细胞

正常人外周血中一般看不见幼稚的干细胞的,只存在有极少量的造血干细胞，其含量为0.01%左右。如果幼稚细胞的比例大幅增加，有可能是类白血病。正因为存在0.01%的造血干细胞，可利用细胞分离的技术(血细胞自动分离机)，将外周血中含有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者以之代替骨髓而进行的干细胞移植，称为外周血干细胞移植。

毕业2年了，虽然这些课都学过，但忘记了很多了，我就凭印象简单给你说说吧。1、酶工程：当然是对于生物活性酶的提取、制作和运用。这里的制作是指将一些酶固定在一种载体上，叫做固定化酶，可反复使用。还有酶修饰，经过化学修饰增加一些离子或基团可以使酶活性或稳定性加强，还有人工合成酶和模拟酶等。2、发酵工程：主要是运用酵母菌进行对食品和酒类的制造。例如啤酒、果酒、醪糟等，这些叫做发酵酒，与白酒（蒸馏酒）有差别。我以前亲自做过猕猴桃酒，有点难吃，不过老师却说不错。3、细胞工程：是用人工手段改变细胞的遗传物质，使其按照人们的思想获得细胞产品，手段可以有细胞融合、核移植等等。4、生物分离工程：（好象叫做生化分离工程）主要是讲怎么把发酵液里的细胞和其他成分分离开。有什么膜分离技术啊，膜亲和技术啊，哦，还有什么超临界萃取，很多技术，想知道仔细点还是去找本书看。5、生化反应工程：（是不是生化反应动力学？）这门课我记得刚及格，有点难，好象是讲的酶与底物反应的控制。控制其过程和速度，比数学都复杂，算起来很麻烦。还有生化反应器，是讲的什么罐罐瓶瓶的，就是要避免杂菌污染，怎么消毒杀菌，比如酵母菌发酵时，如果被其他一些细菌污染了，进入罐体繁殖，就会造成很大的经济损失，很考技术的。 说实在的，这些课本来很有用，你要是随便掌握了哪一门技术，你就很来钱，可惜我什么都学了，什么都没学精通，现在改行了，搞化学工艺了！

细胞免疫疗法是继手术、放疗、化疗的第四大治疗手段。它是通过提取病人血液中的单核细胞，应用生物技术在体外对这些细胞进行培养增殖，使其具有高效识别和杀灭肿瘤细胞的能力，将这些高活性的细胞回输到病人体内，不仅可以准确高效地杀灭肿瘤细胞，还能激发机体产生抗肿瘤的免疫反应，从而使免疫网络发挥正常作用以杀死肿瘤细胞，并启动免疫监视防止肿瘤复发。治疗流程 第一步：利用细胞分离机分离出肿瘤患者的单个核细胞； 第二步：将这些单个核细胞放入GMP标准的生物实验室，然后利用国际专利技术进行细胞培养、增殖； 第三步：使其达到科学杀瘤标准后再进行质量筛选； 第四步：将高质量的细胞回输给患者。这些细胞到达患者体内，能精确杀灭藏匿的癌细胞，并激活机体的整体免疫功能，达到长期抗癌的效果。 　　目前，北京解放军307医院已将细胞免疫治疗技术成功应用于临床，经患者反馈效果良好，为癌症患者的治疗提供了有力保障，而且此项技术也得到了国内外医学界的高度重视和认可

上册第一卷：细胞的培养及生物化学分析第1章 细胞的培养及分析第1节 哺乳动物细胞培养第2节 培养中细胞的生长及调控第3节 作为细胞和组织培养中底物的细胞外基质成分第4节 成纤维细胞的分离和培养第5节 上皮细胞的培养第6节 人毛细血管内皮细胞的分离第7节 淋巴细胞的分离与转化第8节 鼠胚干细胞的培养和体外分化第9节 原代神经细胞的分离和培养第10节 鸡胚胎成肌细胞的分离和培养第11节 新生大鼠心脏细胞的分离和培养第12节 成年大鼠心室肌肉细胞的分离和培养第13节 体细胞融合第14节 细胞同步化第15节 凋亡分析第16节 流式细胞计量术第17节 纤毛类原生动物腹纤毛类的培养和使用第18节 四膜虫的培养和操作第19节 衣藻的培养和遗传分析第20节 盘基网柄菌的培养和分析第21节 酿酒酵母的培养和转化第22节 非洲粟酒裂殖酵母的培养和转化第23节 海洋无脊椎动物胚胎的培养第2章 代谢标记和蛋白质修饰第24节 用32P-磷酸稳态标记HeLa细胞第25节 mRNA体外细胞核连缀转录分析第26节 蛋白质的代谢放射标记第27节 32P代谢标记细胞研究蛋白质的磷酸化第28节 利用透化细胞与细胞器研究蛋白质的磷酸化第29节 用外源底物进行蛋白质激酶分析??第30节 激酶的动力学：应用于双相底物酶的简单酶动力学第31节 磷酸酶的简单制备第32节 蛋白质的甲基化和异戊烯化作用第33节 蛋白质的糖基化第3章 亚细胞的分离第34节 亚细胞的分离第35节 用阳离子硅胶分离技术分离细胞膜第36节 桥粒的分离第37节 粗微体的亚细胞分离第38节 核糖体、核糖体亚基和多核糖体的纯化第39节 高尔基体的分离和分析第40节 从哺乳动物组织中分离过氧化物酶体(微体)第41节 从细胞、组织中分离线粒体第42节 完整叶绿体的分离第43节 从组织或悬浮培养物中制备细胞核第44节 细胞核基质：用于显微和生化分析的制备第45节 用于细胞核蛋白输入的细胞渗透方法第46节 利用瞬时种间异核体分析核质穿梭第47节 核纤层以及富含核纤层组分的制备和鉴定第48节 分离核仁第49节 用于生化和形态分析的染色体制备第50节 DNA的纯化和Southern印迹分析第51节 细胞和组织总RNA的纯化和Northern印迹分析第52节 非洲爪蟾生发泡内含物的涂布制备第53节 从肌肉和非肌肉细胞中纯化肌球蛋白和肌动蛋白第54节 微管、微管相关蛋白和微管依赖的运动蛋白的分离第55节 中间丝的分离和纯化第4章 蛋白质鉴定与分析第56节 蛋白质浓度的测定第57节 蛋白质单-双向凝胶电泳第58节 蛋白质双向凝胶电泳第59节 蛋白质染色检测第60节 蛋白质的放射自显影、荧光显影和磷光成像检测第61节 一维和二维肽图第62节 肽的RP-HPLC图谱和纯化第63节 蛋白质和肽的序列分析第5章 蛋白质表达和相互间作用第64节 T7表达系统的蛋白产生第65节 用GST基因融合载体表达和纯化蛋白质第66节 杆状病毒表达：利用杆状病毒穿梭载体在大肠杆菌中产生重组杆状病毒DNA第67节 哺乳动物表达载体第68节 哺乳动物细胞中进行基因的诱导表达第69节 双杂交系统/相互作用陷阱第6章 在细胞生物学中作为工具的抗体第70节 抗体纯化和标记概述第71节 表位标记第72节 免疫沉淀第73节 免疫印迹法和免疫印迹亲和纯化第74节 人类自身抗体及其靶抗原的特性下册第二卷：光学显微镜及细胞结构第7章 活细胞和细胞周期的观察第75节 用光学显微镜观察活细胞第76节 用荧光技术监测体内分子动力学第77节 噬动轨迹法分析组织培养中细胞的运动第78节 绿色荧光蛋白的异源表达第79节 荧光漂白技术第80节 活细胞中胞内自由钙的成像和检测第81节 光学镊子的构造第8章 大分子的制备和导入细第82节 抗体和DNA探针的荧光标记第83节 活体细胞的定量微注射第84节 爪蟾卵细胞和胚胎的注射第85节 啮齿类动物肌肉直接注射DNA第86节 哺乳动物细胞转染DNA第87节 利用阳离子型脂质体将DNA导入哺乳动物细胞第88节 电穿孔和电融合第89节 反义寡核苷酸的传递第90节 腺病毒表达载体的用途和使用方法第91节 复制缺陷型疱疹病毒扩增子载体及其在基因转移中的应用第92节 反转录病毒介导的基因转导第93节 使用反转录病毒载体进行谱系分析第9章 光学显微镜和表面荧光显微镜第94节 光学显微镜第95节 视频显微镜和图像增强第10章 共焦显微技术、多光子显微技术及去旋方法第96节 共焦显微技术及去旋技术第97节 多光子激发荧光显微技术第三卷：基因及其产物的亚细胞定位第11章 细胞器、蛋白质和基因表达的显像第98节 进行荧光显微镜观察的细胞和组织标本的制备第99节 组织中的β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶活性检测第100节 用酶检测法进行蛋白质的免疫定位第101节 细胞结构的非免疫荧光标记第102节 免疫荧光显微术简介第103节 微管、微管相关蛋白和中间纤维的免疫染色第104节 肌动蛋白的免疫荧光定位第105节 核蛋白的免疫荧光定位第106节 酿酒酵母的免疫荧光方法第107节 果蝇组织的免疫荧光方法第108节 线虫的免疫荧光方法第109节 DNA复制的分析：非同位素标记方法第110节 RNA合成的分析：非同位素标记方法第12章 原位杂交第111节 DNA荧光原位杂交第112节 染色体比较杂交第113节 光谱核型分析法分析染色体第114节 用3H标记探针对组织碎片标本DNA和核RNA进行原位杂交第115节 果蝇染色体DNA的整体荧光原位杂交第116节 RNA原位杂交第117节 脊椎动物胚胎和分离器官的RNA整体原位检测第118节 爪蛙胚胎RNA的整体原位检测第119节 原位PCR第13章 电子显微术第120节 利用透射电子显微术成像第121节 透射电子显微镜的样品制备方法第122节 用扫描电子显微术成像第123节 扫描电子显微镱的样品制备方法第124节 扫描式透射电子显微术第125节 DNA及DNA结合蛋白的电子显微术第126节 核酸和核蛋白复合物的快速印迹法第127节 电镜的细胞化学染色及酶检测??第128节 免疫电镜技术第129节 细胞和分子的快速冷冻第130节 冷冻置换第131节 超薄低温切片的免疫细胞化学第132节 冷冻断裂和冷冻断裂细胞化学附录1 细胞生物学常用储存液、缓冲液及培养基附录2 细胞生物学基本数据与资料附录3 显微镜技术：镜头、滤光片及发射/激发谱附录4 亚细胞组分的定位标志附录5 化学试剂安全注意事项附录6 供应厂商

随着医学科技的发展，近年来再生医学的蓬勃发展，人们对于如何提前购买健康保险越发关心，大家开始存干细胞给自己的生命作保障。于是，近些年，干细胞以及牙髓干细胞也成了热门搜索对象。 干细胞是人体内一种尚未分化的细胞，具有分化成多种组织细胞的能力。人成体干细胞中，牙髓干细胞的活性最强，是其他来源的三倍以上，属间充质干细胞的一种。 “牙髓干细胞来源丰富、采集方便、生物活性高，已成为干细胞研究与应用行业的新宠，尤其在口腔、神经、骨方面疾病的干预治疗上有着无可比拟的优势，同时还具备着间充质干细胞的价值和作用，未来发展前景巨大。”泓信牙齿银行董事长陈庆林先生如是说。牙髓干细胞采集方便、采集过程中没有痛苦。最重要的是牙髓干细胞，无论是成人还是孩子都可以进行采集。据研究发现，孩子的乳牙中的牙髓干细胞是成人牙髓干细胞繁殖速度的三倍、活性更高。每个换牙期间的孩子都有20次储存牙髓干细胞的机会。牙髓干细胞免疫原性低，不容易引起排异反应，一个家庭只需一个家庭成员进行牙髓干细胞储存，就可以用于整个家庭的口腔疾病及其他相关疾病的干预治疗。牙髓干细胞储存的发展早已得到大家认可和支持。那么牙髓干细胞如何运输及储存？ 1、专业的物流体系：专业设计科学的运输方案，恒温营养液运输技术保证运输途中样品质量。 2、严格的时间管理：严格遵守操作规程，保证牙齿在规定时间入库，实验室、冰箱储存罐有实时（24小时）的温湿度监控与报警系统。 3、先进的库存技术：先进的液氮冻存系统保存，避免交叉感染，2AXP全自动干细胞分离系统，保证样品在制备过程中无污染。 4、专业储存设备：实验室用品均采用国外进口，如AXP，MVE，Beckman，Sysmex，Abbott，Roche，BD等。 5、定期检查：每年最少做一次干细胞质量抽检确保活性与分化能力。泓信牙齿银行位于北京经济技术开发经海产业园内，建筑总面积2500平米，库容量50万人份，内设实验室、动物房、细胞制备室、阳性制备室、无菌室、病毒检测室、细胞分析室、程序降温室、PCR实验室等功能间，实验室内设备均为国际先进品牌的医用级仪器设备。为了方便大众的储存需求，泓信牙齿银行已经和近200家口腔医院合作建立牙齿采集点，为储户提供方便、专业、快捷的牙齿样本采集服务。泓信牙齿银行未来将会建立更多的牙髓干细胞库，以满足一日增长的储存需求。

首先让骨髓中的造血干细胞大量释放到血液中去，这个过程称为“动员”。然后，通过血细胞分离机分离获得大量造血干细胞用于移植，这种方法称为“外周血造血干细胞移植”。这样现在捐赠骨髓已不再抽取骨髓，而只是“献血”了。而且，由于技术的进步，现在运用造血干细胞“动员”技术，只需采集分离约50至200毫升外周血即可得到足够数量的造血干细胞。采集足够数量的造血干细胞后，血液可回输到捐献者体内。通过干细胞移植过程可以治疗多种疾病，而且效果明显。造血干细胞移植可以治疗多种血液病、实体瘤、免疫缺陷病和重度急性放射病，这已被很多人所熟悉。据介绍，造血干细胞移植目前广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病、遗传性疾病和某些实体瘤治疗，并获得了较好的疗效。1990年后这种治疗手段迅速发展，全世界1997年移植例数达到4.7万例以上，自1995年开始，自体造血干细胞移植例数超过异基因造血干细胞移植，占总数的60%以上。同时移植种类逐渐增多，提高了临床疗效！干细胞的移植不会对于贡献者造成什么身体的影响！干细胞移植成为现代医学中间不可或缺的技术手段！

植物体细胞杂交育种：1 酶解法（纤维素酶、果胶酶）制备原生质体；2 聚乙二醇或电激使两种原生质体融合、筛选、培养获得杂种细胞；3 经组织培养技术（脱分化再分化）获得杂种植株的幼苗。（如果要获得可育的杂种植株还要：秋水仙素处理幼苗获得异源多倍体植株。）4 选择符合生产需要的体细胞杂交植株。

Hep-2细胞就是喉癌上皮细胞呀

利用干细胞科技促进细胞健康和皮肤抗老化的产品，具有明显的特点，这些特点为其它产品所不具备。第一， 干细胞科技产品中的活性物质，可以激活和增强皮肤干细胞的活力，而干细胞有来自皮肤自身，因此更加符合皮肤自身代谢的规律。第二， 被激活和增强的干细胞，具有不断地繁衍特性，没有停滞，因此是连续不断和生生不息的。这种护肤方式与许多只针对皮肤某一方面的护肤产品相比，更具有全面性和连续性。第三， 含有干细胞科技的护肤产品，更关注皮肤健康的运动代谢过程，具有运动的特性，符合“生命在于运动”的最基本生命理念，这也与许多护肤产品只针对皮肤的静态问题不同。例如，有些针对皮肤老化的产品，只关注了某类细胞的代谢，而没有针对皮肤整体的细胞健康。第四， 含有干细胞科技的护肤产品，不具有特异性，因为被激活的干细胞可以转化为其它任何皮肤需要的细胞，达到全方位护肤的效果。因此，这与单一针对某种皮肤细胞的情形相比，更具有达到长期抗老化的护肤效果。还一有些护肤产品，只针对皮肤细胞中的某一种元素的修复，这样的方法就可能更具有特异性，也就是对某些人有效，而可能对其她人效果不好。第五， 含有干细胞科技的产品，效果来得更加快速，这是因为细胞的生长速度很快，在受到某种信号时就会立刻到达所需要的位置，因此使用者比较容易看到使用后的即时效果。其它产品，则可能不具备这样的即时效果，因为其它产品的活性成分可能更关注于修复某种细胞，而被修复的细胞则需要更长的时间参与和完成皮肤的代谢周期。第六， 干细胞科技护肤产品效果来得更直接，可以直接增强和增加某种皮肤细胞的数量和分布。 其实干细胞最大的功效不是美容，它可以解决人类因疾病所造成的困扰。它具有直接替代和修复作用，对于各类神经系统疾病有好的疗效。例如视神经萎缩视神经发育不全，脑瘫，脑炎后遗症，肌萎缩侧索硬化症等。城阳人民医院开展干细胞治疗吸引了大量国外患者就医。

1.干细胞研究，通过对干细胞分离培养和体外定向分化、扩增，为临床各类器官移植提供物质保障。2.作为毒性判断及安全性实验的工具，参与各种化学、物理、生物因素对机体的毒性实验及其产生不良影响的安全性调查。3.诊断孕早期胎儿性别和遗传疾病，用羊膜穿刺术获得的羊水中胎儿细胞进行培养，产前检测出多种代谢病与遗传病，较准确地指导优生优育。4.应用于辅助生育技术，包括人工授精、体外受精、胚胎移植、胚胎分割、卵浆置换、核移植、治疗性克隆、植入前诊断等衍生技术。5.新药物的研发，包括药品的筛选、疫苗的研制、基因工程药物的开发、杂交瘤技术中的应用、单克隆抗体制备、微囊化技术、生物活性药物的批量生产等。6.肿瘤学上的应用，如建立实验诱导模型、研究肿瘤发生发展机制、选择敏感的化疗药物、计算理想的药物剂量、研究免疫因子的杀伤效应等。7.在现代生物技术中应用，有基因分离跟提取、基因测序和表达、基因转移与重组、转基因动物反应器、癌基因研究等。

我国干细胞产业主要分为干细胞存储、干细胞产品和干细胞临床治疗。干细胞存储是最成熟也最重要的产业化项目。在全国范围内，已有金卫医疗、四川新生命、博雅、冠昊生物、开能环保等多家企业开展细胞存储业务。干细胞产业在中国市场潜力巨大，干细胞可应用于多种疾病的治疗，会有更多的企业加入到干细胞医疗行业中来，未来干细胞医疗行业竞争将尤为激烈。干细胞生物学的研究与应用是生命科学极其重要的组成部分，该领域的发展必将给生物医学领域带来深刻的变革。干细胞研究除了在细胞治疗、组织器官移植、基因治疗中具有重要意义外，还将在新基因发掘与基因功能分析、发育生物学模型、新药开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。干细胞产业链的发展涉及干细胞存储、干细胞药物开发、干细胞治疗，未来三个方向的发展空间均巨大。据前瞻产业研究院发布的《干细胞医疗行业发展前景预测与投资战略规划分析报告》预计到2022年，我国干细胞相关市场规模将接近2865亿元。干细胞医疗被各路资本追逐尽管政策走向尚不明朗，但这并不妨碍干细胞行业成为各路资本的“宠儿”。据统计，在美国纳斯达克挂牌的上市股票中，干细胞概念股的市值超过300亿美元;在A股市场上，中源协和一枝独秀，但中航投资、津滨发展等个股也间接涉及干细胞概念;此外，以四川新生命为代表的干细胞公司则在谋求IPO。全球干细胞产业近两年的潜在市场约800亿美元，到2020年前后可达4000亿美元。在数千亿美元蛋糕的诱惑下，业内公司早已开始攻城略地，在全国各地疯狂布点建库，抢占市场份额。目前，我国已形成比较完整的干细胞产业链，包括提供干细胞采集和存储的上游企业以及提供干细胞分离、扩增等技术服务的下游企业。在干细胞储存行业，竞争已然白热化，甚至有些存储库之间还曾上演“谍战”大戏。目前，干细胞储存竞争白热化，是资本追逐高毛利的必然结果。再生医学在全球范围内都是一个大的方向，并且毛利率基本在70%以上，吸引资本布局也比较正常，激烈竞争有利于行业洗牌。

流式细胞仪检测原理如下：流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标。经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300~400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。样品分选原理。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是:由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中;其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。充电电压一般选+150V，或-150V；;偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。

CD11B: 单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，NK细胞等；CD11C：树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞。流式细胞术是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术。其测量速度快，最快可在1秒钟内检测上万个细胞。可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量。具有明显的统计学意义，提供细胞群体的均值和分布情况。扩展资料：流式细胞技术的应用：1、其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；2、能准确地进行DNA倍体分析；3、借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；4、快速进行细胞分选和细胞收集；5、医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析（心血管疾病），流式细胞术与分子生物学研究；6、应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。参考资料：百度百科-流式细胞技术

　　原理：根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果。 　　1、将待测细胞染色后，制成单细胞悬液。 　　2、用一定压力将待测样品压人流动室，同时不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 　　3、流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光信号和荧光信号。

在2019年的三月份我正式开始做单细胞相关研究工作，有趣的同时也是朋友我们经常误会的是：你是不是用流式细胞术？而我在得知自己要做这单细胞（single cell ）的研究时，在Google搜关键词（single cell ），居然有不少是介绍流式细胞术的。流式细胞术应用到高通量测序领域就变成了微流控技术。可见，把生命科学的视界拉倒单细胞水平的比高通量测序更早的是流式细胞术。 那么在单细胞测序技术出现之前，人们在研究单细胞的时候都是怎么做的呢，都有哪些分析点呢？单细胞测序技术给单细胞研究带来了哪些新的视角？这一切的答案都要求我们对流式细胞术有一个基本的了解。 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 （1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统 激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光） 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。 流式细胞仪(FCM)是集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。 ①细胞生物学 ：细胞凋亡研究；定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。 [详细] ②肿瘤学 ：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。 [详细] ③免疫学 ：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。 [详细] ④血液学 ：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。 [详细] ⑤药物学 ：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。 [详细] 细胞凋亡研究 ：细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。 [详细] ** 细胞分选**：流式细胞仪能够分选某一亚群细胞,分选纯度＞95%。目前细胞分选主要用于研究，临床应用较少。利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞，只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记。 [详细] ** 细胞因子的检测**：随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。本文主要对胞内细胞因子流式细胞技术作介绍。 [详细] ** 血液学应用**：本文向您介绍流式细胞仪在血液研究领域的应用，包括DNA倍体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，NK和LAK细胞活性测定，造血干/祖细胞测定等。 [详细]

我简单说一下：x0dx0a1.首先，机器吸取细胞混悬液，射入由鞘液（一般都是磷酸盐缓冲液）。由于鞘液的流速大，所以细胞混悬液通过轴流的形式在中央，一般是单个细胞排队的形式。x0dx0ax0dx0a2.然后细胞通过检测窗口。有激光束照射。一般细胞都经过荧光染色，被激光照射后，会有不同波长的激发光产生。机器设有检测器来探测激发光的强弱x0dx0ax0dx0a3.根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果（比如抗原量，DNA量，等等）

【答案】：流式细胞仪由三部分构成：1.传感系统，包括样本递送系统、样品池、检测系统、电子传感器和激光源等。2.计算机系统。3.电路、光路和水路系统，有电源、光学传导和滤片、鞘液循环和回收部分等。

流式细胞仪是一种用于分析细胞的仪器。它通过将单个细胞通过一束激光束，并测量从细胞中反射或散射的光来检测细胞的物理和化学特性。通过调节激光的颜色和强度，可以检测细胞的大小、形状、表面标记和细胞内成分等特性。流式细胞仪还可以分离出不同类型的细胞，因为不同类型的细胞在大小、表面标记和细胞内成分等方面有所不同。

激光配置:配置488nm、638nm激光器,488nm、638nm激光功率都不低于50mW。流式细胞仪在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节　气体压力大小以获得稳定的液流速度。测量区光路调节　：这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而FCM中的校准具有双重功能：仪器的准直调整和定量标度。

按需选择。首先明确您要流式细胞仪的目的是什么，比如用来做哪些检测。然后根据这些需求看市场上有多少符合您需求的。您可以查看各项指标、操作界面和数据处理等方面是不是符合您的要求，和现有的条件是否配套。推荐您选择贝克曼库尔特公司的流式细胞仪，贝克曼库尔特自1953年推出世界上第一台流式细胞分析仪后，对技术革新一直执着追求，成为细胞研究领域的领跑者，正为科研人员提供各式各样的流式分析分选产品产品。自动操作技术和低含量目标细胞的分析分选技术完美结合，引导科研人员进入一个新的研究里程碑。目前贝克曼库尔特公司的流式细胞仪包括：临床型流式细胞仪、科研型流式细胞仪、细胞分选仪等；具体型号包括:CytoFLEX系列和MoFlo系列。

(1)光路与流路校正：主要目的在于确保激光光路与样品流处于正交状态，使仪器检测时的变异减少到最小，从而控制仪器的CV值，校正物为Flow-checkFluoropheres。(2)PMT校准：对光电倍增管的校正是流式细胞仪在使用前进行的一项重要质控指标，为保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态，采用质控品Flow-SetFluoropheres进行PMT校准。(3)绝对计数的校准：在进行免疫学检测时，为保证仪器在计数时的准确性，仪器应采用绝对计数校准品；Flowcount建立绝对计数标准。

流式细胞仪工作的原理是使悬浮在液体中分散的细胞或微粒一个个地依次通过样品池，细胞的流速可达9米/秒，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图、直方图和假三维结构图像进行分析。

流式细胞仪的工作原理：借鉴了荧光显微镜技术，将激发光改为激光，使具有更好的单色性；利用荧光染料与单克隆抗体技术，提高特异性与灵敏度；将固定的标本台改为流动的单细胞悬液，并用计算机进行信号的数据处理分析，能同时从一个细胞上获得多种参数资料。

贝克曼库尔特和BD，这两个是国内市场占有率最高的，还有德国的PARTEC和密理博的流式细胞仪。推荐贝克曼库尔特品牌，在流式细胞术领域，无论是常规的细胞检测，还是高复杂性的流式细胞术应用，贝克曼库尔特都致力于通过给客户提供需要的技术来获得最准确、可重复的结果从而帮助客户达到实验目标，如流式细胞分析试剂等产品及技术。对于要求低耗材高成果的诊断型实验室，贝克曼库尔特的解决方案简化了工作流程，同时避免了耗时且易出现高成本失误的手工操作步骤。同时，贝克曼库尔特的技术支持和售后服务网络遍及全球，营销达至130多个国家，为您提供及时可靠的技术支持和售后保障。目前贝克曼库尔特公司的流式细胞仪包括：临床型流式细胞仪、科研型流式细胞仪、细胞分选仪等；具体型号包括:CytoFLEX系列和MoFlo系列。

1、通道是：利用Miltenyi或其他公司的磁珠对目的细胞做预纯化或清洗可提高分拣效率。当然，仅仅利用一轮或多轮磁珠筛选而不用流式细胞仪，许多研究也能开展起来，但这不是本文讨论的重点。Amnis 公司已将流式细胞仪射流与荧光显微镜和数字成像整合在一起。其结果是一系列单个细胞的图像能够显示荧光团的分布，而非简单的平均荧光指数（MFI）。2、目前有33种不同的金属可被同时检测。该仪器被Time of Flight 称为"Cytof" [1] 。考虑购买该仪器的研究人员应该确保他们有这一深度的细胞分析需要。此外，细胞在等离子体中会被汽化，所以用于研究的细胞不能恢复。蒸汽分拣仪硬件设备简单，检测点与收集装置间距离较短，检测样品的激光数多。而流动细胞分拣系统通过比色皿提供层流和增强的样品聚焦。3、然而，流动细胞长度有限，而且激光光学装置需要足够空间避免不同通道间的串扰。对于敏感性来说，流动细胞系统明显占优，但蒸汽系统没有保持细胞清洁的问题，并且能提供额外的激光束。需要指出的是，有些激光束本身对细胞有毒害作用。

高通量流式细胞仪推荐德国赛多利斯。不错的

流式细胞技术 （Flow Cytometer, FCM）是细胞学的研究手段之一。其能在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。例如，采用双激光的方法，研究者可进行核型分析和鉴定，分离纯化某号染色体并构建染色体特异性DNA文库。流式细胞技术是当代最先进的细胞定量分析技术之一。 该技术依托 流式细胞仪 。其主要部件为光源、流动室、荧光检测部件、分选器。 （1）光源。通常是激光光源，目的是提供足够的荧光激光能量。 （2）流动室。其为流式细胞仪中最重要的部分。目的是使细胞流稳定流动，依次通过固定的检测区。其间一道加入还有鞘液（sheath fluid），使样品微粒之间相互分离，基于 鞘流原理 ，使微粒恒定处于同轴流动的中心位置。流动室的设计运用 液体聚焦原理 ，把激光激发点放在液流聚焦点上，该处是液流直径最小处，通常为10-20μm，做到了单个细胞进入检测区。 （3）荧光检测部件。染色细胞通过激光束时会发出荧光，检测系统将接收的这些荧光转换成与其量大小成正比的电压脉冲信号，该脉冲称为 峰值脉冲 ，分析系统根据这些来自不同方向的信号把不同的细胞群加以区分。散射光是围绕细胞360°散发的，所以检测装置里一般有90°散色光检测器（SSC，侧向散射光）和前向散射光检测器（FSC，前向角度散射光）。由于侧向散射光强度较弱，因此光电转换器件选用增益较大的 光电倍增管 。一般来说，6°以内的前向散射光为小角度散射光，可反映细胞体积的大小。大于6°的前向散射为大角度散射光，可提供细胞内的信息，特别是分叶核的信息，细胞质粒存在与否会明显改变前向大角度散射光的强度。由于前向散射光的强度较强，因此用光电二极管作 光电转换器 。 （4）分选器。细胞的分选是通过分离含有单细胞的滴液实现的。通过特异性识别与给液滴加电（2kV～6kV），施加静电场，来实现分离。 过程细节：被激光照射的染色细胞会产生散射光和激发荧光。这两种光信号同时被光电二极管和光电倍增管接收后转换成电脉冲信号。无论是散射光或荧光信号，检测的目的都是要分析不同的粒子。分析的方法有两种，一是测量粒子通过激光束的最大电压（与荧光强度成正比），二是测量脉冲的面积。再经过A/D 转换器将脉冲信号变换成二进制数字信号由计算机处理。光信号基本上反映了细胞体积的大小，荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度。这种属分析型流式细胞仪。分选型则是则是将液滴充电后送入上面描述的分选器中进行分离，目的是为了将所需的细胞做进一步的培养、观察和实验。 染色体倍性不同的细胞，染料吸附于染色体的量迥异，激发的荧光强度限定于一定区间。因此可以对染色体倍性实施鉴定。 总而言之，流式细胞仪能够对细胞的性质进行系列分析，是细胞学研究的重要工具。 [1] 何克健.流式细胞技术与流式细胞仪[J].医疗装备,2000(05):6-8. [2] 罗庆,高建有,李洁维,叶开玉,莫权辉,蒋桥生,查满荣,王发明,刘世彪.利用流式细胞仪对51份猕猴桃种质染色体倍性的鉴定[J/OL].生物学杂志:1-8[2022-06-02]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1081.Q.20220321.1515.00

流式细胞仪（Flow cytometry ）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。

我简单说一下：x0dx0a1.首先，机器吸取细胞混悬液，射入由鞘液（一般都是磷酸盐缓冲液）。由于鞘液的流速大，所以细胞混悬液通过轴流的形式在中央，一般是单个细胞排队的形式。x0dx0ax0dx0a2.然后细胞通过检测窗口。有激光束照射。一般细胞都经过荧光染色，被激光照射后，会有不同波长的激发光产生。机器设有检测器来探测激发光的强弱x0dx0ax0dx0a3.根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果（比如抗原量，DNA量，等等）

这个问题提的挺好的，好在现在在网络上了解过一些有关知识，这个给大家讲解一下吧~希望能够帮助到各位~基茵美细胞剥离技术原理深层激活：利用比头发丝还细的微针，将医用无菌注射水（无菌水）直接输送到皮下，通过REBORN基茵美水剥离水动力软性剥离作用，定点、定层、定量，精准、精细、精微在表皮、真皮、及皮下形成微创面（水液会自动避开毛细血管和神经）。皮肤因微创而启动自愈系统，在修复皮下微创面的过程中，会产生多种细胞修复因子，各类因子相互协作，促进不同层次的细胞再生（胶原蛋白细胞、网状纤维细胞、弹力纤维细胞）。新生的胶原纤维和粘性蛋白，也称作细胞与细胞之间的粘合剂，通过疗程（1~2次），不断增加皮下的厚度，从而达皱纹抚平、凹陷饱满、松弛收紧、脱垂提升的效果。细胞剥离技术可以解决五大问题：1、皱纹2、凹陷3、脱垂4、松弛5、疤痕

1、分离细胞器的方法为差速离心或密度梯度离心. 2、 线粒体：结构包括线粒体内膜、外膜（上分布有基粒）、线粒体基质.线粒体内膜和线粒体基质中含有氧. 叶绿体：结构包括叶绿体外被、类囊体和基质3部分组成,外被上分布着光合作用需要的色素,类囊体和基质上有光合作用需要的酶,含有少量的DNA和RNA. 内质网：功能是合成分泌蛋白质. 高尔基体：功能是将内质网合成的蛋白质进行加工、对比分类、与包装,然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外. 溶酶体：内部含有多种酸性水解酶,功能是溶解或消化,为细胞内的消化器官. 液泡：内有细胞液,其中含有糖类、无机盐、色素和蛋白质等物质. 核糖体：成分包括蛋白质和核糖体RNA（rRNA）,功能是：核糖体是合成蛋白质的地方. 中心体：分布在动物细胞和某些低等植物细胞,由两个互相垂直的中心粒及周围物质组成,与细胞的有丝分裂有关.

在诱导物作用下，相互靠近的细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核细胞。结果应该是有蛋白质，DNA，脂类物质。涂片的不同应该是细胞核的有无，染色后的分布。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。扩展资料：在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。参考资料来源：百度百科-细胞分离技术

离心技术、流式细胞术和细胞电泳。1、离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。2、流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。3、细胞电泳是指在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。

1、取得完全无血液残留的肺脏：实验前将大鼠全身血液放净，取得完全无血液残留的肺脏。2、消化肺组织：常用于细胞消化的酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分离上皮细胞的酶，现在一般用损伤性小的弹性蛋白酶来替代胰蛋白酶。但这种酶却有活性不稳定，有效作用时间短暂，容易自我降解等问题。Dobbs L G等认为弹性蛋白酶能更有选择性的消化分离上皮细胞[9]。胰蛋白酶消化没有选择性，会带来像内皮细胞和间质细胞等一些不能在后面的分离步骤中去除的杂质细胞，因此弹性蛋白酶更有助于提高上皮细胞的纯度和产量。与此相反，Cunningham A C等发现，与弹性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以获得更大产量的Ⅱ型上皮细胞[10]。胶原酶可以用来辅助消化细胞间质。用几种酶混合的方法比单一酶消化效果更好，但目前还没有文献定量描述最优化的酶消化方法。Finkelstein J N等发现可以通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺组织剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的实验中也证实了通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。3、分离纯化细胞：上皮细胞的分离纯化技术经过二三十年的发展日渐成熟，呈现多样化的特点。目前对细胞的分离纯化主要有以下几种方法：(1)密度梯度离心：密度梯度离心分离细胞的原理是不同细胞的沉降系数不同，在密度梯度离心中细胞所处的位置也相应不同。这是最早用于分离Ⅱ型上皮细胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不连续梯度离心，猪肺泡Ⅱ型细胞最终纯度可以达到70%-85%左右[11-12]。沉降系数与细胞的直径和天然密度有关。由于Ⅱ型细胞与其他细胞存在密度和大小的交叉(如巨噬细胞)，仅仅通过离心并不能有效去除杂细胞。Kikkawa(1974)让巨噬细胞吞噬一些重颗粒(如硫酸钡)，改变其密度，可以帮助区分巨噬细胞和上皮细胞。离心后的纯度达到94%,但产量明显减少[8]。上皮细胞的大小和密度变化范围较大，用密度梯度离心要丢掉和其他细胞重叠的细胞层，这必然会造成某些密度大的Ⅱ型细胞损失，产量大大降低。(2)滤膜分离：滤膜分离的原理是根据细胞的大小不同来进行分离。Ⅱ型上皮细胞约10μm，比巨噬细胞(约25μm)和Ⅰ型细胞(50μm-100μm)小，用150μm孔径的滤膜初滤除去大的组织碎片，30 μm ～40 μm孔径的滤膜除去全部Ⅱ型细胞和部分巨噬细胞[13]，采用15μm的滤膜精滤。用滤膜分离操作简单，它和其他分离方法联合使用可以提高纯度。(3)流式细胞技术：流式细胞技术分离的原理是根据不同细胞之间的荧光差异。根据不同种细胞的特征识别，用荧光物质标记筛选。上皮细胞内含有丰富的脂类物质，用亲脂性荧光素标记，可以得到纯度很高的细胞。Funkhouser J D等用抗Ⅱ型上皮细胞的单抗进行免疫荧光标记，再用流式细胞仪进行筛选，得到96%的Ⅱ型上皮细胞[14]。但荧光素对被标记细胞有害。Rochat T R等发现自然荧光和直角光散射可以区分巨噬细胞和单核细胞，这给不经荧光标记分离上皮细胞提供了可能[15]。流式技术分离细胞的产量很低，但纯度极高。这种技术经过完善在将来会更有吸引力。(4)免疫黏附：免疫黏附的原理是各种细胞的膜表面有不同的免疫活性物质。巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞表面都有IgG上的Fc片段的受体。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把细胞悬液置于板上，巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞因为含有Fc片段的受体而与IgG结合，吸附到板上，不黏附的Ⅱ型细胞被冲洗下来[16]。经过多年的摸索，这种方法近几年已开始应用，简便易行，可除去绝大多数的巨噬细胞，有效的提高上皮细胞的纯度。(5)贴壁选择：贴壁选择的原理是各种细胞完成贴壁的时间不同，这种特性用在培养时做筛选。根据最终目的，综合其中几种方法能达到较好的效果。例如先用滤膜过滤，再用IgG包被法。

外周血中单个核细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同。淋巴细胞分离液是一种密度介于1.075∽1.090之间而近似于等渗的溶液，用它做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

PVC段用于细胞分离的原理是基于非特异性吸附原理。PVC段的表面拥有自身的化学性质，表面上的有机化合物可吸附有生命特征的物质，如蛋白质、酶、荷尔蒙、受体等等。这种吸附力不同于离子交换和亲和层析等分离手段，但通过改变PVD段的表面性质，也可以通过这些分离手段来实现对于特定生物物质的分离。这一原理实现细胞分离的方法主要是通过制成PVC支架进行细胞培养，从而使细胞沿PVC段表面生长，形成细胞层，之后对其进行分离。

A．分离各种细胞器常用差速离心法，A正确； B．研究分泌蛋白的合成与分泌时，利用放射性同位素标记法氨基酸，观察与之相关细胞器，B正确； C、高度分化的动物细胞的细胞核仍然具有全能性，因此体细胞核移植技术来培养得到器官，C正确； D、模型的形式很多，真核细胞的三维结构模型属于物理模型，D错误． 故选：D．

有关系，粒子小

通过显微镜观察和细胞分离技术可以确定叶绿体沉淀中是否混有细胞核。对于叶绿体沉淀中是否混有细胞核，可以通过显微镜观察和细胞分离技术来进行确定。具体方法是：将叶绿体沉淀溶于适当的缓冲液，并使用显微镜观察样品中的细胞核和叶绿体形态和位置关系。如果样品中存在细胞核，可以通过染色或使用荧光探针来标记细胞核，使其在显微镜下清晰可见。另外，细胞分离技术也可以用于确定叶绿体沉淀中是否混有细胞核，该技术可以通过离心或分子分离等方法将细胞核与叶绿体分离，以确定样品中的成分组成。

流式细胞术是利用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。其特点是:第一，只要样本制备成单个细胞或生物颗粒悬液均可以分析。第二，测量速度快，每秒中可以测量数千个乃至数万个细胞。第三，同时测量每个细胞的多参数特征。第四，在进行细胞特征分析的同时可以把指定特征的细胞分离出来，以便对特定细胞做进一步培养、克隆化、观察或进行某些实验，这就是分选技术。

目前这还是一个盲点，卫生部没有明确规定，《细胞移植治疗技术管理规范》：（二）细胞制备实验室人员1.细胞制备实验室至少有1名副高级及以上专业技术职务任职资格的总体负责人，从事细胞制备的操作人员有细胞生物学背景和研究经历，有不少于50例实验性细胞制备经验，经过细胞制备相关专业系统培训并考核合格。2.从事质量检验的工作人员应具有相关专业大学（专）本科及以上学历，经专业技术培训并考试合格。

你好：白细胞分离就是把血液中的白细胞分离出来，血液成分包括红细胞、白细胞、血小板。白细胞是其中之一。在医院做大概一次需要3000-5000元，不知你为什么要做。石家庄平安医院开展这项技术。

胡说呢吧。发生质壁分离的条件就是成熟的植物或细胞 质壁分离有3条件。1是成熟植物细胞。因为有原生质体。2是活细胞。只有活细胞才可以发生质壁分离。3是要有浓度差

细菌一般进行无性繁殖。它是通过二分裂方式增加细胞的数 目。在一般条件下，由二分裂形成的子细胞大小相等。据研究，细菌分裂可分4步：第一步是核复制，细胞延长；第二步是形成横隔膜；第三步是形成明显的细胞壁；第四步是细胞分裂，子细胞分离。球菌可沿一个平面或几个平面分裂，所 以可以出现多种排列形态；杆菌一般沿横轴进行分裂。 无性繁殖外，已证明细菌存在着有性繁殖，不过频率很低。

首先来讲外周血：人体血液采出加入防凝剂离心后分为上层血浆层和下层血细胞层。大体来讲外周血细胞包括白细胞、红细胞、血小板三类。白细胞是粒细胞、单核细胞、淋巴细胞的总称。粒细胞用瑞氏染料染色可分辨出三种颗粒白细胞即中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。 粒细胞、单核细胞是抗细菌感染的，淋巴细胞是分泌抗体，主要抵抗病毒感染的。红细胞含血红蛋白是运输氧气的血小板是管止血、凝血的。

分离细胞器的方法如下：一、分离细胞器的方法为差速离心或密度梯度离心。二、线粒体：结构包括线粒体内膜、外膜（上分布有基粒）、线粒体基质.线粒体内膜和线粒体基质中含有氧。叶绿体：结构包括叶绿体外被、类囊体和基质3部分组成,外被上分布着光合作用需要的色素,类囊体和基质上有光合作用需要的酶,含有少量的DNA和RNA。内质网：功能是合成分泌蛋白质。高尔基体：功能是将内质网合成的蛋白质进行加工、对比分类、与包装,然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。溶酶体：内部含有多种酸性水解酶,功能是溶解或消化,为细胞内的消化器官。液泡：内有细胞液,其中含有糖类、无机盐、色素和蛋白质等物质。核糖体：成分包括蛋白质和核糖体RNA（rRNA）,功能是：核糖体是合成蛋白质的地方。中心体：分布在动物细胞和某些低等植物细胞,由两个互相垂直的中心粒及周围物质组成,与细胞的有丝分裂有关。细胞器是细胞质中具有特定形态结构和功能的微器官，也称为拟器官或亚结构。其中质体与液泡在光镜下即可分辨，其他细胞器一般需借助电子显微镜方可观察。细胞器（organelle）一般认为是散布在细胞质内具有一定形态和功能的微结构或微器官。但对于“细胞器”这一名词的范围，还存在着某些不同意见。细胞中的细胞器主要有：线粒体、内质网、中心体、叶绿体，高尔基体、核糖体等。它们组成了细胞的基本结构，使细胞能正常的工作，运转。

免疫细胞（immunecell）主要是指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛泛，主要是T、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化（activation），分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞，共四种类型。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单该吞噬细胞系统的细胞。免疫细胞分离技术x0dx0a1、淋巴细胞的分离x0dx0a取肝素抗凝血1m1加Hanks液1m1稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min水平离心20min，管内分为4层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks液洗两次，每次2000r／min离心10min，最后用RPMIl640培养液将细胞配成2×106／m1的细胞悬液备用。x0dx0a2、T细胞及B细胞的分离x0dx0a将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMIl640培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B细胞，并用少量的RPMIl640培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。x0dx0ax0dx0a3、CD4细胞及CD8细胞的分离x0dx0a（1）CD4细胞的分离：将一定量的T细胞悬液通过一根SephDdexC—10柱，然后用少量的RPMll640培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4细胞。x0dx0a（2）CD8细胞分离：用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。然后将已标记有抗CD8单克隆抗体的T细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1加入上述的平皿内，4℃放置2小时，用PBS轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1PBS吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMIl640培基中备用。CD4细胞亦可用此法分离。x0dx0a4、单核巨噬细胞的分离x0dx0a单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃C02温箱内温育1小时，然后用RPMI1640培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。

在诱导物作用下，相互靠近的细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核细胞。结果应该是有蛋白质，DNA，脂类物质。涂片的不同应该是细胞核的有无，染色后的分布。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。扩展资料：在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。参考资料来源：百度百科-细胞分离技术

在基础医学研究中涉及越来越多的如某一疾病状态组织中，多种基因或遗传变化，区别发展中的组织细胞群以及疾病状态组织细胞，将有助于了解疾病发生的分子机制。因此，在下一代的分子分析方法将需要进入微观世界及自动化程度高。对 某一特殊个体的切片进行遗传指纹图谱鉴定，将有助于诊断及指导治疗。 然而，即使是最经典、可靠的检测方法，也不可避免混杂多种状态细胞中DNA、RNA或蛋白质分子的干扰，因此，需要发展组织显微分离技术，以解决从混合细胞型组织中分离某单一群的细胞。最开始，研究者从冰冻的组织块中粗略地挖取富含某一类细胞类群的组织，或用激光破坏手工墨水标记的不需要部分，或手工工具针或刀机械地去除或刮取相应的组织。上述几种方法在操作过程中繁琐，不够精确，效率不能适应常规的临床分子诊断方法。为了解决上述问题，美国国立健康研究院肿瘤研究所病理研究室与生物医学设备组合作研发激光俘获显微切割技术，发展为Acturus 的PixCell II系统。在操作这套系统时，首先在组织切片上覆盖一层透明的膜，在显微镜下观察该组织切片，选择某一特殊细胞后，开启脉冲式红外激光束，使膜融化变得粘性很强(该膜的成份为 Ethylene Vinyl Acetate Polymer)，等到冷却后将该位置的细胞牢固地粘附在上面从而分离细胞。 该种方法较以往方法改进之处：首先，它简单，不需要移动任何切片部位，一步即可完成从组织中分离特殊细胞，这些在膜上的细胞依然保持其原有的形态，使用无菌、一次性的膜可最大限度地避免可能的污染。这对于后续进行PCR检测是尤为重要的。其次，使膜活化所需的激光能量很小(<50mW)，与常规显微配合是充足的，完全能够满足临床病理组织细胞显微分离的需要。再者，LCM技术分离细胞速度较以往方法有很大提高，例如，从肾组织切片中分离一个肾小球(Glomerulus)所需时间小于10秒，一小时内即可轻松地分离上百个肾小球。手工分离方法远远不能达到该速度。由于组织切片固定，操作者可以反过来确定所分离的细胞是正确的靶细胞。而手工机械显微分离可能会引起周围其它细胞一块松动，污染靶细胞。 一个新技术及伴随新技术诞生的仪器会对科学研究产生重要的影响。在NATURE MEDICINE u2022 VOLUME 5 u2022 NUMBER 1:117-112 u2022 JANUARY 1999 的研究论文中，作者将 LCM、 RNA扩增和基因芯片三种技术整合到分子神经生物学研究中.研究涉及一个神经组织：背根神经节(DRG).DRG位于脊髓两边,很小,大鼠的DRG只有1/3大米粒大.脑内和DRG有类似功能的组织是三叉神经节.DRG中有两类神经元:大神经元和小神经元. 国内科学家曾利用DD-PCR技术研究正常大鼠和接受伤害性刺激的大鼠的DRG的基因表达差异，筛选参与伤害性刺激相关基因,包括新基因和已知基因的新功能.目前认为DRG中与伤害性刺激有关的神经元是小神经元.研究者可能的苦恼是不能分别取出DRG中的大小神经元来进行研究。另一个苦恼是由于DRG很小, 所以为了提取足够使用的RNA,不得不杀大量大鼠,有时一次就杀上百只。而且从大鼠取DRG也不是一件很容易的解剖技术.还有一个苦恼就是DD-PCR要接触同位素,即在进行DD-PCR反应时加入同位素标记的dATP或dCTP，这样得到的PCR产物就标记上了同位素.产物进行PAGE,电泳后干胶仪器干胶.干胶曝X光片, 曝光后的X光片和胶对好位置,从胶中回收感兴趣的DNA片段。鉴于这些苦恼，研究者们可能希望:要是能把大小神经元分开该多好,要是能把RNA扩增该多好,要是做DD-PCR时能不用同位素该多好.如今看来,这些难题似乎可以迎刃而解了。即利用LCM技术取出感兴趣的细胞,利用Epicentre Ampliscribe T7 Transcription Kit把有限量组织中提出的有限量RNA扩增;进行DD-PCR反应时用红外荧光染料标记(的引物)技术取代同位素标记技术,经Odyssey Infrared Imaging System检测和定位,从而可以从胶中回收希望回收的片段。这个回收方案同样可以用于AFLP研究者回收他们感兴趣的DNA片段。 当前,在生命科学领域,和基因组学及蛋白组学一样热门的是神经科学,而且神经科学在国内外都正在成为最具挑战性和最具诱惑力的科学。因此,在国内外从事神经科学研究的科技工作者越来越多,国家对神经科学的资助也越来越大。神经系统由外周神经系统和中枢神经系统组成,中枢神经系统包括脑和脊髓.神经系统主要由两类细胞组成：神经元和胶质细胞.在脑内,不同解剖区域行使不同功能,这里所讲的解剖区域是指核团。核团在显微镜下才可以辨别,是相对集中在一个区域的可能行使一定功能的神经元和胶质细胞的集合体。把某个核团从脑内取出来是不太现实的。脑内核团数以百计,如果要想研究基因在脑内核团的表达水平, 在以前只能用原位杂交技术。如果要想研究蛋白质的表达水平或磷酸化等状态，只能用免疫组织化学技术。而这两个技术虽然能精确定位基因或蛋白质在脑内核团的表达情况,缺点是通量小。因此，如果研究者主要是为了研究很多种基因在特定核团的神经元或胶质细胞的表达情况,新的解决方案之一就是组合LCM技术、RNA扩增技术和基因芯片技术。即利用LCM技术将特定核团的神经元或胶质细胞取出,提取总RNA或mRNA,RNA反转录为cDNA并进行扩增.最后将cDNA标记为探针,和基因芯片杂交。如果研究的基因种类数不多,那么也可以只提取LCM获得的细胞的总RNA,利用定量RT-PCR技术来进行基因表达分析。

汽车暖风系统不热可以分为两方面的原因，一是暖风的控制机构工作不良导致汽车暖风不热的，一是发动机冷却系统造成汽车暖风不热的。在维修时，我们要先判定是哪一方面原因引起汽车暖风不热的，再进行相应的维修。判别造成汽车暖风不热原因的方法很简单，看一下暖风小水箱的两个进水管温度，如果两根管都够热，说明是风量控制机构问题，反之，如果两根水管都凉，或者是一根热一根凉，说明是冷却系统问题。

嗯，是的。流式可以分选计数或分选收集不同大小、不同表面抗原、不同标记等的各类细胞

网上流行的细胞剥离美容术基本原理：利用水动力软性剥离细胞 达到抗衰去皱纹的效果，从原理上看安全问题不大，生理盐水作为剥离的介质，目前医美市场上比较混乱，需要仔细甄别，选择一家品牌服务。你指的的是医美技术细胞剥离吗？　原理1：深层激活，利用头发丝一样zhi细的微针将盐水直接输送到dao皮下，通过水液的软性剥离作用，在皮下形成创面，水液会自动避开毛细血管和神经，神经在修复过程当中会不断产生新的胶原纤维和黏性蛋白，也称作细胞与细胞之间的粘合剂，通过疗程3次，不断增加皮下的厚度，从而达到饱满，去皱紧致提升的效果。原理2：多层修复，定点激活，在皮肤的各个层面把皮肤所需要的营养成分（专配产品）透皮导入，打开皮肤的营养通道，给皮肤补充营养。

利用纳米SiO2微粒实现细胞分离的新技术的基本原理和过程是：先制备SiO2纳米微粒，尺寸大小控制在15～20nm。结构一般为非晶态，再将其表面包覆单分子层。包覆层的选择主要依据所要分离的细胞种类而定，一般选择与所要分离细胞有亲和作用的物质作为附着层。这种SiO2纳米粒子包覆后所形成复合体的尺寸约为30nm；第二步是制取含有多种细胞的聚乙烯吡咯烷酮胶体溶液，适当控制胶体溶液浓度；第三步是将纳米SiO2包覆粒子均匀分散到含有多种细胞的聚乙烯吡咯烷酮胶体溶液中，再通过离心技术，利用密度梯度原理，使所需要的细胞很快分离出来。

目前常用于分离CD34+细胞的方法主要是免疫吸附法。这指的应该是用流式细胞仪，对冻存的骨髓或脐带血（脐带血几率大一些，含量0.1%-1%）进行检测的一种方法或手段，如分离出一批符合标准的CD34造血干细胞，或以此为设定此类细胞的标准。在生理学上，CD分子有许多用途，通常用作细胞的重要受体或配体。不仅可作为表面标志用于细胞的鉴定和分离。

可通过特定序列的探针检测样品中是否含有与之同源的核酸序列。基因克隆的筛选,酶切图谱制作,基因组中特定基因序列的定量和定性检测,基因突变分析,疾病的诊断、微生物病原体检测。根据杂交对象的不同可分为：DNA与DNA；RNA与DNA另外：Westernbl。

超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物。光学和电子显微镜可以对细胞进行定性和定位研究，如免疫荧光技术，冰冻蚀刻技术，同位素示踪技术。

影响细胞分离的因素：能量（atp），细胞膜上的糖蛋白；影响计数的因素：认为操作误差、仪器误差。根据查询百度题库题目：影响细胞分离的因素有哪些?答案：能量（atp），细胞膜上的糖蛋白。细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中由于操作人员采血不顺利，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（filed error）。细胞分离技术包括离心技术、流式细胞术和细胞电泳。离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。

1、主要采用细水涨破法使细胞破裂（一般用动物细胞植被细胞膜，如果用植物细胞的话首先必须使用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，过程繁琐，一般不用植物细胞）；2、从细胞破裂后得到的细胞匀浆中利用差速离心法，分离其中的物质，因为其密度较小（细胞膜主要成分是磷脂），因此分布在上清液中。对complicatedqq 这位同仁再追问中的回答，我纠正一下：1、植物细胞壁的主要成分才是纤维素和果胶，而非植物细胞膜（最大错误）；2、不同的细胞膜的相同点和不同点有哪些？（1）不同的细胞膜的相同点：它们都是以磷脂、蛋白质为主要组成物质，此外还含有少量糖类；（2）不同的细胞膜的不同点：主要体现在膜上的蛋白质种类和数量上存在差异，其中尤其以载体蛋白的种类和数量差异较大。希望提问者“逝痕xyx| ”能够看到后纠正一下，在这里只是出于一种相互学习探讨的目的。

脾细胞分离纯化是一种重要的细胞分离技术，其分离出的细胞在体外培养后可以用于多种实验和研究。在进行脾细胞的分离纯化时，先加不完全培养基可以去除多余的非细胞成分，如浮游细胞和死亡细胞等。这样可以减少对细胞的不利影响和混杂污染，保证细胞的健康性和纯度。然后再加完全培养基，提供全部的必需营养物，促进细胞的增殖和存活。因此，先加不完全培养基再加完全培养基可以有效地提高脾细胞的分离纯化效果。

分离用的是差速离心啊，定性用的是细胞内各组分的鉴别方法，常见的就是染色或者是一些产生颜色的反应

1、取得完全无血液残留的肺脏：实验前将大鼠全身血液放净，取得完全无血液残留的肺脏。2、消化肺组织：常用于细胞消化的酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分离上皮细胞的酶，现在一般用损伤性小的弹性蛋白酶来替代胰蛋白酶。但这种酶却有活性不稳定，有效作用时间短暂，容易自我降解等问题。Dobbs L G等认为弹性蛋白酶能更有选择性的消化分离上皮细胞[9]。胰蛋白酶消化没有选择性，会带来像内皮细胞和间质细胞等一些不能在后面的分离步骤中去除的杂质细胞，因此弹性蛋白酶更有助于提高上皮细胞的纯度和产量。与此相反，Cunningham A C等发现，与弹性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以获得更大产量的Ⅱ型上皮细胞[10]。胶原酶可以用来辅助消化细胞间质。用几种酶混合的方法比单一酶消化效果更好，但目前还没有文献定量描述最优化的酶消化方法。Finkelstein J N等发现可以通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺组织剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的实验中也证实了通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。3、分离纯化细胞：上皮细胞的分离纯化技术经过二三十年的发展日渐成熟，呈现多样化的特点。目前对细胞的分离纯化主要有以下几种方法：(1)密度梯度离心：密度梯度离心分离细胞的原理是不同细胞的沉降系数不同，在密度梯度离心中细胞所处的位置也相应不同。这是最早用于分离Ⅱ型上皮细胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不连续梯度离心，猪肺泡Ⅱ型细胞最终纯度可以达到70%-85%左右[11-12]。沉降系数与细胞的直径和天然密度有关。由于Ⅱ型细胞与其他细胞存在密度和大小的交叉(如巨噬细胞)，仅仅通过离心并不能有效去除杂细胞。Kikkawa(1974)让巨噬细胞吞噬一些重颗粒(如硫酸钡)，改变其密度，可以帮助区分巨噬细胞和上皮细胞。离心后的纯度达到94%,但产量明显减少[8]。上皮细胞的大小和密度变化范围较大，用密度梯度离心要丢掉和其他细胞重叠的细胞层，这必然会造成某些密度大的Ⅱ型细胞损失，产量大大降低。(2)滤膜分离：滤膜分离的原理是根据细胞的大小不同来进行分离。Ⅱ型上皮细胞约10μm，比巨噬细胞(约25μm)和Ⅰ型细胞(50μm-100μm)小，用150μm孔径的滤膜初滤除去大的组织碎片，30 μm ～40 μm孔径的滤膜除去全部Ⅱ型细胞和部分巨噬细胞[13]，采用15μm的滤膜精滤。用滤膜分离操作简单，它和其他分离方法联合使用可以提高纯度。(3)流式细胞技术：流式细胞技术分离的原理是根据不同细胞之间的荧光差异。根据不同种细胞的特征识别，用荧光物质标记筛选。上皮细胞内含有丰富的脂类物质，用亲脂性荧光素标记，可以得到纯度很高的细胞。Funkhouser J D等用抗Ⅱ型上皮细胞的单抗进行免疫荧光标记，再用流式细胞仪进行筛选，得到96%的Ⅱ型上皮细胞[14]。但荧光素对被标记细胞有害。Rochat T R等发现自然荧光和直角光散射可以区分巨噬细胞和单核细胞，这给不经荧光标记分离上皮细胞提供了可能[15]。流式技术分离细胞的产量很低，但纯度极高。这种技术经过完善在将来会更有吸引力。(4)免疫黏附：免疫黏附的原理是各种细胞的膜表面有不同的免疫活性物质。巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞表面都有IgG上的Fc片段的受体。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把细胞悬液置于板上，巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞因为含有Fc片段的受体而与IgG结合，吸附到板上，不黏附的Ⅱ型细胞被冲洗下来[16]。经过多年的摸索，这种方法近几年已开始应用，简便易行，可除去绝大多数的巨噬细胞，有效的提高上皮细胞的纯度。(5)贴壁选择：贴壁选择的原理是各种细胞完成贴壁的时间不同，这种特性用在培养时做筛选。根据最终目的，综合其中几种方法能达到较好的效果。例如先用滤膜过滤，再用IgG包被法

现在可以用显微注射的方法！当然也可以用离心法

生物细胞分离是在高渗透液中细胞壁和细胞膜发生分离。原理是细胞膜的流动性和透过性。细胞分离技术包括离心技术、流式细胞术和细胞电泳。离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。细胞电泳是指在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动

免疫细胞（immunecell）主要是指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛泛，主要是T、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化（activation），分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞，共四种类型。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单该吞噬细胞系统的细胞。免疫细胞分离技术x0dx0a1、淋巴细胞的分离x0dx0a取肝素抗凝血1m1加Hanks液1m1稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min水平离心20min，管内分为4层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks液洗两次，每次2000r／min离心10min，最后用RPMIl640培养液将细胞配成2×106／m1的细胞悬液备用。x0dx0a2、T细胞及B细胞的分离x0dx0a将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMIl640培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B细胞，并用少量的RPMIl640培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。x0dx0ax0dx0a3、CD4细胞及CD8细胞的分离x0dx0a（1）CD4细胞的分离：将一定量的T细胞悬液通过一根SephDdexC—10柱，然后用少量的RPMll640培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4细胞。x0dx0a（2）CD8细胞分离：用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。然后将已标记有抗CD8单克隆抗体的T细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1加入上述的平皿内，4℃放置2小时，用PBS轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1PBS吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMIl640培基中备用。CD4细胞亦可用此法分离。x0dx0a4、单核巨噬细胞的分离x0dx0a单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃C02温箱内温育1小时，然后用RPMI1640培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。

生物细胞分离是在高渗透液中细胞壁和细胞膜发生分离。原理是细胞膜的流动性和透过性。细胞分离技术包括离心技术、流式细胞术和细胞电泳。离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。细胞电泳是指在一定PH 值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动

细胞器的分离,一般采用差速离心法,此法是利用细胞各组分质量大小不同,在离心管不同区域沉降的原理,分离出所需组分,分离得到的细胞器,其纯度可采用电子显微镜法、免疫学法或测定标志酶活力法进行鉴定。 分离细胞器常用的方法是什么 分离细胞器主要会用到差速离心，主要是利用细胞的不同，比如细胞的大小和质量和组分不同。 在离心管不一样的区域的原理，然后我们再分离出所需要的组分，最后得到的细胞器。 一般破碎了细胞之后，我们要先分离各组分，防止干扰，这对—些高难度或者高纯度的生物大分子是有一定的必要的。 我们可以通过电子显微镜或者是定标志酶活力又或者是免疫学法来进行纯度的鉴定。

免疫细胞（immunecell）主要是指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛泛，主要是T、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化（activation），分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞，共四种类型。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单该吞噬细胞系统的细胞。免疫细胞分离技术x0dx0a1、淋巴细胞的分离x0dx0a取肝素抗凝血1m1加Hanks液1m1稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min水平离心20min，管内分为4层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks液洗两次，每次2000r／min离心10min，最后用RPMIl640培养液将细胞配成2×106／m1的细胞悬液备用。x0dx0a2、T细胞及B细胞的分离x0dx0a将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMIl640培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B细胞，并用少量的RPMIl640培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。x0dx0ax0dx0a3、CD4细胞及CD8细胞的分离x0dx0a（1）CD4细胞的分离：将一定量的T细胞悬液通过一根SephDdexC—10柱，然后用少量的RPMll640培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4细胞。x0dx0a（2）CD8细胞分离：用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。然后将已标记有抗CD8单克隆抗体的T细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1加入上述的平皿内，4℃放置2小时，用PBS轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1PBS吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMIl640培基中备用。CD4细胞亦可用此法分离。x0dx0a4、单核巨噬细胞的分离x0dx0a单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃C02温箱内温育1小时，然后用RPMI1640培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。

其实这个检查的临床意义不大。不能说明什么问题，也不能指导治疗。CD3 是总T淋巴细胞的标志。T的百分率正常。CD4是Th（也就是辅助细胞的标志），问题是这个细胞还分两群，Th1和Th2，功能是不同的，要看免疫力，这个分类都没做，太不像话CD8 也不是抑制性T细胞，而是细胞毒T细胞，功能是杀伤病毒感染和其他异常的细胞，你孩子反复呼吸道感染，这个增高也很符合。B细胞室负责产生抗体的，你B细胞数目正常，但是没有测Ig的水平。如果抗体的水平比较低，这也可能是为啥会反复感染的原因。病毒在感染细胞前，健康的人都会有抗体将病毒中和清除，抗体低的话，那就容易感染了。还有呼吸道的反复感染，不一定是免疫力低导致的，空气污染也是罪魁祸首之一。这个和免疫力就无关了。

Ts细胞 抑制性T细胞 能抑制辅助性T细胞 (TH)活性,从而间接抑制B细胞的分化和TC杀伤功能,对体液免疫和细胞免疫起负向调节作用的T细胞亚群.如其功能失常,则免疫反应过强,引起自身免疫性疾病.在TS调节途径中存在诱导TS细胞 (Tsi)、转导TS细胞 (Tst) 和效应TS细胞(Tse) 3种细胞亚群,在抗原刺激后连锁活化,最终由Tse产生T细胞抑制因子作用于TH细胞. Tc细胞 cytotoxic T cell,Tc 亦称杀伤T细胞(killer T cell,TK),具有杀伤靶细胞活性的T细胞亚群.其表面标志为:Lyl-、2+、3+和Ia-,并为单抗系列T8、CD8和Leu2所识别,但不能为CD11所识别,与杀伤细胞(K cell)不同,Tc杀伤靶细胞不依赖于抗体,并能产生淋巴毒素(LT),通过LT介导杀伤靶细胞. Th细胞 辅助T细胞 在免疫调节中起促进作用的T细胞亚群.为单抗系列T4,CD4和Leu所识别,故亦称T4细胞,其功能为产生多种细胞因子,传递抗原信息,促进T、B细胞分化增殖,辅助B细胞产生抗体和诱导迟发性变态反应.根据其表面单抗受体、所产生的细胞因子和功能不同又可分为TH1和TH2,TH1在诱导迟发性变态反应中起主要作用,故亦称炎性T细胞 (inflammatory T cell T1). 亮点：Tr(Treg)调节性T细胞,通过直接接触,分泌抑制性细胞因子抑制效应T细胞活化增值效应

单细胞转录组测序 （Single Cell RNA Sequencing）是在单细胞水平对mRNA进行全转录组扩增及高通量测序的一种高端技术，研究单个细胞内的整体基因表达情况，以及基因的结构变异。主要用于细胞分子机制中细胞异质性研究、以及样本量少而无法进行常规高通量测序等。单细胞RNA-Seq提供成千上万个单个细胞的转录谱，这种水平的通量分析使研究人员能够在单细胞水平上了解哪些基因表达，多少数量以及异质样品中成千上万个细胞之间的差异。 想了解更多单细胞相关知识，点击查看： 1.单细胞转录组(Single cell RNA)概述 2.单细胞转录组亚群分析 3.单细胞转录组高级分析介绍 4.单细胞RNA系列专题之一：单细胞RNA测序中质控之重要细节 （上篇） 5.单细胞RNA系列专题之一：单细胞RNA测序中质控之重要细节 （下篇） 10xGenomics单细胞转录平台作为近来最常见的一种单细胞产品，其工作流程概述如下： GEMs（Gel Bead in emulsion），每一个GEMs均是 Gel Bead + Master Mix + Cell Lysate 的混合，其中 Master Mix 是即用型的常规PCR预混合溶液； Cell Lysate 表示细胞裂解液。如下图所示： 具体的实验流程如图所示，最终含有细胞的油滴占所有油滴比例大约5%，更好地保证了含有细胞的油滴里面只有1个细胞，一个包含细胞的油滴内就是一个单细胞scRNA-Seq。每个GEMs内包含独特的10X barcode用于区分不同的单细胞；每个GEMs内相同的10X barcode与不同的UMI组成用于区分不同转录本的Gel Bead poly(dT) Primers。 V2和V3版本的实验过程和基本原理相同，用于生成3"基因表达文库的 Gel Bead poly(dT) Primers 差异主要是UMI随机序列长度从 10bp 增加到了 12bp。 UMI多样性增加，相应的Gel Beads上Primers的数量也从73多万种增加到350多万种，在相同测序深度下V3能发现更多的基因；GEMs（油包水）数量未有改变，还是能鉴定500-10,000个细胞。下图可见V2和V3结构区别： 下图显示了具体的R1,R2和I1三种数据文件的主要内容，其中V3试剂的R1比V2试剂的R1要长 2bp ，详情见下方： 单细胞其他相关内容，点击查看： 1.不可错过的单细胞转录组研究新维度：空间转录组 2.空间转录组应用领域与研究思路 3.认识膀胱细胞——单细胞水平比较Human和Mouse的不同 4.单细胞亚群鉴定知多少 第一篇 5.单细胞亚群鉴定知多少 第二篇 6.单细胞亚群鉴定知多少 第三篇 7.学10X，你不得懂点FCM？

对植物的叶片具有非常重要的功能，通过光合作用和呼吸作用保证植物的代谢，通过蒸腾作用提供根系从外界吸收水和矿质营养的动力。受实验技术和Markers的限制，目前植物单细胞的研究更多集中于根，但随着原生质体制备难题的突破，植物叶片的单细胞研究逐渐增多，目前已有多篇植物单细胞文章发表于Developmental Cell、Molecular Plant、Plant Biotechnology Journal等高水平期刊上。 一、构建细胞图谱 植物叶是由不同形态且具有特定功能的细胞构成，不同细胞类型的基因表达模式存在差异。通过单细胞转录组测序构建植物叶的细胞图谱，使我们能深入了解植物叶中细胞类型的组成，获取每个细胞独特的转录本信息，从而鉴别细胞身份和功能。 1.案例一 2020年6月在Molecular Plant 期刊上发表的文章[1]中，研究人员以5日龄拟南芥幼苗子叶为材料进行单细胞转录组测序，共获得12844个细胞，通过细胞聚类及注释分析，将这些细胞划分为11个不同的细胞簇，包括与气孔发育相对应的细胞簇，如分生组织母细胞（MMCs）、保卫母细胞（GMCs）、扁平细胞（PC）、叶肉细胞（MPCs）和保卫细胞（GCs）等。 2.案例二 2021年6月在Plant Biotechnology Journal期刊上发表的文章[2]中，研究人员以7日龄花生幼苗叶片为材料进行单细胞转录组测序，共获得6815个细胞，构建了第一张花生单细胞基因表达图谱，通过细胞聚类及注释分析，将这些细胞划分为8个主要的细胞簇，包括栅栏叶肉细胞、海绵叶肉细胞、表皮细胞、原基细胞、韧皮部细胞、管束鞘细胞、薄壁细胞和气孔保卫细胞。通过构建细胞图谱，说明植物叶片是由高度异质的细胞组成的。 二、细胞亚群细分 在植物器官发育研究中，粗略的细胞分群往往不能完整描绘细胞发育轨迹，亚细胞群会存在上下游的发育分化关系，可以更细致的解析细胞发育轨迹，因此细胞亚群的细分就显得尤为重要。 1.案例一 2021年5月在Plant Cell上发表的文章[3]中，研究人员以6周龄拟南芥成熟叶片为材料进行了单细胞转录组测序，以揭示叶韧皮部细胞的不同特性。对维管束细胞Cluster 4、Cluster10、Cluster18进行亚群细分，并根据富集基因确定亚群的细胞类型，分别为C4.1.1（XP1）、C4.1.2（XP2）、C4.2（BS2）C4.3（BS1）、C10.1.1（PCPP）、C10.1.2（PCXP）、C10.2（PP1）C18.1（PP2）和C18.2（XP3），细胞亚群的细分确定了维管束细胞XP-PCXP-PCPP-PP的细胞群，反映了维管束细胞潜在的发育轨迹。 2.案例二 2021年1月在The Plant Cell上发表的文章[4]中，研究人员以玉米叶片为材料进行了单细胞转录组测序，解析了玉米的束鞘分化，发现了束鞘细胞进一步被分为两个亚群，即远轴束鞘细胞（abBS）和近轴束鞘细胞（adBS），这两个亚群是背腹分化的，其中远轴的束鞘细胞分化为参与蔗糖韧皮部负荷的细胞。通过对细胞亚群的分析，可以为细胞发育轨迹提供有力的证据。 三、Marker基因鉴定 在多细胞生物中，细胞类型以及细胞特异性功能的产生在很大程度上源于细胞中不同基因的差异表达。在单细胞转录组数据分析过程中，主要通过差异分析鉴定出某个细胞亚群的特征性基因，再结合Marker基因鉴定细胞类型。因此，新Marker基因的挖掘有助于深入阐明细胞异质性, 并且对于识别植物发育过程中未知细胞类型的细胞群体是非常关键的。 例如，2020年6月在Molecular Plant期刊上发表的文章[1]中，研究人员以5日龄拟南芥幼苗子叶为材料进行了单细胞转录组测序，利用几个已知的参与调控气孔谱系细胞发育的Marker基因对鉴定的细胞类型进行验证，发现 FAMA 、 TMM 、 HIC 和 SCRM 等在特定细胞类型中特异性表达，而其他标记基因在特定的细胞类型中没有特异性表达，从而鉴定了气孔谱系细胞发育过程中不同细胞群的新Marker，为进一步探究气孔谱系细胞发育的潜在调控因子，分析不同细胞类群中的基因表达谱奠定了基础。 四、发育轨迹研究 细胞分群本质上是将植物的发育定性为非连续的过程，但机体或器官的发育过程应该是连续的过程并且交错复杂的，通过分析植物叶片细胞随时间的分化路径，可以了解其动态发育过程。拟时序分析是指根据细胞之间表达模式的相似性对单细胞沿着轨迹进行排序，以此推断出发育过程中细胞的分化轨迹或细胞亚型的演化过程。 例如，2021年6月在Plant Biotechnology Journal期刊上发表的文章[2]中，研究人员以花生叶片为材料进行了单细胞转录组测序，不仅揭示了花生叶片细胞的异质性，还重建了花生叶片的发育轨迹，在主茎附近发现了4个小分枝，不同的亚群细胞显示出细胞分化的主要途径的时间异质性。此外，拟时序分析揭示了10个关键的标记基因，可以用来将所有单个细胞划分为叶细胞发育和分化的9个状态。 五、基因调控网络分析 细胞转录状态的差异导致细胞异质性，转录因子主导的基因调控网络维持并稳定转录状态的特异性。对不同细胞类型的转录因子调控网络进行分析，可以了解植物叶片发育的调控机制。 2021年6月在Plant Biotechnology Journal期刊上发表的文章[2]中，通过对转录因子在不同细胞群中的表达水平的分析，发现与其他群相比，91个被鉴定的转录因子在海绵组织中有下调的趋势，这意味着转录抑制转录因子的表达可能决定花生植株叶片海绵细胞的分化状态。对拟南芥转录因子进行了同源互作网络分析，结果表明乙烯（ETH）和茉莉酸（JA）途径具有关键的特征，构成了以ERF4/6、WRKY40、MYC2和多个JAZ蛋白为核心的蛋白互作网络。 六、胁迫响应机制研究 非生物胁迫是植物生长发育过程中的重要环境影响因素。通过单细胞转录组测序，探索不同处理条件下的细胞类型的组成变化，从而解析生物的胁迫反应机制，有利于我们了解单细胞水平上植物细胞和发育生物学的机理。 在2020年1月发表的文章[5]中，研究了高盐和低氮两种非生物胁迫条件下水稻的响应机制，首先研究了不同环境胁迫下细胞类型特异性差异基因表达，发现在低氮处理中表现差异表达的基因在高盐处理中也表现出差异表达，这意味着植物可能对不同的非生物胁迫做出反应，并采用调控网络的共同重组策略。之后研究了不同环境胁迫下细胞大小的改变，发现在高盐度条件下生长的植物显示出原基和表皮细胞的整体尺寸减小，这可能与渗透压增加导致细胞壁膨胀压降低有关，这些结果揭示了非生物胁迫下细胞类型特异性的大小变化。最后利用发育轨迹分析研究了不同环境胁迫下细胞群体成分的变化，发现在高盐和低氮条件下，叶肉细胞的发育被推迟，推迟叶肉细胞的发育不仅有利于水稻幼苗减少光合作用的能量消耗，而且有利于提高水稻幼苗对恶劣环境的抗性。 七、植物叶片单细胞研究思路总结 目前植物叶片的单细胞研究已经在拟南芥、花生和水稻中开展，一般会重点关注叶肉细胞和气孔相关细胞，去揭示叶肉细胞及气孔谱系细胞的发育调控机制。研究思路为通过细胞聚类分群、感兴趣的细胞亚群细分、鉴定marker基因、研究发育轨迹和基因调控网络等分析，构建物种叶片的单细胞图谱，解析细胞发育及其调控机制，同时对非生物胁迫环境下植物叶的响应机制进行探究。相信随着实验和分析层面一些技术难题的突破，在未来的研究中，对其他细胞类型实现更加深入的解析，开展更多非模式物种的研究，实现更多marker基因的挖掘和验证，开展单细胞多组学分析从多维角度解析植物细胞发育机制等会成为热点方向。植物单细胞领域从兴起开始就展现出蓬勃发展的强劲动力，未来一定会掀起植物转录组研究的重大革命！

https://www.nature.com/articles/s41421-020-0168-9 影响因子： 6.255PMID： 32377375 期刊年卷：Cell Discov 2020;6 生物二区 细胞生物学 Q2 60/190 DOI： 10.1038/s41421-020-0168-9 使用单细胞测序，作者分析了血液中免疫种群的复杂性，并分析了10位患者的70,858个细胞。作者确定了ERS患者的高炎症反应，这可以解释为什么某些患者出院后生病，并建议应重新评估当前的出院标准。此外，作者鉴定了髓样，NK，T和B细胞的独特标志，并指出了TCR和BCR表位的变化。作者的发现有助于阐明抗病毒免疫机制，并揭示了使用疫苗和中和抗体开发免疫疗法的有希望的机会。 用于了解SARS-COV-2清除后的免疫细胞组成（来自PBMC） 回顾性了解免疫细胞反应并告知可能的疫苗设计/药物靶标 用于识别康复患者的免疫特征 作者将患者区分为早期康复阶段（n = 5，ERS，自从对COVID19呈阴性以来<7天）和晚期康复阶段（n = 5，LRS，> 14天），并将这些患者与健康对照组进行比较（n = 5） PBMC的单细胞RNA测序 scBCR-seq和scTCR-seq评估扩增的B细胞和T细胞克隆的克隆性 计算方法没有得到很好的描述，因此某些数字并未直接突出显示得出的结论 使用的某些工具不是标准的工作流程工具，因此需要在方法中进行进一步说明 优点： 缺点： 由SARS-CoV-2引起的COVID-19最近影响了1,200,000多人，造成60,000多人丧生。关键的免疫细胞亚群发生变化，其在COVID-19过程中的状态仍不清楚。作者试图通过单细胞RNA测序技术全面表征COVID-19恢复期外周血单个核细胞的转录变化。发现在COVID-19的早期恢复期（ERS）中，患者的T细胞显著减少，而单核细胞增加。具有较高炎症基因表达的经典CD14 ++单核细胞比例增加，并且ERS中CD14 ++ IL1β +单核细胞的丰度更高。CD4 + T细胞和CD8 + T细胞显著减少，并在ERS中表达高水平的炎症基因。在B细胞中，浆细胞显著增加，而幼稚B细胞减少。确定了几个新的B细胞受体（BCR）的变化，例如IGHV3-23和IGHV3-7，并确认了以前用于病毒疫苗开发的同种型（IGHV3-15，IGHV3-30和IGKV3-11）。最强的配对频率IGHV3-23-IGHJ4表示与SARS-CoV-2特异性相关的单克隆状态，尚未有报道。此外，综合分析预测，IL-1β和M-CSF可能是炎性风暴的新型候选靶基因，而TNFSF13，IL-18，IL-2和IL-4可能对COVID-19患者的康复有益。作者的研究提供了ERS中炎症性免疫信号的第一个证据，提示出院后COVID-19患者仍然易受伤害。新的BCR信号转导的鉴定可能导致开发用于治疗COVID-19的疫苗和抗体。 为了绘制COVID-19患者的免疫微环境图，作者鉴定了血液中的镜像变化，并查明了与疾病严重程度和恢复相关的细胞特异性变化。然后，作者从 早期恢复阶段（ERS）或晚期恢复阶段（LRS）（70,858 PBMC）的总共10例COVID-19患者中整合了scRNA-seq，单细胞配对BCR和单细胞配对TCR分析。作者还从五个健康供体作为对照收集了scRNA-seq数据（57,238个细胞）（图 1a ** 和补充图 S1a–c ）。**该数据集通过了严格的高质量过滤。使用10x Genomics将scRNA-seq样品的单细胞悬液转化为条形码的scRNA-seq库。Cell Ranger软件（版本3.1.0）用于测序数据的初始处理。 图1：COVID-19患者单免疫细胞谱分析的研究设计和分析 作者使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE），根据典型谱系标记物和在每个簇中上调的其他基因的表达，分析了三种免疫细胞谱系，髓样，NK，T和B细胞的分布（图 1b，c ）。对于标记基因，位于t-SNE中的每个细胞中的表达值如图 1d 所示。接下来，作者分别将每个谱系的细胞聚类，并鉴定出总共20个免疫细胞簇。 从COVID-19感染中恢复过来的患者的免疫细胞区包括所有主要的免疫谱系。作者分析了通过质量控制的128,096个scRNA-seq概况，包括来自五个HC，五个ERS和五个LRS患者的36,442个髓样细胞，64,247个NK和T细胞以及10,177个B细胞。补充图 S2a中 显示了每个主题的粗略聚类分析景观，图 2a中 显示了每个组的合并图像。作者发现，与HCs相比，包括ERS和LRS在内的COVID-19患者的髓样细胞比例更高，但NK和T细胞比例更低（图 2b，c ）。有趣的是，与ERS患者相比，LRS患者的B细胞，NK和T细胞更多，但髓样细胞却更少（图 2b，c ）。因此，这些发现表明COVID-19患者外周血中淋巴细胞计数降低，而髓样细胞计数升高。 为了进一步了解COVID-19恢复早期和晚期患者中单核细胞的变化，作者进行了基因表达分析，并使用统一流形近似和投影（UMAP）将髓样细胞亚群化为六个转录不同的亚群。 经典CD14 ++单核细胞（M1）， 非经典CD16 ++（FCGR3A）CD14- / +单核细胞（M2）， 中间CD14 ++CD16 +单核细胞（M3）， CD1C + cDC2（M4）， CLEC9A + cDC1（M5 ）和 pDC（CLEC4C +CD123 +）（M6） 存在于六个不同的簇中（图 3a，b ）。作者发现在HCs和COVID-19患者之间，单核细胞亚群的区室显著不同（图 3c ）。在髓样细胞中，ERS患者中经典CD14 ++单核细胞（M1）的比例高于HCs，而LRS患者中则几乎是正常的（图 3c ）。 图3：恢复期COVID-19患者血液中的髓样细胞亚群及其状态 作者发现，COVID-19患者的CD14 ++ IL1β +单核细胞和IFN激活的单核细胞比HCs富集（图 3d–f ）。与CD14 ++炎性单核细胞（M1）相关的基因具有高表达水平的炎性基因，例如 IL1β，JUN，FOS，JUNB 和 KLF6 。趋化因子 CCL4，CXCR4 ; 以及干扰素刺激的基因 IFRD1，IRF1 和 IFI6 。相比之下，与HCs中的CD14 ++单核细胞（M1）相关的抗炎基因在COVID-19患者中被下调（图 3d，e ）。值得注意的是，UMAP中的IL1β表达值同时具有对比，表明ERS组中IL1β上调，而LRS患者中IL1β下降（图 3f ）。与HCs相比，ERS组的DC集群中也证实了这一点（补充图 S3a，b ）。接下来，作者获取了COVID-19患者与HCs中每个髓样细胞scRNA-seq亚型的平均炎症基因（补充图 S3c ）。这些结果表明，细胞因子的激活驱动单核细胞群的扩展（尤其是CD14 ++感染COVID-19的患者中的炎性单核细胞）。为了探索M1簇中转录变化的生物学意义，作者用DEG进行了GO分析（图 3g ）。作者观察到与细胞因子信号传导和炎症激活相关的途径的富集，这是由 IFITM3 和 IFI6 和 IL1β，JUN，FOS，JUNB 和 KLF6 的上调驱动的（图 3g ）。 T细胞和NK细胞在呼吸道感染中发挥病毒清除关键作用 15 ， 16 。作者的聚类分析基于规范标记（图 4b 和补充图 S4a ）将T和NK淋巴细胞分为10个子集（图 4a ）。 NK细胞高表达NCAM1，KLRF1，KLRC1和KLRD1 ; （1）NK细胞细分为CD56 + CD16 - NK细胞（NK1），它们表达高水平的 CD56 和低水平的 CD16 ； （2）C56 - CD16 + NK细胞（NK2），它们表达高水平的 CD16 和低水平的 CD56 。 CD4 + T细胞表达CD3E和CD4 ; 然后将这些细胞细分为四个簇： （1）幼稚的CD4 + T细胞（T1），它们表达高水平的 CCR7，LEF1 和 TCF7 ； （2）中央记忆CD4 + T细胞（T2，CD4 Tcm），表达高水平的 CCR7 ，但与单纯CD4 + T细胞相比， AQP3 和 CD69 更高； （3）效应器记忆CD4 + T细胞（T3，CD4 Tem），表达高水平的 CCR6，CXCR6，CCL5 和 PRDM1 ; （4）调节性T细胞（T4，Treg），表达 FOXP3 。 CD8 + T细胞表达CD8A和CD8B，并细分为三个簇： （1）幼稚CD8 + T细胞（T5），其表达高水平的 CCR7，LEF1 和 TCF7 ，与幼稚CD4 + T细胞相似； （2）效应记忆CD8 + T细胞（T6，CD8 Tm），表达高水平的 GZMK ； 和细胞毒性CD8 +淋巴细胞（CD8 +CTL）（T7），它们表达高水平的 GZMB，GNLY 和 PRF1 。 （3）增殖性T细胞（T8，T prol）是TYMS + MKI67 +细胞。 图4：恢复的COVID-19患者血液中T和NK细胞反应的特征。 全尺寸图片 在HCs和COVID-19患者之间，T细胞和NK细胞亚群的组成存在显著差异（图 4c ）。在COVID-19患者中，CD8 + T细胞的绝对数量，特别是效应记忆CD8 + T细胞亚组和NK细胞的绝对数量减少，而ERS中NK细胞的相对比例高于HCs。CD4 + T细胞的比例是稳定的，但HCs和COVID-19患者之间CD4 + T细胞亚群的组成存在显著差异。在CD4 + T细胞中，中央记忆CD4 + T细胞的比例明显更高，而幼稚CD4 + T细胞，Tregs和效应记忆CD4的比例+ u2009T细胞低于HCs，尤其是ERS组。值得注意的是，与CD4 + T细胞相关的基因具有较高的炎症相关基因表达水平，并且在COVID-19患者中明显上调（图 4d ）。CD4 + T细胞在COVID-19的ERS患者中具有高表达水平的炎症基因，包括 FOS，JUN，KLF6 和 S100A8 （图 4e ）。相反，COVID-19患者的CD4 + T细胞相关的抗炎基因相对于HCs被下调（图 4d，e ）。这表明CD4 +T细胞是病毒感染的主要参与者。CD4 + T细胞中DEG的比较揭示了参与细胞因子途径和炎症激活的基因的丰富，包括 IFITM3 和 IFI6 以及 IL1B，JUN，FOS，JUNB 和 KLF6 （图 4f ）。需要进一步的研究阐明与COVID-19发病机制有关的IFN途径。 TCR-seq分析显示，ERS组的T细胞扩增明显低于HC组（图 4g ）。此外，幼稚或中枢记忆T细胞几乎没有克隆扩增，而效应记忆T细胞，末端效应CD8 + T细胞（CTL）和增殖T细胞则显示出更高的扩增水平（图 4h ）。另外，ERS组中扩增最高（最大）的克隆是TRAV8-6-TRAJ45：TRAV7-8-TRBJ2-1（补充图 S5d ）。COVID-19患者中CD8 + T细胞比例的降低可能暗示了CD8 + T细胞在病毒清除中的作用（图 4c ）。而且，CD8 +与HCs中的克隆相比，具有扩展克隆的CTL还表现出过度活化的炎症和抗病毒活性（图 4i 和补充图 S4b ）。总之，这些发现表明COVID-19患者外周血中CD8 + T细胞的克隆扩增有助于控制该病毒。作者还通过Seurat FindAllMarkers 分析进行了DEG分析，并在T prol细胞中发现了相似的结果（补充图 S4c ）。接下来，作者将COVID-19患者中每个NK和T细胞亚群scRNA-seq子集的炎症基因与正常RNA-seq数据的 平均值进行比较 （补充图 S4d ）。 通过使用扩散图预测B细胞的基因表达数据，作者使用 scRNA-seq鉴定了四个B细胞簇： 表达 CD19，CD20（MS4A1），IGHD，IGHM，IL4R和 TCL1A的 幼稚B细胞（B1）；** 表达 CD27，CD38和 IGHG的 记忆B细胞（B2）; ** 仅表达 CD19和 CD20（MS4A1）的 未成熟B细胞（B3 ） ；** 以及表达高水平 XBP1和 MZB1的 浆细胞（B4）（图 5a，b 和补充图 S5a ）**。 图5：在COVID-19患者中单细胞B细胞的表征。 全尺寸图片 与HCs相比，COVID-19患者的浆细胞百分比显著增加，而COVID-19患者的幼稚B细胞百分比显著降低（图 5c ）。记忆B细胞和浆细胞（MPB）可能在病毒感染的控制和过继免疫的发展中起重要作用，因为它们协同工作并诱导特异性抗体。此外，与 HCs相比 ，包括 S100A8，IGLL5，SSR3，IGHA1，XBP1 和 MZB1 在内的B细胞活化相关基因主要在ERS组的MPB中表达（图 5d ）。作者还在浆细胞，抗体分泌细胞（ASC）中发现了类似的结果（补充图 S5b，c ），提示ASC在病毒控制中起关键作用。接下来，作者将COVID-19患者每个B细胞亚群的炎症基因平均值与正常RNA-seq数据进行比较（图 5e ）。ERS和HCs之间的基因差异表明COVID-19患者的B细胞反应和抗体分泌增强。GO分析表明， MPHA中IGHA1，XBP1，MZB1，JUN，POLR2L 和 ZFP36 的表达过高，这表明COVID-19患者的B细胞增殖和病毒转录增强（图 5f ）。单细胞BCR-seq分析表明，与HC中相比，COVID-19患者中IgA同种型的表达过高（图 5g） ）。这与血清IgA水平升高相对应，这在其他冠状病毒感染中也很明显。此外，在ERS患者中，（IgA + IgG + IgE）与（IgD + IgM）的比例显著增加，并且随着恢复时间而呈下降趋势（图 5h ）。 使用sc-BCR-seq评估患者血液中克隆扩增的状态，作者发现IL4R +幼稚B细胞显示出很少的克隆扩增，而CD27 + CD38 +记忆B细胞显示出在各种B细胞亚群中最高的扩增水平（图 6a ）。在个体水平上，作者发现与HCs相比，COVID-19患者的克隆明显扩增，这支持了B细胞在SARS-CoV-2感染下经历了独特的VDJ克隆重排的假设。作者还发现，与LRS患者相比，ERS中始终保持较高的B细胞克隆性（图 6b）。 ）。此外，对每个受试者的最大扩增（最大）克隆的定量显示，ERS组中最大克隆的比率高于HCs中的最大克隆的比率（图 6c ）。为了了解扩增的克隆B细胞的功能状态，作者在克隆的记忆B细胞和其他B细胞之间进行了DEG分析。作者的结果表明B细胞基因的表达增加，包括 CD27，SSR4，IGHG1，MZB1 和 XBP1 ，这进一步支持了扩增的克隆B细胞的优异效应子功能（图 6d ）。而且，随着时间的流逝，扩增的B细胞的差异基因会明显消退，而在LRS患者中会降低（图 6d ）。 图6：在COVID-19患者中观察到BCR克隆扩增，VDJ基因使用偏倚。 全尺寸图片 为了研究COVID-19患者中BCR的独特变化和偏好基因，作者比较了COVID-19患者和HCs中VDJ基因的使用情况。作者确定了IGHV3家族的过度表达，COVID-19患者相比尤其是在IGHV3-7，IGHV3-15，IGHV3-21，IGHV3-23和IGHV3-30 （图 6E ）。优选的IGKV是IGKV1-17，IGKV2-28和IGKV3-15，而优选的IGLV是IGLV1-44，IGLV2-8和IGLV3-27（图 6e ）。此外，ERS患者的前两个配对频率是IGHV3-23-IGHJ4和IGHV3-7-IGHJ6（图 6f） ）。这些细胞显示出IGH亚基与分别由IGLV1-44-IGLJ3和IGKV1-17-IGKJ1编码的IGK / L亚基配对，这表明与SARS-CoV-2特异性相关的扩展状态。单独地，ERS-4和ERS-5具有最大的克隆，分别参考IGHV3-23-IGHJ4（补充图 S5e ）和IGHV3-7-IGHJ6（补充图 S5f ）。 总之，以IgA和IgM同种型为主的COVID-19克隆性的增加，以及IGHV基因的偏斜使用，提示SARS-CoV-2对发病机理的贡献。值得注意的是，COVID-19患者中主要IGV基因（尤其是IGHV3-23和IGHV3-7）的偏好为合理设计SARS-CoV-2疫苗提供了框架。 用于预测可能有助于ERS和LRS中T细胞，B细胞，单核细胞和树突状细胞（DC）不同功能状态的细胞间相互作用（图 7a，b ）。在ERS COVID-19患者中，作者发现了与单核细胞激活，增殖和炎症信号有关的适应性信号（图 7a，b ）。 T细胞表达的基因编码TNFSF8，LTA，IFNG，IL17A，CCR5和LTB的配体与TNFRSF8，TNFRSF1A / TNFRSF14，IFNGR1，IL-17RA，CCR1和LTBR的配体相关，这些基因在单核细胞上表达，可能有助于促炎状态。其他T细胞-单核细胞相互作用涉及CSF2和CSF1的表达。 T细胞可能通过CSF2和CSF1的表达激活单核细胞，而CSF2和CSF1与CSFR（CSFR2 / 1）结合并促成炎性风暴。CD14 +单核细胞簇仅表达IL1β，据预测它将与T细胞表达的IL1RAP结合。T细胞与单核细胞的相互作用可能会增强免疫应答，并且仅针对COVID-19患者（图 7a，b ）。 此外，作者发现单核细胞高表达脊髓灰质炎病毒受体，在脊髓灰质炎病毒复制和诱导NF-κB信号传导的第一步中，它作为脊髓灰质炎病毒的细胞受体。从B细胞单核细胞和B细胞T细胞的相互作用中，作者发现B细胞可以分泌大量IL-6，LTA和LTB，并与在单核细胞中表达的IL-6R，LTAR和LTBR结合，大量的IL-6应用于T细胞，以促进IFN-γ，IL-1β和其他炎症细胞因子和趋化因子的分泌。因此，在ERS COVID-19患者的发病高峰中形成了高表达IL-6及其后代的炎性单核细胞的级联特征（图 7c ）。这些活化的免疫细胞可能大量进入肺和其他器官的循环，并发挥免疫破坏作用。 在LRS COVID-19患者中，预计DC配体会与参与细胞增殖和抗体产生的B和T细胞受体相互作用。作者发现LRS患者的外周血含有多种抗体。作者发现，在作者对DC-B细胞相互作用的分析中，IL18-IL18RAP，TNFSF13-TNFRSF13B，TNFSF13-TNFRSF17，TNFSF13B-TNFRSF17，TNFSF13B-TNFRSF13B和TNFSF13B-TNFRSF13C高度表达（图 7d ）。因此，作者推测DC产生IL-18，TNFSF13和TNFSF13B来促进B细胞的增殖，然后在ERS的血液中分泌许多抗体。 从DC-T和T细胞-B细胞的相互作用中，作者发现DC不仅产生IL-18，而且产生IL-7以促进T细胞的增殖。此外，T细胞产生IL-2以促进B细胞的增殖和抗体产生（图 7d ）。因此，细胞间的相互作用有助于作者理解为什么COVID-19患者表现出高单核细胞率和低淋巴细胞率，以及为何康复患者外周血中淋巴细胞的比例逐渐增加。 图7：在COVID-19患者中免疫细胞之间的细胞间通讯。 全尺寸图片 使用单细胞测序，作者分析了血液中免疫种群的复杂性，并分析了10位患者的70,858个细胞。作者确定了ERS患者的高炎症反应，这可以解释为什么某些患者出院后生病，并建议应重新评估当前的出院标准。此外，作者鉴定了髓样，NK，T和B细胞的独特标志，并指出了TCR和BCR表位的变化。作者的发现有助于阐明抗病毒免疫机制，并揭示了使用疫苗和中和抗体开发免疫疗法的有希望的机会。 https://www.immunology.ox.ac.uk/covid-19/literature-digest-old/immune-cell-profiling-of-covid-19-patients-in-the-recovery-stage-by-single-cell-sequencing

非负矩阵分解(Non-negative Matrix Factorization, NMF)的思想可以描述为，对于任意给定的一个非负矩阵V，NMF算法能够找到一个非负矩阵W和一个非负矩阵H，使得非负矩阵V≈W*H 成立 ，从而将一个非负的矩阵分解为左右两个非负矩阵的乘积。 利用矩阵分解来解决实际问题的分析方法很多，如PCA(主成分分析)、ICA(独立成分分析)、SVD(奇异值分解)等。在这些方法中，原始的大矩阵V被近似分解为低秩的V=WH形式。这些方法的共同特点是，即使输入的初始矩阵元素是全正的，传统的秩削减算法也不能保证原始数据的非负性，因子W和H中的元素往往含有负值元素。从数学和计算的观点看，分解结果中存在负值没有问题，但负值元素在实际问题中往往是没有意义的。NMF约束了原始矩阵V和分解矩阵W、H的非负性，这就意味着只能通过特征的相加来实现原始矩阵V的还原，最终导致的结果是：非负性会引发稀疏，非负性会使计算过程进入部分分解。 u26a0ufe0f这里使用pbmc数据集来演示NMF做细胞分群，实际上NMF在对 亚群细分 和 提取feature 时候效果更好，对亚群定义很有帮助。 重新进行标准化和归一化，注意设置 do.center = F ，这样就不会得到负值 在做nmf时， rank 值可以选的比目的预期的细胞类型/细胞状态稍微大一些的值，因为分解的一些因子会富集到线粒体核糖体等噪音，而不会落到一个具体的细胞亚群上面。（这里选了12） u26a0ufe0f：被非负矩阵分解出来的一些marker基因，一般是很有生物学意义的基因（因此适合于亚群细分和提取feature，便于细胞亚群注释） 注意： 如果细胞数比较多，在做NMF时，用于做非负矩阵分解的高变基因选择6000个左右比较合适，没有必要用全部基因来做。（这里演示用了2000个） NMF运行很慢，在做大群定义结果和Seurat相差也不大，因此做大群定义的时候没有必要使用NMF。

血淋巴细胞问题 尊敬的医生 您好 我我在今年的体检中发现我的淋巴细胞亚群分析有异常 以前没有检查过请您看一下 CD4 24.5% 下降 CD8 48% 上升 CD4/CD8 0.51 CD3 75%正常 NK 正常 B细胞7% 下限 CIK 7.7% 高出 血常规基本正常 血红蛋白偏高 超出上限12 总淋巴细胞计数2550 免疫学检查排除CMV EB HIV HBV HCV 没有治疗过 目前也没有特别的不适 但是颈部左侧有个小淋巴节可以摸到 咨询本地医生 说人群中有10%左右人群细胞免疫调节功能差 就像我这样 这种人群容易患肿瘤 让我吃些胸腺肽 调节免疫 多锻炼身体

【答案】：A骨髓增生异常综合征时髓系细胞表面抗原及淋巴细胞亚群分布异常是MDS病态造血的另一种表现，外周血CD3、CD4细胞减少，CD4/CD8比值减低或倒置，与MDS病态发育有关。

这个是可以的，但必须是抗凝的。就算是新鲜血液，抗凝后保存于4度冰箱过夜后也可以检测

Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19 影响因子： 20.479PMID： 32788748 期刊年卷：Nat Immunol 2020 09;219(9) 医学一区 免疫学 Q1 3/155 DOI： 10.1038/s41590-020-0762-x 这篇文章和上一篇文章思路、设计、方法基本一致，甚至结论也有相似之处，通讯作者都是院士，但是为什么发的分值相差距大呢？除了文章发表先后顺序外，在样本量和数据分析方面做得更细致一些，亚群分析更细致一些，另外图表也比上一篇美观，这些问题都值得我们反思！ 作者实施了单细胞RNA测序（scRNA-seq），观察了中度至重度症状的COVID-19患者外周血单核细胞（PBMC）的免疫反应。作者的研究描绘了COVID-19疾病发展过程中血液免疫细胞的高分辨率转录组图谱，这将有助于更好地了解该疾病的保护性和致病性免疫反应。 在由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染引起的冠状病毒疾病2019（COVID-19）中，疾病严重程度与宿主免疫反应之间的关系尚未完全了解。在这里，作者对5位健康供体和13位COVID-19患者（包括中度，重度和恢复期患者）的外周血样本进行了单细胞RNA测序。通过确定免疫细胞的转录谱，并结合组装的T细胞受体和B细胞受体序列，作者分析了免疫细胞的功能特性。COVID-19患者中的大多数细胞类型均表现出强烈的干扰素-α反应和整体急性炎症反应。此外，高度细胞毒性效应T细胞亚群如CD4+ effector-GNLY (granulysin), CD8+ effector-GNLY and NKT CD160与中度患者的康复有关。在重症患者中，免疫系统的特征是干扰素反应紊乱，免疫力衰竭，T细胞受体组成偏向，T细胞广泛扩散。这些发现说明了疾病进展过程中免疫反应的动态性质。 scRNA-seq（10X基因组学）研究了13例患者和5例健康供体（HD）的PBMC的转录组谱（图 1a ）。将13例COVID-19患者分为三种临床情况：中度（ n u2009= 7），重度（ n u2009= 4）和恢复期（conv； n u2009= 6，其中4例与中度病例配对）（图 1a， b ，还对每个受试者进行了单细胞T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）测序。经过统一的单细胞分析流程（请参阅 方法 ），从所有样本的PBMC中的122,542个细胞中获得了约6亿个独特的转录本。在这些细胞中，22,711个细胞（占18.5％）来自HD，37,901个细胞（占30.9％）来自中度状态，24,640个细胞（占20.1％）来自严重状态，而37,290个细胞（占30.4％来自恢复状态）状况。将所有高质量细胞整合到完整且可比较的数据集中，并在校正读取深度和线粒体读取计数后进行主成分分析（补充图 2a，b ）。 图1：HD和COVID-19患者的PBMC的研究设计和单细胞转录谱。 使用基于图的统一流形近似和投影聚类（UMAP），作者根据规范基因标记的表达捕获了14种主要细胞类型或亚型的转录组（图 1c-e 和补充图 2a，b ）。外周血中细胞亚群的组成 (naive-state T (naive T) cells (CD3+CCR7+), activated-state T (activated T) cells (CD3+PRF1+), mucosal-associated invariant T (MAIT) cells (SLC4A10+TRAV1-2+), γδ T cells (TRGV9+TRDV2+), proliferative T (pro T) cells (CD3+MKI67+), natural killer (NK) cells (KLRF1+), B cells (MS4A1+), plasma B cells (MZB1+), CD14+ monocytes (CD14+ mono; LYZ+CD14+), CD16+ monocytes (CD16+ mono; LYZ+FCGR3A+), monocyte-derived dendritic cells (mono DCs; CD1C+), plasmacytoid dendritic cells (pDCs; LILRA4+), platelets (PPBP+) 为了揭示三种情况（中度，重度和转化）中细胞组成的差异并与HDs进行比较，作者根据scRNA-seq数据计算了每个人的PBMC中14种主要细胞类型的相对百分比（图 2a–d ）。活化的T细胞簇的相对百分比在中度患者中达到峰值，甚至在恢复期也没有恢复到正常水平。值得注意的是，幼稚T细胞，MAIT细胞和单DC的相对丰度随着疾病的严重程度而降低，后来在conv患者中这些种群得以恢复（图 2d ）。相比之下，在conv患者中，pro T细胞，血浆B细胞，CD14 +mono和血小板的相对百分比随着疾病的严重程度而增加，后来又下降了。 2d ）。重症患者中CD14 + mono的大量增加是根据最近的一项研究表明，病原性T细胞诱导的炎性单核细胞在COVID-19中引发了炎性风暴（参考文献 22 ）。 图2：疾病状况的细胞组成差异。 接下来，为了研究SARS-CoV-2感染期间的抗病毒和病原体免疫反应，作者评估了两种重要途径的表达水平（基因本体论（GO）生物学过程术语：对干扰素（IFN）-α的反应和急性炎症反应）。跨四个条件的主要细胞类型。作者发现，在COVID-19患者的PBMC中，所有主要细胞类型中对IFN-α的反应均一且显著上调，并且在严重患者中，除血浆B细胞外，几乎所有主要细胞类型中对IFN-α的响应值均最高，其中中度患者的IFN-α反应最大（图 2e ）。另外，除pro T细胞外，急性炎症反应在所选细胞类型的各种条件下均表现出一致且显著的差异。几种细胞类型显示出与疾病严重程度大致对应的急性炎症反应趋势，包括活化的T细胞，γδT细胞，NK细胞和CD16 + mono（图 2e ）。此外，在严重患者中，血浆I型IFN，IFN-γ和其他炎性细胞因子水平最高（补充图 2c ）。这些结果表明，在COVID-19患者中有很强的总体促炎反应（图 2e ）。 为了进一步研究SARS-CoV-2感染后先天免疫细胞的转录组变化（图 3a，b ），作者比较了CD14 +和CD16 +单核细胞中度或重度条件与HD条件的表达模式。作者发现COVID-19患者的IFN反应，髓样白细胞活化，细胞因子产生和核因子（NF）-κB信号通路均涉及显著差异表达的基因（DEG）（图3c，d）。作者发现COVID-19患者的IFN反应，髓样白细胞活化，细胞因子产生和核因子（NF）-κB信号通路均涉及显著差异表达的基因（DEG）（图 3c，d ）。 此外，严重条件下单核细胞中更多的DEG富含分子代谢和分解代谢过程以及细胞因子分泌（补充图 3a ）。对于NK细胞，与单核细胞相似，与IFN反应，细胞因子产生，NF-κB信号通路和白细胞细胞毒性相关的DEGs在COVID-19患者中显著丰富（图 3e，f ），表明先天免疫细胞具有一致的反应感染SARS-CoV-2。此外，与中度患者相比，重症NK细胞的DEGs，例如 ITGB2， CCL5 和 CXCR2 ，与迁移相关的过程更为紧密相关（补充图 3b，c ）。 **图3：在四个条件下个体的先天免疫细胞的特征。 全尺寸图片 与DEG富集结果一致，作者发现SARS-CoV-2感染后单核细胞和NK细胞均显示出明显的IFN和急性炎症反应，特别是在严重患者中（图 2e ）。与HD条件相比，单核细胞和NK细胞中细胞凋亡和迁移的水平也被上调（图 3g ）。与单核细胞和NK细胞中相当的凋亡水平不同，重度患者的先天免疫细胞比中度患者更容易迁移（图 3g 和补充图 3c ）。这些结果表明，在患有COVID-19的患者中，大多数先天免疫细胞类型均表现出强烈的IFN反应。 为了表征个体在四种情况下个体T细胞亚群的变化，作者从PBMC中亚群化T细胞，并根据典型T细胞标志物的表达和分布获得12个亚群（图 4a，b ）： CD4 + T细胞的6种亚型（CD3E + CD4+）， CD8 + T细胞的3种亚型（CD3E + CD8A +） NKT细胞的3种亚型（CD3E + CD4 – CD8A –TYROBP +） 图4：T细胞亚群的免疫学特征 源数据 全尺寸图片 CD4 + T细胞簇的六个亚型 naive CD4+ (CD4+ naive) T cell (CCR7+SELL+), memory CD4+ (CD4+ memory) T cell (S100A4+GPR183+), effector memory CD4+ T cell (S100A4+GPR183+GZMA+) regulatory T (Treg) cell (FOXP3+IL2RA+) 亚型， 两种effector CD4 + T亚型： CD4+ effector-GZMK and CD4+ effector-GNLY。CD4+ effector-GNLY簇的特点是与细胞毒性，包括相关联的基因的高表达NKG7，GZMA，GZMB，GZMH和GNLY，而CD4+ effector-GZMK 簇显示出的高表达GZMK基因（图4b和补充图4a，b）。此外，CD4+ effector-GNLY细胞表现出高表达的TBX21，表明它们是1型辅助性T（T H1）样细胞（补充图4c）。相反，CD4+ effector-GZMK和effector memory CD4+ T cell具有高表达GATA3的2型辅助T（T H 2）细胞样特征（补充图4c）。 CD8 + T细胞簇的三个亚型 CD8+ (CD8+ naive) T cell subset (CCR7+SELL+) and two effector CD8+ T cell subsets (CD8+ effector-GZMK and CD8+ effector-GNLY)，它们都具有高表达的GZMA和NKG7。 CD8+ effector-GZMK独特表达GZMK，而CD8+ effector-GNLY显示出相对高的表达水平GZMB / H和GNLY（图4B和补充图4A，B）。 NKT细胞簇的三个亚型被定义为 NKT (NKT naive) cells (CCR7+SELL+), CD56+ NKT (NKT CD56)，CD160+ NKT (NKT CD160) （图 4a，b ）**。 为了深入了解T细胞亚群中的特征，作者评估了每个簇在四个条件下的分布（图 4c 和补充图 4d，e ）。值得注意的是，与HD相比，COVID-19患者的effector T cells （CD4+ naive, CD4+ memory, CD4+ effector memory, Treg, CD8+naive and NKT naive subsets）的比例下降（图 图4c 和补充图 4D ）。即使在转化条件下，CD4+ naive, CD8+ naive and Treg 的比例簇没有恢复到HD的水平（图 4c 和补充图 4d ）。相反，COVID-19患者的CD4+ effector-GNLY, CD8+ effector-GNLY, NKT CD56 and NKT CD160子集的活跃状态T细胞子集的比例增加，这些细胞毒性子集甚至以高比例存在在conv患者中（图 4c ）。特别要注意的是，HDs中几乎不存在CD4+ effector-GNLY 亚群，但在中度，重度和转化性患者中高度丰富。此外，与中度患者相比，重度患者的NKT CD160亚群的丰度显著降低。 然后，作者评估了在四种情况下不同效应子状态T细胞亚群的细胞毒性和衰竭评分（图 4d 和补充图 4f ）。CD4+ effector-GNLY, CD8+ effector-GNLY, NKT CD56 and NKT CD160子集显示出比其他子集更高的细胞毒性评分。在这些高度细胞毒性的簇中，HDs的细胞毒性评分最低，而中度状态则显示最高的细胞毒性状态，但CD4+ effector-GNLY亚群除外（图 4d，e 和补充图 4f ）。同时，CD4+ effector-GZMK, CD8+ effector-GZMK and NKT CD160 亚群显示出比其他亚组更高的疲劳评分。在这些精疲力竭的亚组中，HDs的精疲力竭评分最低，而重症患者表现为最精疲力竭状态（图 4d，e 和补充图 4f ），这与先前检查重症患者CD8 + T细胞的功能研究一致并发现疲惫不堪的状态和功能受损 23 。 为了进一步研究SARS-CoV-2感染后T细胞中差异转录组的变化，作者比较了中度或重度之间的效应T细胞（排除CD4+ naive, CD4+ memory, CD8+ naive and NKT naive）的表达谱。HD条件。作者观察到，在COVID-19患者中上调的DEG参与了以下过程，包括IFN反应，细胞因子产生，细胞杀伤，白细胞-细胞粘附和细胞骨架组织（图 4f，g 和补充图 4i ）。此外，使用凋亡和迁移评分系统，作者观察到严重患者的T细胞可能经历了迁移和凋亡（图 4h，i 和补充图 4g，h ）。在重症患者的PBMC中的细胞死亡和迁移途径的活化显著表明，细胞死亡和淋巴细胞迁移可以与淋巴细胞减少，在患者中观察到严重COVID-19的常见现象（参考文献相关联 18 ， 19 ， 24 ）。 接下来，为了深入了解各个T细胞之间的克隆关系以及在四个条件下V（D）J基因的使用，作者从TCR测序中重建了TCR序列（补充表 2 ）。简而言之，除了三个NKT子集外，所有子集中具有匹配的TCR信息的细胞超过70％（图 5a，b ）。首先，与HDs相比，COVID-19患者和恢复期患者的克隆扩增明显（图[5c–e]( https://www.nature.com/articles/s41590-020-0762-x#Fig5 ）。在中度和慢性条件下的克隆扩增程度高于严重条件下的克隆扩增程度。同时，在严重的情况下，没有大的克隆扩增（克隆大小> 100）（图 5e ），表明严重的患者可能缺乏效应T细胞的有效克隆扩增。作者观察到T细胞亚群之间不同程度的克隆扩增（图 5c，d ）。效应T细胞亚群CD4 +效应子GNLY，CD8 +效应子GZMK和CD8 +效应子GNLY表明克隆细胞（图的高比例 5a中，d 和补充图 5A ）和包含簇间克隆细胞的高比例（图 5f ），提示效应子T细胞经历了动态状态转变（图 5a，f ）。 全尺寸图片 为了研究COVID-19和HD患者中TCR的动力学和基因偏好，作者比较了四种情况下V（D）J基因的使用情况（图 5g–i 和补充图 5b ）。在四个条件下，前10个互补决定区3（CDR3）序列不同（图 5h ）。中度和转化条件共享一些CDR3序列，因为来自这些条件的四个样本已配对。与其他三个条件相比，HD条件下前10个CDR3序列的使用百分比更低且更均衡。值得注意的是，作者发现在COVID-19患者中V（D）J基因的不同用法具有降低的多样性，这在 TRA 基因中更为明显（图 5i ）。作者还确定了 重度患者与中度和 慢性患者相比 TRAJ39 和 TRAJ43的 过度表达 （图 5g ）。 重症患者首选的TRBJ基因是TRBJ1-1，而中度和转化性患者首选TRBJ2-1（图 5i ）。 **V（D）J基因的选择性使用表明不同的免疫优势表位可能驱动T细胞反应的分子组成，并且可能与SARS-CoV-2特异性感染相关。 为了追踪不同B细胞亚型的动态变化，作者根据规范B细胞标志物的表达和分布将B细胞分为六个子集（图 6a，b 和补充图 6a ）。 naive B subset (MS4A1+IGHD+), memory B subset (MS4A1+CD27+), intermediate transition memory B subset (intermediate memory B; IGHD+CD27+), germinal center B subset (MS4A1+NEIL1+) and two plasma subsets, plasma B (MZB1+CD38+) and dividing plasma B (MZB1+CD38+MKI67+) . 图6：B细胞亚群的免疫学特征。 全尺寸图片 值得注意的是，与HD相比，COVID-19患者的活动状态B子集（germinal center B, plasma B and dividing plasma B subsets）的比例增加。相反，与HD患者相比，COVID-19患者的memory B cells比例下降（图 6c-e ）。 为了进一步研究SARS-CoV-2感染后B细胞的差异转录组变化，作者比较了中度或重度条件下HD的B/plasma cells的表达谱。在COVID-19患者中最丰富的DEG参与了与IFN反应相关的基因（图 6f，g 和补充图 6c ）。此外，重症患者中的DEG与蛋白质合成，成熟和运输相关的生物学过程有关（补充图 6b ）。这些结果揭示了COVID-19患者B细胞亚群的转录组特征。 作者还从BCR测序中重建了BCR序列（补充表 3 ），并分析了BCR克隆扩增的状态。简而言之，每个簇中BCR的检出率均超过75％（图 7a，b ）。作者发现来自重症患者的B细胞显示出比其他三种情况明显的克隆扩增（图 7c 和补充图 6d ），这表明重症患者的B细胞活性和体液免疫反应被强烈激活，这让人想起先前的观察较高的抗体滴度与更差的临床结果相关联 25 ， 26 ， 27 。这引起了这样一种担忧，即病原体导向的抗体可以促进疾病病理，导致抗体依赖性增强，类似于SARS 28 中观察到的增强。 图7：扩展的BCR克隆和V（D）J基因的选择性使用 全尺寸图片 接下来，作者分别评估了中度，重度和转化条件下每位患者中IgA，IgD，IgG和IgM的分布（未检测到IgE）。在大多数患者中，IgM是主要的免疫球蛋白（图 7d，e ）。**与HD相比，COVID-19患者的IgG含量增加，而IgM降低。在恢复期患者中，IgG和IgM的水平恢复到与HDs相似的水平。 为了研究BCR的偏向V（D）J重排，作者比较了四种条件下V（D）J基因的使用情况（图 7f，g 和补充图 6e ）。与其他三种情况相比，作者发现在重症患者中使用了更多的特定V（D）J，这表明重症患者的B细胞可能经历了独特而特定的V（D）J重排（图 7g ）。 作者还发现IHDJ4在所有HD和患者中得到了综合利用（图 7f ），但与其他三种情况下的患者相比，重症患者中IGHJ4的IGHV配对IGHV基因却有所不同（图 7g ） 。 作者观察到IGHV3-7的过度表达在严重患者中（图 7f ）。此外，重症患者中前两个配对的VJ频率为IGHV3-7 / IGHJ4和IGKV3-15 / IGKJ3（图 7g ）。 总体而言 ，严重患者的B细胞克隆性增加以及 IGHV 和 IGKJ 基因的偏斜使用表明SARS-CoV-2感染与宿主B细胞中的V（D）J重排有关。值得注意的是， 在重症患者中选择性使用显性IGV基因，尤其是IGHV3-7和IGKV3-15，可能有助于疫苗的设计。

　　L参考值:7.23--16.85.　　2、免疫球蛋白IGA(IGA)结果:1.50单位:G/L参考值:0.68--3.83.　　3、免疫球蛋白IGM(IGM)结果:1.55单位:G/L参考值:0.63--2.77.　　4、补体C3（C3）结果：0.47单位:G/L参考值:0.85--1.93.　　5、补体C4(C4)结果:0.10单位:G/L参考值:0.12--0.36.　　提问时间: 2005-03-16 16:38:37　　回答：baobei0789　　神　　3月16日 21:13 如何提高免疫力？　　人体内营养素的充足和均衡关系到机体免疫系统的强弱，与某些传染病也有一定的相关性。根据已有的营养学研究成果，人体得到充足的营养素补充，将大大提高人体对疾病的免疫力，在预防非典型肺炎方面发挥作用。那么什么是免疫力呢？免疫力简单的说就是人体对各种疾病的抵抗力，而抵抗力来自身体内的免疫系统，免疫系统由胸腺、骨髓、脾脏、淋巴组织等免疫器官和巨噬细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞等免疫细胞组成。　　健全的免疫系统有三大功能，一是防御功能。免疫力强能帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病，有保护机体不受损害的防御能力；二是稳定功能。免疫功能好，能帮助机体修复或消除人体内新陈代谢、受损伤或衰老死亡的组织细胞，维持机体代谢的内环境始终处于稳定状态；三是监控功能。免疫力强可以帮助机体杀伤和消除异常突变细胞。　　人体的各种机能只有达到一种平衡的状态才能保证健康，机体的营养状况与免疫机能的强弱密切相关。在补充营养的过程中，要注意通过均衡营养保证机体的免疫能力。　　均衡营养免疫三步曲 几种典型的与免疫有关的营养素是如何搭建人体营养———免疫系统的。　　首先，“VA＋Zn”组合（维生素A加锌）构筑起“均衡营养免疫三步曲”的第一步，它们能够帮助阻止病毒进入人体，使呼吸道免受感染。医学实验表明：维生素A是维持上皮组织正常机能的必须物质，可以促进呼吸道等表皮细胞的分化和修复，保证表皮的完整性，从而抵抗病菌入侵；维生素A有“抗感染维生素”之称。锌与维生素A协同作用可以改善维生素A的吸收和运转。所以，维生素A和锌同时作用可有效阻止病毒的入侵。　　维生素C构筑起“均衡营养免疫三步曲”的第二步，帮助杀灭进入人体的病毒。因为它可以干扰病毒侵害白血球，激活全身的白细胞，增强白细胞对病毒的吞噬能力，杀灭病菌，从而增强人体的免疫力，使人体免受病毒侵害。感冒病人的白细胞中维生素C的含量明显下降。　　除了微量元素，还有牛磺酸。牛磺酸是一种氨基酸，能促进免疫系统淋巴细胞的生长和繁殖。另外，它还能清热、镇痛，缓解人体自身因抵御病毒而启动自动调节防御系统产生的症状——发烧，这就是“均衡营养免疫三部曲”的第三步。当人体受到严重侵害时，牛磺酸还发挥清热、退烧作用，进而增强人体的抵抗力。　　也就是说，人们特别是儿童如果能均衡补充多种有利于提高人体免疫力的营养素，搭建体内的营养——免疫防护屏障，就能比较有效地保护机体免受病毒的侵害。

由于CD4掉的比较块，所以建议立刻进行抗病毒治疗、根据实际状况服用抗逆转录病毒病毒药物。兼服用中药唐草片等

细胞毒性t细胞活化后的变化如下。1、T细胞分化成各种效应T细胞亚群，这些效应T细胞亚群要么控制细胞内病原体，要么激活B细胞以靶向细胞外病原体。2、CD8T细胞成为裂解病毒感染或肿瘤细胞的细胞毒性T细胞。3、CD4T细胞分化成辅助T细胞的各种亚群，激活其他免疫细胞（即Th1细胞激活巨噬细胞，Th2细胞激活B细胞）。