙酸。 （12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。[编辑本段]五、操作步骤 ： 成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点： （1） DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。 （2） 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。 （3） DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。 （一）测序反应： 1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。 2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂： （1） 样品反应： 质粒模板DNA 2.1pmol 5×测序缓冲液 5ml 引物 4.5pmol 无菌ddH2O 至终体积16ml （2）对照反应 pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 4.0ml 5×测序缓冲液 5ml pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml 无菌ddH2 O 至终体积 16 ml 3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。 4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。 5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。 6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。 7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。 [注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入： 模板种类/长度 模板量 200bp (PCR产物) 16ng(120fmol) 3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol) 48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol) 由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。 2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式： 4.5pmol=1.5ng×n,其中n为引物碱基数 计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式： dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数 ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数 3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。 模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50% 95℃ 2分钟。然后： 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)。 模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。 95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。 （二）、 测序凝胶板的制备 1、玻璃板的处理： 银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。 （1）短玻璃板的处理 A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。 B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。 C. 4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。 [注意] 1. 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。 2. 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。 3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。 (2)、长玻璃板的处理 A. 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。 B. 5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。 [注意] 1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。 2、凝胶的制备： （1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。 （2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的 TEMED和过硫酸铵。 凝胶终浓度 3 4 5 6 8 12 16 18 尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0 10×TBE缓冲液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 双蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0 10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40 (3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。 [注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。 2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。 （三）电泳： 1、预电泳 （1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。 （2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。 （3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。 （4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。 （5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。 [注意] （1）. 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。 （2）. 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。 2、样品的制备： 当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4- 6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。 3、上样及电泳 关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、 T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长， 0.2mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。 [注意] 1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。 2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。 （四）、 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 5. 凝胶显影： (1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。 (2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。 (3). 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。 6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。 7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。 8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。 [注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。 1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。 2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。 3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。 4. 如果凝胶厚度超过0.4mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。 5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。

就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

要看是什么型号的测序仪了现在有好几家生物公司的测序仪都可以达到1000bp了ABI3730XL好像就可以Sanger法测序的原理： 利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物,直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止,终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

为什么sanger测序被称为dna序列测定Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

这位是搞分子生物学的吗? DNA测序的方法有很多种. 目前最常见的是双脱氧终止法了. 在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了. 也许这样说你不一定明白. 举一个例子, 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下: 在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT. 所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段: GA, GATCCGA, 同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC, 在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG 在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT, 电泳时按分子量大小排列, A反应的片段长度为2, 7; C反应的为4, 5; G反应的为1, 6; T反应的为3, 8, 四个反应的产物分别电泳, 结果为 8 7 6 5 4 3 2 1 A | | C | | G | | T | | 我们可以从右向左读, 为GATCCGAT, 至此, 测序完成(上面这个图在百度知道中显示不正常, 因为百度知道的网页用的是比例字体, 你如果想看它, 拷贝到记事本中, 用等宽的字体来看).

因为pcr利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。DNA模板纯度不纯的时候，会对PCR起抑制作用。PCR反应中，模板只要1ng就可以，所以模板浓度不要太高。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。扩展资料：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下。根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。参考资料来源：百度百科-DNA测序

【答案】：将双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)加到体外复制体系中，如果能够造成末端终止，则DNA复制的方向是5"→3"，因为当DNA复制是3" →5"时，ddNTP无法参入到DNA链的生长端(无3"-羟基，不能与前一个核苷酸形成3"，5"-磷酸二酯键)，即5"端，因此不可能造成末端终止。

这是一个很大的问题。。。 “不确定”？你是指序列未知的待测蛋白质或DNA吗？好吧，我能想到的“不确定”就是未知序列的意思了。 测定未知蛋白质或者DNA的序列一般都可以用三种方法：生物方法、化学方法和物理方法。生物学方法——酶解，一般和化学方法结合使用。 对于蛋白质的测序首先测定蛋白质分子中多肽链的数目，然后拆分多肽链并断开链内二硫键再分析每一条多肽链的序列。 由于测序分析的方法一次能测定的序列不能太长，所以要将获得的多肽链进行裂解，一般使用酶或者溴化氢、羟胺等化学试剂。获得小的多肽片段之后可以使用Edman降解法进行化学降解分析，也可以使用外肽酶进行水解，或者使用质谱等物理方法测定其序列，此外还可以根据所编码的DNA序列进行推定，但是一般这种方法准确率比较低。获得多肽片段序列之后进行肽段在多肽链中次序的决定，解决这个问题使用的是使用多种断裂方法获得不同的肽段组合，因为不同的断裂方法切口彼此错位，不同套的肽段正好相互跨过切口重叠，然后使用推理的方法，将肽段”组装“起来。现在较为常用的方法是X-ray，首先异源表达获得蛋白质晶体然后测定其三维结构，自然也就获得了蛋白质的序列。另外核磁共振也有使用，但是由于测定蛋白质分子量受限，不如X-ray使用广泛。 DNA的测序也是使用生物学方法和化学方法。 生物化方法可以使用与蛋白质测序类似的方法，先获得小片段，然后叠加，R.W.Holley首先测定酵母丙氨酸tRNA序列是使用的策略就是这样。但是一般蛋白质所含氨基酸数目从几个到几千，但是不会太多，相比之下DNA的核苷酸就是天文数字了，因此必须使用其他的办法。Sanger首先提出一种策略——”加减法“，即设计方法使得DNA末端固定为某一种核苷酸，然后通过测定DNA长度来推测其序列。 首先，在做“加法体系”和“减法体系”以前的工作。待测DNA的单链作为模板，一个合适的引物，四种dNTP，用同位素标记。DNA聚合酶从引物开始合成一条互补链，理想情况是，合成所产生各种长度的片段都存在。然后除去那些未参与合成的dNTP，将剩下的合成产物，分成两部分。一部分用于加法系统，一部分用于减法系统。 加法系统：将用于加法系统的产物再分成四小份，每一小份中仅仅将四份中的dNTP的一种加入反应体系。比如仅加入dATP。由于DNA由聚合酶具有3′→5′的外切酶活性，而反应体系中缺少另外三种必要的dNTP，合成产物就从3′→5′方向降解。然而由于存在dATP，显然遇到dA的位置降解反应就停止了。因而所有的片段都是以A结尾的。同理，可以分别制备以C、G或T结尾的另外三组片段。四组片段在同一块凝胶板的不同样品槽中同时电泳（这类图LZ可以在书上随便找到），从放射自显图上就可以推断出碱基序列，因为从A样品槽查出的放射性区带代表A在片段中的位置，同理也可定出C、G和T的位置。【加法系统实际就是以降解为条件，以DNA聚合酶的3′→5′的外切酶活性为基础，当降解过程遇到试剂中所富含的dNTP时，反应就停止】按理只用一个加法系统就足以推断DNA的碱基序列了。但由于技术上的原因，只用一种方法有时不能得到完全正确的结果，因此又设计了一种减法系统。 减法系统：也是将上述酶促产物分成四小份，每一小份中只加入三种dNTP，比如缺少dATP。在这个反应体系中，DNA聚合酶能够把片段继续合成下去，但是在遇到应该是dATP参入的位置时，合成反应就停下来了。这就可以得到一个都是以A前一个位置为结尾的片段组，电泳后同样可以定出A的位置。【减法系统实际就是以合成为条件，当合成过程缺少需要的dNTP时，反应就停止】但此加减法并不尽如人意，由于反应速度上的差异，有些片段可能多些，另一些片段可能少些，有时可能导致漏读和重读，有时图谱上还会出现假谱线，当同样碱基排列时图谱上有时只出现一条带。因此用这个方法测定DNA片段可能有1/50的误差。目前常用的是它的改进法-双脱氧末端终止法。剩下的就是读板的问题，可以想到，在理想情况下，比如以A结尾的各种长度的片段，出现的可能性是均等的。那么在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，相对分子量小的片段迁移速度快。书上的图，都是一块板子，有四个列，分别是以四种不同结尾的核苷酸的电泳情况。跑在越前面的（也就是最靠近底部的），就第一个被读出来，随后的相对分子量不断增大，迁移速度慢，也就是比较大的片段，按其顺序和所处的列，就克直观读出序列。 化学法由Maxam-Gilbert在1977年发明。一、取待测DNA片段，既可以是单链也可以是双链。此法又叫化学切割法，或化学降解法，切割之前先对待测片段作末端标记。用放射性P32-磷酸集团标记链的末端之一。二、将标记完的样品，分成四份。分别采用不同的化学试剂对所得样品，进行修饰进而切割【切割就是利用特异的化学试剂，修饰DNA分子中不同的碱基，使被修饰的碱基之间的连接变得不稳定，发生断裂，而产生各种长度的DNA片段。】【四组切割的方法，在G、G+A、T+C、C处切割】“+”就是同时切割，有点讨厌的是这点，能修饰A，使其糖苷键不稳定的甲酸，同时也会使G的不稳定，所以无奈就有了G+A并在一起，（1）G反应，"硫酸二甲酯"，使鸟嘌呤G的N7原子甲基化，而与脱氧戊糖之间的糖苷键不稳定，可在中性环境中受热断裂，得到一系列G末端的片段。（2）G+A反应 "甲酸",使A和G嘌呤环上的N原子质子化，糖苷键变得不稳定，可用哌啶将其断裂，得到一系列A和G混合的末端的片段。（3）T+C反应 "肼"，使T和C的嘧啶环断裂，通过消除反应，使DNA链发生断裂，得到一系列T+C末端的片段。（4）C反应 在NaCl存在时，只有C与肼反应，得到一系列C末端的片段。用上面加减法一样的电泳，克得到结果，直观读出。至于为什么（2）（3）两步，为什么是G+A、T+C？事实上，如果有单独只断A的或只断T的修饰方法，也可以。但从书上列出的图中，可以看出，断裂的混合物G+A、T+C电泳后并不影响读结果。

第1 代测序技术——荧光标记的Sanger 法第一代就不说了。第2 代测序技术——循环阵列合成测序法述第2 代测序技术中, 序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的. 除了需要昂贵的光学监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像.这都使仪器的复杂性和成本增加. 依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用, 在目前测序成本中比例相当大. 直接读取序列信息, 不使用化学试剂, 对于进一步降低测序成本是非常可取的.在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内, 很难准确预测未来将发生什么.第3 代测序技术——直接测序将基因组DNA 随机切割成大约100 kb 左右的片段,制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交. 然后驱动结合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵列. 通过每个孔的离子电流均可独立测量. 追踪电流的变化确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位置. 利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因组片段文库排列起来, 建立一组完整的基因组探针图. 利用计算机算法, 获得完整的基因组序列.

简单的说，末端终止法的原理是这样的：测序的过程其实就是一个DNA复制的过程，DNA复制过程中需要加入ATCG四种脱氧核苷酸酸原料，但是末端终止法中，还多加了双脱氧的核苷酸，这种核苷酸可以加入到新合成的DNA链中，但是由于它少了个氧原子，所以一旦它加入到DNA链中，后续的核苷酸就不能再连到DNA链上去了。同时这种双脱氧的核苷酸还是可以在特定条件下发光的。当在反应体系中发生大量这种情况的时候，就会出现以下情况：拿你举的序列来说：某一条链合成为 C" GGTAACGA还有 CC" GGTAACGA以及 CCA‘ GGTAACGA以此类推，X‘表示双脱氧的核苷酸，这样我们就得到了各种长度的DNA链，然后把这些DNA通过电泳的方式按照大小分离，并且让他们发光，我们就可以知道某个位置是什么核苷酸了，也就等于知道DNA的序列了。

ddNTP是双脱氧核苷酸 双脱氧核苷酸末端终止法简称为Sanger法或末端终止法，该技术的高明之处在于引入了双脱氧核苷三磷酸（2"，3"ddTBP）作为链终止剂。与普通dNTP不同的是2"，3"ddNTP在脱氧核糖的3" 位置缺少一个羟基，所以，虽然它可以在DNA聚合酶作用下通过其5" 三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺乏3"羟基，2"，3"ddNTP无法同后续的dNTP形成磷酸二酯链，于是，DNA链的合成嘎然而止。如果在DNA合成体系的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却高度特异的链终止展开竞争，结果就形成了一系列长短不一的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的DNA合成体系中分别采用4种不同的ddNTP，就可以产生4组寡核苷酸，每组将产生以一种特异性的ddNTP为末端的不同长度的核苷酸链。经PAGE电泳分离和放射自显影，即可读出被测定的DNA的全部顺序。

终端终止法一般是指一代测序Sanger法，首先是双脱氧核苷酸的应用，也就是说双脱氧核苷酸结合到模板，此PCR终止。GGTAACGA 经过四个反应，我以A的位置测序为例：在扩增液中中加入双脱氧核苷酸A 和正常的ATCG，进行扩增，GGTAACGA 就会扩增出1.GGTA 2.GGTAA 3.GGTAACGA 三条产物。经过电泳 发现有4bp 5bp 8bp的条带。也就是说A碱基 为第4.5.8位置。就可以确定XXXAAXXA。同样的道理进行T、C的上面重复反应就可以得知这条序列了。希望对你有所帮助。

DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法与Gilbert（1977）发明的化学降解法。这两种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。

我认为有的.DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法.自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流.自动化测序是在Sanger法基础上发展而来的.DNA测序的原理

第二代测序技术--以Illumina/Solexa Genome Analyzer 为例1.概述 DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。2.基本原理 Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成变测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。3.操作流程1）测序文库的构建（Library Construction） 首先准备基因组DNA（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insert size，以便在组装（Assembly）的时候获得更多的信息。2）锚定桥接（Surface Attachment and Bridge Amplification） Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。3）预扩增（Denaturation and Complete Amplification） 添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。4）单碱基延伸测序（Single Base Extension and Sequencing） 在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA 聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做Base Calling，Illumina公司Base Calling所用的软件是Illumina"s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。5）数据分析（Data Analyzing） 这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。（注：图片引自Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 9:387–402）4.讨论 目前Solexa测序的读长能达到75bp，这个大小比传统的Sanger测序要短得多，也比Applied Biosystems 公司的SOLID测序要短，但是Solexa测序的优势是能够获得海量的数据，并且价格低廉，按相同的数据量来算，Solexa测序要比其他测序技术便宜很多。75bp的长度肯定是不适合直接用来分析的，测序得到的reads需要拼接之后才能有实际的用途，这就要求有强大的生物信息学分析能力作为支撑。 和传统的测序技术相比，Solexa测序的错误率也相对较高，并且测序错误倾向于分布在read后面的碱基中，如何区分测序错误和真正的DNA多态性也是一个大问题。 尽管新一代测序技术还不尽如人意，但是它还是有着广泛的应用。目前一些模式生物的全基因组重测序、非模式生物的全基因组测序以及一些生物的转录组测序都采用了新一代测序技术，比如说前不久刚发表的熊猫的全基因组(Ruiqian Li et al,2009)测序就是用Solexa测序技术完成的。5.参考文献(1)Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 9:387–402(2)Jay Shendure, Hanlee Ji (2008) Next-generation DNA sequencing. nature biotechnology 6:1135-1145(3)Stephan C Schuster (2008) Next-generation sequencing transforms today"s biology. Nature Methods 5:16-18(4)Zhou DG, Zhao QG, Fu CG et al (2008) The Next Generation Sequencing and its Effect on the Rice Molecular Design Breeding. Molecular Plant Breeding 6: 619-630

百度百科：DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。目前应用最广泛的是由Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法，DNA sequencing technology，在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。

DNA序列测定技术（双脱氧末端终止法）使用须知(张宏、李振甫)一、背景介绍 目前最常用的手工DNA序列测定技术，仍然是Sanger等(1977)提出的酶法，也称双脱氧末端终止法。这种方法生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种(或多种)特定的残基,形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度，各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基，在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后,从放射自显影胶片上，直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300-500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定的简便方法，为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。 除传统的双脱氧链终止法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。此外,新的测序方法亦在不断出现,如上世纪90年代提出的杂交测序法等。 二、双脱氧末端终止法测序步骤 (一)制备模板 有两种类型的DNA可以作为Sanger法测序的模板,即纯化的单链DNA和经热变性或碱变性的双链DNA。 1、单链DNA模板 在一般情况下,可将靶DNA片段克隆于M13mp载体中,从M13mp系列噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板效果最佳，只要细心掌握模板与引物的最佳比例,有经验的测序人员通过一次末端终止反应,能读取300-500个核苷酸序列。 2、经热变性或碱变性的双链DNA模板 利用双链质粒模板测序,其中有两个至关重要的因素,即模板的质量和聚合酶的种类。用小量制备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆,往往因为有污染而并不可取。高纯度的质粒最好采用氯化铯-溴乙锭梯度平衡超速离心法制备。其次是应采用高质量的聚合酶。一次末端终止反应亦可能读出300核苷酸序列。 (二)引物 酶法测序反应中都有一个与模板链特定序列互补的寡核苷酸作为DNA合成的引物。不管是单链DNA作模板,还是用变性双链DNA作模板,都有通用引物可用,而不必另行设计与未知DNA序列互补的引物。通用引物可直接从厂商购买。 （三）DNA测序酶 该酶是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，是测定较长DNA的首选酶。市售的各种以该酶为基础的测序试剂盒，效果甚佳。 (四)放射性标记 传统的DNA测序方法都采用α-32P-dNTP作为放射性标记物,但由于32p发射的高能β射线，常会引起二个问题：首先是放射自显影图谱条带扩散、分辨率低，限制了识读序列的数量和准确性；其次是32P衰变会导致DNA样品分解，通常都应在测序反应后24小时内进行电泳,否则无法获得好的结果。 近年来α-35S-dNTP被广泛采用，是由于35S产生较弱的射线,克服了32P的二大缺点。放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底，测序反应产物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降。 （五）测序胶的准备及电泳 1、硅化玻璃板 2、配置电泳试剂和缓冲液 3、凝胶液的配置 4、电泳 5、电泳后凝胶的处理 (六)DNA序列的识读 DNA序列的识读: ①在显影前后一定要注意标明模板名称、日期和测序人等,并标明各套反应位置；②识读时从显而易见的特征序列开始，如连续的同聚核昔酸(如TTTTT、AAAAA)或交替出现的嘌呤和嘧啶(如GTGTGTGT),一旦找到这种序列，便可较快地确定目的序列的位置。 三、注意事项 尽管核酸序列测定方法越来越成熟、简便并且可以自动化，但事实上,对于一个片段较长、序列未知的待测核酸而言,仍然是一件耗时且繁琐的工作。对于一个待测DNA分子,要制定一个能够简捷准确的测定方案，一般可以从以下几个方面考虑： 1、DNA片段大小。 2、背景资料：是否清楚DNA限制性酶切图谱,是否有一段已知序列,是否具有重复序列等。 3、测序目的: ①测定未知序列；②确定重组DNA的方向与结构；③对突变(如点突变)进行定位和鉴定；④比较性研究，如比较同种病毒不同株系之间的基因差异。后3种测序目的称为确证性测序。 4、实验条件：如手工测序还是自动化测序,合成引物费用等。 由于单套测序反应所能准确测定的DNA序列最长一般仅300-400bp。因此，在进行序列测定之前，必须首先考虑待测DNA分子的大小，其次是所要测定的序列范围以及要求的序列精确程度等，再结合实验室的条件选择切实可行的克隆及测序方案。 DNA序列如何测定 一、常规DNA测序的原理制作物理图谱的过程是一个逐步精细的过程。第一步把每条染色体分成平均长度在400kb的长片段，每段克隆到一个YAC上，所有YAC克隆都按照其在染色体上的实际位置进行排序，我们就得到了一个能够覆盖整个染色体的YAC文库。把每一个YAC克隆携带的染色体片段经部分酶切形成一系列有重叠区域的40kb左右的片段克隆到粘粒上，得到粘粒文库。每个粘粒上的染色体片段再经酶切形成4kb左右的片段克隆到测序专用的质粒载体上。测序质粒上携带的4kb的片段就可以用现在常规测序的方法进行测序了。把所有质粒克隆的DNA片段序列读出，再按照各个片段在染色体上的实际位置进行排列，最后就可以得到染色体的全部核苷酸碱基对序列。染色体的DNA碱基序列是基因组物理图谱的最精细形式。所谓“常规测序方法”的基本特点有两个：第一，把待测序的DNA分子进行处理，得到每个只差1个核苷酸的一系列逐步缩短的DNA分子的混合物；第二，通过凝胶电泳把这些DNA分子分离开来，形成阶梯状排列的条带，然后逐个读出DNA的碱基序列。二、化学法测序得到长度只差一个碱基的DNA分子的方法主要有两种。一种是用化学方法把待测序的DNA片段在每个碱基处切断一次。这是由Maxam和Gilbert发明的方法。具体做法是把待测序的DNA分子成单链分子，其5"端用32p进行放射性标记。然后把这些单链DNA分于分成4份，每份用一种化学试剂处理DNA片段，每种试剂可使DNA分子在一种碱基的5"端的磷酸二酯键处发生断裂。例如，试剂一可使单链DNA分子在A碱基处断裂，试剂二可使单链DNA分子在T碱基处断裂，依此类推。把反应条件控制好，使每个DNA分子只发生一次断裂，这样，我们就得到4种反应产物，每种由在一种碱基处发生断裂形成的DNA片段组成。把这4种反应产物用聚丙烯凝胶电泳进行分离，两个DNA片段只要相差1个碱基，就可以在这种凝胶中被分成两个条带。电泳完成后，用X光胶片进行曝光，最后得到一张由不同条带组成的序列图。从这张图上就可以读出待测DNA片段的碱基序列。5"端的第一个碱基G读不出来，可以通过测定互补链的序列测出这个碱基。三、酸法测序与测序的自动化另外一种得到长度只差一个碱基的DNA分子的方法是英国科学家桑格发明的，这种方法利用DNA聚合酶以待测序的DNA单链分子为模版合成互补的新链。在合成新链时，合成原料除了4种脱氧核糖核苷酸外还加入一种2"和3"位上的羟基都脱除的核苷酸。由于缺少3"羟基，当这种核苷酸被结合到链上后，它的后面不能再结合其他核苷酸，链的合成就此终止。与化学法测序类似，我们可以准备4种反应物，加入的核苷酸类似物分别携带A，G，C，T碱基，每种反应物里包含在一种碱基处终止链延伸的长短不同的DNA片段。这些DNA片段也要用放射性标记，经过凝胶电泳和放射自显影，得到DNA条带图谱，根据图谱可以读出DNA的碱基序列。这种方法比化学法简单，条件易于控制。用4种不同的荧光化合物分别标记4种反应的产物，就可以做到把4种反应物混合在一起进行电泳，可以提高电泳分析的效率。这种方法利用现代精密仪器和机器人技术可以实现DNA测序的高度自动化。目前市场上已经有各种型号的DNA自动测序仪可供选购。根据最新计划，到2000年人类基因组的“草稿”要出来。这个“草稿”包含了90％的人类基因组的序列，每个区域测定5次左右。到2003年完整的人类基因组序列测定可以完成，这个序列可以作为“参考基因组”或者“标准基因组”用于生物医学研究。测定这个“标准基因组”所用的DNA是由10到20位志愿者提供的，用男性的精子DNA和女性的血液DNA作为样品构建了人的基因组文库，因此，“标准基因组”序列不是哪一个具体的人的序列，而是几十位志愿者的序列的综合体现。四、单分子荧光测序单分于荧光测序是一种快速DNA测序法，这是利用单分子操作技术直接读取DNA的碱基序列的方法，与传统的荧光测序法相比，这种方法可大大提高速度。用桑格测序方法现在每天可以解读上万个碱基序列，但是如果单分子荧光测序取得成功，它可以在两分钟内完成传统方法一天的工作。单分于荧光测序的主要过程如下。第一步，取一条大约有5万个碱基那么长的单链DNA分子，把它的一端用化学方法连接在一个非常微小的塑料球上，DNA分子就会缠绕在塑料球上。第二步，在一张类似激光唱片的圆盘上铺一层很薄的液体薄膜，然后用激光光钳把塑料球放在这张光盘的液体膜上进行移动，DNA分子就会在后面被拖着展开，就好像一只船拖着一条绳子快速前进，把绳子拉展一样。第三步，让拉展的的DNA分子与一种核酸外切酶结合。这种核酸外切酶可以和DNA的游离的末端结合，然后逐个把DNA的碱基切割下来。第四步，用单分子光谱技术逐个识别并且读出碱基即达到了测序的目的。目前，单分子荧光测序技术还没有完全成熟。主要问题是用于识别单个碱基的单分子光谱技术还没有过关。利用隧道扫描显微镜和原子力显微镜直接读取DNA分子碱基序列的研究也正在进行之中，近期内有可能取得突破。五、DNA芯片与杂交测序DNA芯片是一种通过杂交测定未知DNA序列的新技术。在一个玻璃或硅片上合成大量的寡聚核苷酸片段，例如可以合成8个碱基长的全部可能的寡聚核苷酸片段（48＝65，536种）。这些探针一头固定在固体基质上，另外一端是游离的。它们在硅片上有规律地排列着，每个特定位置上探针的序列都是已知的。假如有一个DNA片段需要测序，我们可以把它的单链形式用荧光进行标记，然后与硅片上的6万多种探针进行分子杂交，在荧光显微镜下观察杂交结果。如果某个探针与持测DNA的某个部分的序列是完全互补的，待测DNA分子就被结合到硅片上，这个探针所在的位置就会发出荧光。这种包含大量的生物遗传信息的寡聚核着酸阵列就叫DNA芯片，也叫基因芯片。DNA芯片的制备要利用微电子芯片生产中的光刻技术以及在位组合化学技术。DNA芯片的阅读要使用显微术，信息的解读要利用计算机技术。因此，DNA芯片是多学科交叉的产物。

DNA测序（DNAsequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。目前应用最广泛的是由FrederickSanger发明的Sanger双脱氧链终止法（ChainTerminationMethod）。新的测序方法，例如454生物科学的方法和焦磷酸测序法。Sanger测序法Sanger（桑格）双脱氧链终止法是FrederickSanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4种双脱氧核糖核酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个[2]。454生物科学和焦磷酸测序法454测序法由454生物科学发明，是一个类似焦磷酸测序法的新方法。2003年向GenBank提交了一个腺病毒全序列[3]，使得他们的技术成为Sanger测序法后第一个被用来测生物基因组全序列的新方法。454使用类似于焦磷酸测序的方法，有着相当高的读取速度，大约为5小时可以测两千万碱基对[4]。

第二代DNA测序法的原理能解释一下DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。基本原理Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

测序后的DNA序列与预测的有几个碱基不同DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。

DNA测序技术，即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

第1 代测序技术荧光标记的Sanger 法—— 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。用于测序的技术主要有Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法，Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。第2 代测序技术循环阵列合成测序法—— 述第2 代测序技术中, 序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的. 除了需要昂贵的光学监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像.这都使仪器的复杂性和成本增加. 依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用, 在测序成本中比例相当大. 直接读取序列信息, 不使用化学试剂, 对于进一步降低测序成本是非常可取的.在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内, 很难准确预测未来将发生什么.第3 代测序技术直接测序——将基因组DNA 随机切割成大约100 kb 左右的片段,制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交. 然后驱动结合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵列. 通过每个孔的离子电流均可独立测量. 追踪电流的变化确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位置. 利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因组片段文库排列起来, 建立一组完整的基因组探针

1. 去除带有荧光染料的残余ddNTP，不然会有染料峰的干扰；2. 去除残留的酶等蛋白质，因为蛋白质带有苯环，也会对荧光信号的检测带来干扰；3. 毛细管电泳时，要有buffer来保持稳定的离子强度和pH,所以还要再测序前去除盐离子哪些样本不好测？ 当客户把成批的样品交给商业化的测序公司时，经常会被告知一些样本没有结果，或是测得不好，无法提供图谱。做为客户常常不清楚测序失败的原因，对于一些重要的样品只好改送另外的测序公司试试看。dna 测序失败的原因归纳起来有三种： 一是模板的原因，模板的质量很重要，加入反应里的模板“量”并不很严格，但是模板“纯度”要求很高。这就是为什么商业测序公司通常要自已提取模板的原因。控制好模板是提高测序成功率的关键因素。对于一个经过训练，实验操作稳定的人来说，使用商品化成套试剂盒处理的dna模板的质量会有保证。其次，dna模板不能被污染，也就是说在挑菌落，细菌培养过程要防污染。如果菌生长的不好，提出来的模版测序效果也不好。 如果dna模板的质量没问题，有一段区域总是测不通，那就要考虑模板本身存在“难通过”的结构了。基因组中一些高度重复序列，gc 富集序列，poly a/t 序列 通常都是测序的“难点”，相对于质粒模板，pcr 产物的测序效果要差很多。 二是引物的原因，测序的引物除了通用引物就是pcr 的特异引物了。测不出时考虑更换新的引物或者改换另一个方向来测。（注意：即使是同一个模板，正反引物测序的效果可能相差巨大）。虽然很多时候使用pcr 扩增引物来做测序引物，但是测序对引物的特异性要求很高。如果引物与模板的非特异退火，延伸会导致“套峰”样结果。测序失败。 三是测序反应条件的原因，目前dna测序的原理是基于“酶”促反应的sanger 法，如果模板与引物匹配性不好，自然不会延伸出dna 片段；如果反应条件不合适，同样没用反应结果。当商业测序公司使用一个反应条件来测所有的样本时，某些样本的失败就不足为奇了。

SangerDNA测序法的缺陷是（）。 A.测定碱基序列需要大量完全相同的DNA拷贝 B.只能测定碱基数目较大的DNA C.分辨率低 正确答案：A

可以用以下测序方法第1 代测序技术荧光标记的Sanger 法—— 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法，目前Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。第2 代测序技术循环阵列合成测序法—— 述第2 代测序技术中, 序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的. 除了需要昂贵的光学监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像.这都使仪器的复杂性和成本增加. 依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用, 在目前测序成本中比例相当大. 直接读取序列信息, 不使用化学试剂, 对于进一步降低测序成本是非常可取的.在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内, 很难准确预测未来将发生什么.第3 代测序技术直接测序——将基因组DNA 随机切割成大约100 kb 左右的片段,制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交. 然后驱动结合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵列. 通过每个孔的离子电流均可独立测量. 追踪电流的变化确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位置. 利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因组片段文库排列起来, 建立一组完整的基因组探针

第一代DNA测序：双脱氧终止法即sanger测序法。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。第二代DNA测序：边合成边测序在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。第三代DNA测序：单分子测序用一种聚合酶将DNA的复制限制在一个微小的间隙中，给各种碱基加上荧光示踪标记，当碱基合成DNA链时，这些荧光标记就会发出不同颜色的闪光，根据闪光颜色就可识别出不同的碱基。要具体理解测序原理，请自己查询更详细的资料，以上为大体框架，sanger测序法是最老的测序法，沿用了几十年，到目前依然没有过时。二代测序是目前市面上最流行的测序，与一代相比，具有高通量、廉价的特点。三代测序目前仍处于试验阶段，将比二代测序更高通量，更廉价。

P是DNA的特征元素 就像S是蛋白质的特征元素 一个道理

DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。目前应用最广泛的是由Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法，DNA sequencing technology，在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。

DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。目前应用最广泛的是由Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）。新的测序方法，例如454生物科学的方法和焦磷酸测序法。Sanger测序法Sanger（桑格）双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4种双脱氧核糖核酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个[2]。 454生物科学和焦磷酸测序法454测序法由454生物科学发明，是一个类似焦磷酸测序法的新方法。2003年向GenBank提交了一个腺病毒全序列[3]，使得他们的技术成为Sanger测序法后第一个被用来测生物基因组全序列的新方法。454使用类似于焦磷酸测序的方法，有着相当高的读取速度，大约为5小时可以测两千万碱基对[4]。

Sanger法的原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物.直到掺入一种链终止核苷酸为止.每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP).

双脱氧法或酶法利用DNA 聚合酶合成单链DNA 模板的互补拷贝，这一方法最先由F. Sanger 及其合作者发展而来。DNA 聚合酶不能起始DNA 链的合成，而是在复性于“模板“DNA 的引物的3 ‘端上进行链的延伸（图1) 。链的延伸是在引物生长端的3′羟基掺入脱氧核糖核苷酸。双脱氧测序法利用了DNA 聚合酶能以2′, 3"－双脱氧核糖核苷酸(ddNTP) 为底物的特性。当ddNTP被掺入到延伸着的引物的3′ 端时，由于链上3′ 羟基的缺乏，链的延伸就会终止。在4 个测序反应的每个反应中加入4 种可能的ddNTP中的一种，即可产生4 种不同的反应。调整每个测序反应中的ddNTP 与dNTP的比例，使部分引物延伸链分别终止于每一个在模板DNA出现该碱基的位置上。这种测序方式，每个延伸反应的产物是一系列长短不一的引物延伸链，它们都具有由复性引物所决定的固定的5"端和终止于某一ddNTP的不定的3" 端。 常用的双脱氧测序法有两种常用方案。最早期的双脱氧法，称之为Sanger 法(Sanger et al. 1977, 1980) ，是利用大肠杆菌DNA 聚合酶I 的Klenow 片段而发展起来的 。引物在需要测序的单链DNA 模板的3′ 端进行复性（图1)。分成4份进行反应，每一份反应中都含有DNA 聚合酶、3 种未标记的dNTP、一种标记的dNTP 及其相应的ddNTP （图1 右侧）。引物的延伸和标记进行至摄入ddNTP 后被终止。在接下来的反应中，追加高浓度的4 种dNTP 使未被ddNTP 终止的链再延伸以产生更高分子质量的DNA, 这种DNA 链滞留在测序胶的顶部无法分辨。测序产物的平均长度通过ddNTP/dNTP 的比率来控制，比率越高产物越短。 标记／终止法利用修饰的T7 噬菌体DNA 聚合酶得到进一步发展。在两个独立的反应中分别进行引物的标记和双脱氧核苷酸的掺入（图 1左侧）。复性的引物在4 种低浓度dNTP（其中1 种是放射性标记的）存在时进行延伸。DNA 的合成持续到一种或多种dNTP被耗竭为止，这样可保证掺入全部的标记的脱氧核糖核苷酸。标记的混合物分到4 个独立的反应中，每个反应除了含有4 种dNTP 外，还各含4种ddNTP 中的1种。在链终止反应步骤中，高浓度的dNTP 保证DNA 逐次合成至生长链因ddNTP的掺入而终止。测序产物的平均链长取决于标记反应中dNTP 的浓度（浓度越高产物越长）和终止反应中ddNTP : dNTP 的比例。 当使用测序酶的时，标记／终止法能得到平均长度长于Sanger法的测序产物。所以这种方法对于从每个模板上获得最大散序列的信息是更有利的。对于测定小片段DNA（如证实结构）， Sanger法通常就足够了。如确定引物后几个核苷酸的序列信息， Sanger 法则更可靠。热稳定的DNA 聚合酶也可以用于双脱氧测序。因为耐热DNA聚合酶可以在高温下工作，可以用它进行热循环反应，这样可以提高测序产物的产量，因而提高了灵敏度。此外，热稳定聚合酶可以使DNA模板的二级结构变性，而DNA 的二级结构会干扰延伸进程。

【答案】：双脱氧链终止法测序的基本原理是：以待测DNA片段为模板，利用酶法合成与待测片段互补的DNA链。在正常的合成体系中，分别加入4种3"位缺少羟基的双脱氧核苷酸底物，即ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP，制备出四套末端标记的DNA片段。由于ddNTPs一旦掺入合成的DNA链，其链的合成即被终止，这样得到一套长短不一的片段，而每套片段被打断的位置却位于同一碱基，4套片段分别打断在A、T、C、G处。当对这4个不同碱基产生的4套DNA片段进行变性胶电泳分离时，即可产生一个可以直接读出DNA顺序的梯状区带。

。。。sanger太厉害了，核酸和蛋白质测序的sanger都有研究一般sanger测序法就是指的目前最常见的DNA测序技术sanger对蛋白质测序的贡献则是蛋白质N端测序技术，里面涉及到一种关键试剂叫做sanger试剂（2，4-二硝基氟苯）在弱碱性溶液中，氨基酸的α-氨基很容易与2，4-二硝基氟苯作用，生成稳定的黄色2，4-二硝基苯氨基酸。该反应由F. Sanger首先发现，所以此反应又称桑格反应（Sanger reaction）一般sanger法用来鉴定蛋白质N端的氨基酸残基蛋白质测序技术最经典的则是Edman降解法

【答案】：Sanger法DNA顺序测定技术的基本原理，是在反应中加入一种2"，3"-二脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，此物质因没有3"-OH，所以不能进行脱氧核苷酸链的延长。整个测定的程序如下：(1)将被测DNA制成单链模板。分别加入4个反应管中。并在每个管中加入引物、DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种为32P标记)。(2)在4个管中分别加人ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddATP，保温。(3)反应结束后在4个管中分别形成一些全部具有相同5"-引物端和分别以ddT、ddC、ddG、ddA 残基为3"-端结尾的一系列长短不一的混合物。(4)每种混合物经变性聚丙烯酰胺电泳分离及放射自显影，可见4种混合物形成不同的电泳迁移条带。每一条带都代表着一段以ddNTP终止的片段。只要按照电泳条带出现的先后次序即可读出被测DNA的顺序。Sanger法从引物的3"-端开始能合成约300个核苷酸的排列顺序，是现今分子生物中最重要的手段之一。

[1]聚合作用：在引物RNA"-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3"-OH与5"-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3"-5"外切酶活性位点所识别并切除之。 　　[2]3"→5"外切酶活性──校对作用：这种酶活性的主要功能是从3"→5"方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被3"→5"外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用，这表明温度升高使DNA生长链3"末端与模板发生分离的机会更多，因而降解作用加强。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，3"→5"外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3"→5"外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。在某些T4噬菌体突变株中DNA复制的真实性降低，而易发生突变，从此突变株分离得到的T4DNA聚合酶的3"→5"外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突变能力的T4突变株中的T4DNA聚合酶的3"→5"外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。可见，3"→5"外切酶活性对DNA复制真实性的维持是十分重要的。 　　[3]5"→3"外切酶活性──切除修复作用：5"→3"外切酶活性就是从5"→3"方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5"-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分（双链）磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5"→3"。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5"→3"外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5"末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。 　　[4]焦磷酸解作用：DNApolⅠ的这种活性可以催化3"末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。（dNMP)n+XPPi←（dNMP)n-x+X(dNPPP）→DNA 　　[5]焦磷酸交换作用：催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA

能量也是由底物dNTP供给的，底物dNTP在延伸是会断裂一个高能磷酸键，

DNA聚合酶作用部位是磷酸二酯键。1、聚合作用：在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令，即A与T，C与G的配对原则，逐步逐个、连续地将dNTP加到延伸中的DNA分子3"-OH末端，逐步合成延长中的子链DNA。这是DNA聚合酶的主要作用；2、3"→5""外切酶活性（校对作用）：这种酶活性的主要功能是从3"→5"方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸，3"→5"外切酶活性的主要功能是校对作用。当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3"→5"外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸，可见，3"→5"外切酶活性对DNA复制真实性的维持是十分重要的。以保证复制过程的保真性和准确性；3、5"→3"外切酶活性（切除修复作用）：该活性是从5"→3"方向水解DNA延长链前方的DNA链（即只对DNA上双链处的磷酸二酯键有切割作用），主要产生5"—脱氧核苷酸。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。扩展资料： 1、DNA聚合酶可以在每一个新掺入的核苷酸与模板链之间进行仔细地监测。只有在配对正确的情况下，它才会催化核苷酸之间聚合形成磷酸二酯键。2、即使当DNA聚合酶的监测偶然失误，掺入了错误的核苷酸，它还能通过校读的功能纠正错误。参考资料来源：百度百科-DNA聚合酶

一分子磷酸，一分子脱氧核糖（五碳糖），一分子碱基合成一分子脱氧核糖核苷酸，然后很多个脱氧核糖核苷酸合成DNA。1、物理性质：DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。2、分子结构：DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3"，5"-磷酸二酯键相连构成的长链。大多数DNA含有两条这样的长链，也有的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等。DNA有环形DNA和链状DNA之分。在某些类型的DNA中，5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富。在某些噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年代后期，查加夫（E.Chargaff）发现不同物种DNA的碱基组成比例不同，但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数（A=T），鸟嘌呤数等于胞嘧啶数（G=C），因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和，一般用几个层次描绘DNA的结构。3、分布功能：原核细胞的染色体是一个长DNA分子，但是原核细胞没有真正的细胞核。真核细胞核中有不止一条染色体，每条染色体只含一个DNA分子。不过它们一般都比原核细胞中的DNA分子大而且和蛋白质结合在一起。DNA分子的功能是贮存决定物种的所有蛋白质和RNA结构的全部遗传信息；策划生物有次序地合成细胞和组织组分的时间和空间；确定生物生命周期自始至终的活性和确定生物的个性。除染色体DNA外，有极少量结构不同的DNA存在于真核细胞的线粒体和叶绿体中。DNA病毒的遗传物质也是DNA。

一般都需要放在—20.反复融冻就是 拿出来融化了 又放回去，很多次这样，酶会失活、DNA会降解。但我们又要做实验用，就需要常用的酶或引物分装成小管 十几次或者20几次用完。其他放到-80保存。

酶最好一直放在-20,现用现取,用完再放回-20.引物分贮液和使用液.贮液放-20 ；其他如果常用放在4就行.不常用可小量分装,每份大概就是你常用的一次的量,用时拿出一管就ok,如果一管量大,一次用不完,剩余又冻回-20,反复进行不就是反复冻融了吗.

楼上说的对，复制过程的起始需要引物合成酶先合成一小段RNA作为引物，底物是NTP。

dTTP（脱氧胸苷三磷酸）。因为胸腺嘧啶是DNA特有的碱基，所以dNTP中的N应该就是T。dTTP是DNA复制的直接前体，在细胞中一般不在其他地方用作供能物质。在人工合成中，一般用来作PCR、DNA测序、DNA标记等。

这个问题问得好有模板的DNA和镁离子存在时，在DNA聚合酶的催化下，由游离的3-OH对dNTP的α磷酸发动亲核攻击形成磷酸二酯键，生成DNA，同时释放焦磷酸PPi，焦磷酸水解放能，推动反应向右进行

高能磷酸键一定是有能量的,dNMP没有这两个高能磷酸键,又要消耗更多的外源能量……别的不说,能量守恒总没错吧……dNTP一定比dNMP能量高,能量高的分子不稳定,容易反应.

高能磷酸键一定是有能量的,dNMP没有这两个高能磷酸键,又要消耗更多的外源能量……别的不说,能量守恒总没错吧……dNTP一定比dNMP能量高,能量高的分子不稳定,容易反应.

因为在 DNA 复制过程中，dNTP 的焦磷酸掉下来了，变成了 dNMP，同时和上一个碱基连起来了，发生了复制。掉下来的这个焦磷酸分子水解，为 DNA 聚合酶继续工作提供了能量。拓展资料：DNA复制从起始序列开始单向或双向进行。合成DNA双螺旋的两条链是反向平行排列的，其中一条链的起始端与另一条链的末尾端平行排列在一起，每一个复制叉只有一条链是按照从尾到头的正确方向指导新链从头到尾方向合成。根据这条指导链，DNA复制持续向前合成复制叉。参考资料：百度百科，DNA复制

dNTP代表三磷酸脱氧核苷酸dNMP代表磷酸脱氧核苷酸N可以是A、G嘌呤和C、T嘧啶如dGTP三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGMP磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸

组成DNA的基本单位是脱氧核糖核苷酸，具体内容如下：脱氧核糖核酸（英文DeoxyriboNucleicAcid，缩写为DNA）是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。2023年4月，科学家发现首个有两套DNA的动物——黄疯蚁。物质简介DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。DNA分子结构中，两条多脱氧核苷酸链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成双螺旋结构。脱氧核糖-磷酸链在螺旋结构的外面，碱基朝向里面。两条多脱氧核苷酸链反向互补，通过碱基间的氢键形成的碱基配对相连，形成相当稳定的组合。脱氧核糖核酸（DNA）是生物细胞内携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息的一种核酸，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子 。DNA中的核苷酸中碱基的排列顺序构成了遗传信息。该遗传信息可以通过转录过程形成RNA，然后其中的mRNA通过翻译产生多肽，形成蛋白质。在细胞分裂之前，DNA复制过程复制了遗传信息，这避免了在不同细胞世代之间的转变中遗传信息的丢失。在真核生物中，DNA存在于细胞核内称为染色体的结构中。在没有细胞核的其它生物中，DNA要么存在于染色体中要么存在于其它组织（细菌有单环双链DNA分子，而病毒有DNA或RNA基因组）。在染色体中，染色质蛋白如组蛋白、共存蛋白和凝聚蛋白将DNA在一个有序的结构中。这些结构指导遗传密码和负责转录的蛋白质之间的相互作用，有助于控制基因的转录。

DNA的基本单位是脱氧核糖核苷酸。由重复的核苷酸单元组成的长聚合物，链宽2.2到2.6纳米，每个核苷酸单体长度为0.33纳米。尽管每个单体占据相当小的空间，但DNA聚合物的长度可以非常长，因为每个链可以有数百万个核苷酸。例如，最大的人类染色体（1号染色体）含有近2.5亿个碱基对。生物体中的DNA几乎从不作为单链存在，而是作为一对彼此紧密相关的双链，彼此交织在一起形成一个叫做双螺旋的结构。每个核苷酸由可与相邻核苷酸共价键结合的侧链骨架和含氮碱基组成，两条链上的含氮碱基通过碱基互补以氢键相连。糖与含氮碱基形成核苷，核苷与一个或多个磷酸基团结合成为核苷酸。DNA骨架结构是由磷酸与糖类基团交互排列而成。组成脱氧核糖核酸的糖类分子为环状的2-脱氧核糖，属于五碳糖的一种。磷酸基团上的两个氧原子分别接在五碳糖的3号及5号碳原子上，形成磷酸双酯键。这种两侧不对称的共价键位置，使每一条脱氧核糖核酸长链皆具方向性。双螺旋中的两股核苷酸互以相反方向排列，这种排列方式称为反平行。脱氧核糖核酸链上互不对称的两末端一边叫做5"端，另一边则称3"端。脱氧核糖核酸与RNA最主要的差异之一，在于组成糖分子的不同，DNA为2-脱氧核糖，RNA则为核糖。扩展资料DNA的双螺旋通过在两条链上存在的含氮碱基之间建立的氢键来稳定。组成DNA的四种碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）。所有四种碱基都具有杂环结构，但结构上腺嘌呤和鸟嘌呤是嘌呤的衍生物，称为嘌呤碱基，而胞嘧啶和胸腺嘧啶与嘧啶有关，称为嘧啶碱基。两条核苷酸链沿着中心轴以相反方向相互缠绕在一起，很像一座螺旋形的楼梯，两侧扶手是两条多核苷酸链的糖一磷基因交替结合的骨架，而踏板就是碱基。DAN双螺旋是右旋螺旋。不同磷酸盐基团之间的凹槽仍然暴露在外。主沟宽2.2纳米，而小沟宽1.2纳米。两个凹槽的不同宽度决定了蛋白质对不同碱基的可接触性，这取决于碱基是在主沟还是小沟中。与DNA的蛋白质，如转录因子，通常与处在大沟中的碱基接触。其溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。

简要的说就是ATP,GTP,CTP,TTP和ADP,CDP,TDP,GDP量此消彼长之间的相互促进和阻遏。一种NTP的积累量多了就会反馈抑制酶的合成并促进其他的合成。一种NTP的不足会促进酶使其合成增加。当某种NDP积累多了会促进酶合成NTP。

DNA的基本单位是脱氧核糖核苷酸。由重复的核苷酸单元组成的长聚合物，链宽2.2到2.6纳米，每个核苷酸单体长度为0.33纳米。尽管每个单体占据相当小的空间，但DNA聚合物的长度可以非常长，因为每个链可以有数百万个核苷酸。例如，最大的人类染色体（1号染色体）含有近2.5亿个碱基对。生物体中的DNA几乎从不作为单链存在，而是作为一对彼此紧密相关的双链，彼此交织在一起形成一个叫做双螺旋的结构。每个核苷酸由可与相邻核苷酸共价键结合的侧链骨架和含氮碱基组成，两条链上的含氮碱基通过碱基互补以氢键相连。糖与含氮碱基形成核苷，核苷与一个或多个磷酸基团结合成为核苷酸。DNA骨架结构是由磷酸与糖类基团交互排列而成。组成脱氧核糖核酸的糖类分子为环状的2-脱氧核糖，属于五碳糖的一种。磷酸基团上的两个氧原子分别接在五碳糖的3号及5号碳原子上，形成磷酸双酯键。这种两侧不对称的共价键位置，使每一条脱氧核糖核酸长链皆具方向性。双螺旋中的两股核苷酸互以相反方向排列，这种排列方式称为反平行。脱氧核糖核酸链上互不对称的两末端一边叫做5"端，另一边则称3"端。脱氧核糖核酸与RNA最主要的差异之一，在于组成糖分子的不同，DNA为2-脱氧核糖，RNA则为核糖。扩展资料DNA的双螺旋通过在两条链上存在的含氮碱基之间建立的氢键来稳定。组成DNA的四种碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）。所有四种碱基都具有杂环结构，但结构上腺嘌呤和鸟嘌呤是嘌呤的衍生物，称为嘌呤碱基，而胞嘧啶和胸腺嘧啶与嘧啶有关，称为嘧啶碱基。两条核苷酸链沿着中心轴以相反方向相互缠绕在一起，很像一座螺旋形的楼梯，两侧扶手是两条多核苷酸链的糖一磷基因交替结合的骨架，而踏板就是碱基。DAN双螺旋是右旋螺旋。不同磷酸盐基团之间的凹槽仍然暴露在外。主沟宽2.2纳米，而小沟宽1.2纳米。两个凹槽的不同宽度决定了蛋白质对不同碱基的可接触性，这取决于碱基是在主沟还是小沟中。与DNA的蛋白质，如转录因子，通常与处在大沟中的碱基接触。其溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。

BAC是细菌人工染色体意思，之所以有BAC文库的出现，是因为基因组序列太长，测序，以及筛选基因等没有办法完成，所以将基因组片段随机打断成片段，连到载体上构建成一系列的重组子，这样当你需要特定的序列，只需要筛选出自己要的那个bac重组子就行了。说的有点过于简单，不知道你能明白否？末端测序也是采用的双脱氧终止法的。双脱氧终止法的原理是；碱基之间是通过俩个碱基的5‘磷酸基团和3"羟基连接的，双脱氧终止法就是利用了这个3‘羟基，将3"羟基脱氧变成氢键，那么这样下一个碱基的5‘磷酸基团就没有办法连到前一个碱基上了。所以如果在做测序pcr的时候加一部分正常的dNTP(3号位为羟基),加一定量的ddNTP(2,3号位都是氢键)，那么在第一个碱基后如果接上去的是dNTP,那么就可以接着连第三个碱基，如果连得是ddNTP,那么就没有办法连下个碱基形成链终止，在测序pcr中，数以万计的反应，那么就会出现2个碱基后终止的链，也有可能出现3个，4个，N个碱基后终止的链，这样就形成了一系列从一个碱基到N个碱基的序列（其最后一个碱基都是三号位为氢键的，这个应该理解吧）。那么如果我们在连上去的ddNTP上连上个荧光基团(四种ddNTP连上不同的荧光基团)，那么将这一系列长度的链跑胶，会形成一系列的带，通过每条带最后一个碱基的荧光通过机器就能够区分是什么碱基，将这些碱基拼接好后就是你要的序列了。

目前经常使用的载体,主要有质粒和病毒两类.携带目的基因的质粒,它本身就是一种稳定而独立的重组DNA分子.因此重组质粒进入受体细胞后,常不需要把所携带的基因转到受体细胞的染色体上去,就会进行自我复制,异源性DNA也得到了复制.另外,叶绿体和线粒体DNA等作为新型运载体,携带目的基因进入受体细胞后,也是游离在细胞质中. 　　除了质粒之外,噬菌体、动植物病毒等也可以作为载体.利用病毒作为基因运载体时,所携带的目的基因一般需要整合到受体细胞的染色体DNA中去,才能成为稳定的结构而独立复制传递.例如λ噬菌体侵染细菌后,并不伤害受体细胞地和细菌拟核DNA整合到一起,随着细菌拟核DNA复制而复制；采用农杆菌介导的遗传转化方法而导入的外源基因,通常都是被整合到染色体DNA中,因此由此获得的转基因植物相关性状呈孟德尔式遗传. 　　在自然界中,SV40等致癌病毒侵染后形成的DNA就是整合到宿主细胞染色体DNA中进行复制的；HIV侵入宿主细胞后经过逆转录形成DNA,形成的DNA再拼接到宿主细胞的核DNA中.

核酸内切酶 endonuclease 核酸内切酶是在核酸水解酶中,水解DNA分子链内部磷酸二酯键生成寡/寡聚核苷酸的酶.从对底物的特异性来看,可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase、RNaseT1等仅分解RNA的酶；还有就是如链孢霉（Neurospora）核酸酶这类既分解DNA又分解RNA的酶.一般来说,大都不具碱基特异性,但也有诸如HindⅢ、EcoRⅠ等具有限制性的,能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶. 核酸外切酶exonuclease 核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键,降解核苷酸的酶.其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP,RNA为NTP）.按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶. 单链的核酸外切酶包括大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ（exoⅠ）和核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）.核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）能够从5′-末端或3′-末端呈单链状态的DNA分子上降解DNA,产生出寡核苷酸短片段,而且是唯一不需要Mg2+离子的活性酶,是一种耐受性很强的核酸酶.核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）可以用来测定基因组DNA中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置.它只切割末端有单链突出的DNA分子. 双链的核酸外切酶包括大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）、λ噬菌体核酸外切酶（λexo）以及T7噬菌体基因6核酸外切酶等.大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）具有多种催化功能,可以降解双链DNA分子中的许多类型的磷酸二酯键.其中主要的催化活性是催化双链DNA按3′→5′的方向从3′-OH末端释放5′-单核苷酸.大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）通过其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区,经过这种修饰的DNA再配合使用Klenow酶,同时加进带放射性同位素的核苷酸,便可以制备特异性的放射性探针. λ噬菌体核酸外切酶（λexo）最初是从感染了λ噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的.这种酶催化双链DNA分子从5′-P末端进行逐步的水解释放出5′-单核苷酸.但不能降解5′-OH末端.

lamda DNA（应为λDNA）就是λ噬菌体中的DNA。λDNA和质粒DNA的区别如下：λDNA,就是λ噬菌体中的DNA，但是λDNA也分很多种情况的，有正常的，有突变的，还有整合了宿主染色体的。λDNA是一种溶原性的染色体序列，可以整合到宿主的染色体组上，也可以脱离下来，他的整合和脱离所产生的失误可产生宿主的基因重组现象，所以可以用于局限转导，是一种基因转化的载体。天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质粒的套数（copy number）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。

怎么说呐，杀死DNA是什么概念呐？我想了半天也不知道怎么回答……我来把过程给你简单介绍下吧，你判断下是不是“杀死”了宿主DNA把，嘿嘿首先，侵染过程你没问我也就不说了，说下噬菌体的DNA吧噬菌体也分为很多种的，我们常说的是T偶数噬菌体或者λ噬菌体，均为双链DNA，即dsDNA。T偶数噬菌体进入宿主体内后会整合进宿主的DNA中，开始利用宿主体内的物质进行自我复制，以其核酸为蓝图，使宿主细胞代谢系统改变，适应其复制。说白了就是，在宿主DNA中加了一段，改变了其整个调节与功能。大量复制自己，最终裂解宿主释放出自带噬菌体。λ噬菌体则会整合进入宿主DNA中，但是有时候表现出溶源性，即插入一段，对其完全没有任何影响。甚至随着宿主的分裂与其一同复制分裂。那么，你觉得噬菌体杀死宿主的DNA了么？呵呵~

λ噬菌体是最早使用的克隆载体，λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。

lamdaDNA（应为λDNA）就是λ噬菌体中的DNA。λDNA和质粒DNA的区别如下：λDNA,就是λ噬菌体中的DNA，但是λDNA也分很多种情况的，有正常的，有突变的，还有整合了宿主染色体的。λDNA是一种溶原性的染色体序列，可以整合到宿主的染色体组上，也可以脱离下来，他的整合和脱离所产生的失误可产生宿主的基因重组现象，所以可以用于局限转导，是一种基因转化的载体。天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质粒的套数（copynumber）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。

λ噬菌体是最早使用的克隆载体，λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。

噬菌体的核酸有DNA或者RNA构成，这些核酸有单链或者双链的形式。就DNA噬菌体来说，核酸一般双链的，成线状或者环状。但也有特殊的，比如M13是一种单链丝状DNA噬菌体，常作为DNA载体

目前经常使用的载体，主要有质粒和病毒两类。携带目的基因的质粒，它本身就是一种稳定而独立的重组DNA分子。因此重组质粒进入受体细胞后，常不需要把所携带的基因转到受体细胞的染色体上去，就会进行自我复制，异源性DNA也得到了复制。另外，叶绿体和线粒体DNA等作为新型运载体，携带目的基因进入受体细胞后，也是游离在细胞质中。　　除了质粒之外，噬菌体、动植物病毒等也可以作为载体。利用病毒作为基因运载体时，所携带的目的基因一般需要整合到受体细胞的染色体DNA中去，才能成为稳定的结构而独立复制传递。例如λ噬菌体侵染细菌后，并不伤害受体细胞地和细菌拟核DNA整合到一起，随着细菌拟核DNA复制而复制；采用农杆菌介导的遗传转化方法而导入的外源基因，通常都是被整合到染色体DNA中，因此由此获得的转基因植物相关性状呈孟德尔式遗传。　　在自然界中，SV40等致癌病毒侵染后形成的DNA就是整合到宿主细胞染色体DNA中进行复制的；HIV侵入宿主细胞后经过逆转录形成DNA，形成的DNA再拼接到宿主细胞的核DNA中。

噬菌体是一种双链DNA噬菌体一般有些病毒的DNA是单链线性的，比如细菌病毒－噬菌体：丝杆病毒科，细小病毒科，双粒病毒科，微病毒科

λ噬菌体是最早使用的克隆载体，λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链dna分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状dna分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内λ噬菌体dna整合到宿主菌染色体dna中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。

【答案】：柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的。柯斯质粒具有λ噬菌体的cos序列(12 bp)和细菌质粒的复制原点。(1)具有λ噬菌体的特性：在克隆了外源片段后可在体外被包装成噬菌体颗粒，与噬菌体一样能高效地感染对λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。(2)进入寄主的柯斯质粒DNA分子，按照λ噬菌体DNA的方式环化，但无法按噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体颗粒。(3)具有高容量的克隆能力：柯斯质粒本身一般只有5～7.kb左右，而它克隆外源DNA片段的极限值竞高达45kh，远远超过质粒载体及λ噬菌体载体的克隆能力。同时，由于包装限制，柯斯质粒载体的克隆能力还存在一个最低极限值。例如，5kb大小的柯斯质粒载体，插入的外源片段至少不能小于30kb。

(1)cDNA文库是指细胞全部mRNA通过逆转录得到cDNA后被克隆的总和。cDNA的组成特点是片段中不含基因的内含子和其他调控序列。cDNA文库构建基本步骤：①制备mRNA：全RNA提取与mRNA的分离提纯；②合成cDNA：oligo dT与mRNA3"端poly(A)杂交作为引物合成第一链，第二链合成是以第一链为模板，DNA聚合酶催化。常用RNase H切割mRNA-cDNA杂合链中的mRNA序列产生的小片段为引物合成第二链的片段，再连接成完整链；③制备载体DNA：由于cDNA分子的长度在0. 5～8kb，常用的质粒载体和噬菌体载体都可以，载体选择根据文库用途确定，如噬菌粒载体具有噬菌体的高效性和质粒载体系统可以利用蓝白斑筛选的便利；④cDNA的分子克隆：cDNA连入载体，转化重组体，扩增；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，评价文库质量。文库是否有价值主要从文库含量和插入片段的大小来评价，所构建文库必须有足够多的克隆数以确保基因组cDNA每一个序列至少有1个拷贝在文库内。(2)cDNA文库同基因组文库的差别主要在于基因组文库(尤其是真核生物的基因组文库)可能包含有非编码序列，含有更丰富的遗传信息。

构建基因组文库的步骤A 分离基因组DNA；B 用超声波或限制酶等进行基因组DNA部分或完全降解；C 将降解物进行分级得到所需大小DNA片段；D 将DNA片段与载体连接(一般用λ噬菌体载体)；E 将重组体导入宿主细胞；F 最后筛选鉴定重组子克隆。建立基因组文库的方法2—λ噬菌体基因组文库 可插入较大片段，最大可达23kb建立基因组文库的其他方法：cosmid基因组文库 YAC基因组文库 BAC基因组文库基因文库的质量标准：重组克隆的总数不宜过大， 以减轻筛选工作的压力；载体的装载量最好大于基因的长度， 避免基因被分隔克隆；克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域, 以利克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下,重组克隆能稳定保存、扩增、筛选建立cDNA文库的基本步骤 (1)隔离总RNA和净化mRNA (2)合成的双链互补脱氧核糖核酸适合插入一个克隆载体(3)克隆cDNA合适的向量(4)转移到合适的宿主细胞的重组载体(5)筛查阳性克隆cDNA克隆的策略(1)自身引导的第二链合成+同聚物加尾（2）cDNA克隆方法的改进。尾随第一链寡核苷酸（DC）允许使用寡核苷酸引物（ DG）将要开展的第二链（3）cDNA的定向克隆从基因文库中筛选分离目的基因克隆(1)制备核酸探针进行杂交筛选(2) 制备抗体进行免疫杂交筛选(3)根据生物大分子间的相互作用筛选目的基因(4)利用PCR技术筛选目的基因文库(5)利用噬菌体表面展示技术分离目的cDNA克隆：噬菌体展示(phage display)：是在噬菌体表面表达已融合到噬菌体外壳蛋白的重组蛋白或多肽的技术。应用噬菌体展示技术的关键是构建表达性基因文库，这种文库称为噬菌体展示文库(phage display library )。常用的构建噬菌体显示文库的表达载体有两类：丝状噬菌体和以这些噬菌体复制起始序列为基础构建的噬菌粒(phagemid)。mRNA差别显示技术原理：在 mRNA3′端的 poly (A)5"上游的 2个碱基只有 1 2种组合。与此相对应，共可人工合成12种不同的下游引物，用以反转录mRNA 合成cDNA第一条链。这种引物通常称为3"端锚定引物，它由Oligo-d T后面接上两个碱基 (如 5′T1 1 - 1 2 MN3′, M=G、C或 A; N=A、G、C或 T)构成。这样，每一种此类人工合成的寡核苷酸引物，都将能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。由此可知，使用5′T1 1 - 1 2 MN3′引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的但序列结构不同的12份亚群体。DDRT-PCR的主要步骤：Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3"锚定引物作为反转录的引物，合成第一链cDNA；Ⅱ.用5"随机引物和某个3"端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)；Ⅲ.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；Ⅳ.回收特异性差别条带；Ⅴ.用同一引物对扩增已回收的DNA条带；Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；Ⅶ.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。 DNA插入诱变法分离目的基因DNA插入诱变法主要用于植物目的基因的克隆分离研究。其基本原理是，当一段特定的DNA序列插入到植物基因的内部或其邻近位置时，一般会诱导该基因发生突变形成突变体植株，或者在插入位置产生一个新的基因。 如果该DNA插入序列是已知的，便可用它作为DNA分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选得到突变基因片段。然后利用此突变基因片段制备探针，从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。这样，插入的DNA序列相当于在植物基因上贴了一张标签，因此，DNA插入诱变法又叫DNA标签法(DNA tagging)。差别杂交和减法杂交技术分离目的基因差别杂交构建了基因文库后，如没有任何可供选择的探针进行筛选，或没有任何有关目的基因的核苷酸序列信息时，可以考虑用差别杂交法筛选目的基因片段。差别杂交(Differential hybridization)也称为差别筛选(Differential screening)法。特别适用于分离在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调控的基因，亦可有效地用来分离经特殊处理诱导表达的基因。差别杂交的技术原理：有目的基因能正常表达和不能表达的两个不同的细胞群体。在这种情况下，分别制备两种不同细胞群体的mRNA提取物，其中一个群体含有一定比例的目的基因mRNA ，另一个群体不含有目的基因mRNA。差别杂交的技术原理过程：以这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目的基因表达的mRNA群体为探针时，所有包含重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点;而以目的基因不表达的mRNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，变可以挑选出含有目的基因的菌落，供进一步研究用。差别杂交法的局限性：首先，差别杂交的灵敏度比较低，不适合低丰度mRNA的目的基因的分离。其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑，是一项十分耗时耗力的工作；第三，差别杂交重复性差。差别杂交涉及文库的滤膜影印，不同滤膜之间的DNA保有量往往不均一，杂交所得的信号强度也会不一致，需要重新进行点杂交，以做进一步的阳性克隆鉴定工作 。mRNA减法杂交基本原理：从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录成为cDNA，然后与无目的基因表达的组织中提取的mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成程cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍然保持单链状态，这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。基因突变技术分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又分两种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变(oligonucleotide-mediated mutagenesis)；第二类是利用PCR,以双链DNA为模板所进行的基因突变。寡核苷酸介导的定点诱变的原理 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子链的组成部分。因此，所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列。要求所设计的寡核苷酸引物除了所需的突变位点之外，与目的基因编码的区段完全互补。作为诱变剂的寡核苷酸序列，同待诱变的目的基因的互补序列之间，能形成一种稳定的唯一的双链结构。决定双链区段稳定性的主要因素是碱基的组分、核苷酸的错配以及寡核苷酸引物的长度等。寡核苷酸介导的定点诱变的基本步骤(a)将要进行突变的目标基因(或DNA片段)克隆于M13噬菌体载体或噬菌粒载体。(b)从重组的M13或噬菌粒中制备单链DNA。(c)将设计好的寡核苷酸突变引物的5"端用T4多核苷酸激酶进行磷酸化。(d)将上述突变引物与目标基因(单链的DNA模板)进行退火。(e)在存在DNA聚合酶和dNTP的情况下，使退火引物沿单链DNA模板延伸，然后新生链的末端用T4 DNA连接酶连接。(f)转染易感细菌。(g)筛选出带有突变的目标基因的噬菌斑。(h)从突变的重组噬菌体制备单链DNA，通过DNA序列分析确认突变位点的正确性。(i)从重组的M13噬菌体复制型双链DNA中回收突变的目标基因(DNA片段)。(j)将突变了的基因(DNA片段)重组入表达载体进行表达。第五章受体细胞应具备的条件(1)便于重组DNA分子的导入。如易形成感受态，具有较高的转化效率；(2) 能使重组体DNA分子稳定存在于细胞中。如限制性缺陷型； (3) 便于重组体的筛选。如具有与重组体互补的遗传性状； (4) 受体细胞遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长，能进行高密度培养；对动物细胞要可悬浮培养，对培养基适应性要好；(5)安全性高，无治病性，不会对外界环境造成生物污染：感染与寄生缺陷型；(6)蛋白水解酶少,利于外源蛋白在细胞内的积累。尤其是对枯草芽孢杆菌。(7) 受体细胞的密码子偏倚性要小；(8) 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 ▲糖蛋白不能在E.coli中表达；(9) 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值；(10)对于用于基因扩增或基因高效表达的受体要用重组整合缺陷型。第六章克隆基因高表达的相关因素1有效转录开始 关键的一步，并限制外源基因表达的一步！构建表达载体的同时，选择强的和可控制的启动子和相关终止序列。2有效延长和终止转录正确 3 mRNA的稳定性4有效地转录开始5遗传密码子偏向6核糖核酸处理过程7终止密码子8表达载体9重组蛋白Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA）；正调节因子 CAP；负调节因子 lac I Tac 表达系统 tac启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂合启动子。 调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平高于 trp 和 lacUV5启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。包涵体蛋白在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起，形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体(inclusion body, inclusive body)。包涵体主要由蛋白质组成，并且大部分为外源基因的表达产物，它们具有正确的氨基酸序列，但构像却是错误的，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。包涵体形成的原因主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。此外，还有以下原因：(1)表达量过高。(2) 重组蛋白的氨基酸组成(3)重组蛋白所处的环境：温度、pH(4)缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类(5)培养条件不佳酵母基因表达载体的种类 自主复制型质粒载体:含酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和克隆位点等关键元件。较高拷贝数，细胞分裂时不能平均分配到子细胞中。 整合型质粒载体:不含酵母基因组的DNA复制起始区，但含有整合介导区。 着丝粒型质粒载体:在自主复制型质粒载体基础上构建而成，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件，可保证平均分配到子细胞中。1-2拷贝/细胞。 酵母人工染色体:以线性双链DNA形式存在于酵母细胞，每个细胞只有单拷贝。

虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区，能够合成单链DNA，但是它没有M13的功能基因，没有M13基因2的产物存在，所以不能合成单链DNA。而辅助噬菌体具有M13的所有功能基因，但是IG区是缺陷的，辅助噬菌体本身的DNA不能进行单链复制，于是就可以为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白。辅助噬菌体必需具备如下条件：(1)助噬菌体的DNA IG区必需失去功能，其本身的DNA不会被包装到成熟的噬菌体颗粒中；（2）由于辅助噬菌体的IG区失活，其本身的基因不能表达，要使辅助噬菌体的所有功能基因都能进行表达，必须在辅助噬菌体的基因组中导人新的复制起点；(3)辅助噬菌体的基因组中具有选择标记，便于识别和收集一定数量的辅助噬菌体。

小于2kb目的基因。质粒的不相容性：两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。dna就是基因。用于保存和扩增小于2kb目的基因。

　　DNA克隆载体有哪些重要结构元件　　表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因 　　常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。 　　表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

克隆载体主要包括质粒载体和噬菌体载体. 质粒载体需要：1. 起始位点；2. 两种遗传性标记,如Amp或LacZ；3. 多克隆位点（MCS）. 噬菌体载体,这里主要说伽马噬菌体载体,其需要：1. 起始位点；2,复制外壳蛋白的基因；3,互补单链粘性末端（COS位点）；4,阻遏蛋白；5,酶切位点.

因为mRNA的结构。构建cdna是克隆载体是因为mRNA的结构，是经体外反转录合成互补。cdna是指互补(有时称拷贝)DNA，特指在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链。

克隆载体主要包括质粒载体和噬菌体载体。质粒载体需要：1. 起始位点；2. 两种遗传性标记，如Amp或LacZ；3. 多克隆位点（MCS）。噬菌体载体，这里主要说伽马噬菌体载体，其需要：1. 起始位点；2，复制外壳蛋白的基因；3，互补单链粘性末端（COS位点）；4，阻遏蛋白；5，酶切位点。

质粒、基因发动子、噬菌体载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。

因为技术达不到啊，如果技术上可行的话，完全可以在染色体水平上进行DNA测序；主要难点在于DNA实在太长了，序列太多了；因而人们要避开这一点，所以就想到了把DNA分解成片断来操作；但是该怎么分解，毕竟单独把一条染色体分解成小的DNA片断也是不合适的，因为DNA含量太小，太难操作；因此，既要保证DNA片断小，又要保证一定的DNA片断浓度。所以，派拉蒙公司发明了一种方法，即取得细胞样品后，提取细胞中的染色体DNA，利用基因枪等等方法把DNA打碎，这样就保证了DNA片断的小以及浓度的高。然后把这些DNA片断连到载体上，而这些DNA片断连到载体上的部位的载体序列（拗口）是已知的，因此，人们可以测出与载体相连的DNA片断的边缘序列是什么，从而使这些不同的DNA片断可以连在一起；同时，DNA片断的内部序列可以在又一轮的打断、连到载体上后进行测序，直到完全测出。直到最后，所有的序列都被测出。这是一项大工程，需要一个大数据库，呵呵。由大化小，又由小得大，妙啊。所以说DNA测序克隆到载体上是为了解决大片断DNA难以直接测定的问题，毕竟一次测定的DNA序列长度是有限的。就这些，呵呵。